Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowe obrazowanie organoidów w celu zbadania pierwotnej ciliogenezy podczas organogenezy ex vivo

DOI:

10.3791/62365

⸱

14 maja 2021

 ,  ,  , 
1Univ Rennes, CNRS, IGDR (Institut de Génétique et Développement de Rennes), 2CRBM, CNRS, University Montpellier, 3CRCINA, INSERM, CNRS, Université d’Angers, Université de Nantes

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy pochodzące z komórek macierzystych ułatwiają analizę procesów molekularnych i komórkowych, które regulują samoodnawianie się i różnicowanie komórek macierzystych podczas organogenezy w tkankach ssaków. W tym miejscu przedstawiamy protokół analizy biologii rzęski pierwotnej w organoidach sutka myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy to trójwymiarowe struktury pochodzące z komórek macierzystych, które odtwarzają ex vivo złożoną architekturę i fizjologię narządów. W związku z tym organoidy stanowią użyteczne modele do badania mechanizmów kontrolujących samoodnawianie i różnicowanie komórek macierzystych u ssaków, w tym pierwotną ciliogenezę i sygnalizację rzęskową. Rzęska pierwotna to dynamiczny proces składania rzęski pierwotnej, kluczowego centrum sygnalizacji komórkowej, które kontroluje samoodnowę i/lub różnicowanie komórek macierzystych w różnych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół barwienia immunofluorescencyjnego markerów linii komórkowej i pierwotnych rzęsek w organoidach sutkowych myszy montowanych w całości, do mikroskopii świetlnej. Opisujemy metodę obrazowania mikroskopowego i technikę przetwarzania obrazu do analizy ilościowej zespołu i długości rzęsek pierwotnych w organoidach. Protokół ten umożliwia precyzyjną analizę rzęsek pierwotnych w złożonych strukturach trójwymiarowych na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta ma zastosowanie do barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania rzęsek pierwotnych i sygnalizacji rzęskowej w organoidach sutkowych pochodzących z normalnych i genetycznie zmodyfikowanych komórek macierzystych, ze zdrowych i patologicznych tkanek, w celu zbadania biologii rzęski pierwotnej w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój organizmów wielokomórkowych i utrzymanie homeostazy w ich dorosłych tkankach polega na precyzyjnej regulacji między samoodnawianiem a różnicowaniem komórek macierzystych, które zarządzają w czasie i przestrzeni normalnym rozwojem i regeneracją tkanek1. Odwrócenie tej regulacji powoduje anomalie rozwojowe i nowotwory2. W związku z tym zrozumienie mechanizmów molekularnych i komórkowych, które koordynują samoodnawianie i różnicowanie komórek macierzystych, ma kluczowe znaczenie w biologii rozwoju i nowotworów.

Niedawny rozwój metod organogenezy ex vivo, w których tkankowe komórki macierzyste generują trójwymiarowe organoidy, zmienił nasze możliwości badania dynamiki komórek macierzystych podczas organogenezy ssaków i utrzymania homeostazy tkanek w dish3. Organoidy stanowią dobrą alternatywę dla kłopotliwych genetycznie modyfikowanych modeli zwierzęcych do badania tych procesów. Opracowano już protokoły rozwoju organoidów z tkanek komórek macierzystych wielu narządów3, w tym jelita cienkiego i okrężnicy, żołądka, wątroby, trzustki, prostaty i gruczołu sutkowego3. Dodatkowo, rozwój technik somatycznej edycji genomu w organoidowych komórkach macierzystych umożliwia teraz szybkie badanie mechanizmów molekularnych i komórkowych, które kontrolują ich biologię4,5.

Rzęska pierwotna to struktura oparta na mikrotubulach, która jest montowana na powierzchni komórek macierzystych i/lub zróżnicowanych różnych tkanek6. Na ogół nie jest ruchliwy i jest składany jako pojedyncza struktura na komórkę7. Rzęska pierwotna to dynamiczny proces składania rzęski pierwotnej7. Na powierzchni komórki rzęska działa jak platforma sygnalizacji komórkowej8. W związku z tym uważa się, że rzęska pierwotna działa jako kluczowy regulator samoodnawiania i/lub różnicowania komórek macierzystych w wielu tkankach, w tym w mózgu9,10, gruczoł sutkowy4,11, tkanka tłuszczowa12 oraz nabłonek węchowy13, między innymi. Pierwotna ciliogeneza i/lub sygnalizacja rzęskowa są dynamicznie regulowane w różnych liniach komórkowych i na różnych etapach rozwoju4,13,14, ale mechanizmy leżące u podstaw pozostają w dużej mierze do ustalenia.

