Method Article

Montaż i charakterystyka dwuwarstwy z powierzchnią kropelkową w kontrolowanej temperaturze

DOI:

10.3791/62362

⸱

April 19th, 2021

 , 
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie systemu ogrzewania sterowanego temperaturą sprzężenia zwrotnego do promowania składania monowarstw lipidowych i tworzenia dwuwarstwowych warstw na granicy kropelek dla lipidów o podwyższonych temperaturach topnienia, oraz pomiary pojemności w celu scharakteryzowania zmian w membranie sterowanych temperaturą.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda dwuwarstwowej granicy kropel (DIB) do łączenia dwuwarstw lipidowych (tj. DIBs) pomiędzy pokrytymi lipidami kropelkami wodnymi w oleju oferuje kluczowe korzyści w porównaniu z innymi metodami: DIB są stabilne i często długotrwałe, obszar dwuwarstwowy może być odwracalnie dostrojony, asymetria listków jest łatwo kontrolowana za pomocą kompozycji kropel, a tkankopodobne sieci dwuwarstw można uzyskać poprzez przyleganie wielu kropel. Tworzenie DIB wymaga spontanicznego łączenia lipidów w monowarstwy lipidowe o dużej gęstości na powierzchni kropel. Chociaż zachodzi to łatwo w temperaturze pokojowej w przypadku zwykłych syntetycznych lipidów, wystarczająca monowarstwa lub stabilna dwuwarstwa nie tworzy się w podobnych warunkach dla lipidów o temperaturze topnienia powyżej temperatury pokojowej, w tym niektórych komórkowych ekstraktów lipidowych. To zachowanie prawdopodobnie ograniczyło skład – i być może biologiczne znaczenie – DIB w modelowych badaniach błonowych. Aby rozwiązać ten problem, przedstawiono protokół eksperymentalny mający na celu dokładne podgrzanie zbiornika oleju, w którym znajdują się kropelki DIB i scharakteryzowanie wpływu temperatury na błonę lipidową. W szczególności protokół ten pokazuje, jak używać przewodzącej ciepło aluminiowej oprawy i rezystancyjnych elementów grzejnych kontrolowanych przez pętlę sprzężenia zwrotnego w celu przepisania podwyższonych temperatur, co poprawia montaż monowarstw i tworzenie dwuwarstw dla szerszego zestawu typów lipidów. Charakterystyki strukturalne błony, jak również termotropowe przejścia fazowe lipidów tworzących dwuwarstwę, określa się ilościowo poprzez pomiar zmian pojemności elektrycznej DIB. Łącznie procedura ta może pomóc w ocenie zjawisk biofizycznych w błonach modelowych w różnych temperaturach, w tym w określeniu efektywnej temperatury topnienia (TM) dla wieloskładnikowych mieszanin lipidowych. Zdolność ta pozwoli zatem na bliższą replikację naturalnych przemian fazowych w błonach modelowych i zachęci do tworzenia i wykorzystywania błon modelowych z szerszego zakresu składników błony, w tym tych, które lepiej oddają niejednorodność ich komórkowych odpowiedników.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błony komórkowe to selektywnie przepuszczalne bariery składające się z tysięcy typów lipidów1, białek, węglowodanów i steroli, które otaczają i dzielą wszystkie żywe komórki. Zrozumienie, w jaki sposób ich skład wpływa na ich funkcje i ujawnienie, w jaki sposób naturalne i syntetyczne cząsteczki oddziałują z błonami komórkowymi, przylegają do nich, zakłócają je i przemieszczają, są zatem ważnymi obszarami badań o szerokich implikacjach w biologii, medycynie, chemii, fizyce i inżynierii materiałowej.

Te cele odkrywcze bezpośrednio korzystają ze sprawdzonych technik montażu, manipulacji i badania błon modelowych - w tym dwuwarstw lipidowych złożonych z syntetycznych lub naturalnie występujących lipidów - które naśladują skład, strukturę i właściwości transportowe swoich komórkowych odpowiedników. W ostatnich latach dużą uwagę poświęcono metodzie dwuwarstwowej interfejsu kropelkowego (DIB)2,3,4 do budowy płaskiej dwuwarstwy lipidowej między pokrytymi lipidami kropelkami wody w oleju zyskała dużą uwagę5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, 22,23, i wykazał praktyczne zalety w porównaniu z innymi podejściami do tworzenia membran modelowych: metoda DIB jest prosta do wykonania, nie wymaga skomplikowanej produkcji ani przygotowania (np. "malowania") podłoża do podparcia membrany, konsekwentnie daje membrany o najwyższej trwałości, pozwala na standardowe pomiary elektrofizjologiczne i upraszcza tworzenie membran modelowych z asymetrycznością Ulotka Compositions3. Ponieważ dwuwarstwa tworzy się spontanicznie między kropelkami, a każda kropla może być dostosowana pod względem pozycji i składu, technika DIB wzbudziła również znaczne zainteresowanie w opracowywaniu systemów materiałowych inspirowanych komórkami, które opierają się na wykorzystaniu membran reagujących na bodźce18,24,25,26,27,28,29, zrównoważony podział na przedziały i transport14,30,31, and tissue-like materials17,23,32,33,34,35,36.

Większość opublikowanych eksperymentów na błonach modelowych, w tym tych z DIBami, została przeprowadzona w temperaturze pokojowej (RT, ~20-25 °C) i z użyciem kilku syntetycznych lipidów (np. DOPC, DPhPC, itp.). Praktyka ta ogranicza zakres pytań biofizycznych, które można badać w błonach modelowych, a na podstawie obserwacji może również ograniczać rodzaje lipidów, które można wykorzystać do składania DIBs. Na przykład syntetyczny lipid, taki jak DPPC, który ma temperaturę topnienia 42 °C, nie składa ciasno upakowanych monowarstw ani nie tworzy DIB w RT37. Tworzenie DIB w temperaturze pokojowej okazało się również trudne w przypadku ekstraktów naturalnych, takich jak ekstrakty ze ssaków (np. ekstrakt lipidowy z mózgu, BTLE)38 lub bakterii (np. Escherichia coli total lipid extract, ETLE)37, które zawierają wiele różnych rodzajów lipidów i pochodzą z komórek żyjących w podwyższonych temperaturach (37 °C). Umożliwienie badania różnych składów daje zatem możliwość zrozumienia procesów zachodzących za pośrednictwem błony w warunkach istotnych z biologicznego punktu widzenia.

Podniesienie temperatury oleju może służyć dwóm celom: zwiększa kinetykę montażu jednej warstwy i może spowodować, że lipidy ulegną przemianie topnienia, aby osiągnąć płynną fazę nieuporządkowaną. Obie konsekwencje pomagają w montażu monowarstwowym39, co jest warunkiem wstępnym dla DIB. Oprócz ogrzewania w celu tworzenia dwóch warstw, chłodzenie membrany po utworzeniu może być wykorzystane do identyfikacji przejść termotropowych w pojedynczych dwuwarstwach lipidowych38, w tym w naturalnych mieszaninach lipidowych (np. BTLE), które mogą być trudne do wykrycia za pomocą kalorymetrii. Oprócz oceny przemian termotropowych lipidów, precyzyjna zmiana temperatury DIB może być wykorzystana do badania wywołanych temperaturą zmian w strukturze błony38 i zbadania, w jaki sposób skład lipidowy i płynność wpływają na kinetykę gatunków aktywnych błonowo (np. peptydów tworzących pory i białek transbłonowych37), w tym błon modelowych ssaków i bakterii w fizjologicznie odpowiedniej temperaturze (37 °C).

Tutaj zostanie wyjaśniony opis, jak zmontować zmodyfikowany zbiornik oleju DIB i uruchomić regulator temperatury sprzężenia zwrotnego, aby umożliwić montaż jednowarstwowy i tworzenie dwuwarstw w temperaturach wyższych niż RT. W odróżnieniu od poprzedniego protokołu40, zawarto wyraźne szczegóły dotyczące integracji oprzyrządowania potrzebnego do pomiaru i kontroli temperatury równolegle z montażem i charakteryzacją DIB w zbiorniku oleju. Procedura ta umożliwi zatem użytkownikowi zastosowanie tej metody do tworzenia i badania DIB w różnych temperaturach w różnych kontekstach naukowych. Co więcej, reprezentatywne wyniki dostarczają konkretnych przykładów rodzajów mierzalnych zmian zarówno w strukturze błony, jak i transporcie jonów, które mogą wystąpić wraz ze zmianami temperatury. Techniki te są ważnymi dodatkami do wielu badań biofizycznych, które można zaprojektować i skutecznie przeprowadzić w DIBs, w tym badania kinetyki gatunków aktywnych błonowo w różnych składach błonowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podgrzewanej oprawy

