Artykuł metodologiczny

Analiza ilościowa dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się komórek

DOI:

10.3791/62369

⸱

22 maja 2021

 ,  , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole prezentujemy eksperymentalne procedury testu rozprzestrzeniania się komórek, który opiera się na mikroskopii żywych komórek. Dostarczamy narzędzie obliczeniowe typu open source do bezstronnej segmentacji komórek znakowanych fluorescencyjnie i ilościowej analizy dynamiki lamellipodiów podczas rozprzestrzeniania się komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozprzestrzenianie się komórek to dynamiczny proces, w którym komórka zawieszona w podłożu przyczepia się do podłoża i spłaszcza się z zaokrąglonego kształtu do cienkiego i rozłożystego. Po przyczepieniu się komórka-substrat, komórka tworzy cienki arkusz lamellipodiów emanujący z ciała komórki. W blaszkach monomery globularne aktyny (G-aktyny) polimeryzują w gęstą nitkowatą siatkę aktyny (F-aktyna), która naciska na błonę plazmatyczną, zapewniając w ten sposób siły mechaniczne wymagane do rozprzestrzeniania się komórki. Warto zauważyć, że gracze molekularni, którzy kontrolują polimeryzację aktyny w lamellipodiach, są niezbędne dla wielu innych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek i endocytoza.

Ponieważ rozprzestrzeniające się komórki tworzą ciągłe lamellipodia, które rozciągają się na całe obrzeża komórek i stale rozszerzają się na zewnątrz, testy rozprzestrzeniania się komórek stały się skutecznym narzędziem do oceny kinetyki wypukłości blaszkowatych. Chociaż opracowano kilka technicznych implementacji testu rozprzestrzeniania się komórek, obecnie brakuje szczegółowego opisu przepływu pracy, który obejmowałby zarówno protokół krok po kroku, jak i narzędzia obliczeniowe do analizy danych. W tym miejscu opisujemy procedury eksperymentalne testu rozprzestrzeniania się komórek i przedstawiamy narzędzie typu open source do ilościowej i bezstronnej analizy dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się. W połączeniu z manipulacjami farmakologicznymi i/lub technikami wyciszania genów, protokół ten jest podatny na badanie przesiewowe na dużą skalę graczy molekularnych regulujących wypukłości blaszkowate.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Występy blaszkowate to wyraźne struktury cytoszkieletu utworzone na początku migrującej komórki. W lamellipodiach polimeryzacja aktyny za pomocą kompleksu Arp2/3 i formin tworzy szybko rosnącą rozgałęzioną siatkę aktyny, która napiera na błonę plazmatyczną1,2. Siła pchająca generowana przez siatkę aktynową fizycznie popycha komórkę do przodu1,3,4,5. Zubożenie kompleksu Arp2/3 lub zakłócenie szlaków sygnałowych niezbędnych dla wypukłości lamelipodialnych często upośledza migrację komórek6, 7. Chociaż odnotowano również migrację komórek z niedoborem blaszek i blaszek8,9, znaczenie lamellipodiów w migracji komórek jest oczywiste, ponieważ zubożenie tej wystającej struktury zaburza zdolność komórki do poruszania się w złożonych mikrośrodowiskach biologicznych6,10.

Główną przeszkodą w zrozumieniu regulacji lamellipodiów w migrujących komórkach jest naturalna zmienność kinetyki, rozmiaru i kształtu wystających blaszek blaszkowatych11,12,13,14. Co więcej, ostatnie badania wykazały, że lamellipodia wykazują złożone zachowania wystające, w tym zmienne, okresowe i przyspieszające wypukłości14,15. W porównaniu z bardzo zmiennymi lamellipodiami migrujących komórek6,16, lamellipodia powstające podczas rozprzestrzeniania się komórek są bardziej jednolite12. Ponieważ aktywność wystająca rozprzestrzeniających się i migrujących komórek jest napędzana przez identyczne zespoły makromolekularne, które obejmują rozgałęzioną sieć aktyny, kurczliwe wiązki aktomiozyny i adhezje macierzy komórkowej oparte na integrynie17,18, rozprzestrzenianie się komórek jest szeroko stosowane jako model do badania regulacji dynamiki lamellipodiów.

