Przygotowanie i charakterystyka docelowych mikropęcherzyków

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest przygotowanie, oczyszczenie i scharakteryzowanie wypełnionych gazem mikropęcherzyków (ukierunkowanych środków kontrastowych do ultradźwiękowego obrazowania molekularnego). Opisano dwa systemy celowania: biotynylowane pęcherzyki przylegające do streptawidyny oraz cykliczne mikropęcherzyki peptydu RGD, które wiążą się z α_{vβ 3}, znanym biomarkerem neowaskulatury nowotworu.

Streszczenie

Celowanie w mikropęcherzyki (ultradźwiękowe środki kontrastowe do obrazowania molekularnego) jest badane od ponad dwóch dekad. Jednak metody przygotowania mikropęcherzyków i celowania w wiązanie ligandów są kłopotliwe, skomplikowane i długotrwałe. W związku z tym istnieje potrzeba uproszczenia procedury ukierunkowanego przygotowania mikropęcherzyków, aby zbliżyć ją do translacji klinicznej. Celem niniejszej publikacji jest przedstawienie szczegółowego opisu i wyjaśnienia etapów niezbędnych do celowego przygotowania mikropęcherzyków, charakterystyki funkcjonalnej i testowania. Przedstawiono sekwencję zoptymalizowanych i uproszczonych procedur dla dwóch systemów: modelu pary ukierunkowanej na biotynę-streptawidynę oraz cyklicznego peptydu RGD ukierunkowanego na rekombinowane białko α_vβ₃, które ulega nadekspresji na wyściółce śródbłonka neowaskulatury guza.

Tutaj pokazujemy, co następuje: kowalencyjne sprzężenie liganda celującego z kotwicą lipidową, ocena jakości odczynnika i testy potwierdzające pomyślne zakończenie reakcji; przygotowanie wodnego podłoża prekursorowego zawierającego składniki otoczki mikropęcherzykowej, a następnie przygotowanie mikropęcherzyków poprzez amalgamację; ocena skuteczności transferu lipidów do otoczki stabilizatora mikropęcherzyków; regulacja rozkładu wielkości mikropęcherzyków poprzez flotację przy normalna grawitacja w celu usunięcia większych mikropęcherzyków, które mogą być szkodliwe dla stosowania in vivo; ocena rozkładu wielkości mikropęcherzyków za pomocą czujników elektrostrefowych; ocena celowego wiązania mikropęcherzyków z powierzchnią pokrytą receptorem w statycznym teście wiązania (w odwróconym naczyniu); oraz ocena ukierunkowanego wiązania mikropęcherzyków z powierzchnią pokrytą receptorem w teście w komorze z przepływem równoległym.

Wprowadzenie

Obrazowanie molekularne z ukierunkowanymi mikropęcherzykami jest przedmiotem badań i testów od ponad dwóch dekad. Ogólna koncepcja jest prosta: mikropęcherzyki wypełnione gazem, które mają selektywne powinowactwo do biomarkera molekularnego specyficznego dla śródbłonka naczyniowego w obszarze choroby, są wstrzykiwane dożylnie. Cząstki te krążą i gromadzą się w celu (np. neowaskulatura guza lub obszar niedokrwiennego uszkodzenia zapalnego). Przylegające mikropęcherzyki są następnie wykrywane za pomocą kontrastowego obrazowania ultradźwiękowego. Wczesne badania koncepcyjne z zeszłego wieku^1,2 teraz stopniowo zmierzają w kierunku wdrożenia klinicznego: zaledwie kilka lat temu osiągnęły etap badań klinicznych na średnią skalę^3,4. Celem tego manuskryptu jest przedstawienie szczegółowego wyjaśnienia na temat przygotowania i charakterystyki takich docelowych mikropęcherzyków, w oparciu o dwa opublikowane przykłady^1,5.

Procedura przygotowania peptydu-PEG-fosfolipidu, kluczowego składnika do formułowania tych docelowych mikropęcherzyków, jest uzupełniona opisem kontroli jakości odczynników, zgodnie z wymaganiami dotyczącymi pomyślnego zakończenia reakcji. Niestety, niektórzy dostawcy aktywnych odczynników lipidowych estrowych dostarczają materiał, który jest hydrolizowany po przybyciu i dlatego nie jest w stanie uczestniczyć w tworzeniu wiązania amidowego. Podano informacje o tym, ile materiału lipidowego jest przenoszone na otoczkę mikropęcherzykową z pożywki wodnego podczas przygotowywania mikropęcherzyków, a także technikę uzyskiwania tych informacji.

Ważne jest, aby przygotować mikropęcherzyki o stosunkowo wąskim rozkładzie wielkości cząstek: współobecność dużych mikropęcherzyków w pożywkach iniekcyjnych do wewnątrznaczyniowych testów in vivo może prowadzić do zatkania mikrokrążenia; niespecyficzne nagromadzenie mikropęcherzyków, które omijają zastawki płuc, może powodować niespecyficzne fałszywie dodatnie wzmocnienie tkanki⁶, czego można uniknąć, usuwając mikropęcherzyki o większych rozmiarach. W związku z tym przedstawiono prostą procedurę wyboru wielkości cząstek, uzupełnioną opisem metody oceny stężenia i rozkładu wielkości cząstek za pomocą licznika cząstek.

Pierwszy protokół testowy do oceny celowania w mikropęcherzyki, przedstawiony poniżej, opisuje czysto modelowy system, z biotynylowanymi mikropęcherzykami skierowanymi na powierzchnię pokrytą streptawidyną¹. Drugi protokół opiera się na manuskrypcie opisującym uproszczone przygotowanie mikropęcherzyków ukierunkowanych na peptydy, ozdobionych cyklicznym peptydem RGD, który ma specyficzne powinowactwo do α_vβ₃, molekularnego biomarkera neowaskulatury nowotworu⁵. Wykazano, że mikropęcherzyki ozdobione tym cyklo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys], tj. peptydem c(RGDfK) za pomocą prezentowanej techniki, celują w neowaskulaturę guza i osiągają ultradźwiękowe obrazowanie molekularne w mysim modelu guza.

