Artykuł metodologiczny

μTongue: oparta na mikrofluidyce funkcjonalna platforma obrazowania języka in vivo

DOI:

10.3791/62361

⸱

22 kwietnia 2021

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Sungkyunkwan University, 2Center for Neuroscience Imaging Research, Institute for Basic Science, 3School of Biological Sciences, Seoul National University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł przedstawia urządzenie μTongue (mikrofluidyka na języku) do funkcjonalnego obrazowania komórek smaku in vivo poprzez integrację mikrofluidyki z okienkiem obrazowania przyżyciowego na języku.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej jest szeroko stosowanym narzędziem do badania dynamiki wielokomórkowej u żywego zwierzęcia. Nie został jednak z powodzeniem zastosowany w narządzie zmysłów smaku. Dzięki zintegrowaniu mikrofluidyki z okienkiem obrazowania języka przyżyciowego, μTongue zapewnia wiarygodne obrazy funkcjonalne komórek smakowych in vivo pod kontrolowaną ekspozycją na wiele degustacji. W artykule przedstawiono szczegółową procedurę korzystania z systemu μTongue krok po kroku. Składa się z pięciu podsekcji: przygotowanie roztworów degustacyjnych, konfiguracja modułu mikroprzepływowego, montaż próbki, pozyskiwanie funkcjonalnych danych obrazowych oraz analiza danych. Przedstawiono również kilka wskazówek i technik rozwiązywania praktycznych problemów, które mogą pojawić się podczas korzystania z μTongue.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskop fluorescencyjny przyżyciowy jest szeroko stosowany do badania dynamiki czasoprzestrzennej na żywych tkankach. Naukowcy szybko rozwijają genetycznie kodowane czujniki, które zapewniają specyficzne i czułe transformacje procesów biologicznych w sygnały fluorescencyjne - które można łatwo rejestrować za pomocą powszechnie dostępnych mikroskopów fluorescencyjnych1,2. Chociaż większość narządów wewnętrznych u gryzoni została przebadana przy użyciu mikroskopu, jego udane zastosowanie na języku nie zakończyło się jeszcze sukcesem3.

Poprzednie badania nad obrazowaniem komórek smakowych wapniem były prowadzone ex vivo poprzez cienkie cięcie tkanki języka w celu uzyskania obwodowych kubków smakowych4,5,6 lub poprzez odklejanie nabłonka smakowego w celu uzyskania grzybokształtnych kubków smakowych7,8. Przygotowanie tych próbek było nieuchronnie inwazyjne, dlatego naturalne mikrośrodowiska, takie jak unerwienie nerwów, bariery przepuszczalności i krążenie krwi, były w dużej mierze zaburzone. Pierwsze okno obrazowania języka w obrębie przewodu przyżyciowego zostało zgłoszone w 2015 roku przez Choi i wsp., ale wiarygodne zapisy funkcjonalne nie były osiągalne ze względu na artefakty ruchowe i optyczne spowodowane płynnymi bodźcami degustacyjnymi9.

Niedawno wprowadzono mikrofluidykę na języku (μTongue)10. To urządzenie integruje system mikroprzepływowy z okienkiem obrazowania na języku myszy. Osiągając quasi-ustalony przepływ bodźców smakowych przez cały okres obrazowania, artefakty wynikające z ruchu płynu mogą zostać zminimalizowane (Rysunek 1). Port wejściowy jest zasilany przez szereg wielokanałowych regulatorów ciśnienia, podczas gdy port wyjściowy jest podłączony do pompy strzykawkowej, która utrzymuje prędkość 0,3 ml/min. Dodatkowo, artefakty optyczne spowodowane różnicą w współczynnikach załamania światła roztworów degustacyjnych zostały zminimalizowane poprzez analizę ratiometryczną wprowadzającą wskaźnik niewrażliwy na wapń (tdTomato) oraz wskaźnik wapnia (GCaMP6)11. Taka konstrukcja zapewniła mikroskopijną stabilność komórek smakowych in vivo, nawet przy nagłym przełączaniu między kanałami płynowymi. W związku z tym μTongue wdraża niezawodne funkcjonalne badanie przesiewowe wielu smaków dla kubków smakowych myszy in vivo.