Rozprzestrzenianie się komórek to dynamiczny proces mechanochemiczny, w którym komórka w zawiesinie najpierw przylega do substratu poprzez adhezje oparte na integrynie17,19,20, a następnie rozprzestrzenia się poprzez rozszerzanie wypukłości na bazie aktyny21,22,23. Podczas fazy rozprzestrzeniania się lamellipodia emanujące z ciała komórki wystają izotropowo i uporczywie, z niewielkim lub żadnym wycofaniem lub zatrzymaniem12. Najczęściej stosowanymi protokołami rozsiewania komórek są testy końcowe, w których komórki rozprzestrzeniające się są utrwalane w różnych momentach po posianiu19,24. Testy te, choć szybkie i proste, mają ograniczoną moc diagnostyczną do wykrywania zmian w dynamicznych cechach lamellipodiów. Aby określić mechanizmy molekularne, które kontrolują dynamikę lamellipodiów, grupa Sheetz była pionierem w zastosowaniu analizy ilościowej żywych komórek rozprzestrzeniających się i odkryła wiele podstawowych właściwości wypukłości krawędzi komórek11,12,22. Badania te wykazały, że test rozprzestrzeniania się żywych komórek jest solidną i potężną techniką w zestawie narzędzi laboratorium biologii komórki. Mimo to szczegółowy protokół i narzędzie obliczeniowe typu open source do badania rozprzestrzeniania się żywych komórek są obecnie niedostępne dla społeczności zajmującej się biologią komórki. W tym celu nasz protokół określa procedury obrazowania żywych komórek rozprzestrzeniających się i zapewnia narzędzie do automatycznej analizy obrazu. Aby zwalidować tę metodę, zastosowaliśmy hamowanie Arp2 / 3 jako leczenie eksperymentalne i wykazaliśmy, że hamowanie funkcji kompleksu Arp2 / 3 nie zatrzymało rozprzestrzeniania się komórek, ale spowodowało znaczne zmniejszenie prędkości wysunięcia komórek, a także stabilność wystających krawędzi komórek, powodując postrzępione krawędzie komórek. Dane te pokazują, że połączenie obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy obrazu jest użytecznym narzędziem do analizy dynamiki krawędzi komórki i identyfikacji składników molekularnych regulujących blaszkowatość.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sadzenie komórek

UWAGA: Opisany protokół rozprzestrzeniania komórek został przeprowadzony przy użyciu mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) eksprymujących PH-Akt-GFP (marker fluorescencyjny dla3/PI(3,4)P2). Ta linia komórkowa została wygenerowana przez genomiczną integrację konstruktu ekspresji dla PH-Akt-GFP (Addgene #21218) przez edycję genów za pośrednictwem CRISPR. Jednak inne markery fluorescencyjne, które ulegają ekspresji przejściowej lub są zintegrowane z genomem, mogą być również wykorzystane w tym teście. W celu optymalnej segmentacji obrazu zalecamy stosowanie markerów fluorescencyjnych, które są równomiernie rozmieszczone w cytoplazmie, np. cytozolowego GFP.

  1. Hoduj 10 cm naczynie komórek do 90% zgrywania.
  2. Gdy komórki osiągną prawidłowe zlanie, umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm (#1.5; grubość 0,17 mm) w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm. Pokryj szkiełko nakrywkowe 400 μl fibronektyny, która została rozcieńczona w PBS do końcowego stężenia 2,5 μg/ml.
    UWAGA: Liczba szkiełek nakrywkowych wymaganych do przeprowadzenia testu zależy od liczby warunków doświadczalnych i repliki technicznej.
  3. Umieścić szalkę o średnicy 35 mm ze szkiełkiem nakrywkowym pokrytym fibronektyną w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 1 godzinę.
  4. Wyjąć naczynie ze szkiełkiem nakrywkowym z inkubatora. Odessać fibronektynę i przemyć szkiełko nakrywkowe PBS, delikatnie pipetując wokół szkiełka nakrywkowego dwa do trzech razy.
  5. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z 10 cm naczyń komórek i umyć naczynie PBS.
  6. Dodaj 650 μl 0,05% trypsyny-EDTA do 90% zlewającego się naczynia komórek, przechylając naczynie, aby równomiernie rozprowadzić enzym. Umieść naczynie z trypsyną w inkubatorze na 1 minutę.
  7. Wyjąć naczynie z komórkami z inkubatora. Dodać 10 ml pożywki do hodowli komórkowych do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Szybko dodaj kolejne 10 ml pożywki do naczynia, aby ugasić trypsynę.
  8. Odpipetować 1 ml trypsynizowanych komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w celu rozcieńczenia komórek. Odpipetuj zawartość probówki w górę i w dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek w podłożu. W przypadku typów komórek o dużej skłonności do agregacji zaleca się filtrowanie komórek przez sitko komórkowe (rozmiar oczek 100 μm) w celu zminimalizowania występowania zlepiania się komórek.
  9. Z probówki odpipetować 500 - 1000 μl rozcieńczonych komórek do 35 mm szalki zawierającej szkiełko nakrywkowe.
  10. Delikatnie potrząśnij naczyniem, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe ma ~10% zbiegu (~50 000 komórek/ml) i dostosuj objętość rozcieńczonych komórek zgodnie z potrzebami.
    UWAGA: Celem posiadania komórek o tak niskiej konfluencji jest zapewnienie, że w każdym polu widzenia znajdują się 1-2 spolaryzowane komórki, które zostaną wykorzystane do skupienia celu podczas akwizycji rozprzestrzeniania się komórek.
  11. Przejście 1/5 pozostałych komórek w 10-centymetrowym naczyniu do jednego 6-centymetrowego naczynia na każdy warunek poddania działaniu substancji. Umieścić pasujące naczynia i szalkę 35 mm z szkiełkiem nakrywkowym w inkubatorze na noc.
    UWAGA: Będą to komórki, które zostaną przeanalizowane pod kątem dynamiki rozprzestrzeniania się.

2. Inkubacja leków i odzyskiwanie komórek

  1. Dodać 5 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdej z dwóch probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i 20 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej do każdej z dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Liczba par probówek (15 ml + 50 ml) powinna odpowiadać liczbie warunków doświadczalnych.
  2. Aby przetestować znaczenie Arp2/3 dla rozprzestrzeniania się komórek, należy odpipetować farmakologiczny inhibitor Arp2/3, CK-666 lub leczenie kontrolne, takie jak DMSO, do każdej pary probówek wirówkowych do pożądanego stężenia.
  3. Wyjąć z inkubatora pasażowane 6-centymetrowe szalki (patrz krok 1.11) i zassać podłoże. Umyj naczynia ciepłym PBS.
  4. Dodaj zawartość 15 ml probówek wirówkowych z dodatkiem CK-666 lub DMSO do każdej z pasujących naczyń. Oznacz każde danie odpowiednim lekiem i umieść naczynia w inkubatorze na godzinę.
  5. Wyjąć szalki z inkubatora i zassać pożywkę. Umyj naczynia ciepłym PBS, aby dokładnie usunąć wszystkie pozostałe media z czerwieni fenolowej.
  6. Dodaj 230 μl 0,05% trypsyny-EDTA do każdej 6 cm szalki i inkubuj komórki przez 1 minutę.
    UWAGA: W razie potrzeby trypsynę można zastąpić nieproteolitycznym blokerem adhezji komórek.
  7. Wyjmij naczynia z inkubatora. Do każdego zabiegu dodać 5 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej uzupełnionej lekiem do 15 ml probówki wirówkowej oznaczonej jako "Probówka B". Dodaj dodatkowe 5 ml tego samego podłoża do odpowiedniego naczynia, aby ugasić trypsynę. Przenieść zawartość naczynia do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml oznaczonej jako "Probówka A".
  8. Przenieść 1 ml komórek z probówki A do probówki B. Powtórzyć tę czynność dla każdego zabiegu.
  9. Umieść probówki A i B w inkubatorze na 45 minut, aby komórki mogły zregenerować się po trypsynizacji. Lekko poluzuj nakrętkę probówek wirówkowych przed umieszczeniem ich w inkubatorze, aby umożliwić penetrację CO2.
    UWAGA: Czas rekonwalescencji może się różnić w zależności od typu komórek. Chociaż w naszych eksperymentach 45-minutowa regeneracja miała znikomy wpływ na żywotność komórek, niektóre typy komórek mogą ulegać anoikis, gdy są utrzymywane w zawieszeniu zbyt długo. Dlatego zalecamy empiryczne określenie optymalnego czasu rekonwalescencji. Optymalny czas odzyskiwania umożliwia szybkie i synchroniczne rozprzestrzenianie się komórek bez martwych lub apoptotycznych komórek w próbce.

3. Przygotowanie komory magnetycznej

  1. Upewnij się, że wszystkie części 1-dołkowej komory magnetycznej Chamlide Cell, która może pomieścić kwadratowe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm, zostały wyczyszczone przed użyciem.
  2. Wyjąć szalkę 35 mm ze szkiełkiem nakrywkowym (patrz krok 1.11) z inkubatora. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i umyć szkiełko nakrywkowe ciepłym PBS.
  3. Usuń szkiełko nakrywkowe z szalki 35 mm za pomocą kleszków i delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na dolnej płycie komory magnetycznej.
  4. Umieść silikonową uszczelkę na wierzchu szkiełka nakrywkowego.
    UWAGA: Nieprawidłowo umieszczona uszczelka silikonowa jest najczęstszą przyczyną nieszczelności komory magnetycznej. Upewnij się, że uszczelka spoczywa we wgłębieniu dolnej płyty i nie wystaje poza wgłębienie.
  5. Przymocuj korpus główny do dolnej płyty.
    UWAGA: Wykonuj tę część bardzo powoli. Dobrą wskazówką jest przytrzymanie dolnej płyty jedną ręką podczas umieszczania korpusu głównego na górze. Gwarantuje to, że magnesy korpusu głównego nie podnoszą dolnej płyty do góry, co mogłoby potencjalnie przemieścić i spowodować pęknięcie szkiełka nakrywkowego.
  6. Dodaj 1 ml DMEM wolnego od czerwieni fenolowej uzupełnionej lekiem do komory magnetycznej. Weź niestrzępiącą się chusteczkę i ostrożnie przetrzyj obudowę między korpusem a dolną płytą, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków.
    UWAGA: W przypadku wycieku szybko odessaj nośnik i przejdź ponownie od kroku 3.4.
  7. Opuść przezroczystą pokrywę na korpus główny, aby zamknąć komorę magnetyczną.
  8. Najpierw spryskaj chusteczkę laboratoryjną wodą i wytrzyj dno komory magnetycznej (szkiełko nakrywkowe, a nie część metalową). Następnie spryskaj drugą chusteczkę laboratoryjną niewielką ilością 70% etanolu i wytrzyj, uważając, aby nie popękać szkiełka nakrywkowego.

4. Akwizycja obrazu

  1. Rozgrzej inkubator górny i podgrzewacz do 37 °C i ustaw poziom CO2 w inkubatorze górnym na 5%.
    UWAGA: Jeśli inkubator stage top nie jest podłączony do źródła CO2, pożywkę do hodowli komórkowych należy uzupełnić 25 mM HEPES, aby utrzymać stałe pH 7,4.
  2. Nałóż odpowiednią ilość olejku immersyjnego na wstępnie podgrzany obiektyw olejowy 60X, 1.4 N.A.
    UWAGA: W tym protokole używamy obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 60X, 1,4 N.A. ze względu na jego dość duże pole widzenia i wyjątkową skuteczność zbierania światła. Jeśli wymagane jest większe pole widzenia, można użyć obiektywu o mniejszym powiększeniu (np. 20x), o ile stosunek sygnału do szumu obrazów jest większy niż 2,5.
  3. Przynieś zarówno gotową komorę magnetyczną, jak i rurkę B (krok 2.9) do mikroskopu konfokalnego. Umieść komorę magnetyczną na inkubatorze stage top.
    UWAGA: Delikatnie umieść komorę magnetyczną na scenie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w olejku immersyjnym.
  4. Ustaw ostrość na komórki fluorescencyjne za pomocą kanału GFP. Upewnij się, że krawędź komórki jest ostra i dobrze zdefiniowana.
  5. Zdjąć przezroczystą pokrywę komory magnetycznej i odpipetować 500 μl z probówki B do komory magnetycznej. Umieść przezroczystą pokrywę z powrotem na górze komory magnetycznej.
  6. Aby zidentyfikować komórki idealne do analizy rozprzestrzeniania się komórek, należy poszukać "halo" komórek, które jeszcze nie przyczepiły się do szkiełka nakrywkowego, ale już się nie toczą. Komórki, które są w najwcześniejszych stadiach przyczepiania się szkiełka nakrywkowego, są również świetnymi kandydatami, ale akwizycja obrazu musi być szybka, aby uchwycić rozprzestrzenianie się.
  7. Skonfiguruj akwizycję obrazu poklatkowego dla kanału zielonego tak, aby zawierała cztery pola widzenia, obrazowane w odstępach 6-sekundowych.
    UWAGA: Ze względu na dużą zmienność prędkości wypukłości lamelipodiów między różnymi typami komórek, optymalna liczba klatek na sekundę powinna być określona empirycznie. Stosowany w naszych eksperymentach odstęp obrazowania wynoszący 6 sekund jest dobrym punktem wyjścia do analizy wielu komórek mezenchymalnych i nabłonkowych. Jednak komórki, które rozprzestrzeniają się bardzo szybko (np. komórki odpornościowe), mogą wymagać znacznie większej liczby klatek na sekundę (krótszy interwał obrazowania). Optymalna liczba klatek na sekundę dla filmów z rozlewaniem komórek zapewnia przemieszczenie wystającej krawędzi komórki o 2-5 pikseli między kolejnymi klatkami. Biorąc pod uwagę dokładność dopasowania krzywej stosowanej do identyfikacji plateau rozprzestrzeniania się komórek, optymalna liczba klatek na sekundę powinna również zapewnić 50-100 pomiarów przemieszczenia krawędzi komórki podczas fazy szybkiego rozszerzania się komórek. Liczba pól widzenia powinna być dostosowana w zależności od czasu naświetlania, odległości między punktami akwizycji i prędkości ruchu sceny. Zaleca się, aby użytkownicy określili maksymalną liczbę pól widzenia, które można uzyskać z żądaną liczbą klatek na sekundę.
  8. Po określeniu odpowiedniego pola widzenia zapisz współrzędne X i Y stolika mikroskopu. Kontynuuj identyfikowanie trzech innych pól widzenia, które znajdują się stosunkowo blisko siebie na szkiełku nakrywkowym. Zapisz współrzędne stolika mikroskopu dla każdego żądanego pola view.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się optymalizację ścieżki ruchu stołu montażowego między polami widzenia w celu zminimalizowania niepotrzebnych ruchów próbki. Taka optymalizacja może być wykonywana ręcznie lub automatycznie. Nadmierny ruch próbki spowalnia akwizycję i może spowodować, że komórki znikną z pola widzenia podczas opadania.
  9. Pobieraj obrazy przez 15 minut z 6-sekundową liczbą klatek na sekundę i zapisz pliki. Jeśli wymagane jest więcej przejęć, powtórz czynność, zaczynając od kroku 4.6.

5. Analiza obszaru komórki, kolistości i dynamiki wypukłości podczas rozprzestrzeniania się komórek

  1. Przygotowanie obrazów do przetwarzania i analizy danych
    UWAGA: Oprogramowanie wymaga obrazu w formacie .tiff i rozmiaru piksela jako parametrów wejściowych. Oba wymagania mogą być spełnione za pomocą oprogramowania do akwizycji lub Fidżi (w tym protokole). Jeśli te wymagania są spełnione, przejdź do kroku 5.2.
    1. Zainstaluj najnowszą wersję aplikacji Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Otwórz zdjęcie poklatkowe za pomocą Fidżi.
    3. Skopiuj rozmiar obrazu w pikselach, wybierając opcję Obraz > Właściwości. Skopiuj i wklej rozmiar piksela w μm do Notatnika/Worda.
    4. W celu analizy obszaru rozproszenia komórek i kołowości zapisz obraz poklatkowy jako stos obrazów TIFF. Niestandardowe oprogramowanie analityczne nie obsługuje zastrzeżonych formatów plików. Zapisz stos obrazów tiff dla poszczególnych komórek, wybierając pozycję Plik > Zapisz jako > Tiff.
  2. Zainstaluj IDE języka Python (Spyder) i niezbędne pakiety (PySimpleGUI i tifffile) do przetwarzania i analizy danych.
    UWAGA: Instalacja Pythona i pakietów jest wymagana tylko do początkowej konfiguracji.
    1. Filmy poklatkowe będą analizowane w Spyder IDE przy użyciu niestandardowego skryptu Pythona. Aby pobrać Spyder IDE, pobierz dystrybutora Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual), który zawiera Spyder IDE oraz większość niezbędnych bibliotek i pakietów do tej analizy.
    2. Zainstaluj Anacondę i uruchom Spyder za pomocą Anaconda Navigator.
    3. Na karcie konsoli IPython (znajdującej się w prawej dolnej sekcji Spydera) skopiuj i wklej następujące polecenie: install PySimpleGUI i naciśnij Enter. Uruchomienie tego polecenia spowoduje zainstalowanie pakietu potrzebnego do zainicjowania graficznego interfejsu użytkownika (GUI).
    4. W tej samej konsoli skopiuj i wklej następujące polecenie: install tifffile i naciśnij Enter. Uruchomienie tego polecenia spowoduje zainstalowanie pakietu potrzebnego do zapisania obrazów jako plików tiff.
    5. Pobierz wszystkie skrypty języka Python z plików uzupełniających lub najbardziej zaktualizowane skrypty z usługi GitHub pod adresem: https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
  3. Ilościowe określanie obszaru komórki i czynników kształtu komórki podczas rozprzestrzeniania się komórek
    1. Otwórz główny skrypt analizy "cell_spreading_GUI.py", wybierając opcję otwórz plik w górnym panelu Spyder lub używając skrótu Ctrl + O.
    2. Otwórz graficzny interfejs użytkownika analizy rozkładu komórek, wybierając "Uruchom plik" w górnym panelu lub używając skrótu F5.
    3. Kliknij kartę Obszar rozkładu komórek (Rysunek 3A).
    4. Wybierz obraz tiff do analizy za pomocą przycisku przeglądania.
      UWAGA: Wybrany plik musi być plikiem tiff.
    5. Określ katalog docelowy, w którym będą zapisywane dane wyjściowe (np. maski komórek, wartości).
    6. Określ ustawienia wydruku danych:
      1. Zapisz maski: Zapisuje maski komórek wygenerowane podczas procesu segmentacji.
      2. Eksportuj dane: Eksportuj arkusz kalkulacyjny programu Excel (.xlsx), który zawiera wszystkie dane analizy, do folderu docelowego.
        Obszar komórki, okrągłość i proporcje wszystkich rozmieszczających się komórek zostaną zapisane jako arkusz kalkulacyjny Excel w folderze docelowym. Powierzchnia komórki jest obliczana jako:
        figure-protocol-1
        Okrągłość komórki jest miarą tego, jak blisko komórki znajduje się idealnie okrągła komórka. Oblicza się go jako:
        figure-protocol-2
        gdzie A i P są odpowiednio powierzchnią komórki i obwodem komórki. Współczynnik proporcji komórki określa, jak wydłużona jest komórka. Komórka rozkładu powinna mieć współczynnik proporcji zbliżony do 1. Współczynnik proporcji jest obliczany jako:
        figure-protocol-3
      3. Zapisz kontury: Zapisz obrazy nakładki konturów obwiedni komórki w folderze docelowym.
    7. Określanie ustawień segmentacji
      1. Pokaż segmentację: Pokaż wynik segmentacji w konsoli Spyder podczas procesu analizy.
      2. Najmniejsza powierzchnia komórki (μm2): Wprowadź minimalną wartość obszaru komórki, w tym wartości powierzchni komórek w początkowych etapach dołączania. Obiekty o powierzchni mniejszej niż ten próg nie będą traktowane jako rozlewające się komórki. Liczba ta będzie miała wpływ na proces segmentacji.
    8. Określ parametry obrazu.
      1. Interwał akwizycji (s): Wprowadź częstotliwość akwizycji obrazu w sekundach.
      2. Rozmiar piksela (μm): Wprowadź rozmiar piksela, który został zarejestrowany podczas przygotowywania obrazów do analizy.
      3. Głębia bitowa obrazu: Wprowadź głębię bitową kamery/detektora.
    9. Kliknij przycisk Uruchom. Jeśli pojawi się błąd, w konsoli Spydera pojawi się komunikat o błędzie. W przeciwnym razie proces analizy obrazu zostanie wyświetlony w console.
      UWAGA: Pierwszy obraz, który pojawi się w sekcji konsoli/Wykresy (w zależności od ustawień Spyder) pokazuje wszystkie komórki zidentyfikowane w polu widzenia. Zielone pola umieszczone wokół komórek wskazują rozrzucane komórki, które nadają się do segmentacji i analizy. Szare pola wskazują komórki, które nie nadają się do analizy. Łączna liczba zidentyfikowanych komórek rozprzestrzeniania pojawi się również na karcie Konsola. Oprogramowanie wykreśla obszar komórki (na niebiesko) i okrągłość komórki (na czerwono) w funkcji czasu. Wykresy te pozwalają użytkownikom ocenić dokładność segmentacji komórek. Udana segmentacja daje monotonicznie rosnącą krzywą dla obszaru komórki. Aby uzyskać reprezentatywną krzywą obszaru rozprzestrzeniania się komórek, fazę opóźnienia należy ręcznie usunąć z wykresu. Faza opóźnienia obejmuje pomiary powierzchni komórki, zanim komórka zacznie się rozprzestrzeniać. Faza opóźnienia jest wskazywana przez szybkie fluktuacje, jak pokazano na wykresie obszaru komórki ( Rysunek 3C po prawej).