Organogeneza ex vivo daje nadzieję na rozwój podstawowej wiedzy na temat molekularnych i komórkowych mechanizmów kontrolujących biologię komórek macierzystych, w tym pierwotnej ciliogenezy i sygnalizacji rzęskowej. Opiera się jednak na zdolności do prawidłowego obrazowania całych organoidów na poziomie pojedynczej komórki i w skali subkomórkowej. Niedawno użyliśmy modelu organoidów pochodzących z komórek macierzystych sutka myszy, aby pokazać, że rzęski pierwotne pozytywnie kontrolują zdolność do tworzenia organoidów komórek macierzystych sutka myszy4. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół barwienia immunofluorescencyjnego organoidów sutkowych myszy w całości (Rysunek 1A,B), który umożliwia analizę rzęsek pierwotnych za pomocą mikroskopii świetlnej podczas organogenezy ex vivo w trójwymiarze. Niedawno opublikowano alternatywne metody barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania organoidów za pomocą mikroskopii konfokalnej15,16. Protokół ten koncentruje się zamiast tego na przygotowaniu i obrazowaniu organoidów za pomocą mikroskopii świetlnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Poniższy protokół jest zalecany do barwienia organoidów, które były hodowane w 5 dołkach na płytce 96-dołkowej i połączone razem (> 100 organoidów). Organoidy pochodziły z mysich komórek macierzystych sutka. Myszy dawcy były trzymane i traktowane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Rennes (Francja).

1. Odczynniki

  1. Aby przygotować roztwór utrwalający, rozcieńczyć 125 μl 16% handlowego roztworu wodnego paraformaldehydu (PFA) w 375 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w celu wytworzenia 4% roztworu PFA.
    UWAGA: Manipuluj PFA, który jest substancją toksyczną, pod maską chemiczną.
  2. Aby przygotować bufor permeabilizacyjny, rozcieńczyć 1,5 μl Triton X100 w 500 μl PBS, aby uzyskać 0,3% roztwór Triton X100.
  3. Aby przygotować bufor blokujący, rozcieńczyć 1,5 μl Tween-20 i 75 μl normalnej surowicy koziej w PBS, aby uzyskać 5% roztwór surowicy koziej - 0,1% Tween 20.
  4. Aby przygotować podłoże do mocowania lekkiego arkusza, rozpuścić 1 g ultraczystej agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml dH20 lub PBS w temperaturze 65 °C. Przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Odzyskiwanie organoidów

  1. Przenieść organoidy z dołków hodowlanych do probówki o niskiej zawartości wiązania polimeru o pojemności 1,7 ml, po 3-krotnym pipetowaniu w górę iw dół w studzienkach, z końcówką pokrytą FBS, dla której koniec został odcięty (minimalna średnica końca 1,5 mm).
    UWAGA: Powłoka zapobiega przywieraniu organoidów do końcówki. Nisko wiążący materiał polimerowy pozwala na ograniczenie przylegania organoidów do boku probówki podczas całej procedury barwienia.
  2. Napełnij probówkę PBS i wiruj w dół z prędkością 350 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant.

3. Utrwalenie, przepuszczalność i blokowanie

  1. Zawiesić organoidy w 500 μl 4% PFA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wirować z prędkością 350 x g przez 30 s. Usunąć supernatant.
    UWAGA: Począwszy od tego kroku, ponownie zawieszaj organoidy w różnych, po prostu dodając na osadzie organoidów bez ich dotykania. Wszystkie etapy prania wykonuj w temperaturze pokojowej.
  2. Płukać organoidy 1 ml PBS przez 3 minuty. Wirować przy 350 x g przez 30 s. Usunąć supernatant.
    PAUZA: Utrwalone organoidy można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez co najmniej tydzień.
  3. Organoidy należy przepuścić, ponownie zawieszając je w 500 μl PBS-Triton X100 0,3% i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Obracaj organoidy w temperaturze 350 g przez 30 s.
  4. Umyć organoidy, umieszczając je ponownie w 1 ml PBS i inkubować przez 3 minuty. Wirować przy 350 x g przez 30 s. Usunąć supernatant. Powtórz raz.
  5. Opcjonalnie: Zawiesić organoidy w 500 μl lodowatego metanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez 10 min. Ten etap może być wymagany do barwienia określonych markerów centrosomalnych.
  6. Opcjonalnie (jeśli wykonano krok 5): Myć organoidy 1 ml PBS przez 3 minuty. Wirować przy 350 x g przez 30 s. Usunąć supernatant. Powtórz raz.
  7. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał w organoidach poprzez ponowne zawieszenie ich za pomocą 500 μl buforu blokującego (PBS, 5% surowicy koziej, 0,1% Tween 20). Inkubować 1 h i 30 min w temperaturze pokojowej. Wirować z prędkością 350 g przez 30 s. Usunąć supernatant.
  8. Umyć organoidy, umieszczając je ponownie w 1 ml PBS i inkubować przez 3 minuty. Wirować przy 350 x g przez 30 s. Usunąć supernatant.

