To badanie opisuje, jak rozciąć worek endolimfatyczny z wewnętrznego ucha myszy w różnym wieku. Wynik podobnej sekcji pokazano w mysim modelu powiększenia worka endolimfatycznego Slc26a4-zero. Transgeniczna mysz z fluorescencyjnym reporterem wyrażonym w woreczku endolimficznym jest prezentowana jako model do łatwej wizualizacji worka endolimfatycznego i narzędzie edukacyjne.
Artykuł metodologiczny
Wypreparowanie worka endolimfatycznego od myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie zmutowanych mysich modeli zaburzeń słuchu i równowagi u ludzi ujawniło wiele zmian strukturalnych i funkcjonalnych, które mogą przyczynić się do rozwoju ludzkich fenotypów. Chociaż poczyniono istotne postępy w zrozumieniu rozwoju i funkcji nabłonka neurosensorycznego ślimaka i przedsionka, dostępna jest ograniczona wiedza na temat rozwoju, składu komórkowego, szlaków molekularnych i cech funkcjonalnych worka endolimftycznego. Wynika to w dużej mierze z trudności w wizualizacji i mikropreparowaniu tej tkanki, która jest nabłonkiem składającym się tylko z jednej warstwy komórkowej. Przedstawione tutaj badanie opisuje podejście do dostępu i mikropreparacji worka endolimfatycznego z ucha wewnętrznego myszy typu dzikiego w różnym wieku. Wynik podobnej sekcji pokazano w mysim modelu powiększenia akweduktu przedsionkowego z niedoborem wahadła. Przedstawiono transgeniczną mysz z fluorescencyjnym workiem endolimficznym. Ta mysz reporterowa może być używana do łatwej wizualizacji worka endolimfatycznego z ograniczoną preparacją i określenia jego rozmiaru. Może być również używany jako narzędzie edukacyjne do nauki preparowania worka endolimfatycznego. Te procedury preparacyjne powinny ułatwić dalszą charakterystykę tej niedostatecznie zbadanej części ucha wewnętrznego.
Wprowadzenie
Ucho wewnętrzne ssaków składa się ze ślimaka, woreczka, łagiewki, trzech półkolistych kanałów i worka endolimfatycznego (Rysunek 1A). Narządy te składają się z ciągłego, wypełnionego płynem nabłonka zwanego błędnikiem błoniastym, z sąsiednimi narządami łączącymi się bezpośrednio lub poprzez małe struktury kanałowe, takie jak przewód krzyżowy, przewód woreczkowy, przewód łagiewkowy lub przewód endolimfatyczny . W porównaniu z innymi narządami ucha wewnętrznego, worek endolimfatyczny ma unikalne cechy. Po pierwsze, brakuje mu komórek nabłonka czuciowego. Zamiast tego worek endolimfatyczny ma komórki wyspecjalizowane do transportu jonów. Po drugie, chociaż błędnik błoniasty jest zamknięty w błędniku kostnym, wyjątkiem jest worek endolimfatyczny wystający częściowo z kości skalistej do jamy wewnątrzczaszkowej. Ta morfologia wydaje się być wysoce konserwatywna podczas ewolucji ucha wewnętrznego. Po trzecie, worek endolimfatyczny jest pierwszą strukturą, która rozwija się z otocysty we wczesnym stadium embrionalnym, przed utworzeniem innych narządów. Ponadto kilka patologii wiąże się z powiększonym workiem endolimfatycznym lub nieprawidłowym przedziałem endolimficznym. Obecność wariantów patogennych w SLC26A4 (znanych również jako gen pendryny) prowadzi do stosunkowo powszechnej formy odbiorczego ubytku słuchu, spowodowanej powiększeniem worka endolimfatycznego związanym z obecnością powiększonego akweduktu przedsionkowego (EVA)1. W połączeniu z wolem określa się go jako zespół Pendreda2,3. Niektórzy uważają również, że choroba Meniere'a jest związana z nieprawidłowością przedziału endolimfatycznego (hydrops)4. Unikalne cechy worka endolimfatycznego i patologie związane ze zmianą jego morfologii są zgodne z kluczową rolą w rozwoju i utrzymaniu ucha wewnętrznego.
Pomimo swojego znaczenia, wiedza na temat rozwoju, składu komórkowego, szlaków molekularnych i cech funkcjonalnych worka endolimfatycznego jest nadal ograniczona. Wynika to przynajmniej częściowo z trudności w wizualizacji i mikropreparowaniu tej tkanki. Worek endolimfatyczny jest strukturą w kształcie torebki, składającą się z pojedynczej warstwy komórek nabłonkowych, która często jest półprzezroczysta i bardzo trudna do zidentyfikowania z otaczającej go tkanki łączącej za pomocą mikroskopii stereoskopowej światła. Chociaż niewielka liczba badaczy opracowała techniki sekcji całego montażu i opublikowała swoje wyniki eksperymentalne5,6,7,8,9,10, nie ma publikacji skupiającej się na technicznych szczegółach tej procedury.
W tym badaniu opisano metody mikrodysekcji opracowane w celu uzyskania dostępu i izolacji worka endolimfatycznego od ucha wewnętrznego myszy typu dzikiego w różnym wieku, w całym montażu. Wyniki podobnej sekcji pokazano na modelu mysim, pozbawionym ekspresji SLC26A4, który ma powiększenie przewodu endolimfatycznego i worka moczowego. Opisano linię myszy z transgenem kodującym rekombinazę Cre ulegającą ekspresji w woreczku endolimficznym. W obecności fluorescencyjnego reportera ekspresji Cre, w tym przypadku tdTomato, fluorescencja może być wykorzystana do łatwej wizualizacji worka endolimfatycznego z ograniczoną dyspreparacją i uzyskania informacji o jego wielkości. Ta linia myszy reporterowej może być również używana jako narzędzie edukacyjne do ćwiczenia i doskonalenia endolimfatycznych rozwarstwień worków łodomkowych. Zdolność do preparowania tkanki worka endolimfatycznego powinna ułatwić dalszą charakterystykę tego niedostatecznie zbadanego, ale istotnego elementu ucha wewnętrznego.
Protokół
Wszystkie eksperymenty i procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Instytutu Chorób Neurologicznych i Udaru Mózgu/Narodowego Instytutu Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych (#1264) oraz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym i Dentystycznym w Tokio (A2020-058A).
UWAGA: Myszy C57BL/6J (numer katalogowy 000664), Pds-/- znane również jako myszy Slc26a4-/- (129S-Slc26a4 tm1Egr/AjgJ, nr 018424) 11, B6; CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm myszy12 i Ai9(LSL-RCL-tdT) (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze, nr 007909) myszy13 są dostępne w Jackson Laboratory i na życzenie. Wszystkie procedury genotypowania zostały już wcześniej opisane. B6; Myszy CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm wcześniej skrzyżowane wstecznie ze szczepem C57BL/6J przez co najmniej pięć pokoleń, zostały wyhodowane do eksperymentów. Zwierzęta obu płci można badać przy użyciu tego podejścia bez oczywistej różnicy. Pierwszy dzień po nocnym kryciu liczy się jako dzień embrionalny 0,5 (E0,5).
1. Pobieranie i utrwalanie nienaruszonego ucha wewnętrznego w czaszce
- Poddać eutanazji zwierzę doświadczalne lub matkę w ciąży przy użyciu instytucjonalnie zatwierdzonej procedury, na przykład przy użyciu inhalacji CO2 . Jeśli to możliwe, pracuj pod wyciągiem, aby uniknąć lub zminimalizować rozprzestrzenianie się alergenów myszy. Po zweryfikowaniu braku reakcji na bolesne bodźce, takie jak szczypanie łapy lub ogona, należy odciąć zwierzęciu głowę. W przypadku matki w ciąży w ciąży szyjnej zwichnięcie szyjki macicy może być stosowane jako alternatywa dla dekapitacji, jeśli jej ucho wewnętrzne nie jest wykorzystywane do dalszych eksperymentów.
- Zbierz zarodki metodą laparotomii14 za pomocą nożyczek do tętnic z końcówką kulkową, aby chronić zarodki podczas procesu. Manipuluj zarodkami za pomocą kleszczy pierścieniowych. Umieść rogi macicy w PBS o temperaturze 4 °C na lodzie i odizoluj każdy zarodek, jak opisano wcześniej15 przed ich ścięciem.