Protokół

1. Kowalencyjne sprzężenie peptydu z NHS-PEG-DSPE

1. Rozpuścić peptyd c(RGDfK) z pierwszorzędową ε-aminogrupą lizyny niezabezpieczoną i dostępną do sprzęgania w dimetylosulfotlenku (DMSO, 10 mg/ml). Przygotować roztwór metanolu lub chloroformu estru N-hydroksysukcynimidu poli(glikolu etylenowego)-3400-distearoilofosfatydyloetanoloaminy (NHS-PEG-DSPE, 200 mg/ml) i dodać do 1 mg peptydu w DMSO. Dodać 3 μl N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA).
   1. Utrzymuj stosunek molowy peptydu do NHS-PEG-DSPE co najmniej 1:1,2, aby wszystkie pierwszorzędowe grupy aminowe były w stanie zareagować. Utrzymuj stosunek molowy DIPEA:peptyd co najmniej 2:1, aby zapewnić podstawowe warunki pożywki.
      UWAGA: Chloroform, metanol i DIPEA są materiałami niebezpiecznymi. Używaj odpowiedniej ochrony, takiej jak rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary i dygestoria.
      UWAGA: Każdy inny peptyd lub mimetyk z pierwszorzędową grupą aminową może być użyty zamiast c(RGDfK), z niezabezpieczonym N-końcem lub lizyną umieszczoną poza miejscem wiązania. Aby reakcja mogła przebiegać, wszystkie składniki (tj. ligand celujący i lipid) muszą być rozpuszczalne w mieszaninie DMSO-chloroform. Alternatywne rozpuszczalniki, takie jak dimetyloformamid lub jego mieszaniny, mogą być również badane. Możliwa jest również reakcja w środowisku wodnym, ale wydajność sprzężenia będzie znacznie niższa ze względu na szybką hydrolizę aktywnego estru.
2. Po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej należy usunąć lotny materiał organiczny przez odparowanie (użyć strumienia gazowego azotu lub wyparki obrotowej, a następnie odparowania przez noc pod pompą wysokopróżniową, aby usunąć DMSO). Ponownie rozpuścić nielotną pozostałość w chloroformie w stężeniu 1 mg/ml w celu kontrolowanego pobierania próbek.
3. Potwierdzić zakończenie reakcji metodą chromatografii cienkowarstwowej (wywołać płytki TLC w pożywce chloroform:metanol rozpuszczalnik, 2:1 v/v). Potwierdzić obecność lub brak pierwszorzędowej grupy aminowej za pomocą sprayu ninhydryny po podgrzaniu płytki na bloku grzewczym o temperaturze 150 °C.
   UWAGA: Ninhydrin jest materiałem niebezpiecznym. Stosuj odpowiednią ochronę, jak opisano powyżej. Obróbka płyt TLC za pomocą bloku grzewczego musi być wykonywana w dygestorium. Blok grzewczy stanowi potencjalne zagrożenie pożarowe.
4. Przed przygotowaniem mikropęcherzyków należy podwielokrotnić próbkę peptydu-PEG-DSPE z chloroformu (np. 1 ml roztworu o stężeniu 1 mg/ml), odparować chloroform do sucha w strumieniu azotu gazowego, a następnie inkubować za pomocą pompy wysokopróżniowej, a następnie dodać sól fizjologiczną do 1 mg/ml w celu uzyskania przezroczystego roztworu micelarnego.
   1. Jeśli pożądane jest dalsze oczyszczanie mieszaniny reakcyjnej, należy ją ponownie rozpuścić w roztworze soli fizjologicznej. Następnie poddaj otrzymaną mieszaninę micelarną dializie (odcięcie masy cząsteczkowej 6-8 kDa lub podobne), najpierw z normalną solą fizjologiczną, a następnie z kilkoma zmianami wody dejonizowanej.
   2. Potwierdzić zakończenie dializy poprzez sprawdzenie przewodności dializatu. Wyjąć dializowany materiał z worka dializacyjnego, umieścić w fiolce o znanej masie i liofilizować aż do całkowitego wyschnięcia.
      UWAGA: Dostępna jest alternatywna reakcja kowalencyjna polegająca na przyłączeniu liganda do końca PEG-lipidu (np. reakcja maleimidu-PEG-DSPE z tiol-ligandem). Główną zaletą tego podejścia jest sprzężenie zorientowane, jeśli pojedynczy tiol jest dostępny na cząsteczce liganda ⁷. Głównym problemem jest długoterminowa stabilność: wynikowy związek między maleimidem a tiolem może być podatny na degradację w wyniku reakcji retro-Michaela, w zależności od warunków przechowywania ⁸.
      UWAGA: Jakość aktywnych odczynników estrowych znacznie różni się w zależności od producenta: może zależeć od warunków przenoszenia i przechowywania (jeśli materiał nie jest odpowiednio przechowywany lub transportowany, aktywny ester ulegnie hydrolizie i nie będzie w stanie połączyć się z peptydem). W związku z tym istnieje poczucie obowiązku opisania procedury (patrz poniżej) w celu określenia stopnia degradacji NHS-PEG-DSPE, odczynnika do kowalencyjnego przyłączania ligandów docelowych do mikropęcherzyków. NHS-PEG-DSPE, dostarczany w postaci suchego proszku pod argonem, jest przechowywany w głębokim zamrażaniu. Fiolkę doprowadza się do temperatury pokojowej (aby uniknąć kondensacji wilgoci), waży próbkę za pomocą wagi analitycznej i rozpuszcza w metanolu lub DMSO. Fiolkę z suchym odczynnikiem luzem należy zamknąć pod argonem i ponownie do głębokiego zamrożenia, w szczelnie zamkniętym pojemniku ze środkiem osuszającym, do czasu dalszego użycia.
   3. Przygotować wodny roztwór micelarny peptydu-PEG-DSPE (krok 1.4), a także biotyny-PEG-DSPE, poprzez proste dodanie suchego odczynnika do wodnego roztworu soli fizjologicznej i inkubację. Powstają małe kuliste miceli. Aby przyspieszyć przenoszenie odczynnika ze stanu masowego do postaci micelarnej, można zastosować sonikację i kąpiel w gorącej wodzie.
5. Ocenić jakość odczynnika aktywnego estru NHS-PEG-DSPE.
   1. Upewnij się, że NHS obecny w odczynniku ma postać aktywnego estru, aby móc przeprowadzić reakcję sprzęgania z tworzeniem wiązania amidowego.
   2. Umieścić 0,99 ml 0,1 M buforu tetraboranu sodu o pH 9,2 w kwarcowej lub przezroczystej dla ultrafioletu plastikowej kuwecie (nie szkle) w spektrofotometrze i wyzerować przy długości fali 260 nm.
   3. Dodać do kuwety 10 μl świeżo przygotowanego roztworu o stężeniu 200 mg/ml roztworu NHS-PEG-DSPE w metanolu. W tym samym czasie uruchom stoper. Szybko i energicznie wymieszaj zawartość kuwety, aby uzyskać jednorodność. Umieść kuwetę w fotometrze, zamknij pokrywę i rozpocznij pomiar.
   4. Na początku pomiaru spektrofotometrem należy zaznaczyć godzinę rozpoczęcia zapisu i nieprzerwanie wykonywać pomiary absorbancji fotometrycznej przy 260 nm co 10 s przez ~10 min, lub do momentu ustabilizowania się wartości absorbancji.
   5. Wykreślić krzywą kinetyczną, sprawdzić początkowe punkty czasowe A₂₆₀ i ekstrapolować krzywą na czas rozpoczęcia reakcji (tj. znaleźć A₂₆₀ w punkcie, w którym odczynnik został dodany do buforu wodnego i rozpoczęła się reakcja hydrolizy). Załóżmy, że przed dodaniem NHS-PEG-DSPE do buforu w kuwecie nie zaszła hydroliza w rozpuszczalniku organicznym z powodu braku wody.
   6. Obliczyć stosunek między A₂₆₀ na początku reakcji i na końcu hydrolizy; reprezentuje on frakcję zdegradowanego aktywnego estru. Skorzystaj z tych informacji, aby wybrać odpowiednią ilość NHS-PEG-DSPE w celu pełnej modyfikacji pierwszorzędowej grupy aminowej peptydu.

2. Przygotowanie mikropęcherzyków przez amalgamację

1. Przygotowanie biotynylowanych mikropęcherzyków
   1. Równorozpuścić distearoilofosfatydylocholinę (DSPC) i stearynian PEG w glikolu propylenowym (PG, stężenie 10 mg/ml dla każdego w czystym rozpuszczalniku). Użyj gorącej kąpieli wodnej, aby rozpuścić materiały.
   2. Dodać 0,1 ml tego gorącego roztworu PG do fiolki zawierającej 0,85 ml gorącej soli fizjologicznej, szybko wymieszać i dodać micelarną biotynę-PEG-DSPE (50 μl, 1 mg/ml w soli fizjologicznej) w stosunku masowym 1:20 do DSPC.
      UWAGA: Rozpuszczalność składników lipidowych w PG jest zależna od temperatury, dlatego konieczna jest kąpiel w gorącej wodzie. Pomocne jest podgrzanie szklanej fiolki zawierającej sól fizjologiczną w gorącej łaźni wodnej przed dodaniem lipidów, aby uzyskać jednolite podłoże bez widocznych cząstek.
   3. Doprowadzić fiolkę do temperatury pokojowej, umieścić gumowy korek na fiolce, włożyć do połowy i włożyć rurkę kapilarną z PTFE do fiolki. Użyj strumienia dekafluorobutanu, aby napełnić fiolkę, a następnie zamknij korek, jednocześnie usuwając kapilarę.
      UWAGA: Temperatura fiolki podczas łączenia może mieć znaczący wpływ na rozkład wielkości powstałych mikropęcherzyków ⁹.
   4. Zaciśnij zakorkowaną fiolkę w temperaturze pokojowej i umieść w aparacie do amalgamatora. Uruchom amalgamator. Zastosowana jednostka kliniczna jest zaprogramowana na pracę z prędkością 4300 obr./min przez 45 sekund.
   5. Po zakończeniu mieszania należy wyjąć fiolkę z powstałymi mikropęcherzykami z amalgamatoru. Najlepiej scharakteryzować rozkład wielkości i skład mikropęcherzyków i zużyć je w ciągu kilku godzin od przygotowania.
2. Przygotowanie mikropęcherzyków ozdobionych peptydami
   1. Współrozpuść DSPC i stearynian PEG w czystym PG (stężenie 10 mg/ml dla każdego materiału). Użyj gorącej kąpieli wodnej do rozpuszczania. Dodać 0,1 ml tego gorącego roztworu w PG do fiolki zawierającej 0,85 ml gorącej normalnej soli fizjologicznej, szybko wymieszać i dodać peptyd micelarny-PEG-DSPE (50 μl, 1 mg / ml w soli fizjologicznej) dodany w stosunku masowym 1:20 do DSPC.
   2. Doprowadzić fiolkę do temperatury pokojowej, umieścić gumowy korek na wierzchu fiolki, włożyć do połowy i włożyć rurkę kapilarną z politetrafluoroetylenu (PTFE) do fiolki. Użyć strumienia dekafluorobutanu do napełnienia fiolki, a następnie zamknąć korek, jednocześnie usuwając kapilarę.
   3. Zaciśnij zakorkowaną fiolkę i umieść w amalgamatze w celu wymieszania. Fiolka z dyspersją mikropęcherzykową jest gotowa w 45 sekund.
3. Przygotowanie mikropęcherzyków lipidowych barwnika do oceny transferu lipidów do otoczki mikropęcherzykowej
   1. Rozpuść DSPC i stearynian PEG w czystym PG, jak opisano powyżej (użyj gorącej kąpieli wodnej) (stężenie 10 mg/ml dla każdego materiału).
   2. Dodaj 0,1 ml tego gorącego roztworu PG do fiolki z 0,89 ml gorącej normalnej soli fizjologicznej, szybko wymieszaj, dodaj 10 μl roztworu barwnika DiI (1 mg / ml w czystym PG) i wymieszaj. Doprowadzić fiolkę do temperatury pokojowej.
   3. Napełnić przestrzeń nad fiolką dekafluorobutanem jak powyżej, zakorkować fiolkę, zacisnąć i zmieszać jak opisano powyżej.

3. Przetestuj transfer lipidów DiI z wodnego podłoża micelarnego do otoczki bąbelkowej

1. W celu potwierdzenia pod mikroskopem, że fluorescencyjny materiał lipidowy przeniósł się z podłoża wodnego do otoczki mikropęcherzykowej, należy pobrać próbkę porcji mikropęcherzyków z fiolki przez przegrodę za pomocą strzykawki insulinowej.
   1. Następnie dodaj kroplę do szkiełka i przykryj ją standardowym szkiełkiem nakrywkowym. Najpierw rozcieńczyć go kroplą odgazowanej soli fizjologicznej.
   2. Wykonuj mikroskopię za pomocą mikroskopu wideo, wyposażonego w fluorescencyjne oświetlenie epi-iluminacyjne, 100-krotny obiektyw olejowy i kamerę wideo o wysokiej czułości.
2. Aby określić skuteczność przenoszenia materiału lipidowego z wodnego roztworu soli fizjologicznej/pożywki PG do otoczki pęcherzykowej podczas amalgamacji, należy wziąć szczelnie zamkniętą fiolkę z mikropęcherzykami, odwrócić ją i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
   1. Przeprowadzić odwirowanie w wirniku kubełkowym (10 min, 200 x g). Wyjąć fiolkę z wirówki i trzymać ją odwróconą.
   2. Wprowadzić igłę strzykawki insulinowej do przegrody odwróconej fiolki. Powoli odsysaj niewielką objętość (~50 μl) przezroczystego podnatlantu.
      UWAGA: Skośna końcówka igły do aspiracji w podkolorze z odwróconej fiolki po odwirowaniu musi być umieszczona jak najbliżej przegrody, aby zminimalizować ryzyko wchłonięcia mikropęcherzyków.
3. Umieścić próbki podnatantu (2 μl), jak również próbki oryginalnego podłoża lipidowo-PG-solankowego, które zostało użyte do wytworzenia mikropęcherzyków (2 μl) na 96-dołkowej płytce z 0,1 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS):etanol 1:1 z 1% Triton X-100.
4. Zmierz czerwoną fluorescencję barwnika DiI (wzbudzenie 555 nm, emisja 620 nm) za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych.
   1. Do spektroskopii fluorescencyjnej należy używać czarnych płytek z nieprzezroczystym dnem ze względu na niższe tło i brak transferu sygnału między dołkami, co może stanowić problem w przypadku przezroczystych płytek.
   2. Upewnij się, że sygnał fluorescencji mieści się w liniowym zakresie kalibracji: nadmierne stężenie barwnika w studzienkach może prowadzić do tłumienia światła i niedostatecznie zgłaszanego sygnału.
      UWAGA: Czasami może być pożądane usunięcie pozostałości materiału skorupy, który pozostaje w środowisku wodnym po połączeniu. Aby to zrobić, po odwirowaniu flotacji mikropęcherzyków, należy usunąć całą objętość podnatantu przez powolne zasysanie z odwróconej fiolki i zastąpić ją odgazowaną zwykłą solą fizjologiczną. Aby uniknąć nadmiernej zmiany ciśnienia otoczenia w fiolce spowodowanej usunięciem lub dodaniem płynu, należy wprowadzić dodatkową długą igłę do przegrody, aby dotrzeć do fazy gazowej wewnątrz fiolki. Aby utrzymać fazę gazową wewnątrz fiolki, najpierw należy podłączyć igłę do strzykawki wypełnionej gazem fluorowęglowodorowym, aby zapobiec kontaktowi powietrza z preparatem mikropęcherzykowym.

4. Regulacja rozkładu wielkości mikropęcherzyków

1. Użyj normalnej flotacji grawitacyjnej w statycznej odwróconej fiolce, aby dostosować rozkład wielkości mikropęcherzyków, tj. szybko i skutecznie usunąć największe mikropęcherzyki ^5,10.
2. Pobrać fiolkę z mikropęcherzykami natychmiast po przygotowaniu, jak opisano w punkcie 2. Odwróć i połóż do góry nogami na stabilnej, niewibrującej powierzchni na 15-20 minut.
3. Po tej inkubacji należy wprowadzić igłę strzykawki insulinowej do przegrody fiolki, gdy jest ona jeszcze odwrócona, i delikatnie zebrać 300-500 μl mikropęcherzyków z dolnej warstwy.
   UWAGA: Igła strzykawki musi przylegać do wewnętrznej powierzchni przegrody, aby uniknąć gromadzenia się większych pęcherzyków znajdujących się bliżej górnej części płynu w fiolce.
   1. Powoli odciągnąć tłok strzykawki, aby uniknąć turbulencji i hydrostatycznego rozszerzania się pęcherzyków w korpusie strzykawki. Po wyjęciu pobranej próbki ze strzykawki należy unikać nadciśnienia, aby zapobiec zapadaniu się pęcherzyków.
4. Przenieść dyspersję mikropęcherzyków ze strzykawki do fiolki o małej objętości. Następnie napełnić gazem perfluorowanym, korkiem i zaciskiem, w celu krótkotrwałego przechowywania, zliczania cząstek (patrz poniżej) i dalszego użycia.
   1. Jeśli pobieranie próbek odbywa się bezpośrednio ze strzykawki, należy trzymać poziomo i obracać, aby uniknąć flotacji pęcherzyków i uzyskać jednorodność próbki.

5. Ocena rozkładu wielkości mikropęcherzyków

1. Użyj licznika cząstek (opartego na wykrywaniu elektrostref lub zasadzie zaciemnienia światła), aby ocenić rozkład wielkości i stężenie cząstek. Alternatywnie użyj hemocytometru i mikroskopu.
   1. Na krótko dodaj podwielokrotność próbki mikropęcherzyków do normalnej soli fizjologicznej lub izotonu w komorze licznika (zwykle objętość 60-100 ml) i policz. Porównaj rozkład wielkości mikropęcherzyków przed i po oczyszczaniu flotacyjnym.
      UWAGA: Bezpośrednio przed pobraniem próbki należy poddać fiolkę delikatnemu mieszaniu (nie wirowaniu), aby uzyskać reprezentatywne i powtarzalne pomiary. Próbka ze środka badanej objętości.
   2. Napełnij zlewkę o pojemności 100 ml co najmniej 60 ml 0,9% rozcieńczalnika do roztworu soli fizjologicznej i umieść ją na stoliku przyrządu do wysyłania elektrostrefy. Podnieś stolik tak, aby rurka, zewnętrzna płytka elektrody i mieszadło były całkowicie zanurzone w rozcieńczalniku, a mieszadło mogło się obracać.
      UWAGA: Objętość rozcieńczalnika w zlewce można precyzyjnie określić na podstawie jego masy, za pomocą skali (gęstość soli jest bliska 1). Alternatywnie można zastosować pompę dozującą. Elektrody podczas badania wykrywania elektrostref powinny być całkowicie zanurzone.
   3. Zapisz objętość elektrolitu rozcieńczalnika w oprogramowaniu sterującym urządzeniem. Licznik elektrostrefowy wyposażony jest w kryzę o średnicy 50 μm, która umożliwia pomiar cząstek o średnicy od 1 do 30 μm. Najpierw wykonaj uruchomienie w tle; Oczekuje się, że będzie miał mniej niż 5000 zliczeń w 0,5 ml rozcieńczalnika w stanie ślepym. Najlepsze poziomy tła mogą mieć mniej niż 100 zliczeń.
   4. Ustawić objętość próbki w oprogramowaniu sterującym urządzeniem, aby uwzględnić współczynnik rozcieńczenia. Dodać 10-20 μl mieszaniny mikropęcherzyków do zlewki i wykonać drugi cykl.
   5. Użyj danych o rozkładzie rozmiaru tła, aby uwzględnić użycie funkcji "odejmij przebieg w tle" w oprogramowaniu. Stężenie cząstek w oryginalnej próbce mikropęcherzyków należy określić jako liczbę cząstek/ml; Obejmuje on współczynnik rozcieńczenia.
      1. Zewnętrzna powierzchnia końcówki pipety może być również pokryta pęcherzykami powietrza podczas pobierania próbek; należy ją wytrzeć przed włożeniem końcówki do podłoża zliczającego. Nie dotykaj otworu końcówki pipety chusteczką.
      2. Należy unikać niewystarczającego rozcieńczenia cząstek próbki podczas zliczania, aby zminimalizować problemy z korekcją koincydencji, gdy więcej niż jedna cząstka na raz znajduje się w otworze czujnika: system może wtedy zaniżyć stężenie cząstek.
         UWAGA: Średnica kryzy do zliczania cząstek może się różnić. Wybór kryzy 50 μm pozwala na wykrywanie mikropęcherzyków o średnicy do 1 μm, ale nie jest ona tak podatna na zapychanie, jak opcje o mniejszej średnicy.
      3. Skalibruj licznik czujników elektrostrefowych dla tych samych rozcieńczalników testowych (np. sterylnie przefiltrowanego normalnego roztworu do nawadniania solą fizjologiczną), który jest używany w rzeczywistych testach. Laserowa alternatywa dla wykrywania elektrostrefowego ma tę zaletę, że nie wymaga filtrowanej soli fizjologicznej o kontrolowanym stężeniu soli i przewodności elektrycznej.

6. Test celowania w mikropęcherzyki in vitro w teście adhezji/retencji

1. Przygotować powierzchnię receptora biomarkera do kierowania mikropęcherzyków na szalki Petriego.
   1. Weź styropianowe naczynia o średnicy 35 mm, które mają być użyte jako powierzchnia docelowa. Wykorzystaj niespecyficzne przyleganie białek do powierzchni naczynia polistyrenowego z normalnej soli fizjologicznej. Użyć białka modelowego, streptawidyny, do testowania celowania w biotynylowane pęcherzyki, które zawierają biotynę-PEG-DSPE jako część otoczki.
   2. Umieść kroplę roztworu streptawidyny (0,2 ml, 10 μg/ml w PBS) na środku każdej szalki Petriego i przykryj ją plastikowym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 22 mm, aby umożliwić równomierne pokrycie powierzchni szalki. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 4 °C w zamkniętym, wilgotnym środowisku, aby zapobiec wysychaniu naczynia, usunąć szkiełka nakrywkowe.
   3. Natychmiast i wyczerpująco przemyć płytki wodą, PBS, i zablokować je przez inkubację z 1,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez co najmniej 4 godziny, aby zminimalizować niespecyficzne przyleganie mikropęcherzyków do niepowlekanej powierzchni. Jako kontrole należy używać czystych naczyń hodowlanych zablokowanych 1,5% BSA.
   4. Alternatywnie można użyć rekombinowanego roztworu receptora_{α V}β₃ (np. w stężeniu 4 μg/ml w PBS)⁵ zamiast streptawidyny. Skieruj mikropęcherzyki do tego biomarkera za pomocą cyklicznego liganda peptydowego RGD przyłączonego do otoczki mikropęcherzyków.
   5. Utrzymuj naczynie z osadzonym receptorem docelowym mokrym: białko receptorowe może zostać dezaktywowane, jeśli wyschnie.
      UWAGA: Ważne jest, aby stosować białka receptorowe wolne od nośników, które nie zawierają żadnych białek nośnikowych ani środków powierzchniowo czynnych w pożywce - ich obecność dezaktywuje adhezję.
2. Adhezja mikropęcherzyków w małej kropelce: szybko sprawdź docelową przyczepność w warunkach statycznych.
   1. Umieść kroplę mikropęcherzyków (5-20 μl) od spodu na powierzchni docelowej (lub tylko kontrolnej BSA) na szalce Petriego, która jest odwrócona do góry nogami. Spowoduje to przeniesienie pęcherzyków na powierzchnię pokrytą receptorem przez flotację.
   2. Po 5-10 minutach inkubacji odwróconego naczynia w wilgotnym środowisku, odwróć naczynie z powrotem do normalnej pozycji, napełnij je PBS i delikatnie spłucz, aby usunąć wolne mikropęcherzyki. Wykonaj mikroskopię jasnego pola, aby ocenić docelową przyczepność.
3. Przyleganie mikropęcherzyków do powierzchni szalki Petriego: wykonaj celowanie w pełnym naczyniu¹.
   1. Weź naczynie, które ma powłokę na powierzchni receptora i napełnij je całkowicie odgazowanym buforem PBS-BSA (ponad 10 ml dla szalki 35 mm), tak aby menisk buforu wystawał ponad górną część naczynia i był utrzymywany przez siłę kapilarną. Wstrzyknąć pęcherzyki (50 μl) do masy buforu i szybko wymieszać do uzyskania jednorodności. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas mieszania.
   2. Szybko umieść na naczyniu fragment przezroczystej taśmy pakowej lub taśmy uszczelniającej do płytek hodowlanych, podparty płaskim kawałkiem plastiku. Uszczelnij folię ciśnieniowo do naczynia, odwróć "zespół" i umieść go do góry nogami na 30 minut, aby mikropęcherzyki mogły unosić się w górę, dotknąć powierzchni docelowej i przylegać.
   3. Odwróć zapieczętowany "zespół" naczynia z powrotem do konfiguracji "do góry nogami", usuń uszczelkę i zmyj nieprzylegające mikropęcherzyki, spłukując odgazowanym roztworem buforowym. Obserwuj docelowe mikropęcherzyki za pomocą mikroskopii lub obrazowania ultradźwiękowego.
      UWAGA: Gdy inkubuje się odwrócone, szczelne naczynie całkowicie wypełnione dyspersją mikropęcherzyków, można je umieścić pod niewielkim kątem, więc jeśli obecne są jakiekolwiek duże pęcherzyki, będą one unosić się na krawędzi naczynia, poza środkowym obszarem zainteresowania. Wymuszone płukanie z szybkim przepływem pochodzącym z końcówki mikropipety podczas mikroskopii może być wykorzystane do oceny, jak mocno pęcherzyki przylegają do celu (pęcherzyki całkowicie odrywają się od powierzchni kontrolnej nawet przy wolnym przepływie) ¹¹. Odgazowany bufor jest preferowany do rozcieńczania pęcherzyków, ponieważ nadmiar rozpuszczonego powietrza doprowadzi do niekontrolowanego wzrostu mikropęcherzyków.

7. Test celowania mikropęcherzyków in vitro: ocena dynamicznych testów adhezji/retencji w komorze przepływu równoległej płytki

UWAGA: Testujemy przyczepność biotynylowanych pęcherzyków do warstwy streptawidyny za pomocą obrazowania ultradźwiękowego.

1. Użyj dostępnej w handlu równoległej komory przepływowej z płytką ze specjalnie skonstruowanym uchwytem falownika, aby obserwować ukierunkowane przyleganie do szalki Petriego o średnicy 35 mm od przepływającego medium. Po adsorpcji białka docelowego w szalce (patrz ppkt 6.1.1), włożyć korpus komory z wstępnie zainstalowaną uszczelką do naczynia i zamknąć go w uchwycie. Stosować uszczelki o wysokości kanału (tj. grubości uszczelki) 0,127 mm i szerokości kanału 2,5 mm.
   UWAGA: Podczas montażu równoległej komory przepływowej płyty, ilość smaru silikonowego użytego na uszczelce powinna być minimalna. Nie pozwól, aby tłuszcz dostał się do obszaru kanału: unikaj pokrywania powierzchni pokrytej białkiem biomarkera smarem. Aby uzyskać prawidłowe uszczelnienie, należy starannie wybrać szalki 35 mm (patrz Tabela materiałów, aby uzyskać informacje o komorze i czaszy).
2. W przypadku montażu komory przepływowej nie należy zbyt mocno przykręcać nasadki i ramy, które przytrzymują kombinację komory przepływowej naczynia, aby uniknąć wycieku.
3. Podłączyć rurkę przepływową do pompy strzykawkowej pracującej w trybie poboru, a po stronie zasilacza podłączyć cienką rurkę polietylenową (PE50) do fiolki z rozcieńczoną dyspersją mikropęcherzykową, poddawaną ciągłemu mieszaniu z mieszadłem za pomocą mieszadła magnetycznego¹². Kontroluj parametr szybkości ścinania ścianek (WSR) komory, dostosowując objętościowe natężenie przepływu pompy na podstawie wzoru 6Q/bh², gdzie Q to natężenie przepływu, "b" to szerokość kanału, a "h" to wysokość kanału.
   UWAGA: Usuń pęcherzyki powietrza z całego systemu przed perfuzją pożywki zawierającej mikropęcherzyki lub PBS, ponieważ każdy pęcherzyk powietrza przechodzący przez kanał usunie przylegające mikropęcherzyki z powierzchni docelowej i unieważni eksperyment. Połączenie między rurką komory przepływowej a strzykawką musi być odpowiednio uszczelnione.
4. Przygotować dyspersję mikropęcherzyków, dodając obliczoną objętość zagęszczonych pęcherzyków do zbiornika mikropęcherzyków (fiolka scyntylacyjna o pojemności 20 ml) w celu uzyskania stężenia 10-6 mikropęcherzyków/ml w buforze PBS o zawartości 0,1% BSA. Umieść zbiornik podajnika na mieszadle z płytą magnetyczną. Włóż magnetyczny pręt mieszający o wymiarach 1 cm x 2 cm i mieszaj z prędkością ~400 obr./min, aby zachować jednorodność w trakcie badania.
5. Wykonaj obrazowanie ultrasonograficzne komory przepływowej w zbiorniku na wodę¹³.
   1. Zanurz zespół komory przepływowej w odgazowanej wodzie i przytrzymaj go na miejscu za pomocą ciężarka, aby zapobiec ruchowi podczas eksperymentów.
   2. Umieść sondę obrazową clamped bezpośrednio nad kanałem i przechyl ją pod kątem 15° do tyłu, a także pod kątem 5° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zminimalizować odbicie zwierciadlane od powierzchni czaszy. Umieść kanał komory przepływowej w płaszczyźnie obrazowania.
   3. Należy użyć następujących warunków obrazowania: przetwornik 15L8, tryb obrazowania specyficzny dla kontrastu, zakres dynamiczny 50 dB, 7 MHz, indeks mechaniczny (MI) = 0,18, wzmocnienie CPS = 0. Utrzymuj jednolitą kompensację przyrostu czasowego na całym obrazie.
   4. Umieść powierzchnię przetwornika tak, aby dotykała powierzchni wody, a nie głęboko zanurzona. Alternatywnie użyj gumowego rękawa ochronnego wypełnionego żelem ultradźwiękowym.
      UWAGA: Aby zagwarantować powtarzalne ustawienie systemu komory przepływowej do obrazowania, znaczniki należy umieścić na zbiorniku wodnym lub na ekranie systemu ultradźwiękowego.
6. Wprowadzić dyspersję mikropęcherzyków ze zbiornika przez komorę i do pompy na 2 minuty.
   1. Przełącz przepływ na PBS, aby usunąć nieprzylegające pęcherzyki z kanału i ocenić akustyczne rozproszenie wsteczne pozostałych przylegających (docelowych) pęcherzyków. Aby uzyskać obraz tła, zwiększ wskaźnik MI do 1,9, aby zniszczyć przylegające pęcherzyki w polu widzenia obrazowania ultrasonograficznego.
      UWAGA: Dyspersję mikropęcherzyków należy wymieniać w przypadku powtarzających się serii: przy dużym rozcieńczeniu mikropęcherzyki stopniowo ulegają degradacji z czasem.
7. Eksportuj pojedyncze obrazy ze strumienia wideo nagrania ekranu: przed płukaniem PBS, po płukaniu i po zniszczeniu, aby zaimportować je do ImageJ w celu analizy offline. Wybierz obszar zainteresowania (ROI), aby wykluczyć część wlotową i wylotową komory. Po odjęciu sygnału ROI tła określ ilościowo intensywność echa jako średnią intensywność pikseli w ROI.
   UWAGA: Jako alternatywę dla obrazowania ultradźwiękowego, przyleganie mikropęcherzyków do powierzchni docelowej można zaobserwować za pomocą mikroskopii wideo, gdy równoległy zespół komory przepływu płytki w odwróconym uchwycie jest umieszczony na stoliku mikroskopu złożonego, z zapisem wideo ^5,11,12,14. Jest to szczególnie przydatne do obrazowania ukierunkowanej adhezji mikropęcherzyków do receptorów biomarkerów na powierzchni komórki w hodowli komórkowej, gdy komórki wyrażające receptor są hodowane na szalce do hodowli tkankowej, a liczbę mikropęcherzyków związanych z każdą komórką docelową można policzyć bezpośrednio.

Wyniki

Kowalencyjne sprzężenie peptydu i lipidu
Zakończenie reakcji i pożądane powstanie produktu zostało potwierdzone przez TLC. Oddzielna kontrola peptydu bez reakcji nie przesunęła się w górę podczas TLC: została zachowana na początku, a jej miejsce było dodatnie dla pierwszorzędowej grupy aminowej, jak zaobserwowano po rozpyleniu ninhydryny, po podgrzaniu. Ta ninhydryno-dodatnia wolna plamka peptydowa nie była już obserwowana w mieszaninie po zakończeniu reakcji, po TLC próbki mieszaniny reakcyjnej, po usunięciu DIPEA, DMSO i ponownym rozpuszczeniu w chloroformie. Jeśli chodzi o kluczową kwestię jakości odczynnika estrowego NHS, Rysunek 1 przedstawia spektrofotometryczną ścieżkę kinetyki hydrolizy, przy czym punktem zerowym na początku reakcji jest moment dodania estru NHS w rozpuszczalniku organicznym do kuwety. Potwierdza to funkcjonalność aktywnego estru NHS karboksy-PEG-DSPE (patrz sekcja 1 metod). W punkcie zerowym ekstrapolowane A₂₆₀ = 0,33 reprezentuje materiał, który został już zhydrolizowany przed badaniem. Po zakończeniu reakcji hydrolizy, przez ponad 10-15 minut, A₂₆₀ = 1,54 (gdy absorbancja nie wzrasta już znacząco). Potwierdza to obecność aktywnego estru. Dostarcza również danych ilościowych, że ponad 78% materiału nie jest wstępnie zhydrolizowanym NHS, a zatem może być z powodzeniem stosowany do sprzęgania peptydów, przy odpowiednim dostosowaniu ilości odczynnika.

Przygotowanie i transfer materiału lipidowego z podłoża wodnego na powłokę bąbelkową: fluorescencja lipidów
Mikropęcherzyki do tego badania przygotowano tak, aby zawierały śladową ilość (poniżej 1%) barwnika fluorescencyjnego DiI, o charakterystycznej czerwonej fluorescencji, który dodano w postaci roztworu w PG do roztworu soli fizjologicznej PG DSPC i stearynianu PEG. Powstałe mikropęcherzyki wyraźnie wykazują fluorescencję powłoki, gdy w mikroskopie stosowane są filtry wzbudzenia światłem zielonym i czerwonym (patrz Rysunek 2, po lewej). Mikroskopia jasnego pola fazy gazowej mikropęcherzyków (Rysunek 2, po prawej) może być porównana z fluorescencją mikropęcherzyków otoczki. W celu ilościowej oceny transferu materiału lipidowego z fazy wodnej do otoczki pęcherzykowej, mikropęcherzyki unosiły się na wodzie za pomocą wirowania, a sygnał fluorescencyjny przezroczystej fazy infranatantowej porównano z fluorescencją roztworu początkowego przed amalgamatem mikropęcherzyków. Zaobserwowano redukcję sygnału prawie o rząd wielkości (Rysunek 3), tj. ponad 85% materiału lipidowego zostało przeniesione do otoczki mikropęcherzykowej przez amalgamację.

Przygotowanie i korekta rozkładu wielkości mikropęcherzyków
Mikropęcherzyki powstałe w wyniku amalgamacji wykazały typowy rozkład wielkości, o wysokim stężeniu (np. ~4,8 x 10⁹ cząstek na ml dla pęcherzyków biotynylowanych). Rozkład wielkości był szeroki, a cząstki znajdowały się w mierzonym zakresie (od 1 do 30 μm); ~6,3% mikropęcherzyków przekracza średnicę 5 μm (Rysunek 4, zielona krzywa). Donaczyniowe podawanie dużych mikropęcherzyków może prowadzić do ich niespecyficznego gromadzenia się w naczyniach włosowatych krwi i należy tego unikać. Krótka (15-17 min) flotacja odwróconej fiolki w normalnej grawitacji, z późniejszym pobraniem 0,3 ml blisko powierzchni przegrody, pozwala na całkowite usunięcie większych mikropęcherzyków, z niewielką utratą całkowitego stężenia liczby cząstek, do ~4,6 x 10⁹: po flotacji tylko 0,01% cząstek w oczyszczonej próbce ma średnicę powyżej 5 μm (Rysunek 4, czerwona krzywa).

Przyleganie mikropęcherzyków do powierzchni pokrytej receptorem: test statyczny
Procedura ta została po raz pierwszy opisana w poprzednim century¹ i jest używana jako szybki test, który potwierdza funkcjonalność docelowych mikropęcherzyków. Mikropęcherzyki mogą stykać się z powierzchnią naczynia przenoszącą receptor. Jeśli zachodzi oddziaływanie ligand-receptor, pęcherzyki mogą pozostać na powierzchni pomimo energicznego płukania. Przedstawiono przykład takiego szybkiego testu funkcjonalnej adhezji mikropęcherzyków c(RGDfK) do powierzchni pokrytej rekombinowanym α_vβ₃. Rysunek 5 to reprezentatywny obraz mikroskopowy w jasnym polu przylegających mikropęcherzyków na powierzchni receptora na szalce Petriego, po przemyciu PBS, w celu usunięcia niezwiązanych pęcherzyków. Bąbelki w tego typu mikroskopii występują jako ciemne okrągłe wzory. W podobnym stanie, jeśli powierzchnia jest pokryta tylko albuminą (w celu zablokowania niespecyficznej przyczepności), mikropęcherzyki nie będą przylegać i zostaną łatwo zmyte nawet przez delikatne płukanie.

Wiązanie mikropęcherzyków z przepływającego medium: równoległa komora przepływu płytowego
Procedura ta została początkowo zaproponowana jako narzędzie do badania adhezji komórek w warunkach kontrolowanego przepływu¹⁵ i zaadaptowana do badania celowania w mikropęcherzyki dziesiątki lat później¹¹. Testowanie w systemie przepływowym, w przeciwieństwie do testu statycznego, jest znacznie bardziej realistyczne w przypadku scenariusza obrazowania klinicznego, w którym pęcherzyki krążące w przepływie krwi na krótko dotykają ściany naczynia i mogą do niej przylegać, jeśli obecny jest receptor docelowy. Przedstawiono dwa przykłady takich badań. Pierwszym przykładem jest bardziej tradycyjne podejście, w którym przyleganie mikropęcherzyków ozdobionych peptydami do powierzchni pokrytej receptorem jest monitorowane za pomocą mikroskopii wideo. Mikroskopia pozwala odróżnić przylegające mikropęcherzyki od płynących. Pozwala to również na ilościowe określenie tych przylegających mikropęcherzyków w ramce obrazowania mikroskopu: znacznie więcej mikropęcherzyków c (RGDfK) (lewa kolumna) przylega do powierzchni, w porównaniu z kontrolą, w której stosuje się zaszyfrowany peptyd c(RADfK) lub jeśli powierzchnia jest pokryta tylko BSA (Rysunek 6).

Drugim przykładem jest obrazowanie ultrasonograficzne metodą kontrastową płytki Petriego pokrytej streptawidyną (Rysunek 7, prawa strona), do której biotynylowane mikropęcherzyki adsorbują się z powodzeniem z przepływającego medium i mogą być wykryte przez kontrastowe obrazowanie ultrasonograficzne po płukaniu PBS. Powierzchnia naczynia kontrolnego nie zatrzymuje żadnych przylegających mikropęcherzyków z przepływu, więc zasadniczo cały ultradźwiękowy sygnał kontrastowy jest usuwany za pomocą przepływu PBS. Kwantyfikacja ultradźwiękowego sygnału kontrastowego wykazuje silną istotność statystyczną zaobserwowanej różnicy; Stosunek sygnałów celu i sygnałów sterujących przekroczył rząd wielkości.

