Method Article

Analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej

DOI:

10.3791/62368

⸱

April 16th, 2021

 ,  , 
1Departament de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół ekstrakcji całkowitej zawartości lipidów w ścianie komórkowej szerokiej gamy prątków. Ponadto przedstawiono protokoły ekstrakcji i analizy różnych rodzajów kwasów mykolowych. Dostępny jest również protokół chromatografii cienkowarstwowej do monitorowania tych związków prątków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gatunki prątków mogą różnić się od siebie szybkością wzrostu, obecnością pigmentacji, morfologią kolonii wyświetlaną na pożywkach stałych, a także innymi cechami fenotypowymi. Jednak wszystkie mają wspólną cechę najistotniejszą cechę prątków: unikalną i wysoce hydrofobową ścianę komórkową. Gatunki prątków zawierają kompleks połączony z błoną kowalencyjną, który obejmuje arabinogalaktan, peptydoglikan i długie łańcuchy kwasów mykolowych o typach różniących się między gatunkami prątków. Ponadto prątki mogą również wytwarzać lipidy, które znajdują się, niekowalencyjnie połączone, na powierzchni swoich komórek, takie jak między innymi dimykocerozyany ftiocerolu (PDIM), glikolipidy fenolowe (PGL), glikopeptydolipidy (GPL), acylotrehalozy (AT) lub mannozydy fosfatydylo-inozytolu (PIM). Niektóre z nich są uważane za czynniki wirulencji w chorobotwórczych prątkach lub krytyczne lipidy antygenowe w interakcji gospodarz-prątki. Z tych powodów istnieje duże zainteresowanie badaniem lipidów prątków ze względu na ich zastosowanie w kilku dziedzinach, od zrozumienia ich roli w patogenności zakażeń prątkami, po możliwe implikacje jako środki immunomodulujące w leczeniu chorób zakaźnych i innych patologii, takich jak rak. W tym miejscu przedstawiono proste podejście do ekstrakcji i analizy całkowitej zawartości lipidów i składu kwasu mykolowego w komórkach prątków hodowanych w pożywce stałej przy użyciu mieszanin rozpuszczalników organicznych. Po uzyskaniu ekstraktów lipidowych przeprowadza się chromatografię cienkowarstwową (TLC) w celu monitorowania wyekstrahowanych związków. Przykładowy eksperyment przeprowadza się na czterech różnych prątkach: szybko rosnących w środowisku Mycolicibacterium brumae i Mycolicibacterium fortuitum, atenuowanym, wolno rosnącym Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) oraz oportunistycznym patogenie szybko rosnącym Mycobacterium abscessus, co pokazuje, że metody przedstawione w niniejszym protokole mogą być stosowane do szerokiego zakresu prątków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium to rodzaj obejmujący gatunki chorobotwórcze i niepatogenne, charakteryzujący się wysoce hydrofobową i nieprzepuszczalną ścianą komórkową utworzoną przez ich specyficzne lipidy. W szczególności ściana komórkowa prątków zawiera kwasy mykolowe, które są α-alkilowymi i β-hydroksykwasami tłuszczowymi, w których gałąź α jest stała we wszystkich kwasach mykolowych (z wyjątkiem długości), a łańcuch β, zwany łańcuchem meromykolanowym, jest długim łańcuchem alifatycznym, który może zawierać różne funkcjonalne grupy chemiczne opisane wraz z literaturą (α-, α'-, metoksy-, κ-, epoksydowo-, karboksylowe i ω-1-metoksy-mykołany), wytwarzając w ten sposób siedem rodzajów kwasów mykolowych (I-VII)1. Co więcej, inne lipidy o niekwestionowanym znaczeniu są również obecne w ścianie komórkowej gatunków prątków. Gatunki chorobotwórcze, takie jak Mycobacterium tuberculosis, czynnik wywołujący gruźlicę2 wytwarzają specyficzne czynniki wirulencji na bazie lipidów, takie jak dimykocerozy ftiocerolu (PDIM), glikolipidy fenolowe (PGL), di-, tri- i penta-acylotrehalozy (DAT, TAT i PAT) lub sulfolipidy, między innymi3. Ich obecność na powierzchni prątków wiąże się ze zdolnością do modyfikowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza, a tym samym z ewolucją i trwałością prątków wewnątrz gospodarza4. Na przykład obecność triacylogliceroli (TAG) została związana z hiperwirulentnym fenotypem podlinii M. tuberculosis linii 2-Pekin, prawdopodobnie ze względu na jej zdolność do tłumienia odpowiedzi immunologicznej gospodarza5,6. Innymi istotnymi lipidami są lipooligosacharydy (LOS) obecne w prątkach gruźliczych i niegruźliczych. W przypadku Mycobacterium marinum obecność LOS w jego ścianie komórkowej jest związana z ruchliwością ślizgową i zdolnością do tworzenia biofilmów oraz zakłóca rozpoznawanie przez receptory rozpoznające wzorce makrofagów, wpływając na wychwyt i eliminację bakterii przez fagocyty gospodarza7,8. Ponadto brak lub obecność niektórych lipidów pozwala na klasyfikację członków tego samego gatunku do różnych morfotypów o profilach zjadliwych lub osłabionych podczas interakcji z komórkami gospodarza. Na przykład, brak glikopeptydolipidów (GPL) w przybliżonym morfotypie Mycobacterium abscessus jest związany ze zdolnością do indukowania zakwaszenia śródfagosomalnego, a w konsekwencji apoptozy komórek9, w przeciwieństwie do gładkiego morfotypu, który posiada GPL na swojej powierzchni. Ponadto zawartość lipidów w ścianie komórkowej prątków jest związana ze zdolnością do modyfikowania odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Jest to istotne w kontekście wykorzystania niektórych prątków do uruchomienia ochronnego profilu immunologicznego przeciwko różnym patologiom10,11,12,13. Wykazano na przykład, że Mycolicibacterium vaccae, saprofityczne prątki, które są obecnie w fazie III badań klinicznych jako szczepionka immunoterapeutyczna przeciwko gruźlicy, wykazują dwa morfotypy kolonialne. Podczas gdy gładki fenotyp, który zawiera poliester na swojej powierzchni, wyzwala odpowiedź Th2, szorstki fenotyp pozbawiony poliestru może indukować profil Th1, gdy wchodzi w interakcję z komórkami odpornościowymi gospodarza14. Repertuar lipidów obecnych w komórce prątkowej zależy nie tylko od gatunku prątków, ale także od warunków kultur prątków: czas inkubacji15,16 lub skład podłoża hodowlanego17,18. W rzeczywistości zmiany w składzie pożywki wpływają na działanie przeciwnowotworowe i immunostymulujące M. bovis BCG i Mycolicibacterium brumae in vitro17. Co więcej, ochronny profil immunologiczny wywołany przez M. bovis BCG przeciwko prowokacji M. tuberculosis w modelach mysich zależy również od pożywki hodowlanej, w której rośnie M. bovis BCG17. Można je następnie powiązać ze składem lipidowym prątków w każdym stanie hodowli. Z tych wszystkich powodów istotne jest badanie zawartości lipidów w prątkach. Przedstawiono wizualną procedurę ekstrakcji i analizy składu lipidowego ściany komórkowej prątków.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekstrakcja całkowitej ilości niekowalencyjnie połączonych lipidów z prątków (Rysunek 1)

