Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62362

⸱

19 kwietnia 2021

 , 
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie systemu ogrzewania sterowanego temperaturą sprzężenia zwrotnego do promowania składania monowarstw lipidowych i tworzenia dwuwarstwowych warstw na granicy kropelek dla lipidów o podwyższonych temperaturach topnienia, oraz pomiary pojemności w celu scharakteryzowania zmian w membranie sterowanych temperaturą.

Streszczenie

Metoda dwuwarstwowej granicy kropel (DIB) do łączenia dwuwarstw lipidowych (tj. DIBs) pomiędzy pokrytymi lipidami kropelkami wodnymi w oleju oferuje kluczowe korzyści w porównaniu z innymi metodami: DIB są stabilne i często długotrwałe, obszar dwuwarstwowy może być odwracalnie dostrojony, asymetria listków jest łatwo kontrolowana za pomocą kompozycji kropel, a tkankopodobne sieci dwuwarstw można uzyskać poprzez przyleganie wielu kropel. Tworzenie DIB wymaga spontanicznego łączenia lipidów w monowarstwy lipidowe o dużej gęstości na powierzchni kropel. Chociaż zachodzi to łatwo w temperaturze pokojowej w przypadku zwykłych syntetycznych lipidów, wystarczająca monowarstwa lub stabilna dwuwarstwa nie tworzy się w podobnych warunkach dla lipidów o temperaturze topnienia powyżej temperatury pokojowej, w tym niektórych komórkowych ekstraktów lipidowych. To zachowanie prawdopodobnie ograniczyło skład – i być może biologiczne znaczenie – DIB w modelowych badaniach błonowych. Aby rozwiązać ten problem, przedstawiono protokół eksperymentalny mający na celu dokładne podgrzanie zbiornika oleju, w którym znajdują się kropelki DIB i scharakteryzowanie wpływu temperatury na błonę lipidową. W szczególności protokół ten pokazuje, jak używać przewodzącej ciepło aluminiowej oprawy i rezystancyjnych elementów grzejnych kontrolowanych przez pętlę sprzężenia zwrotnego w celu przepisania podwyższonych temperatur, co poprawia montaż monowarstw i tworzenie dwuwarstw dla szerszego zestawu typów lipidów. Charakterystyki strukturalne błony, jak również termotropowe przejścia fazowe lipidów tworzących dwuwarstwę, określa się ilościowo poprzez pomiar zmian pojemności elektrycznej DIB. Łącznie procedura ta może pomóc w ocenie zjawisk biofizycznych w błonach modelowych w różnych temperaturach, w tym w określeniu efektywnej temperatury topnienia (TM) dla wieloskładnikowych mieszanin lipidowych. Zdolność ta pozwoli zatem na bliższą replikację naturalnych przemian fazowych w błonach modelowych i zachęci do tworzenia i wykorzystywania błon modelowych z szerszego zakresu składników błony, w tym tych, które lepiej oddają niejednorodność ich komórkowych odpowiedników.

Wprowadzenie

Błony komórkowe to selektywnie przepuszczalne bariery składające się z tysięcy typów lipidów1, białek, węglowodanów i steroli, które otaczają i dzielą wszystkie żywe komórki. Zrozumienie, w jaki sposób ich skład wpływa na ich funkcje i ujawnienie, w jaki sposób naturalne i syntetyczne cząsteczki oddziałują z błonami komórkowymi, przylegają do nich, zakłócają je i przemieszczają, są zatem ważnymi obszarami badań o szerokich implikacjach w biologii, medycynie, chemii, fizyce i inżynierii materiałowej.

Te cele odkrywcze bezpośrednio korzystają ze sprawdzonych technik montażu, manipulacji i badania błon modelowych - w tym dwuwarstw lipidowych złożonych z syntetycznych lub naturalnie występujących lipidów - które naśladują skład, strukturę i właściwości transportowe swoich komórkowych odpowiedników. W ostatnich latach dużą uwagę poświęcono metodzie dwuwarstwowej interfejsu kropelkowego (DIB)2,3,4 do budowy płaskiej dwuwarstwy lipidowej między pokrytymi lipidami kropelkami wody w oleju zyskała dużą uwagę5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, 22,23, i wykazał praktyczne zalety w porównaniu z innymi podejściami do tworzenia membran modelowych: metoda DIB jest prosta do wykonania, nie wymaga skomplikowanej produkcji ani przygotowania (np. "malowania") podłoża do podparcia membrany, konsekwentnie daje membrany o najwyższej trwałości, pozwala na standardowe pomiary elektrofizjologiczne i upraszcza tworzenie membran modelowych z asymetrycznością Ulotka Compositions3. Ponieważ dwuwarstwa tworzy się spontanicznie między kropelkami, a każda kropla może być dostosowana pod względem pozycji i składu, technika DIB wzbudziła również znaczne zainteresowanie w opracowywaniu systemów materiałowych inspirowanych komórkami, które opierają się na wykorzystaniu membran reagujących na bodźce18,24,25,26,27,28,29, zrównoważony podział na przedziały i transport14,30,31, and tissue-like materials17,23,32,33,34,35,36.