4. Oznakowanie

  1. Zawiesić organoidy w 200 μl buforu blokującego z rozcieńczonymi przeciwciałami pierwszorzędowymi i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z łagodnym wstrząsaniem (60 obr./min na wytrząsarce poziomej). Rurki należy ustawić pod kątem 45° zgodnie z poziomym planem wytrząsarki. Utrzyma organoidy na dnie probówek w buforze barwiącym.
  2. Umyć organoidy, umieszczając je ponownie w 1 ml PBS i inkubować przez 5 minut. Wirować w temperaturze 350 x g przez 30 s. Usunąć supernatant. Powtórz dwa razy.
    UWAGA: Niektóre organoidy w ostatnim etapie mogą przyklejać się do boku probówki, powodując utratę organoidów podczas aspiracji supernatantu po odwirowaniu, dodanie 0,2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do PBS na etapach płukania może zmniejszyć utratę organoidów.
  3. Zawiesić organoidy w 200 μl buforu blokującego z przeciwciałami drugorzędowymi i inkubować przez 1 godzinę i 30 minut z łagodnym wytrząsaniem (60 obr./min na wytrząsarce poziomej). Rurki należy ustawić pod kątem 45° zgodnie z poziomym planem wytrząsarki. Utrzyma organoidy na dnie probówek w buforze barwiącym.
    UWAGA: Hoechst (lub inne barwniki jądrowe, takie jak DAPI lub DRAQ5) można dodać do buforu z przeciwciałami drugorzędowymi.
  4. Umyć organoidy, umieszczając je ponownie w 1 ml PBS i inkubować przez 5 minut. Wirować w temperaturze 350 x g przez 30 s. Usunąć supernatant. Powtórz dwa razy.
    UWAGA: Niektóre organoidy w ostatnim etapie mogą przykleić się do boku probówki, powodując utratę organoidów podczas aspiracji supernatantu po odwirowaniu, dodanie 0,2% (w/v) BSA do PBS na etapach mycia może zmniejszyć utratę organoidów.

5. Przygotowanie próbki agarozy do obrazowania

  1. Stopić lekkie podłoże montażowe przez inkubację w temperaturze 65 °C. Po stopieniu pożywki inkubować ją w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  2. Zawiesić organoidy w 100 μl podłoża montażowego za pomocą końcówki o pojemności 200 μl, z przeciętym końcem końcówki (minimalny rozmiar końcówki: 1,5 mm), pipetując dwukrotnie w górę i w dół.
  3. Zassać podłoże mocujące z organoidami w szklanej kapilarze (zielona kapilara, średnica wewnętrzna: 1,5 mm) za pomocą tłoka. Inkubować kapilarnę w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby podłoże montażowe zestaliło się.
    PAUZA: Kapilar może być przechowywany w PBS w temperaturze 4 °C przez tydzień przed obrazowaniem.

6. Obrazowanie

  1. Za pomocą mikroskopu arkuszowego (np. ZEISS Lightsheet Z.1) zobrazuj organoidy za pomocą obiektywów zanurzających w wodzie 20x lub 40x.
    1. Umieść szklaną kapilarnę w komorze obserwacyjnej. Zlokalizuj kapilarnę za pomocą przedniego aparatu i umieść końcówkę szklanej kapilary na górnej granicy obiektywu wykrywania.
    2. Wybierz próbkę i ustaw optymalną ostrość za pomocą końcówki szklanej kapilary w oświetleniu w jasnym polu. Powoli wypchnij próbkę agarozy z kapilary i zlokalizuj organoidy w zestalonej agarozie.
    3. Organoidy, które mają być zobrazowane, należy trzymać blisko końca naczynia włosowatego, aby zmniejszyć ruchy próbki agarozy w PBS. Obróć kapilarę, aby ustawić optymalną orientację próbki i zdefiniować żądane powiększenie.
    4. Wybierz tryb akwizycji. Zdefiniuj kanały do obrazu, ustaw odpowiednią orientację arkusza świetlnego, ustaw moc lasera dla każdego kanału (aby zmniejszyć fotowybielanie, użyj niskiej mocy lasera), ustaw rozmiar obrazu i żądaną stronę (strony) oświetlenia. Przykładowe parametry obrazowania: Rozmiar obrazu 1920 x 1920, oświetlenie: dwustronne.
    5. Zdefiniuj stos Z do obrazu, ustawiając końce stosu Z za pomocą modułu Z-stack i ustaw rozmiar kroku Z na optymalny.
  2. Przetwórz plik wyjściowy za pomocą modułu przetwarzania obrazu w oprogramowaniu mikroskopu, aby nawigować w próbce, uzyskać projekcję Z i reprezentację 3D.
  3. Obróć próbkę i uzyskaj nowy obraz pod innym kątem lub wyobrazić sobie inne organoidy.
  4. Analizuj obrazy za pomocą interaktywnego oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych (np. Imaris) umożliwiającego (i) wizualizację próbki w 3D, (ii) segmentację obiektów, (iii) identyfikację i analizę ilościową obiektów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody organogenezy ex vivo przekształcają nasze możliwości badania rozwoju tkanek ssaków i utrzymania homeostazy tkanek w naczyniu. Analiza mechanizmów molekularnych i komórkowych, które regulują te procesy, w tym pierwotną ciliogenezę i sygnalizację rzęskową, opiera się na zdolności do obrazowania organoidów w trzech wymiarach.