  1. Zeskrob 0,2 g prątków z pożywki stałej i dodaj do szklanej probówki z nakrętkami z wkładki z politetrafluoroetylenu (PTFE). Dodać roztwór składający się z 5 ml chloroformu i 10 ml metanolu (chloroform: metanol, 1:2).
    UWAGA: W przypadku stosowania rozpuszczalników organicznych należy używać wyłącznie szklanego pojemnika. Pojemniki plastikowe nie są dozwolone. Ponadto potrzebne są nakrętki z wkładką PTFE do butelek.
    UWAGA: Chloroform jest substancją potencjalnie toksyczną i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: Metanol jest substancją potencjalnie toksyczną i niezwykle niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
  2. Pozostaw probówkę w ciągłym mieszaniu przez noc, aby wyekstrahować niekowalencyjnie połączone lipidy z powierzchni komórki prątków.
    UWAGA: Jeśli orbitalna platforma wibracyjna nie jest dostępna, ciągłe mieszanie można zastąpić okresowym mieszaniem ręcznym tak często, jak to możliwe.
  3. Przykryj szklany lejek bibułą filtracyjną, przefiltruj rozpuszczalniki organiczne i zbierz je do szklanej probówki.
  4. Użyj strumienia azotu gazowego, aby odparować fazę ciekłą w rurce. Napełnij probówkę azotem gazowym, przykryj i przechowuj w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Podłącz szklaną pipetę Pasteura do strumienia azotu gazowego, aby dokładnie odparować żądaną probówkę. Dodatkowo utrzymuj rurkę w suchym bloku grzejnym dla rur w temperaturze 37 °C. Gdy rozpuszczalnik odparuje, napełnij rurkę gazowym azotem przed jej zamknięciem.
  5. Dodać 15 ml roztworu chloroformu:metanolu (2:1) do resztek komórkowych. Pozostaw probówkę w ciągłym mieszaniu przez noc, aby wyekstrahować niekowalencyjnie połączone lipidy z powierzchni komórki prątków.
    UWAGA: Jeśli orbitalna platforma wibracyjna nie jest dostępna, ciągłe mieszanie można zastąpić okresowym mieszaniem ręcznym tak często, jak to możliwe.
  6. Odstaw mieszaninę na 1 godzinę. Za pomocą pipety Pasteura odzyskaj rozpuszczalniki organiczne. Przykryj szklany lejek bibułą filtracyjną i przefiltruj rozpuszczalniki organiczne, a następnie zbierz je w tej samej szklanej probówce, która została poprzednio użyta w kroku 1.3. Użyj strumienia azotu gazowego, aby odparować fazę ciekłą w rurce. Napełnić probówkę azotem gazowym, zamknąć ją i ponownie przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Ekstrakcja kwasu mykolowego metodą kwasowej metalizy (Rysunek 2A)