Większość opublikowanych eksperymentów na błonach modelowych, w tym tych z DIBami, została przeprowadzona w temperaturze pokojowej (RT, ~20-25 °C) i z użyciem kilku syntetycznych lipidów (np. DOPC, DPhPC, itp.). Praktyka ta ogranicza zakres pytań biofizycznych, które można badać w błonach modelowych, a na podstawie obserwacji może również ograniczać rodzaje lipidów, które można wykorzystać do składania DIBs. Na przykład syntetyczny lipid, taki jak DPPC, który ma temperaturę topnienia 42 °C, nie składa ciasno upakowanych monowarstw ani nie tworzy DIB w RT37. Tworzenie DIB w temperaturze pokojowej okazało się również trudne w przypadku ekstraktów naturalnych, takich jak ekstrakty ze ssaków (np. ekstrakt lipidowy z mózgu, BTLE)38 lub bakterii (np. Escherichia coli total lipid extract, ETLE)37, które zawierają wiele różnych rodzajów lipidów i pochodzą z komórek żyjących w podwyższonych temperaturach (37 °C). Umożliwienie badania różnych składów daje zatem możliwość zrozumienia procesów zachodzących za pośrednictwem błony w warunkach istotnych z biologicznego punktu widzenia.

Podniesienie temperatury oleju może służyć dwóm celom: zwiększa kinetykę montażu jednej warstwy i może spowodować, że lipidy ulegną przemianie topnienia, aby osiągnąć płynną fazę nieuporządkowaną. Obie konsekwencje pomagają w montażu monowarstwowym39, co jest warunkiem wstępnym dla DIB. Oprócz ogrzewania w celu tworzenia dwóch warstw, chłodzenie membrany po utworzeniu może być wykorzystane do identyfikacji przejść termotropowych w pojedynczych dwuwarstwach lipidowych38, w tym w naturalnych mieszaninach lipidowych (np. BTLE), które mogą być trudne do wykrycia za pomocą kalorymetrii. Oprócz oceny przemian termotropowych lipidów, precyzyjna zmiana temperatury DIB może być wykorzystana do badania wywołanych temperaturą zmian w strukturze błony38 i zbadania, w jaki sposób skład lipidowy i płynność wpływają na kinetykę gatunków aktywnych błonowo (np. peptydów tworzących pory i białek transbłonowych37), w tym błon modelowych ssaków i bakterii w fizjologicznie odpowiedniej temperaturze (37 °C).

Tutaj zostanie wyjaśniony opis, jak zmontować zmodyfikowany zbiornik oleju DIB i uruchomić regulator temperatury sprzężenia zwrotnego, aby umożliwić montaż jednowarstwowy i tworzenie dwuwarstw w temperaturach wyższych niż RT. W odróżnieniu od poprzedniego protokołu40, zawarto wyraźne szczegóły dotyczące integracji oprzyrządowania potrzebnego do pomiaru i kontroli temperatury równolegle z montażem i charakteryzacją DIB w zbiorniku oleju. Procedura ta umożliwi zatem użytkownikowi zastosowanie tej metody do tworzenia i badania DIB w różnych temperaturach w różnych kontekstach naukowych. Co więcej, reprezentatywne wyniki dostarczają konkretnych przykładów rodzajów mierzalnych zmian zarówno w strukturze błony, jak i transporcie jonów, które mogą wystąpić wraz ze zmianami temperatury. Techniki te są ważnymi dodatkami do wielu badań biofizycznych, które można zaprojektować i skutecznie przeprowadzić w DIBs, w tym badania kinetyki gatunków aktywnych błonowo w różnych składach błonowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie podgrzewanego uchwytu

