Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.
Artykuł metodologiczny
Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ksenoprzeszczepy larw danio pręgowanego są szeroko wykorzystywane do badań nad rakiem w celu przeprowadzenia badań in vivo i w czasie rzeczywistym nad ludzkim rakiem. Możliwość szybkiej wizualizacji odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe (chemioterapia, radioterapia i leki biologiczne), angiogenezy i przerzutów z rozdzielczością pojedynczych komórek, stawia model ksenoprzeszczepu danio pręgowanego jako najlepszy wybór do opracowania badań przedklinicznych.
Test ksenoprzeszczepu larwalnego danio pręgowanego ma kilka zalet eksperymentalnych w porównaniu do innych modeli, ale prawdopodobnie najbardziej uderzającą jest zmniejszenie skali rozmiaru, a co za tym idzie czasu. To zmniejszenie skali pozwala na obrazowanie pojedynczych komórek, wykorzystanie stosunkowo niewielkiej liczby komórek ludzkich (zgodnych z biopsjami), średnio-wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków, ale co najważniejsze umożliwia znaczne skrócenie czasu testu. Wszystkie te zalety sprawiają, że test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego jest niezwykle atrakcyjny dla przyszłych zastosowań medycyny spersonalizowanej.
Wiele protokołów ksenoprzeszczepu danio pręgowanego zostało opracowanych z uwzględnieniem szerokiej gamy ludzkich nowotworów; jednak nadal brakuje ogólnego i ustandaryzowanego protokołu do efektywnego generowania ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego. Tutaj przedstawiamy protokół krok po kroku, ze wskazówkami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi dotyczącymi analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.
Wprowadzenie
Danio rerio) staje się potężnym modelowym organizmem kręgowców do badania rozwoju i chorób. Danio pręgowany ma wysoce konserwatywne cechy genetyczne (~70% homologii genetycznej i ~84% genów związanych z chorobą) i podstawowe cechy morfologiczne narządów z ludźmi1,2. Ta ochrona pozwala na wykorzystanie danio pręgowanego do modelowania kilku chorób ludzkich, w tym raka3,4.
Obsługa i utrzymanie danio pręgowanego jest znacznie łatwiejsze i bardziej opłacalne niż myszy ze względu na ich małe rozmiary, wysoką płodność przez cały rok i zewnętrzne nawożenie3,5. Zarodki danio pręgowanego nie wymagają żywienia w ciągu pierwszych 5-7 dni życia i są wykorzystywane jako skuteczny model rozwoju, infekcji i raka1,4,6,7. Zarodki danio pręgowanego wykluwają się po 48 godzinach od zapłodnienia (hpf) i są zwierzętami swobodnie pływającymi z uformowanymi wszystkimi narządami, bijącym sercem i funkcjonalnym układem krążenia, wątrobą, mózgiem, szpikiem nerkowym itp.1,3. Ponadto, na tym etapie rozwoju w grę wchodzi tylko odporność wrodzona, odporność adaptacyjna wciąż się rozwija, co pozwala na ogólnie efektywne wszczepianie komórek ludzkich bez potrzeby stosowania mutantów z obniżoną odpornością7,8. Niemniej jednak ważne jest, aby pamiętać, że nie wszystkie ludzkie komórki wszczepiają się jednakowo9 i że na przykład w przypadku komórek białaczkowych wykazano, że fagocyty (neutrofile i makrofagi) muszą zostać zubożone, aby skutecznie wszczepić10.
Genetyczna zdolność do wykonywania danio pręgowanego i optyczna przezroczystość jego wczesnych stadiów embrionalnych pozwalają na obrazowanie intrażyciowe pojedynczej komórki w wysokiej rozdzielczości, a tym samym na tworzenie najnowocześniejszych technik obrazowania w różnych dziedzinach biologii. Ponadto, w kontekście raka, funkcje te są przydatne do badań w czasie rzeczywistym najwcześniejszych etapów interakcji gospodarz-guz, takich jak badanie potencjału angiogennego i przerzutowego, a także interakcji z wrodzonym układem odpornościowym8,9,11,12,13.
Chociaż w krótkim teście ksenoprzeszczepu nie ma czasu na "ewolucję" przerzutową - możliwe jest przeanalizowanie zdolności komórek nowotworowych do przerzutowania (tj. ich zdolności do przechodzenia przez etapy przerzutowe, takie jak inwazja, wynaczynienie, przeżycie w krążeniu, wynaczynienie i kolonizacja, a zatem badanie tych procesów in vivo i w czasie rzeczywistym8,11, 13,14).
Cechy jego cyklu życiowego stawiają danio pręgowanego jako unikalny model dla spersonalizowanej medycyny w leczeniu raka. Testy można przeprowadzić w krótszym czasie, a wyniki można uzyskać w ciągu kilku tygodni7,8,9,11,12,15,16. Szybkość i wykonalność tych testów daje lekarzom i badaczom możliwość uzyskania wyników translacyjnych, które mogą być przydatne dla pacjentów z rakiem, dla których czas jest niezbędną potrzebą.
Pomimo coraz częstszych prób generowania udanych ksenoprzeszczepów zarodków danio pręgowanego, nadal istnieje potrzeba standaryzacji procedury iniekcji, jak również oceny żywotności komórek i zachowania guza po wstrzyknięciu.
W tym protokole dostarczamy badaczom jasny i szczegółowy przewodnik krok po kroku dotyczący wstrzykiwania ludzkich linii komórek rakowych do embrionów danio pręgowanego i późniejszej fiksacji, barwienia immunologicznego, obrazowania i kwantyfikacji zachowania komórek nowotworowych.
Protokół
Model danio przebrązowany (Danio rerio) był obsługiwany i utrzymywany zgodnie ze standardowymi protokołami europejskiego ustawodawstwa dotyczącego dobrostanu zwierząt, Dyrektywy 2010/63/UE (Komisja Europejska, 2016) oraz zasadami Champalimaud Fish Platform. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Champalimaud oraz portugalskie organizacje instytucjonalne – ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Animal/Organ ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt) oraz DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Generalna Dyrekcja ds. Żywności i Weterynarii).
UWAGA: Przed rozpoczęciem głównego eksperymentu należy poćwiczyć na ludzkiej linii komórkowej raka jelita grubego (CRC) HCT116. Linia ta jest łatwa w przygotowaniu (wysoce proliferacyjna), łatwa do wstrzyknięcia i bardzo efektywnie się przyjmuje (około 95-100%). Do czasu opanowania techniki należy używać nadmiaru komórek (~12x106 komórek, kolba T-75) oraz nadmiaru ryb (400 ryb), ponieważ podczas szkolenia utraconych zostanie wiele komórek i ryb. Badacze są uznawani za przygotowanych, gdy w ksenoprzeszczepach HCT116 zostanie osiągnięty poziom przyjęcia ~95%. Schemat kompletnego protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
1. Przygotowanie do iniekcji
- Na dwa tygodnie przed wstrzyknięciem należy namnożyć komórki w hodowli (szczegółne wytyczne dotyczące optymalnej konfluencji in vitro dla wstrzyknięcia kilku linii komórkowych znajdują się w Tabeli 1).
- Na trzy dni przed wstrzyknięciem należy skrzyżować rybki danio przeznaczone do uzyskania pożądanego tła genetycznego.
2. 24 h przed wstrzyknięciem
- Oczyścić płytki z zarodkami rybki danio (usunąć wszystkie martwe i nierozwinięte zarodki) i odświeżyć medium E3.
- W pomieszczeniu do hodowli komórkowej usunąć medium hodowlane z kolb przeznaczonych do iniekcji, przemyć raz 1x solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS), aby usunąć martwe komórki, i dodać świeże medium.
- Przygotować narzędzia do procedury iniekcji, takie jak: igły do mikroiniekcji, płytki agarowe i spinki do ustawiania zarodków do iniekcji (Rycina 2A-D, szczegóły poniżej).
- Igły do mikroiniekcji (Rycina 2A)
- Użyć kapilar z borokrzemianowego szkła (4 cale, średnica zewnętrzna 1,0 mm, bez włókna) w wyciągaczu do mikropipet (ciepło: ≈500; fil: 10; vel: 50; dec: 60; pull: 100).
- Przygotowanie płytki (Rycina 2B)
- Przygotować 2% agarozę w H2O, podgrzać ją i wylać jedną warstwę rozpuszczonej agarozy na pokrywkę czystej szalki Petriego. Pozostawić do polimeryzacji, a następnie za pomocą linijki narysować od trzech do czterech prostych linii z agarozy do ustawiania zarodków.
- Montaż spinki (Rycina 2C-D)
- Umieścić jeden włos wewnątrz szklanej rurki kapilarnej, pozostawiając około 1 centymetra włosa poza rurką.
- Zagiąć zewnętrzny koniec włosa za pomocą pęsety do wnętrza szklanej rurki kapilarnej, tworząc pętlę o długości ~0,5 mm.
- Uszczelnić krawędź rurki kapilarnej kroplą lakieru do paznokci. Pomoże to również utrzymać pętlę na miejscu. Pozostawić do wyschnięcia. Powtórzyć procedurę na drugiej krawędzi rurki.
- Odciąć kawałek taśmy izolacyjnej (bardziej odpornej, nieprzepuszczalnej i sztywnej niż zwykła taśma klejąca).