  1. Dodaj 2-5 ml roztworu estryfikującego do hermetycznej szklanej rurki z nakrętką z wkładki PTFE. Dodać 0,2 g biomasy prątków do szklanej probówki.
    UWAGA: Roztwór estryfikacyjny powstaje przez zmieszanie 30 ml metanolu, 15 ml toluenu i 1 ml kwasu siarkowego. Komórki prątków można pobrać z kultur stałych lub nawet z komórek zdelipidowanych po przeprowadzeniu ekstrakcji całkowitych lipidów niezwiązanych kowalencyjnie z prątków (pozostałe komórki po przefiltrowaniu w kroku 1.6).
    UWAGA: Toluen jest substancją łatwopalną i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: Kwas siarkowy jest substancją i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
  2. Wymieszaj zawartość przez wirowanie. Pozostawić mieszaninę na noc w suchej kąpieli w temperaturze 80 °C.
  3. Pozwól probówce ostygnąć, aż osiągnie temperaturę pokojową, a następnie dodaj 2 ml n-heksanu do probówki. Mieszaj zawartość przez wirowanie przez 30 s i pozwól probówce osiąść, aż pojawią się dwie klarowne fazy.
    UWAGA: n-heksan jest substancją potencjalnie łatwopalną, drażniącą, szkodliwą dla środowiska i niezwykle niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
  4. Odzyskać górną fazę odpowiadającą fazie n-heksanu. Przenieś go do nowej probówki.
  5. Powtórz krok 2.3. Ponownie odzyskać górną fazę i przenieść ją do tej samej probówki, która została użyta w kroku 2.4.
  6. Odparować zawartość probówki za pomocą strumienia azotu gazowego. Napełnij probówkę azotem gazowym, zamknij ją i przechowuj w temperaturze 4 °C.