  1. Zbierz 2 kawałki gumy izolacyjnej o grubości 1 mm przycięte odpowiednio do szerokości i długości 25 mm x 40 mm, 2 kawałki gumy o grubości 6 mm, które również mają wymiary 25 mm x 40 mm, przygotowany aluminiowy zespół mocowania podstawy i akrylowy zbiornik oleju, który pasuje do viewokienko aluminiowej podstawy (patrz rysunki S1, S2 i S3, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat produkcji i widok rozstrzelony złożenia). Najpierw przygotuj aluminiową oprawę, mocując do dolnej części oprawy szklane okienko nakrywkowe z klejem utwardzanym promieniami UV i przyklejając 1 rezystancyjny element grzejny do górnej części każdego bocznego kołnierza oprawy o wymiarach 25 mm x 25 mm.
  2. Umieść cieńsze kawałki gumy na stoliku mikroskopu tak, aby długa krawędź każdego elementu była styczna do otworu stolika, jak pokazano na (Rysunek 1).
  3. Umieść oprawę z aluminiową podstawą na podkładkach izolacyjnych tak, aby viewokienko oprawy wyśrodkowane nad soczewką obiektywu. Do obrazowania połączonych kropel wymagane jest odpowiednie wyrównanie.
  4. Umieść grubszy kawałek gumy na każdym rezystancyjnym elemencie grzejnym i użyj klipsa do stolika mikroskopowego, aby przytrzymać go na miejscu. Elementy te chronią elementy grzejne przed uszkodzeniami spowodowanymi przez klipsy stolika i izolują przed przypadkowym zwarciem elektrycznym między elementami grzejnymi a zarówno aluminiowym uchwytem, jak i stolikiem mikroskopowym.
  5. Ostrożnie zegnij końcówkę pomiarową termopary, aby uzyskać kąt 90° w odległości ~4 mm od końca.
  6. Włóż wygiętą końcówkę termopary do lewego dolnego rogu aluminiowego uchwytu i delikatnie zabezpiecz ją śrubą blokującą.
  7. Umieść akrylowy zbiornik w studzience aluminiowej oprawy. Odbywa się to przed dodaniem oleju heksadekanowego do studzienki (krok 1.8) aluminiowego uchwytu, aby zminimalizować ryzyko uwięzienia pęcherzyków powietrza między okienkiem podglądu a dnem akrylowego zbiornika, co może zasłaniać widok kropel.
    UWAGA: Olej dodany do viewkomora aluminiowej oprawy służy do dopasowania współczynników załamania światła akrylu i szkła w celu wyraźniejszego obrazowania kropelek zawartych w akrylowym zbiorniku. Dlatego warto zauważyć, że olej w studni aluminiowej oprawy nie styka się z zawartością akrylowego zbiornika i nie jest wymagane rygorystyczne czyszczenie aluminiowego uchwytu.
  8. Dozuj ~ 1,000 μl oleju heksadekanowego do studzienki aluminiowej oprawy (tj. między ściankami akrylowego zbiornika a aluminiowego uchwytu), uważając, aby nie przepełnić. Poziom oleju w studni aluminiowej oprawy powinien być tak wysoki, jak to możliwe, aby zmaksymalizować powierzchnię wymiany ciepła, jednocześnie nie dopuszczając do rozlania się oleju przez krawędzie oprawy na stolik mikroskopu lub soczewkę obiektywu.
  9. Dozuj ~1,000 μL oleju heksadekanowego do akrylowego zbiornika, pamiętając, aby nie przepełnić.
    UWAGA: Akrylowy zbiornik powinien być zawsze dokładnie czyszczony między eksperymentami. Użytkownik musi zastosować reżim składający się z kolejnych płukań alkoholem etylowym i wodą dejonizowaną, a następnie suszenia w misce eksykatora przez ponad 12 godzin.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Podgrzewany montaż sceny. Zdjęcia pokazują montaż oprawy przewodzącej ciepło i zbiornika oleju do tworzenia DIP; Liczby pod każdym obrazem identyfikują odpowiedni krok protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Oprzyrządowanie do jednoczesnej kontroli temperatury sprzężenia zwrotnego i charakterystyki elektrycznej DIB

UWAGA: Ten protokół integruje następujące instrumenty umożliwiające kontrolę temperatury ze sprzężeniem zwrotnym i jednoczesną charakterystykę elektryczną DIB: komputer osobisty (PC) z dwoma dostępnymi połączeniami uniwersalnej magistrali szeregowej (USB), wzmacniacz patch clamp sparowany z dedykowanym systemem akwizycji danych (DAQ-1), generator przebiegów, drugi programowalny DAQ (DAQ-2) z wyjściem napięciowym i modułami wejściowymi temperatury, oraz zasilacz/wzmacniacz. Poniższe kroki opisują niezbędne połączenia tych przyrządów (jak pokazano na Rysunek 2a) potrzebne do odizolowania pomiaru i kontroli temperatury od jednoczesnej elektrofizjologii DIB. W razie potrzeby można dokonać substytucji równoważnych instrumentów.