- Owiniąć kapilarę taśmą, aby zapobiec jej pękaniu.
- Igły do mikroiniekcji (Rycina 2A)
3. Dzień iniekcji
- Oddziel wyklute zarodki od niewyklutych jaj. Dodanie 1x pronazy (0,6 mg/mL, Tabela 3) do medium dla zarodków na tym etapie może przyspieszyć wyklucie. Umieść zarodki w inkubatorze (w temperaturze 28 °C) do momentu iniekcji.
UWAGA: Nie pozostawiaj zarodków w roztworze pronazy dłużej niż przez 1 godzinę, ponieważ enzym będzie oddziaływał na wyklute zarodki, zwiększając ryzyko ich śmiertelności. Upewnij się, że etap rozwojowy zarodków odpowiada 48 hpf (Rysunek 3A, A'), aby uniknąć ryzyka wystąpienia obrzęków i śmiertelności. - Przygotuj 1x Tricaine (z roztworu stokowego 25x).
UWAGA: Szczegółowy przepis znajduje się w Tabeli 3 oraz na stronie Zebrafish Information Network - ZFIN17.
4. Znakowanie komórek do iniekcji
UWAGA: Etykietowanie komórek można przeprowadzić bezpośrednio w kolbie lub w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL po odczepieniu enzymatycznym. Więcej informacji znajduje się w sekcji Dyskusja.
- Usunąć pożywkę do hodowli komórkowej i przemyć kolbę dwukrotnie (2x) za pomocą 1X PBS.
- Znakować komórki wybranym barwnikiem lipofilnym bezpośrednio w kolbie (2 mL roztworu/kolba T75) lub w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL po odczepieniu enzymatycznym. Unikać ekspozycji na światło i inkubować komórki w temperaturze 37 °C (warunki/roztwory znajdują się w Tabeli 1 i Tabeli 2).
- W przypadku znakowania w kolbie:
- Usunąć barwnik, przemyć 1x PBS i odczepić komórki za pomocą EDTA oraz skrobaka do komórek.
- Przenieść komórki do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Centryfugować przez 5 minut przy 300 x g, a następnie przejść do kroku 4.5.
- W przypadku znakowania w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL:
- Centryfugować przez 5 minut przy 300 x g, aby usunąć barwnik, a następnie odrzucić nadsącz. Resuspendować w 1x PBS w celu przemycia.
- Centryfugować przez 5 minut przy 300 x g, a następnie przejść do kroku 4.5.
- Odrzucić nadsącz i resuspendować osad w pożywce do hodowli komórkowej (do osadu o objętości 50 µL dodać ok. 150-200 µL pożywki).
- Ocenić żywotność komórek przy użyciu komory Neubauera z metodą wykluczania błękitu trypanu lub inną wybraną metodą.
- Centryfugować przez 4 minuty przy 300 x g i odrzucić nadsącz. Resuspendować komórki w pożywce do iniekcji.
UWAGA: Zalecane stężenie komórek (ogólnie od 0,25-0,5x106 komórek/µL) oraz rodzaj pożywki znajdują się w Tabeli 1. - Od tego momentu przechowywać komórki w lodzie.
5. Procedura wstrzyknięcia
- Zzniecz zarodki w 1x Tricaine przez 5 minut.
- Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś niewielką liczbę (~50) znieczulonych zarodków na płytkę agarozową i ostrożnie ustaw je w rzędzie, pomagając sobie pętlą z wsuwki do włosów. Upewnij się, że zachowano odstępy między zarodkami, szczególnie między żółtkiem jednego a głową kolejnego (Rycina 4A).
UWAGA: Liczba ustawianych zarodków będzie zależeć od poziomu doświadczenia badacza wykonującego iniekcje. Zacznij od kilku sztuk (~10-20). Schemat prawidłowego rozmieszczenia zarodków na płytce agarowej/agarozowej znajduje się na Rycynie 4A. - Upewnij się, że ustawione zarodki nie wyschną na płytce agarozowej, aby zapobiec ich śmiertelności, ostrożnie dodając na płytkę 1-3 krople roztworu 1x Tricaine.
- Lekko stuknij probówkę do mikrocentryfugi, aby resuspendować komórki. Napełnij igłę do iniekcji od tyłu zawiesiną komórkową, używając końcówki mikroloadera, unikając pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one naruszyć integralność zarodków.
- Otwórz zawór ciśnienia powietrza (40 psi), przygotuj mikroinżektor i ostrożnie umieść igłę do mikroiniekcji w uchwycie.
UWAGA: Zaleca się następujące ustawienia mikroinżektora: Ciśnienie podtrzymujące (Hold pressure) – vent (3 psi); Ciśnienie wyrzutu (Eject pressure) – vent; Zakres (Range) – 100 ms. - Odetnij igłę do mikroiniekcji blisko końcówki za pomocą pęsety Dumont #5 lub podobnej pod stereomikroskopem.
UWAGA: Końcówka musi być tępa i wystarczająco cienka, aby umożliwić przejście komórek bez zapychania się, a także aby uniknąć uszkodzenia zarodków i utraty komórek. Gruba końcówka igły do mikroiniekcji zrani zarodek i doprowadzi do powstania obrzęku lub śmierci zebrafish. Do kalibracji igły nie używa się siatki pomiarowej. Szczegółowe wyjaśnienie znajduje się w sekcji Dyskusja. - Przed iniekcją zarodków przetestuj ciśnienie mikroinżektora, zaczynając od najniższego ciśnienia wyrzutu, aż w ~1-3 impulsach zostanie osiągnięta objętość zbliżona do wielkości oka zarodka zebrafish.
UWAGA: Na początku szkolenia zaleca się, jeśli to możliwe, korzystanie ze stereomikroskopu fluorescencyjnego. Ułatwi to identyfikację komórek znakowanych fluorescencyjnie. - Ostrożnie przebij środek żółtka zarodka, zmniejszając kąt nachylenia igły i powoli wsuwaj ją, aż końcówka igły dotrze do przestrzeni periwitellinycznej (PVS) (Rycina 4B-D).
- Naciśnij pedał mikroinżektora i wstrzyknij komórki do PVS. Jako punkt orientacyjny wykorzystaj oko zarodka. Staraj się wstrzyknąć objętość komórek zbliżoną do wielkości oka zarodka i jak najdalej od serca, aby zapobiec obrzękowi serca.
- Ostrożnie wyjmij igłę i przejdź do następnego zarodka.
- W razie potrzeby dostosuj ciśnienie mikroinżektora.
UWAGA: Komórki mają tendencję do zapychania końcówki, dlatego można zwiększyć ciśnienie. W razie potrzeby można odciąć kapilarę (aby zwiększyć jej średnicę), jednocześnie zmniejszając ciśnienie. - Przenieś wstrzyknięte zarodki do czystej szalki Petriego (Tabela 4) z roztworem 1x Tricaine i pozostaw je do odpoczynku na 5-10 minut. Pozwoli to na zamknięcie się rany.
UWAGA: Aby przenieść zarodki z płytki agarowej do szalki Petriego, dodaj kilka kropli roztworu 1x Tricaine na zarodki i ostrożnie zbierz je plastikową pipetą Pasteura. Przenieś zebrane zarodki do nowej szalki Petriego z roztworem 1x Tricaine. - Usuń roztwór 1x Tricaine i dodaj świeżą pożywkę E3.
- Inkubuj ksenoprzeszczepy w temperaturze 34 °C (temperatura kompromisowa pomiędzy przeżywalnością ludzkich linii komórkowych a rozwojem zebrafish8).
6. Analiza przerzutowania
- W około 1 godzinie po wstrzyknięciu (hpi), obejrzyj wstrzyknięte embriony pod fluorescencyjnym stereomikroskopem i posegreguj ksenoprzeszczepy na 2 grupy, w zależności od braku (Rysunek 5A) lub obecności (Rysunek 5B) komórek w krążeniu.
UWAGA: Nawet jeśli w sercu lub krążeniu zostanie wykryta tylko jedna komórka nowotworowa, zalicz te ksenoprzeszczepy do grupy ksenoprzeszczepów z komórkami w krążeniu. Alternatywnie, komórki można wstrzyknąć bezpośrednio do krążenia, aby zwiększyć liczbę ksenoprzeszczepów w tej grupie.
7. 1 dzień po wstrzyknięciu
- Pod fluorescencyjnym stereomikroskopem dokładnie przeanalizuj każdy embrion i wybierz te z prawidłowo wstrzykniętymi guzami (Rysunek 6).
UWAGA: W razie potrzeby przed przesiewaniem znieczul wstrzyknięte embriony 1X roztworem Tricaine. - Odrzuć następujące embriony/ksenografty (Rysunek 6A-A''):
• bez guza/o nieprawidłowej morfologii/martwe,
• z obrzękiem serca i/lub żółtka,
• z komórkami nowotworowymi wyłącznie w żółtku,
• z bardzo niewielką liczbą komórek rakowych. - Pogrupuj wybrane ksenografty w zależności od wielkości guza. Do porównania wykorzystaj wielkość oka (Rysunek 6B-B'', 6C).
• Guzy mniejsze od oka (+),
• Guzy o wielkości zbliżonej do oka (++),
• Guzy większe od oka (+++). - Rozdziel ksenografty zgodnie z planowanym układem eksperymentalnym i rozpocznij badanie działania leku (grupa kontrolna vs grupa leczona itd.). Codziennie wymieniaj leki oraz medium E3 (Tabela 4).