3. Ekstrakcja kwasu mykolowego metodą zmydlania i metylacji (Rysunek 2B)

  1. Zdrap 0,2 g prątków z podłoża stałego i dodaj do szklanej rurki z nakrętką z PTFE.
  2. Dodać 2 ml roztworu metanolu i benzenu (80:20) zawierającego 5% wodorotlenku potasu. Wymieszaj zawartość przez wirowanie. Podgrzewać mieszaninę przez 3 godziny w temperaturze 100 °C.
    UWAGA: Benzen jest substancją łatwopalną, rakotwórczą i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
  3. Pozwól probówce ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodać 20% kwasu siarkowego w celu zakwaszenia próbek, aby osiągnąć pH = 1.
  4. Dodać 3 ml eteru dietylowego. Delikatnie wymieszaj zawartość przez wirowanie.
  5. Niech uformują się dwie fazy przez osiadanie. Odzyskaj fazę eteru dietylowego i przenieś do nowej probówki. Powtórz krok prania w sumie trzy razy.
  6. Przemyć ekstrakt eteru dietylowego 2 ml wody destylowanej i przenieść górną część odpowiadającą eterowi dietylowemu do nowej probówki. Powtórz krok prania w sumie trzy razy.
  7. Dodać 2 g bezwodnego siarczanu sodu do ekstraktu z eteru dietylowego, aby go wysuszyć.
  8. Przefiltrować zawiesinę. Odparować zawartość za pomocą strumienia gazowego azotu.
  9. Aby przeprowadzić etap metylacji, rozpuść 3 g N-nitrozo-N-metylomocznika we wstępnie schłodzonym roztworze utworzonym przez 45 ml eteru dietylowego i 9 ml 40% KOH w wodzie destylowanej.
    UWAGA: N-nitrozo-N-metylomocznik jest substancją toksyczną, drażniącą, rakotwórczą i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
  10. Przenieść supernatant (diazometan) do nowej kolby schłodzonej w lodzie zawierającej granulki wodorotlenku potasu (około 30 g).
    UWAGA: Jeśli supernatant nie zostanie natychmiast użyty, można go przechowywać w temperaturze -20 °C maksymalnie przez 1 godzinę
    UWAGA: Granulki wodorotlenku potasu są substancją drażniącą i. Materiał ten musi być używany w okapie z przepływem laminarnym, przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: Diazometan jest wysoce toksyczny i potencjalnie wybuchowy. Należy go używać w okapie z przepływem laminarnym ze szkłem bezpiecznym, przy użyciu odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
  11. Dodać 2 ml roztworu eteru zawierającego diazometan, otrzymanego w kroku 3.10, do wysuszonego ekstraktu eteru dietylowego, który zawiera kwasy mykolowe, otrzymanego w kroku 3.8. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Odparować zawiesinę w temperaturze 40 °C. Napełnić probówkę azotem gazowym, zamknąć ją i przechowywać metylowane lipidy w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Odparować diazometan z roztworu eteru pod okapem z przepływem laminarnym, aż eter straci żółty kolor.