  1. Ustanów połączenia wyjściowe i wejściowe z modułami DAQ-2.
    1. Wybierz dwie pary zacisków śrubowych na module wyjściowym napięcia dla różnicy napięć połączenia i podłącz przewody do tych miejsc. Zaciski o numerach nieparzystych są typowymi połączeniami uziemiającymi, a zaciski o numerach parzystych są wyjściami bez uziemienia, jak pokazano na ( Rysunek 2c). Podłącz każdą z tych dwóch par przewodów do oddzielnych adapterów BNC z zaciskiem śrubowym, a następnie podłącz każdy adapter do oddzielnego BNC używanego do kierowania sygnałów napięcia do innych instrumentów.
      UWAGA: W tej konfiguracji połączenia różnicowe na zaciskach 0 i 1 są przypisane do wyjścia kontroli temperatury do wzmacniacza mocy, podczas gdy inna para połączeń na zaciskach 6 i 7 jest przeznaczona do wyjścia napięciowego, które ma być wysyłane do kropel za pośrednictwem wzmacniacza zaciskowego patch clamp.
    2. Odnosząc się do (Rysunek 2c), wybierz jeden zestaw zacisków termopary (np. zaciski 2 i 3 są oznaczone jako para TC1) w module wejściowym termopary i podłącz do niego przewody termopary.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Połączenia przewodów systemowych. Schemat urządzeń i okablowania wymaganego dla systemu jest pokazany w (a), natomiast szczegółowe spojrzenie na połączenia DAQ-2 znajduje się w (b). Ilustracja w (c) pokazuje kropelki wody na elektrodach pokrytych hydrożelem zanurzonych w oleju w celu tworzenia DIP. Dwie elektrody są podłączone odpowiednio do uziemionych i nieuziemionych (V+) połączeń na stacji czołowej wzmacniacza patch clamp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Po wykonaniu połączeń elektrycznych z modułami DAQ-2 podłącz obudowę DAQ-2 do komputera za pomocą połączenia USB i podłącz do źródła zasilania elektrycznego. Następnie potwierdź pomyślną instalację sterownika i oprogramowania przed użyciem z oprogramowaniem komercyjnym.
  2. Skonfiguruj i podłącz wzmacniacz mocy między DAQ-2 a rezystancyjnymi elementami grzejnymi.
    1. Skonfiguruj wzmacniacz do pracy w trybie wzmocnienia o stałym wzmocnieniu ze wzmocnieniem 10X.
    2. Za pomocą adaptera bananowego jack-BNC podłącz BNC wychodzący z zacisków 0 i 1 modułu wyjściowego napięcia (Rysunek 2b) do złączy wejściowych we wzmacniaczu mocy.
    3. Za pomocą dodatkowych adapterów BNC i okablowania podłącz zaciski wyjściowe wzmacniacza mocy do obu zestawów elementów grzejnych, które są połączone równolegle do siebie i amplifier, aby zapewnić, że oba elementy utrzymują ten sam spadek napięcia podczas użytkowania.
  3. Ustanowić niezbędne połączenia dla sprzętu do elektrofizjologii.
    1. Podłącz BNC wychodzący z zacisków 6 i 7 modułu wyjściowego napięcia (Rysunek 2b) do złączy BNC Rear Switched External Command z tyłu wzmacniacza patch clamp.
    2. Podłącz drugi BNC między wyjściem generatora przebiegów a złączem Front Switch External Command z tyłu patch clamp amplifier.
      UWAGA: Te dwa połączenia zapewniają alternatywne metody generowania przebiegów napięcia, które są przykładane do elektrod kropelkowych za pośrednictwem wzmacniacza patch clamp. Generator przebiegów jest szczególnie przydatny do generowania trójkątnych napięć falowych używanych do pomiaru pojemności membrany. Użytkownik może zdecydować, które, jeśli którekolwiek z nich, są niezbędne dla jego własnej aplikacji.
    3. Za pomocą trzeciego BNC podłącz wyjście mierzonego prądu znajdujące się na przednim panelu patch clamp amplifier do dostępnego złącza BNC z wejściem analogowym na froncie DAQ-1.
    4. Za pomocą czwartego BNC podłącz wyjście mierzonego napięcia membrany (z tyłu wzmacniacza patch clamp) do oddzielnego złącza wejścia analogowego na DAQ-1. Umożliwia to digitalizację napięcia przyłożonego do elektrod.
    5. Po przygotowaniu i podparciu dwóch elektrod kropelkowych na mikromanipulatorach, jak opisano w krokach 7-9 w ref.40, podłącz przewody elektrody do szyldu zacisku krosowego, który jest podłączony do wzmacniacza zacisku krosowego.
      UWAGA: Rolą stopnia czołowego jest kontrolowanie napięcia między elektrodami i pomiar powstałego prądu, który jest przekształcany w proporcjonalne napięcie, które jest wyprowadzane przez wzmacniacz patch clamp do DAQ-1.
    6. Podłącz DAQ-1 do komputera za pomocą złącza USB i podłącz odpowiednie zasilające zarówno do patch clamp amplifier, jak i DAQ-1.
  4. Włącz wszystkie urządzenia pomiarowe.
    UWAGA: Być może najważniejszym szczegółem w tej konfiguracji jest upewnienie się, że połączenia wyjściowe wzmacniacza mocy (mA-A) są elektrycznie odizolowane od jednostki czołowej wzmacniacza patch clamp amplifier, który wykorzystuje czuły obwód do pomiaru prądów na poziomie pA-nA w DIB.

3. Kontrola temperatury sprzężenia zwrotnego dwuwarstwowego interfejsu kropelkowego

UWAGA: Następujące kroki do obsługi systemu kontroli temperatury sprzężenia zwrotnego są oparte na niestandardowym graficznym interfejsie użytkownika (GUI) stworzonym do implementacji proporcjonalno-całkowej (PI) kontroli temperatury sprzężenia zwrotnego40,41 (zobacz Dodatkowe pliki kodowania). Zamiast tego można użyć innego oprogramowania i algorytmów sterowania. Kopia tego programu jest dostarczana do czytelnika wraz z informacjami uzupełniającymi do artykułu, jednak użytkownik jest odpowiedzialny za skonfigurowanie go do własnego sprzętu i potrzeb.

