Montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze

Summary

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie systemu ogrzewania sterowanego temperaturą sprzężenia zwrotnego do promowania składania monowarstw lipidowych i tworzenia dwuwarstwowych warstw na granicy kropelek dla lipidów o podwyższonych temperaturach topnienia, oraz pomiary pojemności w celu scharakteryzowania zmian w membranie sterowanych temperaturą.

Abstract

Metoda dwuwarstwowej granicy kropel (DIB) do łączenia dwuwarstw lipidowych (tj. DIBs) pomiędzy pokrytymi lipidami kropelkami wodnymi w oleju oferuje kluczowe korzyści w porównaniu z innymi metodami: DIB są stabilne i często długotrwałe, obszar dwuwarstwowy może być odwracalnie dostrojony, asymetria listków jest łatwo kontrolowana za pomocą kompozycji kropel, a tkankopodobne sieci dwuwarstw można uzyskać poprzez przyleganie wielu kropel. Tworzenie DIB wymaga spontanicznego łączenia lipidów w monowarstwy lipidowe o dużej gęstości na powierzchni kropel. Chociaż zachodzi to łatwo w temperaturze pokojowej w przypadku zwykłych syntetycznych lipidów, wystarczająca monowarstwa lub stabilna dwuwarstwa nie tworzy się w podobnych warunkach dla lipidów o temperaturze topnienia powyżej temperatury pokojowej, w tym niektórych komórkowych ekstraktów lipidowych. To zachowanie prawdopodobnie ograniczyło skład – i być może biologiczne znaczenie – DIB w modelowych badaniach błonowych. Aby rozwiązać ten problem, przedstawiono protokół eksperymentalny mający na celu dokładne podgrzanie zbiornika oleju, w którym znajdują się kropelki DIB i scharakteryzowanie wpływu temperatury na błonę lipidową. W szczególności protokół ten pokazuje, jak używać przewodzącej ciepło aluminiowej oprawy i rezystancyjnych elementów grzejnych kontrolowanych przez pętlę sprzężenia zwrotnego w celu przepisania podwyższonych temperatur, co poprawia montaż monowarstw i tworzenie dwuwarstw dla szerszego zestawu typów lipidów. Charakterystyki strukturalne błony, jak również termotropowe przejścia fazowe lipidów tworzących dwuwarstwę, określa się ilościowo poprzez pomiar zmian pojemności elektrycznej DIB. Łącznie procedura ta może pomóc w ocenie zjawisk biofizycznych w błonach modelowych w różnych temperaturach, w tym w określeniu efektywnej temperatury topnienia (T_M) dla wieloskładnikowych mieszanin lipidowych. Zdolność ta pozwoli zatem na bliższą replikację naturalnych przemian fazowych w błonach modelowych i zachęci do tworzenia i wykorzystywania błon modelowych z szerszego zakresu składników błony, w tym tych, które lepiej oddają niejednorodność ich komórkowych odpowiedników.

Introduction

Błony komórkowe to selektywnie przepuszczalne bariery składające się z tysięcy typów lipidów¹, białek, węglowodanów i steroli, które otaczają i dzielą wszystkie żywe komórki. Zrozumienie, w jaki sposób ich skład wpływa na ich funkcje i ujawnienie, w jaki sposób naturalne i syntetyczne cząsteczki oddziałują z błonami komórkowymi, przylegają do nich, zakłócają je i przemieszczają, są zatem ważnymi obszarami badań o szerokich implikacjach w biologii, medycynie, chemii, fizyce i inżynierii materiałowej.

Te cele odkrywcze bezpośrednio korzystają ze sprawdzonych technik montażu, manipulacji i badania błon modelowych - w ty....

Protocol

1. Przygotowanie podgrzewanej oprawy

1. Zbierz 2 kawałki gumy izolacyjnej o grubości 1 mm przycięte odpowiednio do szerokości i długości 25 mm x 40 mm, 2 kawałki gumy o grubości 6 mm, które również mają wymiary 25 mm x 40 mm, przygotowany aluminiowy zespół mocowania podstawy i akrylowy zbiornik oleju, który pasuje do viewokienko aluminiowej podstawy (patrz rysunki S1, S2 i S3, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat produkcji i widok rozstrzelony złożenia). Najpierw przygotuj aluminiową oprawę, mocując do dolnej części oprawy szklane okienko nakrywkowe z klejem utwardzanym promieniami UV i przyklejając 1 rezystancyjny element grzejny do ....