4. Analiza metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)

  1. Nasącz szklaną komorę TLC. W tym celu przykryj jedną ze ścian komory TLC kawałkiem bibuły filtracyjnej i pozwól jej zetknąć się z fazą ruchomą utworzoną przez mieszaninę rozpuszczalników. Umieść pozostałą objętość rozpuszczalnika na dnie komory TLC.
    UWAGA: Dno komory TLC musi być przykryte co najmniej 1 cm fazą ruchomą. W obecnych eksperymentach wykorzystano różne fazy ruchome do opracowania TLC. Składały się one z 85 ml n-heksanu i 15 ml eteru dietylowego; 100 ml dichlorometanu; 90 ml chloroformu, 10 ml metanolu i 1 ml wody; 30 ml chloroformu, 8 ml metanolu i 1 ml wody; 60 ml chloroformu, plus 35 ml metanolu i 8 ml wody; 95 ml chloroformu plus 5 ml metanolu; i 90 ml eteru naftowego (60–80 °C) plus 10 ml eteru dietylowego.
    UWAGA: W dwuwymiarowym TLC użyj n-heksanu:acetonu (95:5) w pierwszym kierunku trzy razy i użyj pojedynczego wywołania z toluenem:acetonem (97:3) w drugim kierunku, aby przeanalizować skład kwasu mykolowego. Aby przeanalizować PIM, użyj chloroformu:metanolu:wody (60:30:6) w pierwszym kierunku raz i użyj chloroformu:kwasu octowego:metanolu:wody (40:25:3:6) w drugim kierunku. Do analizy PDIM i AG należy trzykrotnie użyć eteru naftowego (60-80 °C): octanu etylu (98:2) w pierwszym kierunku i użyć pojedynczego wywołania z eterem naftowym (60-80 °C):acetonu (98:2) w drugim kierunku.
    UWAGA: Eter dietylowy jest substancją potencjalnie toksyczną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: Dichlorometan jest substancją potencjalnie toksyczną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: Eter naftowy jest substancją potencjalnie łatwopalną, szkodliwą dla środowiska i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: Kwas octowy jest substancją potencjalnie łatwopalną i. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: Octan etylu jest substancją łatwopalną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: Aceton jest substancją łatwopalną i niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
  2. Zamknij komorę TLC, aby nasycić ją przez co najmniej 20 minut. W międzyczasie rozpuść lipidy obecne w szklanej probówce w 0,2-1 ml chloroformu.
    UWAGA: Objętość użyta do rozpuszczenia lipidów może być modyfikowana w zależności od pożądanego lub oczekiwanego stężenia próbki.
  3. Nanieść 10 μl każdej zawiesiny za pomocą szklanej rurki kapilarnej bezpośrednio na płytkę TLC i pozostawić próbkę do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Próbki należy nakładać w dolnej części płytki, pozostawiając 1 cm z każdej strony. Próbki muszą być oddalone od siebie o co najmniej 0,5 cm. Po nałożeniu próbki na płytkę, probówki można ponownie odparować za pomocą azotu gazowego i przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego wykorzystania.
  4. Włożyć płytkę do nasyconej komory TLC zawierającej fazę ruchomą. Pozwól, aby faza ruchoma przebiegała przez TLC.
    UWAGA: Każdy ruch zastosowany w komorze TLC wpływa na płyn płynący rozpuszczalnik na płytce i wpływa na ruchliwość lipidów. W przypadku wykonywania dwuwymiarowej TLC, wymagane są dwie komory TLC, które muszą zawierać oba systemy elucji.
  5. Wyjąć płytkę z komory TLC, gdy rozpuszczalnik osiągnie odległość 1 cm od górnego końca płytki. Pozostawić płytkę pod strumieniem laminarnym do całkowitego wyschnięcia krzemionki.
    UWAGA: W przypadku analizy składu kwasu mykolowego przy użyciu n-heksanu i eteru dietylowego (85:15), powtórz kroki 4.4 i 4.5 jeszcze dwa razy, aż do trzykrotnego przeprowadzenia fazy ruchomej na płytce TLC.
  6. Odsłoń płytkę z wymaganą plamą; w razie potrzeby podgrzej płytę.
    UWAGA: W niniejszym eksperymencie do rozpylania płytek TLC użyto 15-20 ml następujących roztworów: 10% hydrat kwasu molibdatofosforowego w etanolu, aż płytka stanie się jasnożółta, a następnie podgrzanie płytki w temperaturze 120 °C; 5% w etanolu 20% α-naftolu w kwasie siarkowym, a następnie podgrzanie płytki do 120 °C; Odczynnik Molibden Blue (1,3% tlenek molibdenu w 4,2 M kwasie siarkowym) do momentu pojawienia się pasm fosforanowych lub 1% antronu w kwasie siarkowym.
    UWAGA: Hydrat kwasu molibdatofosforowego jest substancją łatwopalną i. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: Etanol jest substancją potencjalnie łatwopalną i niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: 1-Naftol jest substancją łatwopalną, i niezwykle niebezpieczną. Musi być używany w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).
    UWAGA: Odczynnik w sprayu Molibdenum Blue jest substancją, toksyczną i niezwykle niebezpieczną. Należy go używać w kapturze z przepływem laminarnym, w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu pokazania szerokiego zakresu lipidów obecnych w różnych gatunkach prątków, wybrano M. bovis BCG, ponieważ jest to szorstki i wolno rosnący prątek. W procedurze dodano szorstkie i szybko rosnące M. fortuitum i M. brumae, a na koniec uwzględniono również gładki morfotyp M. abscessus. Te cztery gatunki pozwalają nam na wizualizację szerokiego spektrum lipidów pochodzących z prątków, takich jak acylotrehalozy (AT), GPL, PDIM, PGL, PIM, TDM i TMM. Co więcej, wszystkie cztery gatunki ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono prosty protokół uznawany za złoty standard metody ekstrakcji niekowalencyjnie połączonych związków lipidowych ze ściany komórkowej prątków. Pokazano dalszą wizualizację za pomocą jedno- i dwuwymiarowych TLC z wyekstrahowanych lipidów czterech różnych prątków.