  1. Przygotuj 2 kawałki izolacyjnej gumy o grubości 1 mm przycięte do wymiarów 25 mm x 40 mm (szerokość i długość), 2 kawałki gumy o grubości 6 mm o tych samych wymiarach (25 mm x 40 mm), przygotowany zespół podstawy z aluminium oraz akrylowy zbiornik na olej, który pasuje do okna obserwacyjnego podstawy aluminiowej (szczegóły wykonania oraz widok rozwichrzony zespołu znajdują się na Rysunkach S1, S2 i S3). W pierwszej kolejności przygotuj uchwyt aluminiowy, mocując do jego spodu szklaną lamellkę okna obserwacyjnego za pomocą kleju utwardzanego promieniami UV i przyklejając po jednym rezystancyjnym elemencie grzejnym do każdego z bocznych kołnierzy uchwytu o wymiarach 25 mm x 25 mm.
  2. Umieść cieńsze kawałki gumy na stole mikroskopu w taki sposób, aby dłuższa krawędź każdego z nich była styczna do otworu w stole, jak pokazano na (Rysunku 1).
  3. Ustaw uchwyt z podstawą aluminiową na podkładkach izolacyjnych tak, aby okno obserwacyjne uchwytu znajdowało się centralnie nad obiektywem. Prawidłowe wyrównanie jest niezbędne do obrazowania połączonych kropli.
  4. Połóż grubszy kawałek gumy na każdym rezystancyjnym elemencie grzejnym i przymocuj go za pomocą zacisku stołu mikroskopu. Kawałki te chronią elementy grzejne przed uszkodzeniem przez zaciski stołu i izolują przed przypadkowym zwarciem elektrycznym między elementami grzejnymi a podstawą aluminiową oraz stołem mikroskopu.
  5. Ostrożnie zegnij końcówkę pomiarową termopary, aby uzyskać kąt 90° w odległości ok. 4 mm od końca.
  6. Wsuń zgiętą końcówkę termopary w lewy dolny róg uchwytu aluminiowego i delikatnie zabezpiecz ją śrubą blokującą.
  7. Włóż akrylowy zbiornik do otworu w uchwycie aluminiowym. Należy to zrobić przed dodaniem oleju heksadekanowego do otworu (krok 1.8) uchwytu aluminiowego, aby zminimalizować ryzyko uwięzienia pęcherzyków powietrza między oknem obserwacyjnym a dnem akrylowego zbiornika, co mogłoby zasłonić widok kropli.
    UWAGA: Olej dodawany do komory obserwacyjnej uchwytu aluminiowego służy do dopasowania współczynników załamania światła akrylu i szkła w celu uzyskania wyraźniejszego obrazu kropli znajdujących się w akrylowym zbiorniku. Warto zatem zauważyć, że olej w otworze uchwytu aluminiowego nie ma kontaktu z zawartością akrylowego zbiornika, w związku z czym rygorystyczne czyszczenie uchwytu aluminiowego nie jest wymagane.
  8. Wlej ok. 1 000 µL oleju heksadekanowego do otworu w uchwycie aluminiowym (tj. pomiędzy ścianki akrylowego zbiornika a uchwyt aluminiowy), uważając, aby nie przelać cieczy. Poziom oleju w otworze uchwytu aluminiowego powinien być tak wysoki, jak to możliwe, aby zmaksymalizować powierzchnię wymiany ciepła, ale bez dopuszczenia do wylania się oleju poza krawędzie uchwytu na stół mikroskopu lub obiektyw.
  9. Wlej ok. 1 000 µL oleju heksadekanowego do akrylowego zbiornika, pamiętając, aby nie przelać cieczy.
    ​UWAGA: Akrylowy zbiornik powinien być zawsze dokładnie czyszczony pomiędzy eksperymentami. Należy zastosować procedurę polegającą na sukcesywnym płukaniu alkoholem etylowym i wodą dejonizowaną, a następnie suszeniu w naczyniu w eksykatorze przez ponad 12 h.

Układ eksperymentalny do spektroskopii; wzbudzenie optyczne; sekwencja kroków; przygotowanie urządzenia.
Rycina 1: Montaż stolika grzewczego. Zdjęcia przedstawiają montaż uchwytu przewodzącego ciepło i zbiornika z olejem do tworzenia DIB; numery pod każdym zdjęciem wskazują odpowiadający im krok protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Instrumentacja do jednoczesnej temperaturokontroli z pętlą sprzężenia zwrotnego i charakterystyki elektrycznej DIB

UWAGA: Niniejszy protokół integruje następujące urządzenia w celu umożliwienia sprzężenia zwrotnego w kontroli temperatury oraz jednoczesnej charakterystyki elektrycznej DIB: komputer osobisty (PC) z dwoma dostępnymi złączami uniwersalnej magistrali szeregowej (USB), wzmacniacz patch clamp połączony z dedykowanym systemem akwizycji danych (DAQ-1), generator funkcji, drugi programowalny moduł DAQ (DAQ-2) z modułami wyjścia napięcia i wejścia temperatury oraz zasilacz/wzmacniacz. Poniższe kroki opisują niezbędne połączenia tych urządzeń (zilustrowane na Ryc. 2a), które są wymagane do odseparowania pomiaru i kontroli temperatury od jednoczesnej elektrofizjologii DIB. W razie potrzeby można zastosować zamienniki w postaci równoważnych urządzeń.

  1. Ustanów połączenia wyjściowe i wejściowe dla modułów DAQ-2.
    1. Wybierz dwie pary zacisków śrubowych w module wyjścia napięcia dla różnicowych połączeń napięcia i przyłącz do nich przewody. Zaciski o numerach nieparzystych stanowią wspólne połączenia masy, a zaciski o numerach parzystych są wyjściami nieuziemionymi, jak pokazano na (Rysunku 2c). Podłącz każdą z tych dwóch par przewodów do oddzielnych adapterów zacisk śrubowy-BNC, a następnie podłącz każdy adapter do oddzielnego kabla BNC służącego do przesyłania sygnałów napięcia do innych instrumentów.
      UWAGA: W tej konfiguracji połączenia różnicowe w zaciskach 0 i 1 są przypisane do wyjścia sterowania temperaturą do wzmacniacza mocy, natomiast kolejna para połączeń w zaciskach 6 i 7 jest przeznaczona dla wyjścia napięcia przesyłanego do kropel za pomocą wzmacniacza patch clamp.
    2. Zgodnie z (Rysunkiem 2c), wybierz jeden zestaw zacisków termopary (np. zaciski 2 i 3 wyznaczone jako para TC1) w module wejściowym termopary i podłącz do nich przewody termopary.