- Inkubuj ksenografty w temperaturze 34°C aż do zakończenia badania.
8. 4 dni po wstrzyknięciu
- W ostatnim dniu analizy znieczul ksenografty roztworem Tricaine 1x i ostrożnie ułóż je na płytce agarowej.
UWAGA: Należy odrzucić wszelkie martwe lub obrzęknięte ksenoprzeszczepy. Leczenie farmakologiczne i niektóre komórki nowotworowe mogą wywołać toksyczność i w konsekwencji doprowadzić do obumarcia ksenoprzeszczepu. Takie ksenoprzeszczepy nie są brane pod uwagę podczas ilościowego oznaczania stopnia przyjęcia przeszczepu. - Aby określić procent przyjęcia przeszczepu: pod stereomikroskopem fluorescencyjnym przeanalizowano każdy żywy ksenoprzeszczep i oceniono brak (Rycina 6D) / obecność (Rycina 6E) guzów w przestrzeni oko-naczyniowej (PVS).
- Aby określić procent przerzutów: przy użyciu stereomikroskopu fluorescencyjnego należy przeanalizować każdy ksenograft i ocenić obecność lub brak mikrorzutów w ogonowej tkance krwiotwórczej (CHT) w dwóch wcześniej zdefiniowanych grupach (CIRC i NO CIRC, Rysunek 6F)
- Zgodnie z planem eksperymentalnym, należy wybrać odpowiednie ksenografty i poddać je eutanazji przy użyciu 25-krotnego roztworu Tricaine (Tabela 3).
- Utrwalić je w 4% formaldehydzie (FA) przez co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc w 4 °C.
UWAGA: Należy użyć formaldehydu bez zawartości metanolu (16% FA) rozcieńczonego do stężenia 4% w PBS/0,1% Triton. Tubki należy wypełnić utrwalaczem po samą górę. Tubki należy umieścić w pozycji poziomej, aby zapewnić jednorodne utrwalenie wszystkich ksenoprzeszczepów, co zwiększa przepuszczalność i zapobiega agregowaniu się danio pręgowanych na dnie. - Alternatywnie można je unieruchomić za pomocą PIPES (na 1 ml: 100 µL 1 M soli sodowej PIPES (4 °C); 1 µL 1 M MgSO₄4 (RT); 4 µL 0,5 M EGTA (temp. pokojowa); 93.7 µL z 16% FA (temp. pokojowa); 801.3 µL z ddH2O2O).
UWAGA: PIPES lepiej zachowuje fluorescencję linii transgenicznych RFP i mCherry niż 4% FA. - Jeśli immunobarwienie zostanie wykonane w innym dniu, należy zastąpić FA 100% metanolem (MetOH). Ksenoprzeszczepy utrwalone w 100% metanolu można przechowywać w temperaturze -20 °C na czas nieokreślony.
UWAGA: MetOH może obniżać wydajność niektórych barwień (np. falloidyny) oraz wygaszać niektóre oznakowania fluorescencyjne. Należy wcześniej potwierdzić skuteczność przeciwciał w próbkach utrwalonych w MetOH.
9. Immunobarwienie całego preparatu do obrazowania konfokalnego
UWAGA: Technika immunofluorescencji całego preparatu trwa 3 dni i jest podzielona w następujący sposób: Pierwszy dzień poświęcony jest permeabilizacji ksenoprzeszczepów i inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Drugi dzień obejmuje płukanie i inkubację z przeciwciałem drugorzędowym, a trzeci dzień to płukanie, fiksacja ksenoprzeszczepów oraz przechowywanie w medium montażowym.
- Dzień 1
- Jeśli ksenografty były przechowywane w 100% MetOH, należy je rehydratować poprzez serię malejących stężeń MetOH (75%, 50%, 25% MetOH rozpuszczony w PBS/0,1% Triton). Jeśli utrwalono je w FA, należy zastąpić go PBS/0,1% Triton.
- Przemyć 4x przez 5 minut w PBS/0,1% Triton.
- Przemyć 1x przez 5 minut w H2O.
UWAGA: Probówki muszą być zawsze ułożone poziomo podczas etapów utrwalania, permeabilizacji i płukania, chyba że zaznaczono inaczej. - Zastąpić H2O lodowatym acetonem i inkubować w -20 °C przez 7 minut.
UWAGA: Należy umieścić probówkę 50 mL z acetonem w temperaturze -20 °C, aby była gotowa do użycia. Probówki do mikrocentryfugi muszą być ustawione pionowo w statywie, aby aceton nie wyciekł. - Przemyć 2x przez 10 minut w PBS/0,1%Triton.
- Inkubować z roztworem blokującym PBDX_GS przez 1 h w RT (bufor blokujący PBDX_GS: 50 mL 1x PBS; 0,5 g albuminy surowicy bydlęcej - BSA; 0,5 mL DMSO; 250 µL 10% Triton; 750 µL surowicy koziej - GS (15 µL/1 mL)).
- Usunąć PBDX_GS i dodać ~40 µL rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego (zazwyczaj 1:100).
UWAGA: Objętość rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego zależy od liczby ksenograftów znajdujących się w probówce do mikrocentryfugi. Należy upewnić się, że wszystkie ksenografty są zanurzone. - Inkubować przez 1 godzinę w RT, a następnie przez noc w 4 °C. Probówki ustawić pionowo.
- Dzień 2
- Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć 2x przez 10 minut w PBS/0,1% Triton.
- Przemyć 4x przez 30 min w PBS/0,05% Tween.
UWAGA: Następne etapy muszą być wykonywane w ciemności (użyć folii aluminiowej, aby chronić probówki przed światłem). - Usunąć PBS/0,05% Tween i dodać ~50-100 µL rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego (zazwyczaj 1:200 - 1:400) + DAPI (50 µg/mL) rozpuszczonego w PBDX_GS.
- Inkubować przez 1 godzinę w RT, a następnie przez noc w 4 °C. Probówki ustawić pionowo i chronić przed światłem.
- Dzień 3 (użyć folii aluminiowej, aby chronić probówki przed światłem)
- Usunąć rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego i przemyć 4x przez 15 minut w PBS/0,05% Tween.
- Utrwalić w temperaturze pokojowej przez 20 minut w 4% FA.
- Przemyć 1x przez 5 minut w PBS/0,05% Tween.
- Usunąć PBS/0,05% Tween i dodać 1 kroplę wodnego medium montażowego do każdej probówki do mikrocentryfugi. Probówki ustawić pionowo.
- Zamontować lub przechowywać w 4 °C w ciemności do czasu montowania. Probówki ustawić pionowo.
10. Montowanie ksenoprzeszczepów
UWAGA: Przez cały czas trwania procesu należy chronić probówki do mikrowirówki przed światłem. Ksenoprzeszczepy u rybek zebrafish są montowane pomiędzy dwiema szkiełkami przykrywkowymi (24 x 60 mm # 1.5). Pozwala to na obrócenie zamocowanych ksenoprzeszczepów podczas obrazowania konfokalnego, dzięki czemu dostępne są obie strony guza (górna i dolna). Do nanoszenia medium montażowego nie należy używać plastikowych pipet – ksenoprzeszczepy mogą zostać wciągnięte do pipety. Schematyczną reprezentację następnych kroków przedstawiono na Rysunku 7.
- Oznacz szkiełko nakrywkę Y, a brzegi szkiełka nakrywki X zabezpiecz wazeliną lub smarem silikonowym, aby zapobiec wyciekowi medium montażowego.
- Przenieś ksenoprzeszczepy za pomocą szklanej pipety Pasteura na szkiełko nakrywkę X.
- Ustaw je ostrożnie za pomocą spinki do włosów i usuń nadmiar wodnego medium montażowego.
- Dodaj wodne medium montażowe do szkiełka nakrywki Y.
- Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkę Y na szkiełku nakrywce X. Nie dociskaj szkiełek nakrywczych, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia ksenoprzeszczepów.
- Umieść tak przygotowany zestaw szkiełek na przedmiocie mikroskopowym i zabezpiecz go przezroczystą taśmą klejącą. Ułatwi to manipulację podczas obrazowania konfokalnego oraz przechowywanie próbek.
11. Obrazowanie konfokalne
UWAGA: Apochromatyczny obiektyw immersyjny 25x z korekcją wodną jest optymalny do obrazowania guzów PVS z rozdzielczością pojedynczych komórek (przykłady przedstawiono na Rysunku 8C-C" oraz Rysunku 9A).
- Należy pozyskać próbki za pomocą funkcji z-stack z interwałem 5µm pomiędzy poszczególnymi przekrojami. W przypadku obrazów przeznaczonych do rekonstrukcji 3D, w szczególności naczyń, należy zastosować interwał od 1-3µm pomiędzy przekrojami (Rysunek 8A).
12. Analiza i kwantyfikacja
- Do przetwarzania i analizy obrazów konfokalnych należy użyć oprogramowania FIJI/ImageJ lub analogicznego.
- Otwórz surowe dane (.czi, .lsm, itd.) w oprogramowaniu FIJI.
- Aby wybrać wszystkie lub tylko jeden kanał w trybie kompozytowym, wybierz: Image > Colors > Channels Tool.