6. Ilościowe określanie dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się komórek za pomocą kymografów

  1. Przed uruchomieniem analizy należy przyciąć surowe filmy rozprzestrzeniających się komórek, aby utworzyć szeregi czasowe poszczególnych komórek rozprzestrzeniających się.
    1. Użyj narzędzia Prostokąt na pasku narzędzi Fidżi, aby ręcznie wybrać obszar zainteresowania (ROI), który hermetyzuje pojedynczą komórkę. (Aby upewnić się, że zwrot z inwestycji w pełni obejmuje komórkę rozsiewającą, użyj funkcji przewijania, aby sprawdzić zwrot z inwestycji we wszystkich punktach czasowych.)
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy ROI i wybierz Duplikuj.
    3. Zaznacz opcję Zduplikowany stos i kliknij przycisk OK.
  2. Otwórz główny skrypt analizy "cell_spreading_GUI.py", wybierając przycisk Otwórz plik na pasku narzędzi Spydera lub używając skrótu Ctrl + O. Jeśli graficzny interfejs użytkownika został już otwarty, przejdź bezpośrednio do kroku 6.3.
  3. Otwórz graficzny interfejs użytkownika analizy rozkładu komórek, wybierając opcję Uruchom plik w górnym panelu lub używając skrótu F5 (Rysunek 3B).
  4. Kliknij kartę Generator i analiza Kymograph.
  5. Użyj przycisku przeglądania, aby wybrać obraz tiff do analizy.
    UWAGA: Zastrzeżone formaty plików, np. nd2, lif, zen, nie są obsługiwane przez skrypt.
  6. Określ folder docelowy, w którym mają zostać zapisane dane wyjściowe (maski komórek i wartości).
  7. Określ ustawienia wyjściowe.
    1. Eksportuj dane: Eksportuj arkusz kalkulacyjny programu Excel (.xlsx) do folderu docelowego, który zawiera względne pozycje krawędzi komórek i zdarzenia wycofywania kymogramów.
  8. Określ parametry obrazu:
    1. Interwał akwizycji (s): Wprowadź częstotliwość akwizycji obrazu w sekundach.
    2. Rozmiar piksela (μm): Wprowadź rozmiar piksela, który został zarejestrowany podczas przygotowywania obrazów do analizy w kroku 5.1.3.
    3. Najmniejsza powierzchnia komórki (μm2): Wprowadź minimalną wartość obszaru komórki, w tym wartości powierzchni komórek w początkowych etapach dołączania. Obiekty o powierzchni mniejszej niż ten próg nie będą traktowane jako rozlewające się komórki. Liczba ta będzie miała wpływ na proces segmentacji.
    4. Głębia bitowa obrazu: Wprowadź głębię bitową kamery/detektora.
  9. Kliknij przycisk Uruchom. Jeśli pojawi się błąd, w konsoli Spydera pojawi się komunikat o błędzie. W przeciwnym razie podsumowanie kwantyfikacji dynamiki wypukłości zostanie wyświetlone w konsoli. Będą 4 pary pomiarów częstotliwości cofania i prędkości wypukłości, które są wyodrębniane z 4 kymografów generowanych z górnej, dolnej, lewej i prawej części komórki. Częstotliwość retrakcji oblicza się jako:
    figure-protocol-4
    UWAGA: Ta liczba pokazuje, jak często blaszka cofa się w trakcie rozprzestrzeniania się. Średnia prędkość wysunięcia jest mierzona przez nachylenie między początkiem występu a punktem płaskowyżu na kimografie. Podsumowujący rysunek kimograficzny zostanie wyświetlony w konsoli po segmentacji. Aby zapisać rysunek podsumowujący, kliknij go prawym przyciskiem myszy i zapisz obraz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższy protokół opisuje procedury eksperymentalne obrazowania żywych komórek rozprzestrzeniających się oraz narzędzie obliczeniowe do ilościowej analizy dynamiki rozprzestrzeniania się komórek. Narzędzie obliczeniowe może być używane w formacie nisko- lub wysokoprzepustowym do identyfikacji graczy molekularnych regulujących maszynerię polimeryzacji aktyny na krawędzi natarcia komórki.