  1. Uruchom oprogramowanie DAQ-2 na komputerze i otwórz plik programu do kontroli temperatury. Po otwarciu graficznego interfejsu użytkownika otwórz program ponownie, klikając ikonę folderu w lewym dolnym rogu graficznego interfejsu użytkownika i wybierając program do kontroli temperatury (Rysunek 3).
  2. Wprowadzić odpowiednie wartości liczbowe dla proporcjonalnego wzmocnienia sterującego (KP) i integralnego wzmocnienia sterującego (KI).
    UWAGA: Stwierdzono, że wartości KP i KI wynoszące odpowiednio 0,598 i 0,00445 działają dobrze w konfiguracji. Wartości te zostały określone iteracyjnie poprzez symulację przy użyciu modelu systemu, który obejmuje parametry uzyskane z mierzonych reakcji ogrzewania w pętli otwartej (patrz Rysunek 4). Podczas ogrzewania w pętli otwartej zalecana moc grzewcza jest niezależna od mierzonej temperatury. Natomiast ogrzewanie w pętli zamkniętej polega na ciągłym dostosowywaniu mocy przyłożonej do grzejników w sposób, który pomaga zbliżyć mierzoną temperaturę do temperatury pożądanej. Osiąga się to w tym przypadku za pomocą schematu sterowania PI.
  3. Aby przetestować schemat kontroli temperatury, wprowadź żądaną temperaturę zadaną (powyżej temperatury pokojowej), a następnie włącz sterowanie temperaturą ze sprzężeniem zwrotnym w graficznym interfejsie użytkownika. Obserwuj sygnał zmierzonej temperatury pod kontrolą sprzężenia zwrotnego (pętla zamknięta), który jest wyświetlany w graficznym interfejsie użytkownika przez kilka następnych minut. Jeśli zmierzona temperatura oleju znacznie przekracza żądaną temperaturę, reaguje zbyt wolno na zmiany lub nie zbiega się do żądanej wartości zadanej, użytkownik będzie musiał dostosować wzmocnienia sterowania, aby osiągnąć pożądaną wydajność w pętli zamkniętej.
    UWAGA: Program określa limit nasycenia mocy (a tym samym napięcia) dostarczanej do rezystancyjnych elementów grzejnych. Dla przykładu, dwa opisane w niniejszym dokumencie elementy pobierają do 5 W mocy każdy. Okablowanie ich równolegle oznacza, że całkowity pobór mocy nie powinien przekraczać 10 W. Zaleca się, aby użytkownik wziął pod uwagę maksymalną ilość mocy, która powinna być dostarczana do urządzeń i wiedział, że to ograniczenie może wpływać na prędkość, z jaką system zamkniętej pętli będzie reagował na pożądane zmiany temperatury. Elementy grzejne o większej mocy umożliwiają szybsze nagrzewanie i wyższe temperatury zadane, ale wymagają wyższych prądów dostarczanych do ogrzewania.
  4. Gdy system jest dostrojony do akceptowalnej wydajności w pętli zamkniętej, wprowadź żądaną temperaturę oleju do tworzenia DIB jako wartość zadaną w GUI.
    UWAGA: Na przykład, temperatura zadana 60 °C dała dobre wyniki w eksperymentach z liposomami BTLE w kropelkach wodnych37. Użytkownik jest odsyłany gdzie indziej2,40 w celu zapoznania się z protokołami wyjaśniającymi montaż DIB między kroplami wiszącymi na elektrodach drutowych oraz konfigurację sprzętu elektrofizjologicznego przy użyciu wzmacniacza patch clamp, DAQ-1 i oprogramowania do pomiaru elektrofizjologii. W szczególności protokół Najem, et al.40 może być ściśle przestrzegany aż do kroku 13. Poza tym etapem stosuje się nieco inne podejście do udanego tworzenia jednowarstwowych i dwuwarstwowych przy użyciu lipidów, które wymagają ogrzewania w celu promowania tworzenia jednowarstwowych lub dwuwarstwowych.
  5. Opuść końcówki elektrod srebra/chlorku srebra (Ag/AgCl) do oleju, aż prawie dotkną dna akrylowego zbiornika. Takie umiejscowienie końcówek elektrod ma kluczowe znaczenie dla utrzymania kropli na elektrodzie w podgrzanym oleju, gdzie zaobserwowano, że prądy konwekcyjne w oleju odrywają kropelki od elektrod pokrytych hydrożelem (Rysunek 2c).
  6. Odpipetować kroplę 250 nl wodnego roztworu lipidowego zawierającego 2 mg/ml BTLE, 100 mM chlorku potasu (KCl) i 10 mM kwasu 3-(N-morfolino) propanosulfonowego (MOPS) na każdą końcówkę elektrody i pozostawić je do inkubacji w podgrzanym oleju przez co najmniej 10 minut, aby ułatwić tworzenie się monowarstwy.
  7. Przykryj scenę główną i podgrzewaną oprawę sceniczną uziemioną klatką Faradaya.
  8. Doprowadź kropelki do delikatnego kontaktu powoli
    manipulowanie poziomymi pozycjami elektrod, aż użytkownik zobaczy, że kropelki odkształcają się w kontakcie lub zaczynają się nawzajem przemieszczać i odczekaj kilka minut, aż rozpocznie się tworzenie dwuwarstw. Jeśli po kilku minutach nie utworzy się dwuwarstwa, kropelki można bardziej skompresować, aby ułatwić tworzenie dwuwarstwy. Powstawanie rozrzedzonej dwuwarstwy międzyfazowej można potwierdzić poprzez oględziny (Rysunek 5a) lub poprzez pomiar wzrostu amplitudy prądu pojemnościowego o kształcie prostokątnym indukowanego przez generator przebiegów wytwarzający napięcie trójkątne 10 mV, 10 Hz22. Pozwól dwuwarstwie osiągnąć równowagę przez co najmniej 10 minut, aby osiągnąć stały obszar międzyfazowy, po początkowym uformowaniu, a przed późniejszą charakteryzacją w początkowym punkcie zawartości.
    UWAGA: Rodzaj oleju może mieć znaczący wpływ na rozrzedzenie dwuwarstwowe, grubość membrany i kąt zwilżania między kroplami. Ogólnie rzecz biorąc, im mniejsza cząsteczka oleju, tym łatwiej może ona pozostać w hydrofobowym rdzeniu dwuwarstwy zajmowanej przez lipidowe łańcuchy acylowe. Retencja oleju zwiększa zarówno naprężenia i grubość jednowarstwowych, jak i dwuwarstwowych oraz zmniejsza powierzchnię i kąt kontaktu między kroplami. Wskaźniki te oznaczają słabszy stan przyczepności. Większe, masywniejsze cząsteczki wywierają odwrotny efekt. Na przykład skwalen jest cząsteczką o większej objętości niż alkany, takie jak heksadekan, co umożliwia łatwe wykluczenie go spomiędzy monowarstw podczas rozrzedzania dwuwarstwowego. W związku z tym DIB utworzone w skwalenie są cieńsze, wykazują większe obszary i kąty kontaktu oraz wykazują wyższe swobodne energie powstawania22,42 (miara adhezji kropla-kropla).

4. Charakterystyka zachowań zależnych od temperatury w DIBs

UWAGA: Wiele procesów fizycznych może być badanych w modelowych membranach opartych na DIB, w tym jak zmiany temperatury wpływają na strukturę i właściwości transportowe membrany. Po pomyślnym uformowaniu dwuwarstwy w żądanej temperaturze należy wykonać następujące czynności.

  1. Zmierz nominalną pojemność membrany, jednocześnie obniżając temperaturę kąpieli olejowej z nastawy, która pozwala na tworzenie dwuwarstw, aby zidentyfikować termotropowe przejścia fazowe lipidów w membranie38.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres temperatury w graficznym interfejsie użytkownika i wyczyść wyświetlane dane. Dzięki temu w buforze dostępna jest wystarczająca ilość miejsca na kolejne nagrania.
    2. Korzystając z generatora przebiegów podłączonego do wzmacniacza patch clamp, nałóż trójkątny przebieg napięcia (np. 10 mV, 10 Hz) na elektrody DIB i zarejestruj indukowaną odpowiedź prądową przez dwuwarstwę.
    3. Schłodzić dwuwarstwę, zmniejszając temperaturę zadaną w krokach co 5 °C i czekając co najmniej 5 minut w nowej temperaturze w stanie ustalonym między zmianami temperatury, aż do osiągnięcia żądanej temperatury. Alternatywnie spróbuj pasywnie schłodzić dwuwarstwę, wyłączając system sterowania sprzężeniem zwrotnym. Należy jednak pamiętać, że eksperymenty z zastosowaniem pasywnego chłodzenia w temperaturze 50-60 °C skutkowały wyższymi wskaźnikami koalescencji.
    4. Po schłodzeniu kąpieli olejowej i dwuwarstwy do żądanej temperatury minimalnej, ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy wykres temperatury w graficznym interfejsie użytkownika i wyeksportuj dane temperatury w funkcji czasu do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego. Zatrzymaj bieżące nagrywanie.
    5. Na podstawie zmierzonego prądu oblicz pojemność nominalną odpowiedzi fali prostokątnej w funkcji czasu w okresie chłodzenia.
    6. Wykreśl pojemność nominalną (C) w funkcji temperatury (T), aby zaobserwować, jak zmieniła się pojemność membrany. Zlokalizuj niemonotoniczne zmiany w C i T, aby zidentyfikować TM.
      UWAGA: Pojemność nominalną można obliczyć na podstawie amplitudy prądu prostokątnego 43 (|I|) Korzystanie z relacji |I| = C dv/dt, gdzie dv/dt jest równe czterokrotności iloczynu amplitudy napięcia (|V|) i częstotliwość (f) przyłożonego napięcia trójkątnego. Z tych równań C = |I|/(4|V|f).
  2. Podobnie ocenić quasi-statyczną pojemność właściwą (CM) dwuwarstwy w ustalonych temperaturach, kolejno zwiększając temperaturę kąpieli olejowej i obszaru dwuwarstwy.
    1. Zmień temperaturę zadaną w krokach co 10 °C za pomocą graficznego interfejsu użytkownika i pozwól systemowi zrównoważyć się do nowej temperatury.
      1. Wykonaj krok 4.1.2, aby rozpocząć pomiar prądu pojemnościowego i rejestrację.
      2. Zmień obszar dwuwarstwy, ostrożnie dostosowując położenie elektrod za pomocą mikromanipulatorów (tj. oddzielenie elektrod zmniejsza powierzchnię dwuwarstwową). Pozwól, aby prąd fali prostokątnej osiągnął amplitudę w stanie ustalonym i zbierz obrazy DIB, aby umożliwić obliczenie powierzchni membrany w funkcji czasu, używając kamery zamontowanej na mikroskopie do zobrazowania dwuwarstwy widzianej z apertury stolika mikroskopu. Jednocześnie dodaj znacznik cyfrowy w bieżącym oprogramowaniu do nagrywania, aby oznaczyć odpowiedni punkt czasowy do zbierania obrazów.