Schemat eksperymentu z podgrzewanym stolikiem wraz z wzmacniaczem i układem termopar do akwizycji i analizy danych.
Rysunek 2: Połączenia okablowania systemu. Schemat urządzeń i okablowania niezbędnego do działania systemu przedstawiono w (a), natomiast szczegółowy widok połączeń DAQ-2 znajduje się w (b). Ilustracja w (c) przedstawia kropelki wodne na elektrodach pokrytych hydrożelem, zanurzone w oleju w celu formowania DIB. Dwie elektrody są podłączone odpowiednio do złącza uziemionego oraz nieuziemionego (V+) w jednostce headstage wzmacniacza patch clamp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Po wykonaniu połączeń elektrycznych z modułami DAQ-2, podłącz obudowę DAQ-2 do komputera PC za pomocą połączenia USB oraz do źródła zasilania elektrycznego. Następnie, przed użyciem oprogramowania komercyjnego, potwierdź poprawną instalację sterowników i oprogramowania.
  2. Skonfiguruj i podłącz wzmacniacz mocy pomiędzy DAQ-2 a rezystancyjnymi elementami grzejnymi.
    1. Skonfiguruj wzmacniacz do pracy w trybie wzmocnienia o stałym wzmocnieniu wynoszącym 10X.
    2. Używając adaptera wtyczki bananowej do BNC, podłącz kabel BNC wychodzący z zacisków 0 i 1 modułu wyjścia napięcia (Rysunek 2b>) do wejść wzmacniacza mocy.
    3. Używając dodatkowych adapterów BNC i okablowania, podłącz wyjścia wzmacniacza mocy do obu zestawów elementów grzejnych, które są połączone ze sobą i ze wzmacniaczem równolegle, aby zapewnić taki sam spadek napięcia na obu elementach podczas pracy.
  3. Ustanów niezbędne połączenia dla sprzętu elektrofizjologicznego.
    1. Podłącz kabel BNC wychodzący z zacisków 6 i 7 modułu wyjścia napięcia (Rysunek 2b>) do tylnych przełączanych złączy komendy zewnętrznej BNC (Rear Switched External Command BNC connectors) z tyłu wzmacniacza patch-clamp.
    2. Podłącz drugi kabel BNC pomiędzy wyjściem generatora przebiegów a przednim złączem komendy zewnętrznej (Front Switch External Command connection) z tyłu wzmacniacza patch-clamp.
      UWAGA: Te dwa połączenia stanowią alternatywne metody generowania przebiegów napięcia przyłożonych do elektrod w kropli za pośrednictwem wzmacniacza patch-clamp. Generator przebiegów jest szczególnie przydatny do generowania trójkątnych przebiegów napięcia stosowanych do pomiaru pojemności błony. Użytkownik może zdecydować, które z nich są niezbędne dla jego konkretnej aplikacji.
    3. Za pomocą trzeciego kabla BNC podłącz wyjście zmierzonego prądu znajdujące się na przednim panelu wzmacniacza patch-clamp do dostępnego analogowego złącza wejściowego BNC z przodu DAQ-1.
    4. Za pomocą czwartego kabla BNC podłącz wyjście zmierzonego napięcia błonowego (z tyłu wzmacniacza patch-clamp) do oddzielnego analogowego złącza wejściowego w DAQ-1. Umożliwia to digitalizację napięcia przyłożonego pomiędzy elektrodami.
    5. Gdy dwie elektrody w kropli zostaną przygotowane i zamocowane na mikromanipulatorach zgodnie z opisem w krokach 7-9 w ref.40, podłącz przewody elektrod do przedwzmacniacza (headstage) patch-clamp, który jest połączony kablem ze wzmacniaczem patch-clamp.
      UWAGA: Rolą przedwzmacniacza jest kontrolowanie napięcia pomiędzy elektrodami i pomiar wynikającego z tego prądu, który jest konwertowany na proporcjonalne napięcie wyjściowe przesyłane ze wzmacniacza patch-clamp do DAQ-1.
    6. Podłącz DAQ-1 do komputera PC za pomocą połączenia USB i podłącz odpowiednie kable zasilające zarówno do wzmacniacza patch-clamp, jak i do DAQ-1.
  4. Włącz całą aparaturę pomiarową.
    ​UWAGA: Być może najważniejszym szczegółem w tej konfiguracji jest zapewnienie, aby połączenia wyjściowe wzmacniacza mocy (mA-A) były elektrycznie odizolowane od jednostki przedwzmacniacza wzmacniacza patch-clamp, która wykorzystuje czuły obwód do pomiaru prądów rzędu pA-nA w DIB.