Results

Rysunek 1 pokazuje, jak aluminiowe urządzenie i akrylowy zbiornik oleju są przygotowywane na stoliku mikroskopowym do tworzenia DIB. Kroki montażowe 1.2-1.4 służą do izolacji termicznej oprawy od sceny w celu bardziej wydajnego ogrzewania. Kroki 1.5-1.7 pokazują, jak prawidłowo przymocować termoparę do uchwytu i ustawić zbiornik oleju, a kroki 1.8-1.9 pokazują zalecane miejsca dozowania oleju do tych kawałków.

Rysunek 2 przedstawia ko.......

Discussion

Protokół opisany w niniejszym dokumencie zawiera instrukcje dotyczące montażu i obsługi eksperymentalnego systemu do kontroli temperatury oleju i kropelek używanych do tworzenia DIBs. Jest to szczególnie korzystne dla umożliwienia tworzenia DIB przy użyciu lipidów, które mają temperaturę topnienia powyżej RT. Ponadto, poprzez precyzyjną zmianę temperatury zbiornika oleju, można manipulować temperaturą dwuwarstwy w celu zbadania wpływu podwyższonych temperatur na różne właściwości i charakterystyki membrany, w tym pojemno.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm guma izolacyjna (x2)	Dowolna		Izoluje spód aluminiowej oprawy od stolika mikroskopu
25 mm x 40 mm x 6 mm guma izolacyjna (x2)	Dowolna		Chroni elementy grzejne przed uszkodzeniem przez klipsy stolika mikroskopu i izoluje górną część elementów grzejnych.
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy	Sigma Aldrich	M3183	Środek buforujący do roztworu lipidowego
Podłoże akrylowe	Wykonane we własnym zakresie	HTD_STG_2	~ 1000 uL akrylowej studni z zewnętrznym profilem poka-yoke do ustalenia orientacji
Aluminiowa oprawa	Wykonana we własnym HTD_STG_1		Oprawa podstawowa z szybem naftowym, w której znajduje się oprawa acylowa i zawiera dwie płaskie podkładki przylegające do szybu naftowego dla elementów grzejnych
Brain Total Lipid Extract	Avanti	131101C-100mg	25 mg/ml ekstrakt lipidowy ze świństwa
Kompaktowa obudowa DAQ (cDAQ)	Instrumenty krajowe	cDAQ-9174	Obudowa do przechowywania wielu typów czujników, modułów pomiarowych lub wyjściowych
System akwizycji danych (DAQ)	Urządzenia molekularne	Digidata 1440A	Przetwornik analogowo-cyfrowy o wysokiej rozdzielczości
Wzmacniacz/zasilacz o stałym wzmocnieniu	Hewlitt Packard	HP 6826A	Wzmacnia napięcie wyjściowe DC z modułu wyjściowego napięcia
Glass Cover Slip	Corning	CLS284525	Uszczelnia spód aluminiowej podstawy i pozwala na charakterystykę optyczną dwuwarstwowej
Element grzejny (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm Element grzejny kaptonowy z folii polimmidowej o wymiarach 25 mm x 25 mm z ograniczeniem mocy 5 watów.
Śruba M3 ze stali nierdzewnej	McMaster Carr	90116A150	Mocuje termoparę do aluminiowego uchwytu
Wzmacniacz zacisków krosowych	Urządzenia molekularne	AxoPatch 200B	Mierzy prąd i wyprowadza napięcie do stopnia głównego
Komputer osobisty	Dowolny		komputer z wieloma szybkimi portami USB i minimum 6 GB pamięci RAM
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	P3911	Elektrolit roztwór zdysocjowanych jonów
Moduł wejściowy temperatury	National Instruments	NI 9211	Umożliwia pomiary termopary z otwartym i zimnym złączem dla podwozia cDAQ
Termopara	Omega	JMTSS-020U-6	Termopara typu U o średnicy 0,02 cala i długości 6 cali
Klej utwardzany promieniami UV	Loctite	19739	Mocuje szklane szkiełko nakrywkowe do aluminiowego uchwytu podstawy
Moduł wyjściowy napięcia	National Instruments	NI 9263	Analogowy moduł wyjściowy napięcia do użytku z obudową cDAQ
Generator przebiegów	Agilent	33210A	Służy do wyprowadzania fali sinusoidalnej 10 mV 10 Hz