Artykuł przedstawia urządzenie μTongue (mikrofluidyka na języku) do funkcjonalnego obrazowania komórek smaku in vivo poprzez integrację mikrofluidyki z okienkiem obrazowania przyżyciowego na języku.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
μTongue: oparta na mikrofluidyce funkcjonalna platforma obrazowania języka in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej jest szeroko stosowanym narzędziem do badania dynamiki wielokomórkowej u żywego zwierzęcia. Nie został jednak z powodzeniem zastosowany w narządzie zmysłów smaku. Dzięki zintegrowaniu mikrofluidyki z okienkiem obrazowania języka przyżyciowego, μTongue zapewnia wiarygodne obrazy funkcjonalne komórek smakowych in vivo pod kontrolowaną ekspozycją na wiele degustacji. W artykule przedstawiono szczegółową procedurę korzystania z systemu μTongue krok po kroku. Składa się z pięciu podsekcji: przygotowanie roztworów degustacyjnych, konfiguracja modułu mikroprzepływowego, montaż próbki, pozyskiwanie funkcjonalnych danych obrazowych oraz analiza danych. Przedstawiono również kilka wskazówek i technik rozwiązywania praktycznych problemów, które mogą pojawić się podczas korzystania z μTongue.
Wprowadzenie
Mikroskop fluorescencyjny przyżyciowy jest szeroko stosowany do badania dynamiki czasoprzestrzennej na żywych tkankach. Naukowcy szybko rozwijają genetycznie kodowane czujniki, które zapewniają specyficzne i czułe transformacje procesów biologicznych w sygnały fluorescencyjne - które można łatwo rejestrować za pomocą powszechnie dostępnych mikroskopów fluorescencyjnych1,2. Chociaż większość narządów wewnętrznych u gryzoni została przebadana przy użyciu mikroskopu, jego udane zastosowanie na języku nie zakończyło się jeszcze sukcesem3.
Poprzednie badania nad o....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Sungkyunkwan i Uniwersytetu Narodowego w Seulu.
1. Przygotowanie roztworów: sztuczna ślina i degustatory
- Przygotować sztuczną ślinę, rozpuszczając 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4 i 1,8 mM HCl w wodzie destylowanej (>1 L) i dostosuj pH roztworu do 7 (patrz Tabela materiałów)12.
- Przyg....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Do uzyskania obrazu pączka smakowego wykorzystano mysz Pirt-GCaMP6f-tdTomato. Powierzchnia języka myszy była pokryta autofluorescencyjnymi brodawkami nitkowatymi. Pączki smakowe są rzadko rozmieszczone na powierzchni języka (Rysunek 4A). Obrazy pączka smakowego i jego struktury pozyskano przy użyciu trzech różnych detektorów z filtrami. Przy użyciu zestawu filtrów 607/70 nm uzyskano sygnał tdTomato z komórek smakowych do analizy ratiometrycznej (Rysunek 4B). Prz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Poniżej opisano szczegółowy protokół zastosowania μTongue do badania aktywności funkcjonalnej komórek smakowych in vivo. W tym protokole przeprowadza się funkcjonalne obrazowanie komórek smakowych przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. Oprócz wykorzystania myszy transgenicznych, alternatywną opcją może być elektroforetyczne ładowanie barwników wapniowych (lub barwników wykrywających napięcie) na komórki smakowe.
W tym eksperymencie użyto wszystkich roztworów smakowych o.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują konkurencyjne interesy finansowe: J. Han i M. Choi są wynalazcami opatentowanej technologii μTongue opisanej w tym artykule, a system μTongue jest komercyjnie dostępny za pośrednictwem SciTech Korea.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (nr 2019M3A9E2061789) oraz przez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (nr 2019M3E5D2A01058329). Jesteśmy wdzięczni Eunsoo Kim i Eugene'owi Lee za ich pomoc techniczną.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| acesulfam K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Sztuczna ślina / smaczny |
| roztwór chlorku wapnia | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Sztuczna ślina / degustacja |
| kwasu cytrynowego | Sigma Aldrich | C0759-100G | Sztuczna ślina / tastant |
| cykloheksymid | Sigma Aldrich | 01810-5G | Sztuczna ślina / degustacja |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Sztuczna ślina / degustacja |
| Klej dentystyczny | Denkist | P0000CJT-A2 | Preparat dla zwierząt |
| Obraz J | NIH | ImageJ | Analiza danych |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Sztuczna ślina / degustacja |
| Klej błyskawiczny | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Preparat dla zwierząt |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Sztuczna ślina / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Sztuczna ślina / degustacja |
| Ketamina | Yuhan | Ketamina 50 | Preparat dla zwierząt |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Sztuczna ślina / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Sztuczna ślina / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Analiza danych |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Sztuczna ślina / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Sztuczna ślina / tastant |
| Mutiphoton | mikroskop Thorlab | Bergamo II | Mikroskop |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Sztuczna ślina / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Sztuczna ślina / tastant |
| Obiektyw | Nikon | N16XLWD-PF | Mikroskop |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Sterowanie przepływem |
| PC | LG | Lg15N54 | Miernik pH z kontrolą płynów |
| Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Sztuczna ślina / degustacja | |
| Solanka buforowana fosforanami | Sigma Aldrich | 806562 | Sztuczna ślina / tastant |
| chinina | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Sztuczna ślina / degustacja |
| Pompa strzykawkowa | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Kontrola |
| płynówTRITC-dekstran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Przygotowanie dla zwierząt |
| Ultraszybki laser | światłowodowy Toptica | FFultra920 01042 | Mikroskop |
| Ksylazyna | Bayer Korea | Rompun | Preparat dla zwierząt |
Bibliografia
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