- Aby dostosować poziom jasności i kontrastu, wybierz: Image > Adjust > Color Balance.
- W celu ilościowego określenia wielkości guza:
- Wybierz trzy reprezentatywne przekroje guza – z górnej, środkowej i dolnej części – na każdy stos z (Rysunek 8 A) na jeden ksenoprzeszczep.
UWAGA: Rozdzielczość konfokalna pozwala na obrazowanie głębokości guza do ~60-70 µm. W przypadku dużych guzów obrazowanie całkowitej objętości może być niemożliwe. - Otwórz arkusz kalkulacyjny w celu naniesienia danych.
- Policz wszystkie jądra barwione DAPI, które odpowiadają komórkom nowotworowym w 3 wybranych przekrojach (Rysunek 8 A, B). Aby to zrobić:
- Uruchom wtyczkę do liczenia komórek w FIJI/ImageJ, wybierając Plugins > Analyze > Cell counter.
- W narzędziu do liczenia komórek kliknij Initialize, wybierz typ licznika i klikaj na obrazie, aby ręcznie rozpocząć tryb liczenia. Przy każdym kliknięciu licznik dodaje liczbę policzonych komórek (liczbę kliknięć).
- Po przeliczeniu jednego pełnego przekroju zapisz liczbę komórek w odpowiednim dokumencie Excel.
- W programie Fiji kliknij Reset w oknie Cell Counter, aby usunąć informacje, jeśli ten sam licznik zostanie użyty ponownie. W przeciwnym razie informacje można zachować i użyć innych liczników dla kolejnych przekrojów (lub komórek).
- Przejdź do drugiego reprezentatywnego przekroju i powtórz poprzednie kroki. Zbierz wszystkie dane.
UWAGA: Przebarwienie DAPI jest powszechnie stosowane do liczenia komórek ze względu na wyraźne zdefiniowanie poszczególnych komórek; można jednak zastosować inne barwienia specyficzne dla komórek.
- Aby obliczyć całkowitą liczbę komórek w guzie, zastosuj następujący wzór:
UWAGA: Współczynnik korekcyjny 1,5 oszacowano dla komórek o średnicy jądra ~10-12 µm. Korekcja ta może wymagać dostosowania, jeśli komórki są większe lub mniejsze. Więcej szczegółów na temat tej metody znajduje się w sekcji Dyskusja.
- Wybierz trzy reprezentatywne przekroje guza – z górnej, środkowej i dolnej części – na każdy stos z (Rysunek 8 A) na jeden ksenoprzeszczep.
- W celu ilościowego określenia innych markerów (komórek odpornościowych, figur mitotycznych, PPH3, aktywowanej kaspazy 3, Ki67 itd.) przeanalizuj wszystkie przekroje za pomocą tej samej wtyczki (wizualizację figur mitotycznych przedstawiono na Rysunku 8C-C''). Podziel całkowitą liczbę policzonych komórek przez odpowiadającą im wielkość guza i pomnóż przez 100, aby uzyskać wartość procentową.
UWAGA: Należy pamiętać, że niektóre komórki mogą znajdować się pomiędzy dwoma przekrojami; należy przesuwać się w górę i w dół stosu z, aby upewnić się, że żadna komórka nie została policzona dwukrotnie.
Wyniki
Ksenoprzeszczep u rybek zebrafish jako narzędzie do badania terapii przeciwnowotworowych.
Linia komórkowa raka jelita grubego HCT116 została oznakowana barwnikiem CM-DiI i wstrzyknięta do przestrzeni okożółtkowej (PVS) embrionów w 2. dobie po zapłodnieniu (dpf). Po wstrzyknięciu ksenoprzeszczepy inkubowano w temperaturze 34 °C, która umożliwia wzrost komórek nowotworowych bez upośledzenia rozwoju rybek zebrafish. Następnego dnia ksenoprzeszczepy przeskanowano pod kątem obecności lub braku masy guza w PVS (rybki, w których wstrzyknięcie nie przebiegło prawidłowo, odrzucono i poddano eutanazji) (Rycina 6A-A''). Ksenoprzeszczepy pogrupowano według wielkości guza (Rycina 6B-B'') i rozdzielono losowo (na płytce 6-dołkowej: ok. 12 ksenoprzeszczepów na dołek) na grupę kontrolną nietraktowaną oraz grupę leczoną chemioterapią FOLFIRI (0.18 mM kwasu folinowego, 0.08 mM irynotekanu i 4.2 mM fluorouracylu (5-FU)).
Kontrolne medium E3 oraz leki wymieniano codziennie, a martwe rybki danio usunięto. W 4. dniu po infekcji (dpi) oraz trzy dni po rozpoczęciu leczenia (dpt) ilościowo oceniono przyzeszczepienie zgodnie z krokiem 8.2 protokołu. Za przyzeszczepienie uznano częstotliwość występowania ksenograftów z widoczną masą guza w przestrzeni okołosercowej (PVS) w 4. dniu po infekcji. Na przykład, jeśli pod koniec eksperymentu przeżyło 40 larw i u 35 z nich w PVS stwierdzono obecność guza, stopień przyzeszczepienia wynosi 87,5%. Ksenografty poddano eutanazji i utrwaleniu w celu oceny wielkości guza oraz apoptozy za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej.
Immunofluorescencję wykonano w celu wykrycia komórek apoptotycznych, stosując przeciwciało anty-cleaved Caspase 3 (Asp175) (rabbit, 1:100, #CST 9661) oraz DAPI (50 µg/mL) do barwienia kontrastowego jąder komórkowych. Zestawy obrazów seryjnych (co 5um) pozyskano przy użyciu konfokalnego mikroskopu LSM710, a analizę danych przeprowadzono w oprogramowaniu FIJI/ImageJ, zgodnie z opisem w kroku 12. Ilościowe oznaczenie indeksu mitotycznego, apoptozy (% aktywnej Caspase3) oraz wielkości guza wykazało, że FOLFIRI indukuje istotny spadek liczby mitoz (test Manna-Whitneya, P<0.0001) oraz istotną indukcję apoptozy (test Manna-Whitneya, P<0.0001), co wiązało się z 54% redukcją wielkości guza (P<0.001) (Rysunek 8C-E, Rysunek 9A-E).
Cechy te są przydatne w wysokoprzepustowych przesiewach fenotypowych leków, a także do testowania w krótkim czasie efektów fizjologicznych i wewnątrzkomórkowych kilku metod leczenia nowotworów.
Charakterystyka ksenoprzeszczepów ludzkich w organizmie danio pręgowanego z użyciem przeciwciał specyficznych dla człowieka
Jak w przypadku wszystkich modeli ksenoprzeszczepów, istnieje ryzyko błędnej identyfikacji komórek. Na przykład makrofagi mogą fagocytować ludzkie komórki nowotworowe, ulegając zabarwieniu barwnikiem lipofilowym, a następnie przemieszczać się w organizmie gospodarza (danio pręgowanego), przez co komórki te mogą zostać pomylone z mikroprzewzrostami nowotworowymi. Dlatego też znakowanie ksenoprzeszczepów specyficznymi ludzkimi przeciwciałami, takimi jak przeciwciała przeciwko ludzkim HLA, ki-67 lub ludzkim mitochondriom (hMITO), jest kluczowe dla wstępnej charakterystyki, a także dla zapoznania się z morfologią komórek nowotworowych (Rysunek 9F-I).
Ksenotransplantat u rybek zebrafish do badania oddziaływań międzykomórkowych.
Kolejną istotną zaletą modelu ksenotransplantacji u rybek zebrafish jest możliwość badania oddziaływań między różnymi komórkami nowotworowymi oraz analizy wpływu każdego typu komórek na zachowanie pozostałych. Można przeprowadzać koiniekcję różnych ludzkich komórek nowotworowych (różnych klonów z tego samego guza lub z różnych guzów). W tym przykładzie dwie linie komórkowe CRC pochodzące od tego samego pacjenta zostały oznakowane różnymi barwnikami lipofilnymi i zmieszane w stosunku 1:1 przed iniekcją (Rysunek 9J-K').
Podczas mieszania ludzkich linii komórkowych (w celu generowania guzów poliklonalnych) w tym samym przeszczepie, należy unikać stosowania barwnika DiO, ponieważ prowadzi to do niespecyficznego podwójnego barwienia (Tabela 2). Zamiast tego należy zastosować na przykład CM-DiI (linia komórkowa nr 1) wraz z zielonym CMFDA (linia komórkowa nr 2) lub CM-DiI (linia komórkowa nr 1) wraz z Deep red (linia komórkowa nr 2) (Tabela 2, Rysunek 9J-K'), aby umożliwić łatwe rozróżnienie populacji pod koniec eksperymentu. Aby określić częstotliwość każdego klonu w obrębie guza, należy użyć dwóch różnych typów liczników w programie FIJI w celu zidentyfikowania każdego klonu, a następnie podzielić tę wartość przez całkowitą liczbę komórek (sumę wszystkich klonów), aby uzyskać relacyjną frakcję każdego z nich (%).