W tym protokole, procedury eksperymentalne są szczegółowo wyjaśnione dla obrazowania wapniowego kubków smakowych grzybów myszy in vivo za pomocą μTongue. Najpierw opisano przygotowanie sztucznej śliny i roztworów smakowych. Po drugie, wprowadza się ustawienie systemu mikroprzepływowego w celu osiągnięcia przepływu w stanie quasi-ustalonym. Po trzecie, opisano procedury używane do montażu języka myszy na μTongue, aby umożliwić akwizycję obrazu. Na koniec określono każdy etap analizy obrazu, w tym korekcję artefaktów ruchu bocznego i ratiometrię. Protokół ten można łatwo zaadaptować do każdego laboratorium badawczego wyposażonego w mysz i mikroskop dwufotonowy lub równoważny sprzęt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Sungkyunkwan i Uniwersytetu Narodowego w Seulu.

1. Przygotowanie roztworów: sztuczna ślina i degustatory

  1. Przygotować sztuczną ślinę, rozpuszczając 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4 i 1,8 mM HCl w wodzie destylowanej (>1 L) i dostosuj pH roztworu do 7 (patrz Tabela materiałów)12.
  2. Przygotować smaki, takie jak kwaśny: 10 mM kwasu cytrynowego; słony: 400 mM NaCl, opcjonalnie z 50 μM amilorydem; słodki: 40 mM acesulfam K; gorzki: mieszanina 5 mM chininy, 5 mM denatonium i 20 μM cykloheksymidu, rozpuszczając degustacyjną substancję chemiczną w sztucznej ślinie przygotowanej w kroku 1.1.

2. Przygotowanie układu mikroprzepływowego

UWAGA: Degustatory były dostarczane do języka myszy za pomocą ciśnieniowego, wielokanałowego systemu dostarczania płynów (patrz Rysunek 1 i Tabela materiałów).

  1. Napełnij zbiorniki ciśnieniowego systemu perfuzyjnego sztuczną śliną i degustatorami.
  2. Podłącz przewód sprężonego powietrza do wejścia regulatora i ustaw ciśnienie powietrza w zakresie od 30 do 50 psi w układzie dostarczania płynu.
  3. Ustaw ciśnienie wyjściowe regulatora na 0.4 psi i sprawdź, czy pod tym ciśnieniem płyn wypływa z rurki.
  4. Podłącz kolektor ze zbiorników do portu wejściowego μTongue.
  5. Podłącz port wyjściowy μTongue do pompy strzykawkowej i pobierz płyn za pomocą ~300 μL∙min-1, aby ustalić stan ustalony. Obserwuj stałą objętość wiszącej kropli pod μTongue. Dostosuj wartość parametru ustawienia w zależności od wysokości próbki.
  6. Odłączyć przewód sprężonego powietrza i zatrzymać pompę strzykawkową do czasu zakończenia kroku 3 protokołu.

3. Przygotowanie myszy do obrazowania in vivo (Rysunek 2).

UWAGA: Wszystkie preparaty dla zwierząt były przeprowadzane w ciągu dnia w warunkach aseptycznych na stole laboratoryjnym.