        UWAGA: Mikromanipulatory pozwalają na precyzyjną kontrolę elektrod, a co za tym idzie delikatny kontakt między kroplami. Zgrubna manipulacja kropelkami może prowadzić do nieudanego eksperymentu poprzez koalescencję kropel lub spowodowanie odpadnięcia kropli z elektrody. Jak omówiono w innym miejscu22, powierzchnia dwuwarstwowa jest obliczana na podstawie długości kontaktu między kroplami, które wyglądają jak nakładające się na siebie okręgi na obrazie w widoku z dołu. Położenie i wymiary kropel oraz długość linii jezdnej można obliczyć za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów lub innych naukowych narzędzi programistycznych.
      3. Powtórz krok 4.2.1.2 co najmniej 4 razy, aby uzyskać łącznie 5 obrazów DIB i obszarów stanu ustalonego prądu dwuwarstwowego.
    2. Powtórz krok 4.2.1 dla każdej żądanej temperatury.
    3. W oznaczonych punktach czasowych odpowiadających dwuwarstwowym obszarom stanu ustalonego dla uzyskanych obrazów, przeanalizuj bieżące nagrania i obrazy DIB, aby wyodrębnić dane C i A dla każdej temperatury.
    4. Wykreśl dane C w funkcji A dla każdej temperatury i oblicz nachylenie regresji pierwszego rzędu, która reprezentuje Cm dwuwarstwy w każdej temperaturze22.
    5. Wartości wykresu Cm uzyskane z kroku 4.2.4 w porównaniu z T.
    6. Zbadaj dane CM i T dla zmian niemonotonicznych, aby określić temperatury topnienia, TM.
  3. Oceń dynamikę powstawania kanałów jonowych zależnych od napięcia, generując krok wejściowy napięcia stałego przez dwuwarstwę.
    1. Ustaw napięcie początkowe na żądaną wartość kroku w mV (np. 100 mV).
    2. Ustaw Napięcie końcowe i Rozmiar kroku na wartość wyższą niż żądany krok (np. Napięcie końcowe 110 mV i Rozmiar kroku 110 mV).
    3. Ustaw żądany czas trwania wejścia kroku w sekundach (np. 90 s).
    4. Wybierz żądaną polaryzację wejścia krokowego (np. dodatnia).
    5. Przełącz wzmacniacz patch clamp tak, aby wysyłał do stopnia głównego napięcie sterujące pochodzące z GUI/voltage moduł wyjściowy
      6. .
    6. Zainicjuj bieżące nagrania.
    7. Włącz napięcie i zapisz odpowiedź prądu indukowanego, która powinna wykazywać odpowiedź w kształcie litery S na napięcie krytyczne (np. ~70 mV dla 1 μg/mL Mz w 2 mg/mL BTLE).
  4. Oddzielnie można uzyskać dynamiczne zależności prąd-napięcie dla membrany w żądanych temperaturach, aby ujawnić zależności zależne od napięcia, takie jak zachowanie kanału jonowego.
    1. Przełącz wzmacniacz patch clamp, aby wysłać do stopnia głównego napięcie sterujące pochodzące z generatora przebiegów i zainicjować nagrania prądu.
    2. Na generatorze przebiegów wyprowadź ciągły przebieg sinusoidalny o żądanej amplitudzie, przesunięciu i częstotliwości.
    3. Zapisz odpowiedź prądu indukowanego w jednym lub wielu cyklach.
    4. Powtórz w razie potrzeby dla różnych amplitud i częstotliwości fal sinusoidalnych oraz temperatur.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Graficzny interfejs sterowania temperaturą. Na tym rysunku przedstawiono i opisano krytyczne kroki wymagane do korzystania z graficznego interfejsu użytkownika programu do kontrolowania temperatury kąpieli olejowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje, jak aluminiowe urządzenie i akrylowy zbiornik oleju są przygotowywane na stoliku mikroskopowym do tworzenia DIB. Kroki montażowe 1.2-1.4 służą do izolacji termicznej oprawy od sceny w celu bardziej wydajnego ogrzewania. Kroki 1.5-1.7 pokazują, jak prawidłowo przymocować termoparę do uchwytu i ustawić zbiornik oleju, a kroki 1.8-1.9 pokazują zalecane miejsca dozowania oleju do tych kawałków.