Rysunek 1. Schemat podsumowujący procedurę ksenoprzeszczepu u ryby danio Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2. Materiały do iniekcji zarodków zebrafish: A. Igła borokrzemianowa B. Płytka z 2% agarozy. C Pętla w kształcie spinki D. Etapy tworzenia pętli w kształcie spinki: 1. Umieścić jeden włos w szklanej rurce kapilarnej, pozostawiając około 1 centymetra włosa poza rurką. 2-3. Z pomocą pęsety zawinąć zewnętrzny koniec włosa do wnętrza szklanej kapilary, tworząc pętlę o długości ~0,5 mm. 4. Uszczelnić krawędź rurki kapilarnej kroplą lakieru do paznokci. 5-6. Okleić kapilarę kawałkiem taśmy izolacyjnej, aby chronić ją przed pęknięciem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3. Reprezentatywne obrazy z mikroskopu stereoskopowego zarodków danio pręgowanego 48 godzin po zapłodnieniu (48 hpf): A-A'. Prawidłowa morfologia zarodka danio pręgowanego w 48 hpf rozwoju, gotowego do mikroiniekcji B-B'. Morfologia zarodka danio pręgowanego, który nie osiągnął odpowiedniego stadium rozwoju do mikroiniekcji w 48 hpf i wykazuje już pewien stopień obrzęku serca (czarna grot strzałki) oraz rozszerzone żółtko. A' oraz B' to odpowiednio powiększenia A i B. Paski skali reprezentują 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 4. Schematyczny przedstawienie ustawienia płytki do mikroiniekcji zarodków danio pręgowanego: A. Ustawienie znieczulonych zarodków w płytce z 3% agaru/2% agarozy. B. Graficzne przedstawienie zarodka danio pręgowanego 2 dni po zapłodnieniu, gdzie czarna strzałka wskazuje przestrzeń periwitellinową (PVS). C i D. Komórki nowotworowe mogą być wstrzykiwane pod różnymi kątami do przestrzeni periwitellinowej (PVS) zarodka 48 godzin po zapłodnieniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5. Analiza przerzutowa. 1 godzinę po wstrzyknięciu (1hpi) zarodki są sortowane według braku (NO_circ) lub obecności (CIRC) komórek nowotworowych w krwiobiegu. W 4. dniu po wstrzyknięciu określa się liczbę ksenoprzeszczepów w obu grupach, które wykazują obecność mikroprzerzutów. Komórki w grupie (A) NO_circ musiały przejść przez wszystkie etapy przerzutowania, aby móc utworzyć mikroprzerzut, podczas gdy komórki w grupie CIRC (B) przeszły jedynie ostatnie etapy kaskady przerzutowej. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 6. Reprezentatywne obrazy z fluorescencyjnego stereomikroskopu ksenoprzeszczepów w 1. i 4. dobie po iniekcji. Ludzkie komórki nowotworowe wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego TdTomato (czerwony) zostały mikroiniekcyjne do zarodków danio prążkowanego w 2. dobie po zapłodnieniu (dpf). W 1. dobie po iniekcji (dpi) należy przeskanować iniekcyjne zarodki i odrzucić te z błędną iniekcją lub z obrzękiem (A-A''), a następnie posortować prawidłowo iniekcyjne zarodki zgodnie z wielkością guzów (B-B''). C. Reprezentatywne ilościowe zestawienie całkowitej liczby komórek obecnych w różnych kategoriach wielkości guzów w 1. dobie po iniekcji w ksenoprzeszczepach SW620. Każda kropka reprezentuje ksenoprzeszczep przeanalizowany zgodnie z opisem w sekcji 12. W 4. dobie po iniekcji należy przeskanować larwy i określić liczbę poszczególnych klas: brak guza (D); obecność guza w przestrzeni okołopęcherzykowej (PVS) (E) oraz obecność mikroprzerzutu w tkance głownej (CHT) (F). Paski skali reprezentują 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 7. Schematyczne przedstawienie montażu ksenoprzeszczepu do obrazowania konfokalnego. 1. Przykład etykietowania na szkiełku nakrywce Y, jasnoniebieska linia na szkiełku nakrywce X reprezentuje obrys, w obrębie którego nanosi się wazelinę/smar silikonowy, aby zapobiec wyciekowi medium montażowego. 2. Przykłady ustawienia ksenoprzeszczepu na szkiełku nakrywce X do obrazowania konfokalnego. 3. Wodne medium montażowe (niebieska strzałka) służy do przytwierdzenia szkiełka nakrywki Y na wierzchu szkiełka nakrywki X. 4. Przykład prawidłowo zamontowanych szkiełek nakrywek. 5. Szkiełka nakrywki są następnie umieszczane na szkiełku przedmiotowym i zabezpieczone przezroczystą taśmą. 6. Zamontowane ksenoprzeszczepy gotowe do obrazowania konfokalnego. Stworzone za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 8Wizualna reprezentacja kwantyfikacji wielkości guza na obrazach z mikroskopu konfokalnego. Obrazy konfokalne ksenoprzeszczepu HCT116 w 4. dniu po wstrzyknięciu A. Seria przekrojów z-stack w kanale DAPI uzyskana za pomocą 5 µm odstęp. Czerwone przerywane linie otaczają trzy reprezentatywne przekroje wykorzystane do liczenia komórek. B. Ilustracja kwantyfikacji jąder barwionych DAPI przy użyciu wtyczki Cell Counter w oprogramowaniu ImageJ/Fiji. C-EPrzykład rozdzielczości na poziomie pojedynczych komórek w obrębie guza, w której możliwa jest wizualizacja/ilościowe oznaczenie figur mitotycznych w barwieniu DAPI lub przy użyciu przeciwciała przeciwko fosfo-histonie H3 (kolor zielony). D i E powiększenia wynoszą C. Paski skali reprezentują 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 9. Reprezentatywne wyniki. A-E. Linia komórek raka jelita grubego HCT116 została znakowana barwnikiem Vybrant CM-DiI i wstrzyknięta do przestrzeni okołżółtkowej (PVS) embrionów w 2. dniu po zapłodnieniu (dpf). Po wstrzyknięciu ksenoprzeszczepy inkubowano w temperaturze 34 °C. W 1. dniu po wstrzyknięciu (dpi) ksenoprzeszczepy przeszły screening i zostały losowo przydzielone do grupy kontrolnej (nieleczonej) oraz grupy leczonej preparatem FOLFIRI przez 3 kolejne dni, a następnie utrwalone w 4. dniu po wstrzyknięciu. A. Wykonano immunofluorescencję w celu wykrycia komórek apoptotycznych, stosując przeciwciało anty-cleaved Caspase 3 oraz DAPI do kontrastowania jąder. Ilościowe oznaczenie indeksu mitotycznego C, apoptozy (% aktywnej kaspazy 3) D oraz wielkości guza E wykazało, że FOLFIRI indukuje istotny spadek liczby mitoz (test Manna-Whitneya, P<0.0001) oraz istotną indukcję apoptozy (test Manna-Whitneya, P<0.0001), czemu towarzyszyła 54-procentowa redukcja wielkości guza (P<0.001). Liczba analizowanych ksenoprzeszczepów jest wskazana na rysunku, a każda kropka reprezentuje jeden ksenoprzeszczep. F-H. Reprezentatywne obrazy ksenoprzeszczepów raka jelita grubego w 4. dniu po wstrzyknięciu, znakowane ludzkimi markerami w kolorze zielonym (ludzkie HLA, ki67 i hMITO) w PVS oraz CHT I. J-J'. Obrazy konfokalne poliklonalnych ksenoprzeszczepów, wstrzykniętych z dwiema różnymi ludzkimi liniami komórkowymi raka jelita grubego, znakowanymi lipofilnym barwnikiem CellTracker Deep Red (Cy5 - biały), CellTracker Green CMFDA (488 - zielony) oraz kontrastowaniem DAPI. K-K'. Obrazy konfokalne dwóch różnych ludzkich linii komórkowych raka jelita grubego, znakowanych lipofilnym barwnikiem CellTracker Deep Red (Cy5 - biały), Vybrant CM DiI (594 - czerwony) oraz kontrastowaniem DAPI. Paski skali reprezentują 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Linia komórkowa | Tkanka | Gatunek | Morfologia | Tryb wzrostu | Optymalna konfluencja do iniekcji | Środek dysocjujący do wstrzykiwań | Czas dysocjacji | Protokół znakowania | Medium do wstrzykiwania | Podziel całkowitą liczbę komórek przez (aby uzyskać optymalne stężenie do iniekcji) | |||||||
| SW480 | Gruczolakorak jelita grubego (pierwotny) | Człowiek | Nabłonkowy | Przyległe | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minut | Kolba | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| SW620 | Gruczolakowrak jelita grubego (przerzuty) | Człowiek | Nabłonkowy | Przylegający | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minut | Kolba | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HCT116 | Rak jelita grubego (pierwotny), z mutacją genu Kras | Człowiek | Nabłonkowy | Przytwierdzone | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minut | Kolba | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HKE3 | Rak jelita grubego, Kras WT | Człowiek | Nabłonkowy | Przybylne | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minut | Kolba | PBS 1x | 0,25 | |||||||
| HT-29 | Gruczolakorak jelita grubego (pierwotny) | Człowiek | nabłonkowy | Przybłonowe | 70% - 75 % | PBS/EDTA 2 mM | 5 minut | Kolba | PBS 1x | 0,2 | |||||||
| CACO-2 | Gruczolakowrak jelita grubego (pierwotny) | Człowiek | Nabłonkowy | Adherentne | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minut | probówka do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml | Pożywka pełna | 0,25 | |||||||
| MCF-7 | Gruczolakorak piersi (przerzuty) | Człowiek | Nabłonkowy | Adherentne | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minut | probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | 60% FBS + 40% pożywki kompletnej | 0,5 | |||||||
| Hs578T | Rak piersi (pierwotny) | Człowiek | Nabłonkowy | Przylegający | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 2 minuty | probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | 60% FBS + 40% pożywki kompletnej | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-468 | Gruczolakorak piersi (przerzuty) | Człowiek | Nabłonkowy | Przylegający | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 8 minut | probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | 60% FBS + 40% pożywki kompletnej | 0,5 | |||||||
| MDA-MB-231 | Gruczolak raka piersi (przerzuty) | Człowiek | nabłonkowy | Przytwierdzalne | 70% - 75 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minut | probówka do mikrowirówki 1,5 ml | Pożywka pełna | 0,5 | |||||||
| RT112 | Rak przejściowokomórkowy pęcherza moczowego (pierwotny) | Człowiek | Nabłonkowy | Przytwierdzające | 85% - 90% | TrypLE | 6 minut + skrobacz do komórek | probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | Pożywka pełna | 0,5 | |||||||
| BFTC905 | Rak przejściowokomórkowy pęcherza moczowego (pierwotny) | Człowiek | Nabłonkowy | Przyłgający | 75% - 85% | TrypLE | 10 minut | probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | 80% pełnej pożywki + 20% PBS/EDTA 2 mM | 0,5 | |||||||
| J82 | Rak przejściokomórkowy pęcherza moczowego (pierwotny) | Człowiek | Nabłonkowy | Przytwierdzalne | 85% - 90% | TrypLE | 10 minut | probówka do mikrowirówki 1,5 ml | Pożywka kompletna | 0,5 | |||||||
| RT4 | Rochiakomiowy rak pęcherza moczowego (pierwotny) | Człowiek | Nabłonkowy | Przytwierdzające | 85% - 90% | TrypLE | 6 minut | probówka do mikrocentrifugowania 1,5 ml | Pożywka pełna | 0,5 | |||||||
| MIA PaCa-2 | Rak nabłonkowy trzustki (pierwotny) | Człowiek | Nabłonkowy | Przytwierdzalne | 80% - 90% | TrypLE | 3 minuty | probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | 60% FBS + 40% pożywki kompletnej | 0,5 | |||||||
| PANC-1 | Rak epithelioid trzustki (pierwotny) | Człowiek | Nabłonkowy | Adherentne | 80% | TrypLE | 5 minut | probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | PBS/EDTA 2 mM | 0,5 | |||||||
| VC8 | Fibroblasty płuc, mutant BRCA2, z deficytem HR | chozhamster chiński | nabłonkowy | Adherentne | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minut | probówka do mikrocentrifugowania o pojemności 1,5 ml | Pożywka pełna | 0,25 | |||||||
| VC8-B2 | Fibroblasty płucne, ludzkie BRCA2, BRCA2 −/− z deficytem HR | chochoł chiński | Nabłonkowy | Przytwierdzone | 70% - 80 % | PBS/EDTA 1 mM | 5 minut | probówka do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml | Pożywka pełna | 0,25 | |||||||
Tabela 1: Optymalna konfluencja in vitro dla kilku linii komórkowych w celu iniekcji
| Barwnik do komórek | Numer katalogowy | Widmo fluorescencji (Exc. - Em.) | Rozcieńczenie zapasu | Rozcieńczenie robocze do barwienia w kolbie | Rozcieńczenie robocze do barwienia w mikroprobowce 1.5 mL | Czas inkubacji | Obserwacje | ||||||
| Vybrant CM-DiI | V22888 | 549 nm - 569 nm | Już rozcieńczony | 4:1000 w PBS 1x | 4:1000 w PBS 1x | 15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC | |||||||
| Vybrant DiO | V22886 | 484 nm - 501 nm | Już rozcieńczony | 5:1000 w PBS 1x | 5:1000 w PBS 1x | 15 min @ 37 ºC + 4 min @ 4 ºC | Słaba rozdzielczość w obrazowaniu konfokalnym 4 dni po wstrzyknięciu | ||||||
| CellTracker Deep Red | C34565 | 630 nm - 660 nm | 1 mM w DMSO | 0.5 - 2.5 µM w PBS 1x | 0.5 - 2.5 µM w PBS 1x | 15 min @ 37 ºC | |||||||
| CellTracker Green CMFDA | C7025 | 492 nm - 517 nm | 10 mM w DMSO | 0.5 - 2.5 µM w PBS 1x | 0.5 - 2.5 µM w PBS 1x | 15 min @ 37 ºC | Produkt wycieka do jamy brzusznej 48 godzin po wstrzyknięciu, ale jest idealny do badań nad współwstrzykiwaniem | ||||||
Tabela 2: Barwnik i warunki
| Rozmiar | liczba larw | Objętość pożywki E3 1x |
| 100 mm x 15 mm (standard) | Do 50 | 20-25 ml |
| 60 mm x 15 mm | Do 20 | 10 ml |
| płytka 6-dołkowa | Do 15 na studzienkę | 3-4 ml na dołek |
Tabela 3: Opcje szalek Petriego
| pożywka E3 50x – roztwór stokowy | Dla 10 litrów sterylnej wody: |
| 146,9 g NaCl | |
| 6,3 g KCl | |
| 24,3 g CaCl22·2H2O | |
| 40,7 g MgSO44·7H2O | |
| pożywka E3 1x – gotowa do użycia | 400 ml pożywki E3 50x |
| 60 ml 0,01% roztworu błękitu metylenowego | |
| Napełnić do 20 litrów wody z systemu rybnego | |
| Tricaine 25x – roztwór zapasowy i eutanazja | 2 g proszku trykainy |
| 500 ml wody z odwróconej osmozy | |
| 10 ml 1 M Tris (pH 9) | |
| Dostosować do pH 7 | |
| Tricaina 1x – Znieczulenie | 20 ml Tricainy 25x |
| Dopełnić wodę systemową do objętości 500 mL | |
| 60 mg/mL Pronazy - roztwór stokowy 100x | 1 g pronazy |
| 16,7 ml sterylnej wody | |
| 0,6 mg/mL pronazy – 1x gotowy do użycia | 100 µL pronaza 100x |
| 9,9 ml pożywki E3 1x |
Tabela 4: Składy roztworów
Dyskusja
Rosnące znaczenie danio pręgowanego jako modelu rozwoju nowotworów i badań przesiewowych leków zaowocowało licznymi publikacjami 3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Jednak wstrzykiwanie komórek rakowych do zarodków danio pręgowanego jest techniką, która wymaga wysokiego poziomu zręczności, co może stanowić wyzwanie dla badaczy. W niniejszym protokole staramy się dostarczyć praktycznych informacji i wskazówek, które mogą pomóc w przezwyciężeniu początkowych wyzwań związanych z zakładaniem ksenoprzeszczepów zarodków danio pręgowanego.
Postępowanie z komórkami przed wstrzyknięciem
Ten zoptymalizowany protokół generowania ksenoprzeszczepów danio pręgowanego z liniami komórkowymi można dostosować do różnych typów komórek (nowotworowych) o różnej morfologii. Zalecamy, aby wszystkie linie komórkowe używane do ksenoprzeszczepów danio pręgowanego były wolne od mykoplazmy. W przeciwieństwie do innych zanieczyszczeń bakteryjnych, obecność mykoplazmy w hodowli komórkowej nie powoduje zmian, które można łatwo wykryć pod mikroskopem22. Zanieczyszczenie mykoplazmą może wpływać na potencjał wszczepiania linii komórkowych, ich wrażliwość na leki, a także na żywotność zarodków danio pręgowanego.
Chociaż komórki mogą nadal się namnażać przez dłuższy czas, ich fenotyp i genotyp mogą być podatne na zmiany. Ważne jest, aby zapoznać się z morfologią i zachowaniem linii komórkowych w hodowli. Zalecamy utrzymanie liczby pasaży komórkowych po rozmrożeniu w zakresie 3-12, aby uzyskać powtarzalne wyniki. Dlatego należy przeprowadzać regularne badania na obecność mykoplazmy.
Komórki powinny znajdować się w fazie logarytmicznej (faza wzrostu wykładniczego przed osiągnięciem konfluencji ~70%) w dniu wstrzyknięcia. Umożliwi to odpowiednie wszczepienie i prawidłowy rozwój charakterystycznych cech charakterystycznych guza. Aby zapobiec zmianom w fenotypie komórek w obrębie ksenoprzeszczepu, kluczowe znaczenie ma utrzymanie stałej konfluencji dla wstrzyknięć między eksperymentami. Liczba wstrzykiwanych komórek może być dostosowana do charakterystyki każdej linii komórkowej, ponieważ niektóre mogą wymagać większej gęstości wstrzyknięcia, aby rozwijać się w zarodkach danio pręgowanego.