  1. Znieczulenie myszy
    1. Przygotuj 7-tygodniową lub starszą mysz dowolnej płci. Użyj genetycznie zmodyfikowanej linii myszy, która wyraża białka fluorescencyjne wykrywające wapń w komórkach smakowych.
    2. Mysz jest skrępowana do znieczulenia. Mieszaninę 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny wstrzykuje się dootrzewnowo do myszy13.
  2. TRITC-dekstran (500 kDa) w buforze fosforanowym 2,5% w/V soli fizjologicznej jest podawany dożylnie myszy drogą zadoczodołową w celu obserwacji krążenia krwi podczas sesji obrazowania.
  3. Przymocuj narzędzie do mocowania głowy do czaszki myszy, aby zminimalizować artefakty ruchu.
    1. Głowę myszy spryskuje się 70% ETOH, podczas gdy mysz jest umieszczona w pozycji leżącej. Lekko unieś skórę głowy kleszczami i odetnij około 7 mm2 nożyczkami.
    2. Oczyść włosy wokół skóry głowy, usuń okostną pod skórą, nałóż natychmiastowy klej na czaszkę i przymocuj niestandardowy łącznik do głowy.
    3. Po stwardnieniu kleju błyskawicznego nałóż klej dentystyczny wokół utrwalacza głowy i oświetl niebieskim światłem, aby zestalić klej dentystyczny.
  4. Umieść język myszy na dolnej części μTongue.
    1. Przymocuj dolną wargę myszy do dolnej części μTongue za pomocą kleju błyskawicznego.
    2. Umieść mysz na tablicy (tablica do przygotowania myszy w Rysunek 1B) i umieść dolną jednostkę μTongue na słupkach (μTongue hold post w Rysunek 1B). Upewnij się, że otwory na krawędzi dolnej jednostki są wyrównane ze słupkiem.
    3. Dokręć mocowanie głowicy myszy do uchwytu mocownika głowicy na płycie. Następnie dostosuj odległość między głowicą myszy a urządzeniem. Obróć głowicę myszy płynnie o około 45° za pomocą uchwytu mocującego głowicę. Proces ten zapobiega fizycznemu kontaktowi nosa myszy z obiektywem mikroskopu.
    4. Delikatnie przeciągnij język myszy za pomocą plastikowej pęsety i przymocuj brzuszną stronę języka do górnej części dolnej części μTongue. Następnie przetrzyj powierzchnię języka myszy wilgotnym bawełnianym wacikiem.
    5. Namocz kawałek papieru w sztucznej ślinie i umieść go na odsłoniętej powierzchni języka myszy, aby utrzymać mokry stan.
    6. Umieść zakrzywione podkładki na słupkach, które przytrzymują oba końce dolnej części μTongue.
  5. Umieść preparat mysz na stoliku mikroskopowym. Umieść odsłonięty język myszy pod przybliżonym środkiem obszaru obiektywu mikroskopu. Pamiętaj, aby nie odbiegać od zakresu dynamiki sceny. Następnie dokręć deskę myszy na scenie za pomocą.
  6. Umieść poduszkę grzewczą pod korpusem myszy i utrzymuj temperaturę na poziomie 36.5 °C-37.5 °C. Monitoruj temperaturę korpusu myszy za pomocą czujnika temperatury i kontroluj temperaturę poduszki grzewczej za pomocą sygnału zwrotnego z czujnika temperatury.
  7. Przekręć cienki kawałek papieru i umieść go w ustach myszy, aby zapobiec przedostawaniu się płynu do tchawicy myszy.
  8. Usuń mokrą chusteczkę z języka myszy i umieść przygotowany μTongue na języku myszy. Umieść kanał mikroprzepływowy na języku i dostosuj jego położenie, aby obserwować powierzchnię języka przez okienko obrazowania.
  9. Zabezpiecz μTongue, delikatnie przykręcając oba końce z minimalnym naciskiem.

4. Akwizycja obrazowania

  1. Przed użyciem włącz laser dwufotonowy o długości fali 920 nm i mikroskop.
  2. Zamontuj obiektyw zanurzeniowy w wodzie (16x, NA 0.80 lub 25x, NA 1.1) na mikroskopie. Upuść wodę destylowaną na okienko obrazowania μTongue i zanurz obiektyw.
  3. W trybie aparatu włącz światło za pomocą lampy rtęciowej i oświetl powierzchnię języka.
  4. Dostosowując oś Z, przeszukaj sygnał autofluorescencyjny z brodawek nitkowatych, aby znaleźć przybliżoną płaszczyznę ogniskową. Następnie za pomocą pokrętła regulacji X i Y zlokalizuj kubek smakowy.
  5. Przełącz się w tryb wielofotonowy. Ustaw warunki akwizycji obrazu w następujący sposób: długość fali wzbudzenia: 920 nm; zestaw filtrów emisji: 447/60 nm, 525/50 nm i 607/70 nm; Dwukierunkowy tryb skanowania rastrowego, rozmiar ramki: 512 x 512.
  6. Dostosuj pozycje X i Y, aby umieścić kubek smakowy na środku okna obrazu.
  7. Przeszukaj naczynia krwionośne otaczające kubek smakowy na około dwóch trzecich wysokości kubka smakowego. Wizualizacja krążenia krwi za pomocą wstrzyknięcia TRITC-dekstranu (500 kDa) z kroku protokołu 3.2. Jeśli przepływ krwi jest zatkany, lekko poluzuj mocujące, aby umożliwić przepływ krwi.
  8. Dostosuj oś Z i znajdź płaszczyznę Z kubka smakowego, która zawiera odpowiednią liczbę komórek smakowych.
  9. Kontynuuj obrazowanie wapnia z częstotliwością 2-6 Hz przez 80 s. Zapewnij roztwór smakowy przez 20 s, włączając zbiornik układu fluidycznego po rozpoczęciu obrazowania. Po 20 sekundach stymulacji smaku przestaw zbiornik z powrotem na sztuczną ślinę.
  10. Po zakończeniu obrazowania sekwencyjnego należy odczekać około 3-4 minuty przed następną sesją obrazowania. Utrzymuj sztuczną ślinę płynącą do języka myszy, aby zmyć resztki smaku z poprzedniej sesji obrazowania. W zależności od projektu eksperymentu powtórz sesję w razie potrzeby.
  11. Po zakończeniu obrazowania wapnia in vivo należy poddać mysz eutanazji zgodnie z procedurą IACUC. Mysz pod narkozą jest poświęcana w komorze CO2.
    UWAGA: Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u stóp. Podczas sesji obrazowania należy konsekwentnie pobierać sztuczną ślinę z rezerwuarów. Jeśli w oknie obrazowania μTongue pojawią się pęcherzyki, usuń je, przepychając je przez wejście lub wyjście μTongue za pomocą silnego ciśnienia cieczy.

5. Analiza obrazu (Rysunek 3)

  1. Konwersja obrazu
    1. Otwórz surowe pliki obrazów za pomocą Fiji14 lub podobnego oprogramowania do analizy obrazu.
    2. Przekonwertuj plik obrazu na plik stosu RGB, aby użyć kodu NPL Bud Analyzer.
      1. Kolor obrazu > > podzielone kanały
      2. Obraz > Kolor > Scal kanały i wybierz obraz z kroku 5.2.1.
      3. Stos kolorów > obrazu > do RGB
  2. Rejestracja obrazu
    UWAGA: Użyj niestandardowego kodu do analizy danych. Zapoznaj się z https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
    1. Uruchom kod o nazwie Taste_GUI.m; pojawi się okno GUI o nazwie NPL Bud Analyzer. Kliknij przycisk Nowa analiza w prawym górnym rogu, a następnie załaduj przekonwertowany obraz z kroku 5.1. Ustaw liczbę klatek na sekundę nad załadowanym obrazem.
    2. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) nad załadowanym obrazem w celu rejestracji. Kliknij dwukrotnie wybrany ROI, a rozpocznie się automatycznie obliczona rejestracja.
  3. Uzyskać względne zmiany intensywności fluorescencji (ΔF/F)
    1. Wróć do okna NPL Bud Analyzer, aby automatycznie wyświetlić zarejestrowany obraz z kroku 5.2. Jeśli użytkownik ma już plik reg, kliknij przycisk Załaduj dane i wybierz plik _reg.tif.
    2. Kliknij przycisk OKRĄG lub WIELOKĄT i umieść ROI komórki smakowej na obrazie kubka smakowego.
    3. Przedstawia on surową intensywność fluorescencji i ślad wapnia (ΔF/F) wybranej komórki smakowej automatycznie pod obrazem kubka smakowego.
    4. Kliknij Zapisz ślad, aby wyświetlić ślad wapnia (ΔF/F) po prawej stronie graficznego interfejsu użytkownika, podczas gdy ROI jest wyświetlany nad obrazem kubka smakowego. Powtarzaj kroki 5.3.2-5.3.4, aż wybór ROI zostanie zakończony.
      UWAGA: Kliknij przycisk Usuń ślad, jeśli ROI jest błędnie wybrany, aby wyeliminować ostatnio wybrany zwrot z inwestycji i ślad wapnia.
    5. Po zakończeniu wyboru ROI wpisz nazwę pliku w prawym dolnym rogu i kliknij przycisk Zakończ, aby wyeksportować ślad wapnia ΔF / F w formacie .xls oraz obraz pąka tase z ROI w formacie .bmp.
  4. Analiza śladu wapnia
    1. Przeanalizować śladową zawartość wapnia otrzymaną w kroku 5.3. Weź pod uwagę, że komórki smakowe zareagowały na degustację, gdy intensywność fluorescencji wzrosła o więcej niż dwa odchylenia standardowe od linii bazowej po dostarczeniu degustacji4, a wartości p są mniejsze niż 0,01, przy użyciu sparowanych lub niesparowanych testów t10.
    2. Rozważ komórkę smakową jako komórkę reagującą, jeśli reaguje na określony smak więcej niż dwa razy na trzy próby(~60%)15.
    3. Reprezentatywne śladowe ilości wapnia należy uzyskać, uśredniając poszczególne śladowe ilości wapnia uzyskane w kroku 5.4.1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysz Pirt-GCaMP6f-tdTomato została użyta do uzyskania obrazu kubka smakowego. Powierzchnia języka myszy pokryta była autofluorescencyjnymi brodawkami nitkowatymi. Kubki smakowe są rzadko rozsiane po powierzchni języka (Ryc. 4A). Obrazy kubka smakowego i jego struktury uzyskano za pomocą trzech różnych detektorów filtrujących. Korzystając z zestawu filtrów 607/70 nm, uzyskano sygnał tdTomato z komórek smakowych do analizy ratiometrycznej (Rysunek 4B). Za pomocą zestawu filtrów 525/5...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniżej opisano szczegółowy protokół zastosowania μTongue do badania aktywności funkcjonalnej komórek smakowych in vivo. W tym protokole przeprowadza się funkcjonalne obrazowanie komórek smakowych przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. Oprócz wykorzystania myszy transgenicznych, alternatywną opcją może być elektroforetyczne ładowanie barwników wapniowych (lub barwników wykrywających napięcie) na komórki smakowe.