Protokół opisany powyżej umożliwia barwienie organoidów sutkowych w całości. Powstają z komórek podstawnych wzbogaconych komórkami macierzystymi sutka, które...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj szczegółowy protokół umożliwia barwienie i obrazowanie organoidów sutka myszy, które rosną w półstałym podłożu. Protokół ten można przypuszczalnie zastosować do barwienia organoidów naśladujących architekturę różnych tkanek, które rosną w pożywkach półstałych i stałych. W przypadku organoidów, które rosną w 100% Matrigel z podłożem na wierzchu, etapy odzyskiwania i utrwalania nieznacznie się różnią. Pożywkę hodowlaną należy dobrze usunąć z kultury. Po szybkim przemyciu PBS, roztwór utrwalający (4% PFA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Xavierowi Pinsonowi za pomoc w rozwoju mikroskopii arkuszowej; centrum biotechnologicznemu Biosit, w tym MRic, Arche, głównym obiektom cytometrii przepływowej i SFR Santé F. Bonamy, w tym głównej placówce MicroPICell, za wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez Fondation ARC, Cancéropôle Grand Ouest, Université de Rennes 1, Fondation de France. Doktor nauk medycznych był wspierany przez stypendium dla absolwentów Uniwersytetu w Rennes. V.J.G. otrzymał stypendium podoktoranckie od Fondation ARC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciw myszom IgG1 647Thermo-FisherA21240
Anty-mysie IgG2A 488Thermo-FisherA21131
Anty-królik 546Thermo-FisherA11035
Arl13bNeuroMab73-287
EMS 16% wodny roztwór paraformaldehydu,mikroskopia elektronowa15710
FBSThermo-Fisher10270106
gtubulinSigma-AldrichT5326
Hoechst 33342Thermo-Fisher62249
Integrin a6Biolegend313616
Light Sheet KapilaraZeiss701908
Light SheetTłok Zeiss701998
Niskie wiązanie Probówki do mikrowirówekBioScience27210
Normalny roztwór blokujący surowicę koziąVector labsS-1000
PBSSigma-Aldrichp3587
Technologia sygnalizacji komórekślimaka9585
Triton-X100Sigma-AldrichT9284
Tween-20Euromedex9005-64-5
UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaThermo-Fisher16520050
klasy EM Nauki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
  2. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  3. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  4. Guen, V. J., et al. EMT programs promote basal mammary stem cell and tumor-initiating cell stemness by inducing primary ciliogenesis and Hedgehog signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
  5. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  6. Satir, P., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. The primary cilium at a glance. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 499-503 (2010).
  7. Guen, V. J., Prigent, C. Targeting Primary Ciliogenesis with Small-Molecule Inhibitors. Cell Chemical Biology. 27 (10), 1224-1228 (2020).
  8. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  9. Han, Y. G., et al. Hedgehog signaling and primary cilia are required for the formation of adult neural stem cells. Nature Neuroscience. 11 (3), 277-284 (2008).
  10. Tong, C. K., et al. Primary cilia are required in a unique subpopulation of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12438-12443 (2014).
  11. Wilson, M. M., Weinberg, R. A., Lees, J. A., Guen, V. J. Emerging Mechanisms by which EMT Programs Control Stemness. Trends in Cancer. 6 (9), 775-780 (2020).
  12. Hilgendorf, K. I., et al. Omega-3 Fatty Acids Activate Ciliary FFAR4 to Control Adipogenesis. Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).
  13. Joiner, A. M., et al. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. Journal of Neuroscience. 35 (40), 13761-13772 (2015).
  14. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
  15. van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709(2020).
  16. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie organoid worganoidy tr jwymiarowesygnalizacja rz skowabarwienie immunofluorescencyjnemikroskopia arkusza wiat aorganoidy gruczo u mlekowegor nicowanie kom rek macierzystychsk adanie rz sekprzetwarzanie obrazu
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły