Artykuł metodologiczny

Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji

DOI:

10.3791/62354

⸱

15 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Medical Entomology Laboratory, Department of Entomology and Nematology, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, 2U. S. Fish and Wildlife Service, Pacific Islands Fish and Wildlife Office, 3Department of Entomology and Nematology, University of California Davis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj jest protokół ekstrakcji DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych do produkcji wysokiej jakości ekstrakcji DNA od komarów. Ekstrakcje te są odpowiednie dla dalszego podejścia do sekwencjonowania nowej generacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno opublikowany protokół ekstrakcji DNA za pomocą kulek magnetycznych i automatycznego narzędzia do ekstrakcji DNA sugerował, że możliwe jest wydobycie wysokiej jakości i ilości DNA z dobrze zachowanego pojedynczego komara, wystarczającego do dalszego sekwencjonowania całego genomu. Jednak poleganie na drogim automatycznym przyrządzie do ekstrakcji DNA może być zaporowe dla wielu laboratoriów. W tym przypadku badanie zapewnia przyjazny dla budżetu protokół ekstrakcji DNA oparty na kulkach magnetycznych, który jest odpowiedni dla niskiej i średniej przepustowości. Opisany tutaj protokół został pomyślnie przetestowany przy użyciu pojedynczych próbek komarów Aedes aegypti. Obniżone koszty związane z wysokiej jakości ekstrakcją DNA zwiększą zastosowanie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w laboratoriach i badaniach o ograniczonych zasobach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawny rozwój ulepszonego protokołu ekstrakcji DNA1 umożliwił przeprowadzenie wielu ważnych dalszych badań obejmujących sekwencjonowanie całego genomu2,3,4,5,6. Ten protokół ekstrakcji DNA oparty na kulkach magnetycznych zapewnia wiarygodną wydajność DNA z pojedynczych próbek komarów, co z kolei zmniejsza koszty i czas związany z uzyskaniem wystarczającej liczby próbek z kolekcji terenowych.

Ostatnie postępy w genomice populacji i krajobrazu są bezpośrednio skorelowane z malejącymi kosztami sekwencjonowania całego genomu. Chociaż poprzedni protokół ekstrakcji DNA1 zwiększa wydajność związaną z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości, mniejsze laboratoria/badania bez funduszy mogą zrezygnować z korzystania z tych nowych, potężnych narzędzi genomiki krajobrazowej i populacyjnej ze względu na koszty wdrożenia protokołu (np. koszty specjalistycznych instrumentów).

Tutaj prezentowany jest zmodyfikowany protokół ekstrakcji DNA, który wykorzystuje podobny etap ekstrakcji kulek magnetycznych jak Neiman et al.1 w celu uzyskania DNA o wysokiej czystości, ale nie polega na drogich instrumentach do lizy tkanek i ekstrakcji DNA. Protokół ten jest odpowiedni dla eksperymentów wymagających >10 ng wysokiej jakości DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ogólne przechowywanie próbek i przygotowanie przed ekstrakcją DNA

  1. Uwodnić próbkę w 100 μl wody klasy PCR przez 1 godzinę (lub przez noc) w temperaturze 4 °C, jeśli próbka była przechowywana w >70% alkoholu w celu zmiękczenia tkanki.

2. Zakłócenie próbki

  1. Ustawić inkubator lub blok grzewczy z wytrząsaniem na temperaturę 56 °C.
  2. Przygotować mieszaninę buforazy K (PK) i enzymu. Do każdej pojedynczej ekstrakcji komarów wymagane jest 2 μl proteinazy K (100 mg/mL) i 98 μl buforu proteinazy K (łącznie 100 μl). Aby przygotować mieszankę wzorcową dla wielu próbek, należy zwiększyć całkowitą ilość (łącznie dla wszystkich pojedynczych próbek) o ~15%, aby zapewnić dostępność odpowiedniej objętości.
  3. Jeśli próbki zostały uwodnione przed ekstrakcją, należy wylać wodę z każdej probówki z próbką.
  4. Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej tkankę komara dodać 100 μl mieszaniny buforu PK/enzymu.
  5. Homogenizować tkankę za pomocą tłuczka do probówek do mikrowirówek.
  6. Odwirowywać próbki przez 1 minutę przy 9 600 x g w temperaturze pokojowej.
  7. Inkubować próbkę przez 2-3 godziny w temperaturze 56 °C.
  8. Podczas inkubacji przygotuj pozostałe odczynniki, korzystając z etapu ekstrakcji DNA (krok 3).

3. Ekstrakcja DNA

  1. Zrób mieszankę wzorcową z koralików magnetycznych. Dla każdej próbki wymieszać 100 μl buforu do lizy, 100 μl izopropanolu i 15 μl kulek magnetycznych (łącznie 215 μl). Aby przygotować mieszankę wzorcową do wielu reakcji, należy zwiększyć całkowitą ilość (łącznie dla wszystkich pojedynczych próbek) o ~20%, aby zapewnić dostępność odpowiedniej objętości.
  2. Po czasie inkubacji (krok 2.7) przenieść każdy lizat do czystej probówki do mikrowirówki lub studzienki na mikropłytkę za pomocą pipety.
  3. Do każdej próbki dodać 100 μl lizatu i 215 μl mieszanki wzorcowej z kulkami magnetycznymi.
  4. Użyj pipety, aby dobrze wymieszać przez 10-20 s, a następnie odstaw na 10 minut w temperaturze pokojowej. Od czasu do czasu delikatnie potrząsaj probówką, aby zmaksymalizować wiązanie kulek magnetycznych i DNA.
  5. Umieść probówkę/płytkę na magnetycznym separatorze kulkowym i poczekaj, aż roztwór będzie klarowny.
  6. Wylać płyn z probówki/płytki za pomocą pipety. Podczas usuwania supernatantu staraj się nie dotykać ani nie naruszać kulek magnetycznych trzymających DNA.
  7. Odsunąć rurkę/płytkę od magnetycznego separatora kulek i dodać 325 μl buforu płuczącego 1 do każdej studzienki.
  8. Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  9. Powtórz kroki 3.5-3.6.
  10. Odsunąć rurkę/płytkę od magnetycznego separatora kulek i dodać 250 μl buforu płuczącego 1 do każdej studzienki.
  11. Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  12. Powtórz kroki 3.5-3.6.
  13. Odsunąć probówkę/płytkę od magnetycznego separatora kulkowego i dodać 250 μl buforu płuczącego 2 do każdej próbki.
  14. Dokładnie wymieszaj i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  15. Powtórz kroki 3.5-3.6.
  16. Odsunąć rurkę/płytkę od magnetycznego separatora kulek i dodać 250 μl buforu płuczącego 2 do każdej studzienki.
  17. Dokładnie wymieszaj i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  18. Powtórz kroki 3.5-3.6.
  19. Odsunąć probówkę/płytkę od magnetycznego separatora kulkowego i dodać 100 μl buforu elucyjnego do każdej studzienki.
  20. Dokładnie wymieszaj i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  21. Przesuń probówkę/płytkę na magnetycznym separatorze kulkowym i poczekaj, aż roztwór będzie klarowny.
  22. Odpipetować supernatant do nowej, czystej, 0,5 probówki do mikrowirówki lub studzienki na mikropłytkę.
  23. Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze 4 °C (do 1 tygodnia) lub -80 °C. Jeśli używana jest mikropłytka, przykryj ją parafilmem.
  24. Określić wydajność DNA przy użyciu dowolnej odpowiedniej metody.
    UWAGA: W tym badaniu wykorzystano odczyt fluorometru DNA i absorbancję przy 260/280 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Średnia wydajność DNA na pojedynczą głowę komara / tkankę klatki piersiowej wynosiła 4,121 ng/μL (N = 92, odchylenie standardowe 3,513) mierzona za pomocą fluorometru podczas elucji przy użyciu 100 μL buforu elucyjnego. Jest to wystarczające dla wymagań wejściowych genomowego DNA o długości 10-30 ng niezbędnych do budowy biblioteki całego genomu1,7. Ilość DNA może wahać się od 0,3 do 29,7 ng/μl w zależności od wielkości ciała komara i warunków przechowywania. Czę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół można dostosować do innych gatunków owadów. Pierwotna wersja protokołu wprowadzona w Nieman et al.1 została przetestowana na wielu gatunkach, w tym Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta i Keiferia lycopersicella

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za wsparcie finansowe od Regionalnego Centrum Doskonałości ds. Chorób Przenoszonych przez Wektory na Południowo-Zachodnim Pacyfiku, ufundowane przez Amerykańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób (Umowa o współpracy 1U01CK000516), grant CDC NU50CK000420-04-04, Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa USDA (projekt Hatch 1025565), stypendium UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory dla Tse-Yu Chen, grant NSF CAMTech IUCRC Phase II (AWD05009_MOD0030), oraz Departament Zdrowia Florydy (Kontrakt CODQJ). Ustalenia i wnioski zawarte w tym artykule są ustaleniami i wnioskami autora (autorów) i niekoniecznie reprezentują poglądy U.S. Fish and Wildlife Service.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor AEQiagen19077Bufor elucyjny
AL BuforQiagen19075Bufor do lizy
AW1 BuforQiagen19081Bufor myjący 1
AW2 BuforQiagen19072Bufor myjący 2
Zawieszenie MagAttract GQiagen1026901kulka magnetyczna
Separator magnetycznyEpigentekQ10002-1
NanodropSpektrofotometr mikroobjętościowyThermoFisherND-2000
Bufor PKBufor ThermoFisher4489111Bufor proteinazy K
FluorometrThermoFisherA25561
QubitInvitrogenQ33238

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).
  3. Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).
  4. Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473(2019).
  5. Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
  6. Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).
  7. Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211(2016).
  8. Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
  9. Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
  10. Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
  11. Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja za pomoc kulek magnetycznychsekwencjonowanie ca ego genomuAedes aegyptisekwencjonowanie wysokoprzepustoweoczyszczanie DNAtrawienie proteinaz Kprob wka do mikrocentryfugigenomika populacyjnaprzep yw gen w

Powiązane artykuły