Uwagi dotyczące etykietowania komórek
Aby lepiej uwidocznić ludzkie komórki nowotworowe do wstrzyknięcia i przyszłej analizy, komórki nowotworowe można znakować barwnikami fluorescencyjnymi. Ze względu na różnice w wielkości komórek, całkowita liczba komórek/cm2 w przylegających kulturach różni się między liniami komórkowymi. Będzie to miało wpływ na skuteczność protokołu barwienia, a także na liczbę komórek pobranych do wstrzyknięcia. Duże komórki, które dają niską liczbę kolb na kolbę (np. Hs578T) lub rosną w klastrach (tj. BFTC905), będą wymagały połączenia kilku kolb w jednym eksperymencie. W takim przypadku barwienie komórek nie powinno być wykonywane bezpośrednio w kolbie, ponieważ spowoduje to użycie nadmiernej ilości barwnika (wysoki koszt). Z drugiej strony, komórki, które są bardzo wrażliwe na nadmierne cykle wirowania, a także te, które dają duże liczby na kolbę (tj. HCT116), mogą być barwione bezpośrednio w kolbie, a następnie odłączane za pomocą skrobaczki EDTA/komórek (więcej informacji znajduje się w Tabeli 1).
Jeśli to możliwe, zamiast stosować podejście enzymatyczne, należy użyć EDTA do odłączenia komórek w dniu wstrzyknięcia, tak aby komórki szybciej odzyskiwały swoje połączenia komórka-komórka i były poddawane mniejszej liczbie etapów wirowania. Niemniej jednak, jeśli komórki są wrażliwe na EDTA, bardzo przylegają lub rosną w skupiskach - można zastosować metodę enzymatyczną. Optymalizacja idealnego stężenia do iniekcji, jak również pożywki iniekcyjnej zależy od charakterystyki każdej linii komórkowej, dlatego może wymagać pewnych korekt (tabela 1).
Kalibracja mikroiniekcji
W przeciwieństwie do dostarczania oligonukleotydów lub leków do zarodka danio pręgowanego, siatka nie jest używana do kalibracji igły podczas pracy z liniami komórkowymi do ksenoprzeszczepów. Po pewnym czasie podczas wstrzykiwania komórki zaczną się zatykać i konieczne jest przecięcie końcówki igły, aby zwiększyć jej średnicę lub całkowicie zmienić igłę. Ta procedura utrudnia kalibrację siatki.
Aby rozwiązać ten problem, liczba dozowanych komórek jest regulowana przez ciśnienie wyrzutu i czas potrzebny do osiągnięcia rozmiaru podobnego do oka zarodka w ciągu 1-3 impulsów. Następnie, aby dalej kontrolować wielkość guza, w rozdzielczości 1 dpi, ksenoprzeszczepy są sortowane według wielkości guza, jak pokazano na rycinie 6 B-B". Jak pokazano na przykładzie z ryc. 6C , ta metoda sortowania jest skuteczna w zmniejszaniu zmienności rozmiarów guza: jeśli zsumujemy je wszystkie razem (+, ++, +++), STEV jest ~dwukrotnie wyższy od klasy ++ (~906 komórek do ~422 komórek), a zmienność współczynnika wynosi ~31,9% w porównaniu do 14,5% w klasie ++. Ponieważ odniesieniem do wstrzykiwań jest objętość, całkowita liczba komórek różni się znacznie w zależności od typu komórek - zależy od wielkości i kształtu komórek. Na przykład duże komórki z dużą ilością cytoplazmy, takie jak rak piersi Hs578T, wytwarzają znacznie mniejsze guzy (~ 600 komórek). Ponadto każda linia komórkowa wymaga innej liczby komórek. Na przykład linie komórkowe HT29 CRC i RT112 raka pęcherza moczowego wykazały, że im większa liczba wstrzykniętych komórek, tym wyższa śmiertelność danio pręgowanego. W związku z tym potrzebny jest okres optymalizacji podczas opracowywania ksenoprzeszczepów, aby sprawdzić, czy linia komórkowa ma działanie toksyczne w zarodku lub wymaga większej/mniejszej gęstości iniekcji.
Wstrzyknięcia
Jedną z najczęstszych rozbieżności podczas generowania ksenoprzeszczepów zarodków danio pręgowanego jest miejsce wstrzyknięcia. Żółtko jest zwykle wybieranym miejscem do wstrzykiwania ze względu na jego łatwą dostępność. Zaobserwowaliśmy jednak, że komórki wstrzyknięte do żółtka mają większą tendencję do obumierania. Chociaż jest to trudniejsze technicznie, zalecamy wstrzyknięcie do PVS i jak najdalej od serca. W obrębie PVS komórki mogą się agregować, rekrutować naczynia krwionośne i komórki odpornościowe, migrować, wewnątrznaczynieniowo, wynaczyniać i tworzyć mikroprzerzuty, jeśli wykazują cechy przerzutowe 8,11.
Skuteczność wszczepienia
Oczekuje się, że różnice w skuteczności wszczepienia i wielkości guza między liniami komórkowymi w rozdzielczości 4 dpi wynikają z ich różnych stopni podstawowej śmierci/przeżycia/proliferacji komórek, ale także ze względu na wrodzoną immunogenność, którą każda linia komórkowa może wykazywać9.
Przerzutów
Przerzuty to wieloetapowa kaskada zdarzeń, które można podzielić na dwa dowolne etapy. W pierwszym etapie komórki nowotworowe muszą oderwać się od miejsca pierwotnego, migrować i zaatakować sąsiednie tkanki, a następnie przedostać się do krwiobiegu. W drugim etapie komórki nowotworowe muszą przetrwać w krążeniu, wynaczynić z naczyń krwionośnych lub limfatycznych, a na koniec skolonizować się w miejscach wtórnych23. Aby odróżnić te wczesne i późne zdarzenia oraz zająć się potencjałem/biegłością różnych komórek nowotworowych do wykonywania tych kroków, zaprojektowaliśmy prosty test.
Ogólnie rzecz biorąc, po wstrzyknięciu do PVS komórki nowotworowe mogą dostać się bezpośrednio do krążenia, a następnie zostać fizycznie uwięzione w ogonowej tkance krwiotwórczej (CHT) (obszar ogonowy). Jednak zgodnie z charakterystyką każdej komórki nowotworowej - widzieliśmy, że niektóre komórki nowotworowe pozostają na CHT 4 dpi i są w stanie tworzyć mikroprzerzuty, podczas gdy inne komórki nowotworowe znikają (oczyszczone po złapaniu w CHT).
Dlatego, porównując skuteczność mikroprzerzutów (przy 4 dpi), gdy komórki zostały umieszczone bezpośrednio w krążeniu - CIRC (komórki muszą przejść tylko późne etapy przerzutów) vs. gdy nie - NO CIRC (komórki muszą przejść przez wczesne i późne etapy, aby móc utworzyć mikroprzerzuty), możemy ocenić ich wczesny lub późny potencjał przerzutowy. Zaobserwowaliśmy komórki nowotworowe, które mogą skutecznie tworzyć mikroprzerzuty w CHT w obu grupach (CIRC i NO CIRC), co sugeruje, że komórki te mają zdolność do przechodzenia wszystkich etapów kaskady przerzutowej (na przykład SW480 i MDA-MB-468)8,11. W przeciwieństwie do tego, inne komórki nowotworowe mają bardzo niski potencjał przerzutowy w obu grupach, prawie nigdy nie wytwarzają mikroprzerzutów, nawet po wstrzyknięciu do krążenia (tj. widoczne w CHT przy 24 hpi, ale przy 4 dpi już ich tam nie ma, na przykład Hs578T)8. Jednak wyraźnie znaleźliśmy inną grupę - taką, która jest w stanie wytworzyć mikroprzerzuty dopiero po wstrzyknięciu do krążenia (mikroprzerzuty możemy zaobserwować tylko w grupie CIRC). Sugeruje to, że komórki te mają niską skuteczność w wykonywaniu pierwszych kroków kaskady przerzutowej, ale z drugiej strony są w stanie przetrwać w krążeniu, wynaczynić i skolonizować odległe miejsce.
Barwienie immunologiczne i obrazowanie
Przed utrwaleniem ten protokół iniekcji może być używany do innych podejść do obrazowania na żywo, takich jak mikroskopia kontrastu różnicowego interferencyjnego na żywo (DIC), mikroskopia z wirującym dyskiem, obrazowanie konfokalne na żywo o wysokiej rozdzielczości i mikroskopia arkuszy świetlnych itp.
Martwe komórki i szczątki komórkowe wydają się jasne, gdy są obserwowane przez fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy i mogą być mylone z żywymi komórkami, zwłaszcza jeśli celem badania jest ocena potencjału przerzutowego linii komórkowych. Pragniemy podkreślić znaczenie wykonywania obrazowania konfokalnego ze specyficznymi markerami żywotności i DAPI w celu oceny stanu przeżycia guza i mikroprzerzutów. Fundamentalne znaczenie ma również stosowanie specyficznych ludzkich przeciwciał do wykrywania komórek ludzkich, takich jak mitochondria anty-ludzkie lub anty-ludzkie HLA. Wdrażając protokół, trenuj oczy eksperymentatora, porównując barwienie w mikroskopie stereoskopowym z obrazami konfokalnymi. Po pewnym czasie eksperymentatorzy są w stanie wyraźnie odróżnić szczątki od żywych komórek w fluorescencyjnym mikroskopie stereoskopowym.