Schematyczne przedstawienie procedur eksperymentalnych jest przedstawione w Rysunek 1. T...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany test rozprzestrzeniania się komórek pozwala na ciągłe śledzenie zmian morfologicznych (np. wielkości i kształtu komórki) oraz ruchów krawędzi komórek (tj. prędkości wypukłości i częstotliwości retrakcji), które są cechami, których brakuje w większości protokołów rozprzestrzeniania komórek19,24. Podczas gdy powszechnie stosowane testy rozprzestrzeniania się komórek w punkcie końcowym pozwalają na określenie szybkości rozprzestrzeniania si...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Connaught Fund New Investigator Award dla S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (granty RGPIN-2015-05114 i RGPIN-2020-05881), University of Manchester i University of Toronto Joint Research Fund, oraz University of Toronto XSeed Program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% trypsyna (0,05%), 0,53 mM EDTABisent Bioproducts325-042-CL
10,0 cm szalka Petriego, polistyren, poddana działaniu TC, wentylowanaStarstedt83.3902
15 mL Probówka wirówkowa PP o wysokiej przejrzystości, stożkowe dno, z nakrętką z uszczelką kopułkową, sterylnaFalcon352097
1-dołkowa Chamlide CMS do szkiełek nakrywkowych 22 mm x 22 mmQuorum TechnologiesCM-S22-1
35 mm Naczynie do hodowli komórkowych Easy-Grip Style z powłoką TC
50 ml, przezroczysta, gniazdo z uszczelką zatyczkową602002
6,0 cm Naczynia do hodowli komórkowych poddane obróbce w celu zwiększenia przyczepu komórek, sterylnyVWR10861-658
Arp2/3 I, kamera CK-666Millipore Sigma182515
, Prime 95B-25MMFotometria
Dimetylosulfotlenek, SterylnyBioShopDMS666
DMEM, 1x, 4,5 g/L Glukoza, z L-Glutaminą, Pirogronianem Sodu i Fenolem CzerwoneBioprodukty Żubrów319-005 CL
DMEM/F-12, HEPES, Bez Czerwieni FenolowejGibco11039021
D-PBS, 1XBioprodukty z żubra311-425 CL
Płodowa surowica bydlęcaBioprodukty żubra080-110
Fidżi SoftwareImageJ
HEPES (1 M)Gibco15630080
Oczyszczone białko fibronektyny z ludzkiego osocza 1 mgMillipore SigmaFC010
Olejek immersyjnyCargille16241
Roztwór L-glutaminy (200 mM)Bioproduktyżubra609-065-EL
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Gibco11140050
Okulary Micro Cover Glasses, kwadratowe, nr 11/2 22 x 22 mmVWRCA48366-227-1
NikonEclipse Ti2-E
, olej CFI Plan Apo Lambda 60XNikonMRD01605
Penicylina-StreptomycynaSigmaP4333
Wirujący dysk, światło grzebienia V2CrestOptics
SpyderAnakonda
Inkubator górnyTokai Hit
Statistics Software,Prism GraphPad
, Styl 2Mikroskopia elektronowa Nauki78326-42
Probówka wirówkowa Falcon 353001 inhibitor kompleksu Korpus mikroskopu , obiektyw pęseta

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
  2. Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells. PLoS Biology. 5 (11), 317(2007).
  3. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  4. Mogilner, A., Oster, G. Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments. Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).
  5. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  6. Wu, C., et al. Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis. Cell. 148 (5), 973-987 (2012).
  7. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. Journal of cell science. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
  8. Gupton, S. L., et al. Cell migration without a lamellipodium. The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).
  9. Dimchev, V., et al. Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708(2021).
  10. Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).
  11. Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves. Cell. 116 (3), 431-443 (2004).
  12. Dubin-Thaler, B. J., et al. Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading. PLoS ONE. 3 (11), 3735(2008).
  13. Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration. The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).
  14. Wang, C., et al. Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging. Nature Communications. 9 (1), 1688(2018).
  15. Dimchev, G., et al. Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation. Journal of cell science. 133 (7), 239020(2020).
  16. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).
  17. Yamada, K. M., Kennedy, D. W. Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function. The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).
  18. Cai, Y., et al. Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow. Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).
  19. Humphries, M. J. Cell adhesion assays. Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).
  20. Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  21. Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -G., Sheetz, M. P. Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
  22. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).
  23. Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events. Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).
  24. Guan, J. -L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. Cell Migration, Developmental Methods and Protocols. Methods in molecular biology. 294, Clifton, N.J. 55-68 (2004).
  25. Raucher, D., et al. Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion. Cell. 100 (2), 221-228 (2000).
  26. Machacek, M., Danuser, G. Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes. Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).
  27. Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency. The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).
  28. Bardsley, W. G., Aplin, J. D. Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves. Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wypustki lamellipodialnepolimeryzacja aktynytest rozprzestrzeniania si kom rekmikroskopia konfokalnazautomatyzowana analiza obrazuzarodkowe fibroblasty mysieinhibicja Arp2 3

Powiązane artykuły