W tym eksperymencie użyto wszystkich roztworów smakowych o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują konkurencyjne interesy finansowe: J. Han i M. Choi są wynalazcami opatentowanej technologii μTongue opisanej w tym artykule, a system μTongue jest komercyjnie dostępny za pośrednictwem SciTech Korea.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (nr 2019M3A9E2061789) oraz przez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (nr 2019M3E5D2A01058329). Jesteśmy wdzięczni Eunsoo Kim i Eugene'owi Lee za ich pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
acesulfam KSigma Aldrich04054-25GSztuczna ślina / smaczny
roztwór chlorku wapniaSigma Aldrich21115-100MLSztuczna ślina / degustacja
kwasu cytrynowegoSigma AldrichC0759-100GSztuczna ślina / tastant
cykloheksymidSigma Aldrich01810-5GSztuczna ślina / degustacja
denatoniumSigma AldrichD5765-5GSztuczna ślina / degustacja
Klej dentystycznyDenkistP0000CJT-A2Preparat dla zwierząt
Obraz JNIHImageJAnaliza danych
IMPSigma Aldrich57510-5GSztuczna ślina / degustacja
Klej błyskawicznyLoctiteLoctite 4161, HenkelPreparat dla zwierząt
K2HPO4Sigma AldrichP3786-100GSztuczna ślina / tastant
KClSigma AldrichP9541-500GSztuczna ślina / degustacja
KetaminaYuhanKetamina 50Preparat dla zwierząt
KH2PO4Sigma AldrichP0662-25GSztuczna ślina / tastant
KHCO3Sigma Aldrich237205-500GSztuczna ślina / tastant
MATLABMathworkMATLABAnaliza danych
MgCl2Sigma AldrichM8266-100GSztuczna ślina / tastant
MPGSigma Aldrich49601-100GSztuczna ślina / tastant
Mutiphotonmikroskop Thorlab  Bergamo IIMikroskop
NaClSigma AldrichS3014-500GSztuczna ślina / tastant
NaHCO3Sigma Aldrich792519-500GSztuczna ślina / tastant
ObiektywNikonN16XLWD-PFMikroskop
OctaflowALA Scientific InstrumentsOCTAFLOW IISterowanie przepływem
PCLGLg15N54Miernik pH z kontrolą płynów
ThermoscientificORION STAR AZ11Sztuczna ślina / degustacja
Solanka buforowana fosforanamiSigma Aldrich806562Sztuczna ślina / tastant
chininaSigma AldrichQ1125-5GSztuczna ślina / degustacja
Pompa strzykawkowaHavard ApparatusPHD ULTRA 4400Kontrola
płynówTRITC-dekstranSigma Aldrich52194-1GPrzygotowanie dla zwierząt
Ultraszybki laserświatłowodowy TopticaFFultra920 01042Mikroskop
KsylazynaBayer KoreaRompunPreparat dla zwierząt

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
  2. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  3. Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
  4. Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
  5. Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
  6. Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
  7. Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
  8. Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
  9. Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
  10. Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
  11. Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
  12. Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
  13. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
  16. Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
  17. Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie mikrofluidycznemikroskopia intravitalnaobrazowanie kom rek smakowychobrazowanie wapniamikroskopia dwufotonowap ki smakowej zyk in vivoobrazowanie kr enia krwidostarczanie substancji smakowych

Powiązane artykuły