Chociaż powszechnie stosowane są inne metody ilościowego określania obciążenia guza, takie jak cały obszar fluorescencji, zalecamy wykonanie barwienia immunologicznego całej góry i obrazowania konfokalnego jako dokładniejszą metodę. Nie tylko skuteczność barwienia barwnikami lipofilowymi jest bardzo zmienna (tj. niektóre komórki są bardzo dobrze wybarwione, a inne nie - prawdopodobnie ze względu na zawartość lipidów w ich błonach), ale także wielokrotnie barwniki lipofilowe tworzą agregaty, a martwe komórki wydają się być jaśniejsze - tworząc kilka artefaktów, które można pomylić z żywymi komórkami.
Komórki mogą być transdukowane za pomocą białek fluorescencyjnych, aby pomóc w ich śledzeniu i pominąć znakowanie komórek. Należy jednak upewnić się, że transdukowane i nietransdukowane komórki dają takie same wyniki w ksenoprzeszczepach danio pręgowanego.
Ponadto makrofagi mogą fagocytować te fluorescencyjne szczątki komórek, stając się znakowane fluorescencyjnie i migrować, generując fałszywie dodatnie komórki przerzutowe. Dlatego zalecamy szereg narzędzi analitycznych, które oczywiście można rozszerzyć na wiele innych odczytów w celu dokładniejszej interpretacji zachowania guza:
- Proliferacja - kwantyfikacja figur mitotycznych za pomocą przeciwciała DAPI lub anty-pHH3Ser10 (Merck Millipore Cat. #06-570),
- Śmierć komórki przez apoptozę – przeciwciało antyaktywowane Kaspazą3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) lub równoważne,
- Wielkość guza - liczenie DAPI - ludzkie komórki nowotworowe wykazują bardzo wyraźną organizację chromatyny, dzięki czemu można je łatwo odróżnić od komórek danio pręgowanego i zawsze można je dokładnie sprawdzić za pomocą barwnika (podczas treningu oka),
- Do badań przerzutowych, w celu jednoznacznego wykrycia komórek ludzkich, - anty-ludzkie HLA (Abcam EP1395Y Kat. #ab52922), anty-ludzkie mitochondria (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).
W przypadku akwizycji konfokalnej z odstępem 5 μm między warstwami w stosie Z kontrolnych komórek rakowych HCT116 (średnia wielkość jądra 10-12 μm średnicy) z barwieniem przeciwstawnym DAPI, zaobserwowaliśmy, że ~ 50% komórek jest współdzielonych między dwoma kolejnymi plasterkami. W związku z tym, jeśli każdy wycinek jest liczony, istnieje duże ryzyko dwukrotnego policzenia tych samych komórek. Przechodzenie tam i z powrotem między wycinkami w celu uniknięcia problemów z kwantyfikacją skutkuje czasochłonną i podatną na błędy techniką. Aby ułatwić kwantyfikację całkowitej liczby komórek i umożliwić większą odtwarzalność między badaczami, stworzyliśmy wzór na wielkość guza opisany wcześniej w tym protokole8.
Dołączyliśmy numer poprawki (1,5), aby uwzględnić ~50% komórek współdzielonych między wycinkami. Okazało się, że średni błąd ręcznego liczenia całego guza między badaczami wynosił 20%. Dwóch badaczy korzystających z tej formuły miało 2% błąd. Zastosowanie tej formuły ma 93% wskaźnik dokładności i 98% wskaźnik odtwarzalności. Przetestowaliśmy również metody automatyczne, ale wykazały one błąd wyższy niż 50% spowodowany ustawieniami progowymi.
Ze względu na charakterystykę komórek apoptotycznych kwantyfikacja aktywowanych komórek kaspazy 3 jest trudniejsza. Aby zmniejszyć liczbę błędów i różnic w wynikach, zalecamy, aby próbki kontrolne i eksperymentalne były liczone przez tego samego badacza. Dodatkowo, ucząc się tej techniki, nowy badacz musi liczyć obrazy, które zostały już określone ilościowo przez bardziej doświadczonych badaczy, aby porównać wyniki i trenować.
W razie potrzeby czas trwania testu można wydłużyć. Należy jednak wziąć pod uwagę, że larwy danio pręgowanego wymagają żywienia od ~7 dni po zapłodnieniu (5 dni po wstrzyknięciu). Ponadto wytyczne i przepisy dotyczące dobrostanu zwierząt stosowane w przypadku larw starszych niż 6 dni po zapłodnieniu mogą się różnić.
Protokół ten zapewnia przydatne narzędzia, które umożliwiają pojedynczemu badaczowi wstrzyknięcie około ~ 200-300 larw danio pręgowanego na godzinę; oraz wyniki pełnego testu, w tym analizy i interpretacji statystycznej, uzyskane w ciągu trzech tygodni. Mamy nadzieję, że ten protokół pomoże naukowcom stać się ekspertami w generowaniu ksenoprzeszczepów danio pręgowanego. Nie jest to łatwe; Musisz ćwiczyć, ale dotrzesz do celu. Powodzenia!
Podziękowania
Dziękujemy Fundacji Champalimaud, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, współfinansowanej przez FCT/Lisboa2020) i FCT-PTDC/MEC-ONC/31627/ 2017 za dofinansowanie. Stypendia FCT dla VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Wszystkim członkom Fior Lab za krytyczne dyskusje; B. Costa i C. Rebelo de Almeida za udostępnianie danych; oraz członkom naszego laboratorium, C. Rebelo de Almeidzie, M. Barroso i L. Leite za ich udział w filmie. Chcielibyśmy podziękować CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro i inni) oraz zespołowi Champalimaud Communication, Events and Outreach, w szczególności Alexandre'owi Azinheirze za fantastyczne stworzenie filmu oraz Catarinie Ramos i Teresie Fernandes za ich pomoc.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agar do bakteriologii | VWR | 97064-336 | Płytka agarowa |
| anty-kaspaza3Asp175 (monoklonalny królik) | Technologie sygnalizacji komórkowej | 9661 | Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia immunologicznego całej góry (Rozcieńczenie 1:100) |
| anty-ludzkie HLA (monoklonalne królika) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia immunologicznego całej góry (Rozcieńczenie 1:100) |
| anty-488 (monoklonalny królik) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Przeciwciało drugorzędowe do barwienia immunologicznego całego wierzchowca (Rozcieńczenie 1:200) |
| anty-594 (monoklonalne królika) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Przeciwciało drugorzędowe do barwienia immunologicznego całej góry (Rozcieńczenie 1:200) |
| CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher | Scientific C34565 | Barwnik lipofilowy (Rozcieńczenie 1:1000) |
| CellTracker Zielony barwnik CMFDA | ThermoFisher Scientific | C2925 | Barwnik lipofilowy (rozcieńczenie 1:1000) |
| Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml | VWR | 525-0610 | |
| Stożkowa probówka wirówkowa 15 ml | VWR | 525-0604 | |
| DAPI | |||
| Laserowy ściągacz do mikropipet jądrowych i chromosomowych P-2000 | Sutter-Instrument | Ściągacz | |
| Probówka do mikrowirówek 1,5 ml | Abdos | P10202 | |
| Szkiełka mikroskopowe, krawędź tnąca | RS France | BPB016 | Szkiełka do montażu |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Medium montażowe |
| Pneumatyczna pompa Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Mikrowtryskiwacz |
| Prostokątne okulary nakrywkowe, Menzel Glä ser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Szkiełka nakrywkowe do montażu |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Płytka agarowa |
| Cienkościenne szklane kapilary | World Precision Instruments | TW100-4 | Kapilary borokrzemianowe |
| TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatyczny roztwór odrywający |
| Wazelina | Wazeli uszczelnienie | ||
| Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Barwnik lipofilowy (Rozcieńczenie 1:1000) |
| Vybrant DiO Roztwór do znakowania komórek | ThermoFisher Scientific | V22886 | Barwnik lipofilowy (Rozcieńczenie 1:1000) |
| ZEISS Axio Zoom.V16 do biologii | ZEISS | Fluorescencyjny mikroskop stereo zmiennoogniskowy | |
| Zeiss LSM 710 | Mikroskop konfokalny | ZEISS |
Bibliografia
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
- Weintraub, A. All eyes on zebrafish. Lab Animals. 46, 323-326 (2017).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases. Current Topics in Innate Immunity II. Lambris, J. D., Hajishengallis, G. , Springer. 253-275 (2012).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).
- Póvoa, V., et al. Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model. Nature Communications. 12, 1156(2021).
- Galletti, G., et al. Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression. Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).
- Rebelo de Almeida, C., et al. Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy. Communications Biology. 3, 1-13 (2020).
- Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status. Cancers. 12, 1769(2020).
- Osmani, N., Goetz, J. G. Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish. Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).
- Hyenne, V., et al. Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo. Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).
- Costa, B., et al. Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine. EBioMedicine. 51, 102578(2020).
- Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models. Cells. 9, 293(2020).
- TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki. , Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE (2021).
- Zhao, C., et al. A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors. Plos One. , (2011).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7, 745-754 (2014).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).
- Zon, L. I., Peterson, R. The New Age of Chemical Screening in Zebrafish. Zebrafish. 7, 1(2010).
- Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen. , Available from: https://www.invivogen.com/review-mycoplasma (2016).
- van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutation Research. 728, 23-34 (2011).
Przedruki i uprawnienia