3. Sprzężenie zwrotne w kontroli temperatury dwuwarstw interfejsu kropel

UWAGA: Poniższe kroki dotyczące obsługi systemu sprzężenia zwrotnego kontroli temperatury opierają się na niestandardowym graficznym interfejsie użytkownika (GUI) stworzonym w celu wdrożenia proporcjonalno-całkującego (PI) sterowania temperaturą z pętlą sprzężenia zwrotnego40,41 (patrz Supplementary Coding Files). Zamiast tego można zastosować inne oprogramowanie i algorytmy sterowania. Kopia tego programu jest udostępniona czytelnikowi wraz z informacjami uzupełniającymi do artykułu, jednak użytkownik jest odpowiedzialny za jego konfigurację pod kątem własnego sprzętu i potrzeb.

  1. Uruchom oprogramowanie DAQ-2 na komputerze PC i otwórz plik programu sterowania temperaturą. Po otwarciu interfejsu GUI otwórz program ponownie, klikając ikonę folderu w lewym dolnym rogu GUI i wybierając program sterowania temperaturą (Rysunek 3).
  2. Wprowadź odpowiednie wartości liczbowe dla wzmocnienia regulacji proporcjonalnej (KP) oraz wzmocnienia regulacji całkującej (KI).
    UWAGA: Ustalono, że w tej konfiguracji dobrze sprawdzają się wartości KP wynosząca 0.598 oraz KI wynosząca 0.00445. Wartości te zostały wyznaczone iteracyjnie poprzez symulację z wykorzystaniem modelu systemu zawierającego parametry uzyskane z pomiarów odpowiedzi grzewczej w pętli otwartej (patrz Rysunek 4). Podczas grzania w pętli otwartej zadana moc grzewcza jest niezależna od mierzonej temperatury. W przeciwieństwie do tego, grzanie w pętli zamkniętej polega na ciągłym dostosowywaniu mocy dostarczanej do grzałek w sposób, który pomaga zbliżyć mierzoną temperaturę do temperatury zadanej. Jest to tutaj realizowane przy użyciu schematu sterowania PI.
  3. Aby przetestować schemat sterowania temperaturą, wprowadź żądaną temperaturę zadaną (powyżej temperatury pokojowej), a następnie włącz sprzężenie zwrotne sterowania temperaturą w interfejsie GUI. Obserwuj mierzony sygnał temperatury pod kontrolą sprzężenia zwrotnego (pętli zamkniętej), który jest wyświetlany w GUI przez następne kilka minut. Jeśli mierzona temperatura oleju znacznie przekroczy temperaturę zadaną, będzie reagować zbyt wolno na zmiany lub nie zbiegnie się do zadanej wartości, użytkownik będzie musiał dostosować wzmocnienia sterowania, aby uzyskać pożądane parametry pętli zamkniętej.
    UWAGA: Program definiuje limit nasycenia dla mocy (a tym samym napięcia) dostarczanej do rezystancyjnych elementów grzejnych. Na przykład dwa elementy opisane w niniejszej pracy pobierają moc do 5 W każdy. Połączenie ich równolegle oznacza, że całkowity pobór mocy nie powinien przekroczyć 10 W. Zaleca się, aby użytkownik wziął pod uwagę maksymalną ilość mocy, która powinna być dostarczona do urządzeń, i pamiętał, że limit ten może wpływać na szybkość reakcji systemu w pętli zamkniętej na żądane zmiany temperatury. Elementy grzejne o większej mocy umożliwiają szybsze nagrzewanie i osiągnięcie wyższych temperatur zadanych, ale wymagają większych prądów zasilających do grzania.
  4. Po nastrojeniu systemu do akceptowalnych parametrów pętli zamkniętej, wprowadź w GUI żądaną temperaturę oleju dla tworzenia DIB jako wartość zadaną.
    UWAGA: Na przykład temperatura zadana 60 °C przyniosła dobre wyniki w eksperymentach z liposomami BTLE w kropelkach wodnych37. W celu zapoznania się z protokołami wyjaśniającymi montaż DIB między kropelkami zawieszonymi na elektrodach drutowych oraz konfiguracją sprzętu elektrofizjologicznego z użyciem wzmacniacza patch clamp, DAQ-1 i oprogramowania do pomiarów elektrofizjologicznych, należy odwołać się do innych źródeł2,40. W szczególności można ściśle postępować zgodnie z protokołem Najema i wsp.40 aż do kroku 13. Po tym kroku stosuje się nieco inne podejście w celu skutecznego utworzenia monowarstwy i biwarstwy w przypadku stosowania lipidów, które wymagają podgrzania w celu promowania ich tworzenia.
  5. Zanurz końcówki elektrod srebrnych/chlorku srebra (Ag/AgCl) w oleju, aż niemal dotkną dna akrylowego zbiornika. Takie ustawienie końcówek elektrod jest kluczowe dla utrzymania kropelki na elektrodzie w podgrzanym oleju, ponieważ zaobserwowano, że prądy konwekcyjne w oleju mogą odrywać kropelki od elektrod pokrytych hydrożelem (Rysunek 2c).
  6. Nanieś pipetą kropelkę 250 nL wodnego roztworu lipidów zawierającego 2 mg/mL BTLE, 100 mM chlorku potasu (KCl) i 10 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) na każdą końcówkę elektrody i inkubuj je w podgrzanym oleju przez minimum 10 minut, aby promować tworzenie monowarstwy.
  7. Przykryj headstage i uchwyt stolika grzewczego uziemioną klatką Faradaya.
  8. Doprowadź kropelki do delikatnego kontaktu, powoli
    manipulując poziomym położeniem elektrod, aż użytkownik zauważy deformację kropelki w wyniku kontaktu lub zacznie ona wypierać drugą kropelkę, a następnie odczekaj kilka minut, aż rozpocznie się tworzenie biwarstwy. Jeśli po kilku minutach biwarstwa nie powstanie, można mocniej docisnąć kropelki do siebie, aby ułatwić jego formowanie. Powstanie cienkiej biwarstwy międzyfazowej można potwierdzić poprzez inspekcję wizualną (Rysunek 5a) lub mierząc wzrost amplitudy prądu pojemnościowego o kształcie prostokąta, indukowanego przez generator sygnałowy generujący trójkątne napięcie 10 mV, 10 Hz22. Pozwól biwarstwie równoważyć się przez minimum 10 minut, aby osiągnęła stabilny obszar międzyfazowy, zaraz po początkowym utworzeniu i przed późniejszą charakterystyką przy początkowej temperaturze zadanej.
    UWAGA: Rodzaj oleju może mieć znaczący wpływ na cieńczenie biwarstwy, grubość membrany i kąt kontaktu między kropelkami. Generalnie, im mniejsza cząsteczka oleju, tym łatwiej może ona pozostać w hydrofobowym rdzeniu biwarstwy zajmowanym przez łańcuchy acylowe lipidów. Retencja oleju zwiększa napięcia i grubość zarówno monowarstwy, jak i biwarstwy, oraz zmniejsza obszar i kąt kontaktu między kropelkami. Parametry te oznaczają słabszy stan adhezji. Większe, bardziej masywne cząsteczki wywierają przeciwny efekt. Na przykład skwalen jest cząsteczką bardziej masywną niż alkany, takie jak heksadekan, co pozwala mu być łatwo usuwanym spomiędzy monowarstw podczas cieńczenia biwarstwy. W związku z tym DIB tworzone w skwalenie są cieńsze, wykazują większe obszary i kąty kontaktu oraz wyższe swobodne energie tworzenia22,42 (miara adhezji kropelka-kropelka).

4. Charakterystyka zachowań zależnych od temperatury w DIBach

UWAGA: W modelowych błonach opartych na DIB można badać wiele procesów fizycznych, w tym wpływ zmian temperatury na strukturę i właściwości transportowe błony. Poniższe kroki należy wykonać po pomyślnym utworzeniu dwuwarstwy w pożądanej temperaturze.

  1. Zmierz nominalną pojemność błony podczas obniżania temperatury kąpieli olejowej z wartości nastawy umożliwiającej tworzenie dwuwarstwy, aby zidentyfikować termotropowe przejścia fazowe lipidów w błonie38.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres temperatury w interfejsie graficznym (GUI) i wyczyść wyświetlane dane. Zapewni to wystarczającą ilość miejsca w buforze dla kolejnych pomiarów.
    2. Używając generatora przebiegów podłączonego do wzmacniacza patch-clamp, przyłóż trójkątny przebieg napięcia (np. 10 mV, 10 Hz) na elektrody DIB i zarejestruj indukowaną odpowiedź prądową przez dwuwarstwę.
    3. Schładzaj dwuwarstwę, zmniejszając temperaturę nastawy w krokach co 5 °C i oczekując minimum 5 min w nowej temperaturze stanu ustalonego pomiędzy zmianami temperatury, aż do osiągnięcia pożądanej wartości. Alternatywnie można spróbować pasywnego chłodzenia dwuwarstwy poprzez wyłączenie systemu sterowania sprzężeniem zwrotnym. Należy jednak pamiętać, że eksperymenty z zastosowaniem pasywnego chłodzenia z poziomu 50-60 °C skutkowały wyższym tempem koalescencji.
    4. Po ochłodzeniu kąpieli olejowej i dwuwarstwy do pożądanej temperatury minimalnej ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy wykres temperatury w GUI i wyeksportuj dane temperatury w funkcji czasu do arkusza kalkulacyjnego. Zatrzymaj pomiar prądu.
    5. Na podstawie zmierzonego prądu oblicz nominalną pojemność dla odpowiedzi prądowej fali prostokątnej w funkcji czasu podczas okresu chłodzenia.
    6. Przedstaw nominalną pojemność (C) w funkcji temperatury (T), aby zaobserwować zmiany pojemności błony. Zlokalizuj niemonotoniczne zmiany C względem T, aby zidentyfikować TM.
      UWAGA: Nominalną pojemność można obliczyć z amplitudy prądu fali prostokątnej43 (|I|) korzystając z zależności |I| = C dv/dt, gdzie dv/dt jest równe czterokrotności iloczynu amplitudy napięcia (|V|) i częstotliwości (f) przyłożonego napięcia trójkątnego. Z tych równań wynika, że C = |I|/(4|V|f).
  2. Podobnie określ quasi-statyczną pojemność właściwą (Cm) dwuwarstwy w stałych temperaturach, sukcesywnie zwiększając temperaturę kąpieli olejowej oraz powierzchnię dwuwarstwy.
    1. Zmień temperaturę nastawy w krokach co 10 °C za pomocą GUI i pozwól systemowi wyrównać się do nowej temperatury.
      1. Wykonaj krok 4.1.2, aby rozpocząć pomiar prądu pojemnościowego i rejestrację.
      2. Zmień powierzchnię dwuwarstwy, ostrożnie regulując pozycje elektrod za pomocą mikromanipulatorów (tj. rozsunięcie elektrod zmniejsza powierzchnię dwuwarstwy). Poczekaj, aż amplituda prądu fali prostokątnej osiągnie stan ustalony, i wykonaj zdjęcia DIB, aby umożliwić obliczenie powierzchni błony w funkcji czasu, używając kamery zamontowanej na mikroskopie do obrazowania dwuwarstwy widzianej z otworu stolika mikroskopowego. Jednocześnie dodaj znacznik cyfrowy w oprogramowaniu do zapisu prądu, aby zaznaczyć odpowiadający punkt czasowy dla wykonanego zdjęcia.
        ​UWAGA: Mikromanipulatory pozwalają na precyzyjną kontrolę elektrod i tym samym łagodny kontakt między kroplami. Gwałtowna manipulacja kroplami może doprowadzić do niepowodzenia eksperymentu wskutek koalescencji kropli lub spowodować odpadnięcie kropli z elektrody. Jak omówiono w innym miejscu22, powierzchnia dwuwarstwy jest obliczana z długości kontaktu między kroplami, które w obrazie z widoku od dołu wyglądają jak nachodzące na siebie koła. Pozycje i wymiary kropli oraz długość linii kontaktu można obliczyć za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów lub innych narzędzi programistycznych do celów naukowych.
      3. Powtórz krok 4.2.1.2 minimum 4 razy, aby uzyskać łącznie 5 obrazów DIB i obszary stanu ustalonego prądu dwuwarstwy.
    2. Powtórz krok 4.2.1 dla każdej pożądanej temperatury.
    3. W zaznaczonych punktach czasowych odpowiadających powierzchniom dwuwarstwy w stanie ustalonym dla uzyskanych obrazów przeanalizuj zapisy prądu i obrazy DIB, aby wyodrębnić dane C i A dla każdej temperatury.
    4. Przedstaw dane C w funkcji A dla każdej temperatury i oblicz nachylenie regresji pierwszego rzędu, która reprezentuje Cm dwuwarstwy w każdej temperaturze22.
    5. Przedstaw wartości Cm uzyskane w kroku 4.2.4 w funkcji T.
    6. Przeanalizuj dane Cm względem T pod kątem niemonotonicznych zmian, aby zidentyfikować temperatury topnienia, TM.
  3. Oceń dynamikę tworzenia napięciowo-zależnych kanałów jonowych poprzez wygenerowanie skokowego wejściowego napięcia prądu stałego (dc) przez dwuwarstwę.
    1. Ustaw Initial Voltage (napięcie początkowe) na pożądaną wartość skoku w mV (np. 100 mV).
    2. Ustaw Final Voltage (napięcie końcowe) oraz Step Size (wielkość skoku) na wartość wyższą niż pożądany skok (np. napięcie końcowe 110 mV i wielkość skoku 110 mV).
    3. Ustaw pożądany czas trwania wejścia skokowego w sekundach (np. 90 s).
    4. Wybierz pożądaną polaryzację dla wejścia skokowego (np. dodatnią).
    5. Przełącz wzmacniacz patch-clamp tak, aby przesyłał do głowicy napięcie sterujące pochodzące z GUI/modułu wyjściowego napięcia.
    6. Rozpocznij rejestrację prądu.
    7. Włącz napięcie i zarejestruj indukowaną odpowiedź prądową, która powinna wykazywać odpowiedź w kształcie litery S przy krytycznym napięciu (np. ~70 mV dla 1 µg/mL Mz w 2 mg/mL BTLE).
  4. Osobno, w pożądanych temperaturach, można uzyskać dynamiczne zależności prądowo-napięciowe dla błony, aby ujawnić zależności zależne od napięcia, takie jak zachowanie kanałów jonowych.
    1. Przełącz wzmacniacz patch-clamp tak, aby przesyłał do głowicy napięcie sterujące pochodzące z generatora przebiegów i rozpocznij rejestrację prądu.
    2. Z generatora przebiegów wygeneruj ciągły przebieg sinusoidalny o pożądanej amplitudzie, przesunięciu i częstotliwości.
    3. Zarejestruj indukowaną odpowiedź prądową przez jeden lub wiele cykli.
    4. Powtórz w razie potrzeby dla różnych amplitud i częstotliwości fal sinusoidalnych oraz różnych temperatur.

Panel sterowania LabView z wykresem przebiegu dla analizy skoku DC; zawiera ustawienia kontroli temperatury.
Rycina 3: Interfejs graficzny użytkownika (GUI) do kontroli temperatury. Na tej rycinie wyróżniono i opisano krytyczne kroki niezbędne do wykorzystania GUI programu w celu sterowania temperaturą kąpieli olejowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia sposób przygotowania aluminiowego uchwytu i akrylowego zbiornika na olej na stoliku mikroskopu w celu formowania DIB. Kroki montażowe 1.2-1.4 służą do izolacji termicznej uchwytu od stolika, co pozwala na bardziej efektywne ogrzewanie. Kroki 1.5-1.7 pokazują, jak prawidłowo przymocować termoparę do uchwytu i ustawić zbiornik na olej, a kroki 1.8-1.9 wskazują zalecane miejsca aplikacji oleju do tych elementów.

Rysunek 2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany w niniejszym dokumencie protokół zawiera instrukcje dotyczące montażu i obsługi układu eksperymentalnego służącego do kontrolowania temperatury oleju oraz kropelek wykorzystywanych do tworzenia DIB. Jest on szczególnie przydatny w przypadku formowania DIB przy użyciu lipidów o temperaturach topnienia powyżej temperatury pokojowej (RT). Ponadto, poprzez precyzyjną zmianę temperatury zbiornika z olejem, można manipulować temperaturą dwuwarstwy, aby zbadać wpływ podwyższonych temperatur na różne właściwości i charak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Wsparcie finansowe zostało zapewnione przez National Science Foundation Grant CBET-1752197 oraz Grant Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych FA9550-19-1-0213.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
25 mm x 40 mm x 1 mm guma izolacyjna (x2)DowolnaIzoluje spód aluminiowej oprawy od stolika mikroskopu
25 mm x 40 mm x 6 mm guma izolacyjna (x2)DowolnaChroni elementy grzejne przed uszkodzeniem przez klipsy stolika mikroskopu i izoluje górną część elementów grzejnych.
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy Sigma AldrichM3183Środek buforujący do roztworu lipidowego
Podłoże akryloweWykonane we własnym zakresieHTD_STG_2~ 1000 uL akrylowej studni z zewnętrznym profilem poka-yoke do ustalenia orientacji
Aluminiowa oprawaWykonana we własnym HTD_STG_1Oprawa podstawowa z szybem naftowym, w której znajduje się oprawa acylowa i zawiera dwie płaskie podkładki przylegające do szybu naftowego dla elementów grzejnych 
Brain Total Lipid ExtractAvanti131101C-100mg25 mg/ml ekstrakt lipidowy ze świństwa 
Kompaktowa obudowa DAQ (cDAQ)Instrumenty krajowe cDAQ-9174 Obudowa do przechowywania wielu typów czujników, modułów pomiarowych lub wyjściowych
System akwizycji danych (DAQ)Urządzenia molekularne Digidata 1440A Przetwornik analogowo-cyfrowy o wysokiej rozdzielczości
Wzmacniacz/zasilacz o stałym wzmocnieniuHewlitt PackardHP 6826AWzmacnia napięcie wyjściowe DC z modułu wyjściowego napięcia
Glass Cover SlipCorningCLS284525Uszczelnia spód aluminiowej podstawy i pozwala na charakterystykę optyczną dwuwarstwowej
Element grzejny (x2)OmegaKHLV-101/525 mm Element grzejny kaptonowy z folii polimmidowej o wymiarach 25 mm x 25 mm z ograniczeniem mocy 5 watów.
Śruba M3 ze stali nierdzewnejMcMaster Carr90116A150Mocuje termoparę do aluminiowego uchwytu
Wzmacniacz zacisków krosowychUrządzenia molekularne AxoPatch 200B Mierzy prąd i wyprowadza napięcie do stopnia głównego
Komputer osobistyDowolnykomputer z wieloma szybkimi portami USB i minimum 6 GB pamięci RAM
Chlorek potasuSigma AldrichP3911Elektrolit roztwór zdysocjowanych jonów
Moduł wejściowy temperaturyNational Instruments NI 9211Umożliwia pomiary termopary z otwartym i zimnym złączem dla podwozia cDAQ
TermoparaOmegaJMTSS-020U-6 Termopara typu U o średnicy 0,02 cala i długości 6 cali
Klej utwardzany promieniami UVLoctite19739Mocuje szklane szkiełko nakrywkowe do aluminiowego uchwytu podstawy
Moduł wyjściowy napięciaNational Instruments NI 9263Analogowy moduł wyjściowy napięcia do użytku z obudową cDAQ
Generator przebiegówAgilent33210A Służy do wyprowadzania fali sinusoidalnej 10 mV 10 Hz

Bibliografia

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755(2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726(2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008(2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585(2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142(2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998(2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Monta dwuwarstwy lipidowejkontrola temperaturypojemno b onywzmacniacz patch clamptermotropowe przej cie fazowedostrajanie powierzchni dwuwarstwyformowanie kana w jonowychcharakterystyka modelowej b onytemperatura topnienia lipid w
Montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.