Dwie kolejne połączone mieszaniny chloroformu i metanolu w celu odzyskania zawartości lipidów w komórkach prątków są najczęściej stosowaną mieszaniną rozpuszczalników 23,24,25,26,27,28,29.<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez hiszpańskie Ministerstwo Nauki, Innowacji i Uniwersytetów (RTI2018-098777-B-I00), Fundusze FEDER oraz Generalitat Katalonii (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido jest laureatką kontraktu doktorskiego (FI) z Generalitat de Catalunya.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kwas octowyMerck100063UWAGA. Bezwodny do analizy EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur
AcetonCarlo Erba400971NUWAGA. ACETON RPE-ACS-ISO DO ANALIZ ml 1000
AnthroneMerck8014610010Anthrone do syntezy.
BenzenCarlo Erba426113UWAGA. Benzen RPE - Do analizy - ACS 2,5 l
Szklana rurka kapilarnaMerckBR708709MARKA®   jednorazowe BLAUBRAND®   mikropipety, intraMark
ChloroformCarlo Erba412653UWAGA. Chloroform RS - Do HPLC - Klasa izokratyczna - Stabilizowany etanolem 2,5 L
Suchy blokgrzewczy J.P. Selecta7471200
DiklorometanCarlo Erba412622UWAGA. Dichlorometan RS - Do HPLC - Klasa izokratyczna - Stabilizowany amylenem 2,5 L
Eter dietylowyCarlo Erba412672UWAGA. Eter dietylowy RS - Do HPLC - Klasa izokratyczna - Niestabilizowany 2,5 L
octanu etyluPanreac1313181211UWAGA. Octan etylu (Reag. USP, Ph. Eur.) do analizy, ACS, ISO
Alkohol etylowy AbsoluteCarlo Erba4146072UWAGA. Etanol absolutny bezwodny RPE - Do analizy - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Lejek szklanyVidraFOCDURA.2133148 1217/1
Rurka szklanaVidraFOCVFOC.45066A-16125Rurka szklana z nakrętką z odzysku PTFE
MetanolCarlo Erba412722UWAGA. Metanol RS - Do HPLC - ZŁOTO - Ultragradientowy stopień 2,5 L
Hydrat kwasu molibdetofosforowegoMerck51429-74-4UWAGA.
Odczynnik w sprayu Molibdenum Blue, 1,3%SigmaM1942-100MLUWAGA.
n-heksanCarlo Erba446903UWAGA. n-Heksan 99% RS - ATRASOL - Do analizy śladów 2,5 L
n-nitrozo-n-metylomocznikaSigmaN4766UWAGA
Orbitalna platforma wibratorskaDDBiolab995018NB-205L Inkubator laboratoryjny
Eter naftowy (60-80º C)Carlo Erba427003UWAGA. Eter naftowy 60 - 80° C RPE - Do analizy 2,5 L
OpryskiwaczVidraFOC712/1
Siarczan sodu bezwodnyMerck238597
Kwas siarkowy 95-97%Merck1007311000UWAGA. Kwas siarkowy 95-97%
komora TLCMerckZ204226-1EAProstokątne zbiorniki do wywoływania TLC, kompletne L i razy; H i czasy; szer. 22 cm i razy; 22 cm i razy; Płytka TLC 10 cm
Merck1057210001TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
Grzejnik płytowyTLC CAMAG223306CAMAG TLC Plat Heater III
ToluenCarlo Erba488551UWAGA. Toluen RPE - Do analizy - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
VortexFisher Scientific10132562IKA  Agitador IKA vó rtex 3
1-naftolSigma-Aldrich102269427UWAGA.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
  2. Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
  3. Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
  4. Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315(2017).
  5. Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
  6. Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985(2020).
  7. Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217(2017).
  8. Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
  9. Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185(2016).
  10. Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
  11. Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
  12. Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
  13. Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232(2016).
  14. Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
  15. Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  16. Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
  17. Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734(2020).
  18. Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
  19. Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
  20. Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
  21. Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
  22. Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
  23. Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
  24. Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
  25. Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
  26. Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
  27. Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
  28. Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
  29. Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
  32. Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
  33. Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
  34. Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
  35. Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
  36. Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
  37. Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
  38. Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035(2015).
  39. Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
  40. Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
  41. Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacteria LipidsLipid ExtractionThin Layer ChromatographyMycolic Acid AnalysisMycobacterial Cell WallOrganic Solvent ExtractionOne Dimensional TLCTwo Dimensional TLCPhenolic GlycolipidsGlycopeptidolipids

Related Articles