Rysunek 2 przedstawia ko...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w niniejszym dokumencie zawiera instrukcje dotyczące montażu i obsługi eksperymentalnego systemu do kontroli temperatury oleju i kropelek używanych do tworzenia DIBs. Jest to szczególnie korzystne dla umożliwienia tworzenia DIB przy użyciu lipidów, które mają temperaturę topnienia powyżej RT. Ponadto, poprzez precyzyjną zmianę temperatury zbiornika oleju, można manipulować temperaturą dwuwarstwy w celu zbadania wpływu podwyższonych temperatur na różne właściwości i charakterystyki membrany, w tym pojemno...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie finansowe zostało zapewnione przez National Science Foundation Grant CBET-1752197 oraz Grant Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych FA9550-19-1-0213.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
25 mm x 40 mm x 1 mm guma izolacyjna (x2)DowolnaIzoluje spód aluminiowej oprawy od stolika mikroskopu
25 mm x 40 mm x 6 mm guma izolacyjna (x2)DowolnaChroni elementy grzejne przed uszkodzeniem przez klipsy stolika mikroskopu i izoluje górną część elementów grzejnych.
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy Sigma AldrichM3183Środek buforujący do roztworu lipidowego
Podłoże akryloweWykonane we własnym zakresieHTD_STG_2~ 1000 uL akrylowej studni z zewnętrznym profilem poka-yoke do ustalenia orientacji
Aluminiowa oprawaWykonana we własnym HTD_STG_1Oprawa podstawowa z szybem naftowym, w której znajduje się oprawa acylowa i zawiera dwie płaskie podkładki przylegające do szybu naftowego dla elementów grzejnych 
Brain Total Lipid ExtractAvanti131101C-100mg25 mg/ml ekstrakt lipidowy ze świństwa 
Kompaktowa obudowa DAQ (cDAQ)Instrumenty krajowe cDAQ-9174 Obudowa do przechowywania wielu typów czujników, modułów pomiarowych lub wyjściowych
System akwizycji danych (DAQ)Urządzenia molekularne Digidata 1440A Przetwornik analogowo-cyfrowy o wysokiej rozdzielczości
Wzmacniacz/zasilacz o stałym wzmocnieniuHewlitt PackardHP 6826AWzmacnia napięcie wyjściowe DC z modułu wyjściowego napięcia
Glass Cover SlipCorningCLS284525Uszczelnia spód aluminiowej podstawy i pozwala na charakterystykę optyczną dwuwarstwowej
Element grzejny (x2)OmegaKHLV-101/525 mm Element grzejny kaptonowy z folii polimmidowej o wymiarach 25 mm x 25 mm z ograniczeniem mocy 5 watów.
Śruba M3 ze stali nierdzewnejMcMaster Carr90116A150Mocuje termoparę do aluminiowego uchwytu
Wzmacniacz zacisków krosowychUrządzenia molekularne AxoPatch 200B Mierzy prąd i wyprowadza napięcie do stopnia głównego
Komputer osobistyDowolnykomputer z wieloma szybkimi portami USB i minimum 6 GB pamięci RAM
Chlorek potasuSigma AldrichP3911Elektrolit roztwór zdysocjowanych jonów
Moduł wejściowy temperaturyNational Instruments NI 9211Umożliwia pomiary termopary z otwartym i zimnym złączem dla podwozia cDAQ
TermoparaOmegaJMTSS-020U-6 Termopara typu U o średnicy 0,02 cala i długości 6 cali
Klej utwardzany promieniami UVLoctite19739Mocuje szklane szkiełko nakrywkowe do aluminiowego uchwytu podstawy
Moduł wyjściowy napięciaNational Instruments NI 9263Analogowy moduł wyjściowy napięcia do użytku z obudową cDAQ
Generator przebiegówAgilent33210A Służy do wyprowadzania fali sinusoidalnej 10 mV 10 Hz

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755(2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726(2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008(2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585(2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142(2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998(2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Droplet Interface BilayerLipid Bilayer AssemblyTemperature ControlMembrane CapacitancePatch Clamp AmplifierThermotropic Phase TransitionBilayer Area TuningIon Channel FormationModel Membrane CharacterizationLipid Melting Temperature

Related Articles