Rysunek 1. Kinetyka hydrolizy aktywnego estru NHS-PEG-DSPE, obserwowana przez uwalnianie NHS w środowisku alkalicznym za pomocą badań spektrofotometrycznych przy długości fali 260 nm. Punkt zerowy to czas dodawania NHS-PEG-DSPE w rozpuszczalniku organicznym do 0,1 M buforu boranowego o pH 9,2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Mikroskopia mikropęcherzyków wypełnionych gazem po połączeniu. Po lewej, mikroskopia fluorescencyjna (zielone wzbudzenie, czerwona emisja, barwnik otoczki lipidowej DiI). Po prawej, mikroskopia jasnego pola (obserwacja fazy gazowej), takie samo powiększenie. Szerokość ramki, 85 um (mikrometr stolikowy 10 μm osadzony w prawym dolnym rogu każdego obrazu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Spektroskopia fluorescencyjna próbki barwnika lipidowego DiI z pożywki do przygotowania mikropęcherzyków przed amalgamatem (po prawej) oraz po połączeniu i usunięciu mikropęcherzyków przez flotację odśrodkową (po lewej). Wzbudzenie fluorescencji - 555 nm, emisja - 620 nm. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Rozkład wielkości cząstek w liczbowym stężeniu mikropęcherzyków po przygotowaniu do amalgamacji (kolor zielony), z następującą po niej flotacją grawitacyjną w celu usunięcia dużych mikropęcherzyków (kolor czerwony) i zliczaniem tła tylko rozcieńczalnika (kolor niebieski). Elektrononowy czujnik zliczania cząstek w zwykłej soli fizjologicznej, kryza 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Mikroskopia w jasnym polu mikropęcherzyków c(RGDfK) na naczyniu pokrytym α_vβ₃. Szerokość ramki obrazu wynosi 106 μm; pasek to 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. In vitro w komorze z równoległym przepływem płytkowym mikropęcherzyki ozdobione peptydami na powierzchnię pokrytą rekombinowanym α_Vβ₃. Mikropęcherzyki ozdobione cRGDfK skutecznie przylegały do naczynia (po lewej), przyłączenie kontrolnych nieukierunkowanych mikropęcherzyków cRADfK (zaszyfrowanych, środkowych) było minimalne (p<0,00005), podobnie jak zatrzymywanie mikropęcherzyków na powierzchni kontrolnej zawierającej tylko albuminę (po prawej, p<0,0025). Naprężenie ścinające ścianki przepływu w komorze przy 1 dyn/cm². Adhezja mikropęcherzyków monitorowana za pomocą wideomikroskopii; Przedstawiona jest liczba cząstek w polu widzenia. Czas akumulacji wynosi 4 min. Dane przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe. Przedruk za zgodą od⁵. Prawa autorskie, 2018, Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Kontrastowe obrazowanie ultrasonograficzne równoległej komory przepływu płytek po ukierunkowanej adhezji i przepłukaniu buforem biotynylowanych mikropęcherzyków na naczyniu pokrytym streptawidyną (środek, przylegające docelowe mikropęcherzyki, po prawej, to samo naczynie, po wybuchu ultrasonograficznym o wysokim wskaźniku MI) i naczynie kontrolne pokryte tylko albuminą (po lewej). Dwie minuty perfuzji dyspersji mikropęcherzyków (PBS/BSA, 10⁶ cząstek/ml) przy szybkości ścinania 450 ^s-1, a następnie przepłukiwanie buforu. Kwantyfikacja sygnału ultradźwiękowego jest przeprowadzana z obszarów zainteresowania w klatkach wideo po odjęciu tła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Znaczenie prostej techniki przygotowania mikropęcherzyków ozdobionych ligandem jest oczywiste. Zastosowanie techniki amalgamacji do przygotowania mikropęcherzyków, zapoczątkowanej przez Ungera i wsp.^,16 , może służyć temu celowi z wielu powodów. Wytwarzanie mikropęcherzyków za pomocą amalgamatora jest łatwe do wykonania. Jednofazowa jednostka 120 V o niewielkich rozmiarach jest dostępna i niedroga. Procedura jest szybka (45 sekund) i skuteczna: od razu przygotowuje się 1 ml dyspersji mikropęcherzykowej w środowisku wodnym. Zawiera miliardy cząstek na ml, co jest więcej niż wystarczające do badań naukowych. Produkcja odbywa się w szczelnie zamkniętej fiolce z przestrzenią nad gazem perfluorowanym. W razie potrzeby zawartość fiolki pozostanie sterylna od momentu aseptycznego napełniania, podczas wytwarzania (łączenia) i do momentu użycia. To sprawia, że podejście to jest odpowiednie do użytku klinicznego, ponieważ nie wymaga skomplikowanych przygotowań w dedykowanym sterylnym środowisku klinicznym.

Procedura opiera się na samoorganizacji: podczas mieszania, gdy na powierzchnię faz gaz-woda w ruchomej fiolce przykładane jest wysokie ścinanie, powstają małe fragmenty gazu, które pod wpływem napięcia powierzchniowego przybierają kulisty kształt. PG, jako kosurfaktant, obecny w medium w wysokim stężeniu, zmniejsza napięcie powierzchniowe i energię potrzebną do wytworzenia granicy faz gaz-woda podczas ścinania. Następnie bardziej "klasyczne" środki powierzchniowo czynne, takie jak PEG-lipidy i fosfolipidy, które są obecne w znacznie niższych stężeniach, dostają się do granicy faz, najprawdopodobniej wypierając PG i tworząc monomolekularną warstwę na powierzchni pęcherzyka. Ta powłoka jest dość stabilna; Jest to prawdopodobnie spowodowane połączeniem "stałego" lipidu (temperatura przemiany fazowej DSPC wynosi 56 °C, więc nie jest podatny na fuzję międzybłonową) i przedłużonej powłoki szczotkowej PEG, która otacza mikropęcherzyki i hamuje bezpośredni kontakt monowarstwowy sąsiednich pęcherzyków. Można spekulować, że obecność wysokiego stężenia PG w pożywce może obniżyć stabilność otoczki mikropęcherzykowej. W przypadku jego braku mikropęcherzyki są stabilne w szczelnie zamkniętych fiolkach w atmosferze fluorowęglowodorowej przez wiele miesięcy, z tylko umiarkowanym topnieniem między pęcherzykami. W przypadku zastosowań klinicznych, z małym amalgamatem przy łóżku pacjenta, przerwa między przygotowaniem mikropęcherzyków a użyciem może być krótka, minuty lub godziny. Przy obecności PG w pożywce stężenie mikropęcherzyków nie wykazuje znaczącego spadku, przynajmniej przez kilka godzin przechowywania w lodówce.

Dodatkową zaletą opisanej procedury (wspomaganej przez zastosowanie kosurfaktantu PG w pożywce do przygotowania pęcherzyków) jest wysoka skuteczność (>85%) transferu lipidów do otoczki, podczas gdy tradycyjna sonikacja zapewnia ~20%^{skuteczność5}, a nowoczesne metody mikroprzepływowe jeszcze niższą17. Wysoki poziom wydajności transferu jest ważny nie tylko dlatego, że zmniejsza się marnotrawstwo materiału lipidowego i drogiego liganda, ale także dlatego, że zminimalizowana jest również ilość ligandów bezpęcherzykowych współobecnych w pożywkach. Wtedy wolny ligand może nie mieć możliwości zablokowania docelowego receptora biomarkera, z którym mikropęcherzyki mają się związać za pośrednictwem liganda na swojej powierzchni. Ogólna ilość receptora biomarkera w docelowym układzie naczyniowym jest często dość wysoka, więc może to nie mieć większego znaczenia. Na podstawie dostępnej literatury patentowej¹⁸ można zasugerować, że co najmniej 50% materiału otoczki lipidowej i liganda celującego w preparatach mikropęcherzykowych w testach klinicznych może być związane z otoczką pęcherzykową. Można to ogólnie porównać z radioznakowanymi przeciwciałami lub peptydami, które są szeroko stosowane w badaniach obrazowania receptorów medycyny nuklearnej: większość z tych ukierunkowanych na cząsteczki ligandów w rzeczywistości nie przenosi "gorącego" radioizotopu nawet dla najwyższej zgłoszonej aktywności specyficznej¹⁹, podczas gdy w przypadku docelowych mikropęcherzyków materiał otoczki w tym badaniu (w tym ligand-lipid) jest w większości przyłączony do mikropęcherzyków.

Selektywną adhezję docelowych mikropęcherzyków przygotowanych tą techniką zademonstrowano in vitro w dwóch zestawach modeli celowania: adhezji statycznej i eksperymentu celowania w komorze przepływowej. W teście statycznym docelowe mikropęcherzyki ściśle przylegały do docelowej warstwy receptora i nie były usuwane za pomocą płukania buforowego, w przeciwieństwie do ustawień kontrolnych, w których mikropęcherzyki były usuwane z powierzchni nawet przy delikatnym płukaniu. Podobnie, w teście przepływowym, przeprowadzonym w równoległej komorze przepływowej, biotynylowane pęcherzyki wykazały statystycznie istotną i doskonałą przyczepność do warstwy streptawidyny na naczyniu polistyrenowym w porównaniu z powierzchnią kontrolną zawierającą tylko albuminę. Mikropęcherzyki ozdobione peptydem c (RGDfK) selektywnie przylegały do powierzchni pokrytej α_{vβ 3}, zarówno w statycznym teście adhezji, jak iw komorze przepływu równoległej płytki.

Poniższe kwestie można uznać za ograniczenia opisywanego protokołu. Po pierwsze, procedura nie uwzględnia cząstek submikronowych. Instrument, który został użyty w badaniu, nie był przystosowany do wykrywania nanopęcherzyków (tj. cząstek o średnicy poniżej 1 μm). Cząstki te mogły być obecne w preparacie. Chociaż ich akustyczny sygnał rozpraszania wstecznego jest ogólnie znany jako niski i nie zaobserwowano ich w tym badaniu za pomocą mikroskopii, obecność nanopęcherzyków powinna być nadal brana pod uwagę. Drugą istotną kwestią jest niejednorodność wielkości mikropęcherzyków. Pomimo usunięcia większych cząstek, wielkość powstałych pęcherzyków jest daleka od jednolitości. Powinno to stanowić podstawę do rozważenia i uzasadnienia dla dalszych badań w dziedzinie formulacji mikropęcherzyków.

Podsumowując, narracja przedstawiona w tym manuskrypcie powinna zapewnić wystarczający poziom szczegółowości technicznej, aby szybko i łatwo wyprodukować docelowe mikropęcherzyki. Przedstawiono kroki w celu przeprowadzenia dodatkowego oczyszczania (jeśli jest to pożądane), dostosowania rozmiaru i/lub oceny niewielkiej ilości materiału skorupy, która pozostaje w środowisku wodnym. Opisano szczegółowe narzędzia analityczne do oceny parametrów mikropęcherzyków, takich jak rozkład wielkości i stężenie oraz zdolność in vitro mikropęcherzyków ozdobionych ligandem do przylegania do docelowych receptorów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Amalgamator	Lantheus, Billerica, MA.	Można użyć Vialmix	ESPE Capmix, Wig-L-Bug lub innego amalgamatora o prędkości 4300 obr./min.
biotyna-PEG3400-DSPE	Laysan Bio, Arab, AL.	Biotyna-PEG-DSPE-3400
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Fisher Scientific, Waltham, MA	BP1600-100 lub podobna
PBS wolna od Ca-Mg Fisher	Scientific, Waltham, MA	14190-144
Wirówka z wirnikiem kubełkowym	IEC/Thermo, Fisher Scientific, Waltham, MA.	NH-SII	Dowolna wirówka z wirnikiem kubełkowym
chloroform	Fisher Scientific, Waltham, MA	C297-4
cykliczny (RGDfK) peptyd	AnaSpec, Fremont, CA	AS-61111
Decafluorobutan	F2 Chemicals, Preston UK	CAS 355-25-9
DiI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	468495-100MG
DIPEA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
Jednorazowa kuweta UV, 1,5 ml	BrandTech, Essex, CT.	759150
DMSO	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
Suchy grzejnik blokowy, wysokotemperaturowy	Techne Cole Palmer, Staffordshire UK	DB-3A
DSPC	Lipoid, Ludwigshafen, Niemcy	LIPOID PC 18:0/18:0
Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych	Molecular Devices, San Jose,  CA.	Spectramax Gemini XS	Nie jest już dostępny, zastąpiony przez Gemini XPS; każdy czytnik płytek fluorescencyjnych z funkcją wykrywania czerwonego barwnika będzie działał
Mikroskop z fluorescencyjnym epi-oświetleniem.	Leica	Laborlux 11	Nie jest już dostępna; wystarczy dowolny mikroskop fluorescencyjny; do zbierania strumieni obrazów wymagana jest kamera wideo o wysokiej czułości
NHS-PEG3400-DSPE	NOF-America, White Plains, NY.	SUNBRIGHT DSPE-034GS	Niektórzy alternatywni producenci dostarczają materiał, który jest w większości lub całkowicie hydrolizowany po przybyciu
Spray Ninhydrin do płytek TLC	BVDA, Haarlem, Holandia	AS-72177
Normalny roztwór do nawadniania solą (0,9% NaCl)	Baxter, Deerfield IL.	2F7124
Równoległa komora przepływowa z płytą, do 35 mm Corning Petri Dish	Glycotech, Gaithersburg, MD.	31-001	Może działać tylko z szalkami Petriego Corning, ale niekoniecznie z innymi producentami, ze względu na różne wymiary
System wymiarowania cząstek	Beckman Coulter, Hialeah, FL	Multisizer 3	Już niedostępny, zastąpiony przez Multisizer 4, z podobną zasadą wykrywania elektrostref. Alternatywnie można zastosować metody optyczne, np. Accusizer.
PEG 6000 monostearynian	Kessco Stepan, Joliet, IL.	CAS 9004-99-3
Szalki Petriego, średnica 35 mm, wysokość 10 mm	Corning, Corning, NY.
Szkiełka nakrywkowe plastikowe, 22x22mm	Cardinal Health, McGaw Park, IL.	M6100
Glikol propylenowy	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	P4347
Rekombinowana mysia alfavbeta3, wolna od nośnika	R& D Systems, Minneaposis, MN.	7889-AV-050
Korki gumowe, 13mm	Kimble-Chase, Vineland, NJ	W017900
Fiolki surowicy, 2 ml, 13mm	Kimble-Chase, Vineland, NJ	223683
Płytki TLC z krzemionki, F254	Analtech, Newark, DE	P02521
Tetraboran sodu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	S9640
Streptavidin	AnaSpec, Fremont, CA	AS-72177
Pompa strzykawkowa,  opcja zaparzania/pobierania	Aparat Harvard, Holliston, MA	PHD2000, 70-2001
System obrazowania ultrasonograficznego z trybem specyficznym dla kontrastu.	Sonda Siemens/Acuson, Mountain View CA	Sequoia c512, 15L8	Sequoia starej generacji jest wyłączona z produkcji od ponad dekady. Dostępne jako sprzęt używany. Tryb CPS musi być odblokowany dla przetwornika 15L8.
Spektrofotometr UV	Beckman, Brea, Kalifornia.	DU640	Nie jest już dostępny, można go zastąpić dowolnym urządzeniem obsługującym falę ultrafioletową 260 nm