- Przetnij głowę na pół od tyłu do przodu: najpierw naciąć czubek głowy, najpierw nacinając skórę, a następnie górną część czaszki, nacinając około jednej trzeciej przy każdym cięciu, aby nie doszło do zgięcia czaszki. Następnie od razu odetnij spód czaszki.
UWAGA: W przypadku zarodków zaleca się stosowanie ostrego ostrza, a nie nożyczek. Bardzo ważne jest, aby w każdym wieku czaszka nie uległa deformacji podczas jej przecięcia. - Nie dotykając ani nie zginając czaszki, ostrożnie usuń półmózg aby odsłonić kostny błędnik (Rycina 1B, Dodatkowa Figura 1A-B).
- W przypadku myszy po urodzeniu w 5. dniu lub starszych należy przeciąć zewnętrzny przewód słuchowy i pociągnąć skórę do przodu w kierunku nosa. Przyciąć czaszkę wokół ucha wewnętrznego (rysunek uzupełniający 1C).
- Przenieść dwie półczaszki każdego zwierzęcia z uchem wewnętrznym, możliwie nienaruszone, do szklanej fiolki lub probówki zawierającej 10 ml 4% paraformaldehydu (PFA) o temperaturze 4 °C, rozcieńczonego w 1x PBS i przechowywać na lodzie pod wyciągiem.
UWAGA: Na tym etapie nie próbuj wyjmować ucha wewnętrznego z czaszki, ponieważ może to spowodować uszkodzenie przewodu endolimfatycznego i worka wewnątrzlimfatycznego. - Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C na wytrząsarce na biegunach. W przypadku pracy z tkanką zwierzęcia z fluorescencyjnym reporterem, probówkę zawierającą próbkę należy umieścić w folii aluminiowej lub w pudełku, aby zminimalizować ekspozycję na światło.
UWAGA: Jeśli jesteś zainteresowany badaniem mikrotubul i związanych z nimi cząsteczek, utrwalanie tkanek powinno być wykonywane w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą utrwalacza RT. - Wyrzuć PFA do odpowiedniego pojemnika w dygestorium. Przemyć trzy razy 10 ml 1x PBS przez 15 minut za każdym razem na kołyszącym się wytrząsarce w temperaturze RT, aby usunąć utrwalacz przed rozbiorem.
2. Mikrodysekcja worka endolimfatycznego
- Przenieść każdy preparat z ucha wewnętrznego do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm zawierającego 1x PBS.
- Umieść preparat w naczyniu tak, aby korzeń 8. nerwu czaszkowego był skierowany do góry. Przytrzymaj tkankę w tej pozycji, chwytając ślimak kleszczami #4 (Rysunek 1C).
- Zidentyfikuj ważne punkty orientacyjne: akwedukt przedsionkowy, przedni i tylny kanał półkolisty, podest pospolity i zatokę esicy (żyłę) (Ryc. 1D).
UWAGA: Worek endolimfatyczny u myszy typu dzikiego jest półprzezroczysty i trudny do wizualizacji. Aby udana mikrodysekcja worka endolimfatycznego była ważna, aby zrozumieć jego anatomię i lokalizację (Rysunek 1E). - Naciąć oponę twardą i akwedukt przedsionkowy, a także leżące poniżej tkanki łączne otaczające worek endolimfatyczny, za pomocą igły 27 G na strzykawce o pojemności 1 ml (Rysunek 1D, F).
UWAGA: W przypadku dorosłej myszy odwapnienie preparatu za pomocą 10% EDTA (pH 7,4) przed mikrodysekcją jest przydatne, ale nie konieczne, aby ułatwić nacięcie akweduktu przedsionkowego. W przypadku rozwarstwienia otwartego worka endolimfatycznego starszego niż 5 dzień po urodzeniu, zaleca się ustawienie linii nacięcia na akwedukcie przedsionkowym nieco do przodu, aby wykonać nacięcie w świetle worka endolimfatycznego (Figura 2A). - Przytrzymaj tkankę łączną znajdującą się po stronie worka endolimfatycznego za pomocą kleszczy i pociągnij tkankę, aby oderwać ją od kości skroniowej (Rysunek 1G).
- Ostrożnie usuń wszelkie pozostałe zanieczyszczenia. Preparat zwykle obejmuje nabłonek worka endolimfatycznego, otaczające tkanki łączne, część akweduktu przedsionkowego i zatokę esicy (Ryc. 1H-I). W razie potrzeby oddziel nabłonek worka endolimfatycznego od otaczających tkanek (Ryc. 1J).
- (Opcjonalnie) W celu rozwarstwienia otwartego worka endolimfatycznego należy przytrzymać część trzpienia preparatu tak, aby można było zaobserwować przekrój poprzeczny światła. Włóż igłę 27 G do światła i przesuń ją, aby przeciąć worek endolimfatyczny na dwa arkusze ( Rysunek 2B-C). Przytrzymaj krawędź każdej tkanki przypominającej arkusz kleszczami i oddziel je od siebie (Rysunek 2D-F).
3. Immunohistochemia
- Po mikrodysekcji użyj kleszczy #5, aby przenieść worki endolimfatyczne do 9-dołkowej szklanej płytki punktowej.
- Używając mikroskopu, aby upewnić się, że worki endolimfatyczne pozostają nienaruszone, użyj pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć wszystkie 1x PBS z wyjątkiem jednej kropli zawierającej tkankę. Dodać 200 μl roztworu przepuszczalnego i blokującego (1x PBS z 0,15% Triton X-100 (PBS-TX) i 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.
- Po usunięciu całego roztworu blokującego, z wyjątkiem jednej kropli zawierającej tkankę, dodać 200 μl przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Przeciwciała antypendrynowe6 rozcieńczone w stosunku 1:1000 w roztworze blokującym mogą być użyte do identyfikacji bogatych w mitochondria komórek worka endolimfatycznego, chociaż słaby wyraz występuje również w podzbiorze komórek bogatych w rybosomy16 (Rysunek 5).
- Po trzech przemyciach w 1x PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej, inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi. W celu przedstawionego tutaj znakowania inkubować 200 μl przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym, rozcieńczonych z zapasu handlowego w stosunku 1:500 w roztworze blokującym, z tkanką na platformie kołyszącej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Falloidyna sprzężona z barwnikiem fluorescencyjnym, która rozpoznaje β-aktynę (ACTB), może być użyta do podkreślenia obecności worka endolimfatycznego i przewodu, a także tkanki łączącej wokół nich (Figura 5A, C, F-G).
- Zamontuj woreczki endolimftyczne między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym za pomocą podłoża do mocowania zapobiegającego blaknięciu z DAPI. Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia, chronionych przed światłem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, nałóż przezroczysty lakier do paznokci na styku szkiełka nakrywkowego i szkiełka, aby je uszczelnić i ograniczyć tworzenie się pęcherzyków powietrza. W przypadku próby wizualizacji zróżnicowanego rozmieszczenia białek na wierzchołkowej i podstawno-bocznej powierzchni komórek nabłonkowych, zaleca się otwarcie worka podczas etapu montażu poprzez nacięcie krawędzi i otwarcie go.
- Obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego. Najpierw zwizualizuj preparaty worka endolimfatycznego z 10-krotnym obiektywem, aby zapewnić globalny widok etykietowania worka (Rysunek 5A-D). Następnie użyj obiektywu 63x, aby uzyskać szczegółowy obraz rozmieszczenia interesującego białka w mitochondriach i komórkach bogatych w rybosomy worka endolimfatycznego (Rysunek 5F-G).
Wyniki
Każdy etap mikrodysekcji worka endolimfatycznego myszy typu dzikiego w 5. dobie po urodzeniu (P5) został szczegółowo omówiony w powiązanym materiale wideo, a migawki kluczowych kroków tej dysekcji i otwarcia worka endolimfatycznego przedstawiono w Rycina 1 i Rysunek 2.
Reprezentatywne wyniki sekcji worka endolimfatycznego z fluorescencją tdTomato w 16,5 dniu embrionalnym (E16.5), w dniu P5 oraz P30, przeprowadzone zgodnie z tym protokołem, przedstawiono na Rysunku 3 oraz na Rysunku uzupełniającym 1 i Rysunku uzupełniającym 2. Przy użyciu mikroskopu sekcyjnego z fluorescencją, worek endolimfatyczny można łatwo zwizualizować w czaszce po usunięciu mózgu u myszy niosących transgen Tg(ATP6V1B1-Cre) w obecności reportera ekspresji Cre: Ai9 (LSL-RCL-tdT) (patrz Rysunek 3A-B oraz Rysunek uzupełniający 1 w celu obejrzenia obrazów wykonanych w świetle padającym oraz obrazów fluorescencji tdTomato worka endolimfatycznego na różnych etapach sekcji). U tych myszy Cre jest wyrażany mozaikowo w komórkach wzdłuż całego worka i przewodu endolimfatycznego (Rysunek 3, patrz również Rysunek uzupełniający 2 w celu porównania wizualizacji worka endolimfatycznego z reporterem fluorescencyjnym versus bez niego). Choć ekspresja tego reportera nie jest specyficzna dla endogennej ekspresji Atp6v1b1, która ogranicza się do komórek bogatych w mitochondria worka endolimfatycznego16, będących jednym z dwóch typów komórek tego nabłonka (Rysunek 5E), stanowi ona pomocne narzędzie do identyfikacji i sekcji worka endolimfatycznego.
Wewnętrzne uszy wypreparowane z modelu mysiego z powiększeniem akweduktu przedsionkowego przedstawiono na Rysunku 4. W porównaniu z kontrolnymi rówieśnikami z jednego miotu, worki i przewody endolimfatyczne u myszy z niedoborem SLC26A4 (pendryny) są powiększone.
Reprezentatywne obrazy immunohistochemii nienaruszonego worka endolimfatycznego z tkanką łączną i bez niej przedstawiono na Rysunku 5. Przedstawiono również wyniki immunohistochemii otwartego worka endolimfatycznego myszy typu dzikiego w dniu P5 (Rysunek 5F-G). Worek endolimfatyczny składa się z pojedynczej warstwy nabłonka sfałdowanej w strukturę w kształcie kieszonki, zawierającą w swoim świetle endolimfę. Nabłonek ten składa się z dwóch typów komórek: komórek bogatych w mitochondria oraz komórek bogatych w rybosomy (Rysunek 5E). Preparat całego worka endolimfatycznego będzie spłaszczony, ponieważ endolimfa nie jest już obecna. Worek będzie wyglądał jak dwie przeplatające się warstwy nabłonka, co utrudnia określenie subkomórkowej lokalizacji białek eksprymowanych w tym nabłonku. Poprzez otwarcie worka endolimfatycznego można łatwo zwizualizować pojedynczą warstwę nabłonka i dokładniej określić względny rozkład interesujących białek w odniesieniu do światła worka endolimfatycznego. Można dokładniej określić potencjalne wzbogacenie tych białek po stronie apikalnej (światłowej, gdzie znajdowałaby się endolimfa) versus bazalnej. Jako przykład, SLC26A4 jest wzbogacony po stronie apikalnej komórek bogatych w mitochondria (Rysunek 5F).
Rysunek 1. Sekcja całego worka endolimfatycznego myszy typu dzikiego w 5. dobie po urodzeniu (P5).
(A) Schemat błoniastego labiryntu rozwiniętego ucha wewnętrznego myszy (po prawej). Wskazano położenie worka endolimfatycznego, ślimaka oraz struktur przedsionkowych. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Honda et al.16.
(B) Przekrój pośrodkowy w płaszczyźnie strzałkowej przedstawiający lewą półczaszkę. Wskazano położenie worka endolimfatycznego (strzałka). (O, kość potyliczna; F, kość czołowa)
(C) Torebka błędnika wraz z częścią łuskową kości skroniowej.
(D) Ważne punkty orientacyjne naniesione na przerywany kwadrat w panelu C. (ES, worek endolimfatyczny; ED, przewód endolimfatyczny; VA, kanał przedsionkowy; ASC, przedni kanał półkolisty; PSC, tylny kanał półkolisty; CC, wspólna noga; SS, zatoka sagiitalna/esowata)
(E) Schematyczny przekrój wzdłuż ciągłej białej linii na panelu D przechodzącej przez worek endolimfatyczny. Strona proksymalna worka endolimfatycznego jest pokryta kostnym kanałem zwanym kanałem przedsionkowym, wraz z przewodem endolimfatycznym. Po stronie dystalnej worek endolimfatyczny, otoczony tkanką łączną (CT), rozszerza się i wystaje poza labirynt kostny, znajdując się pomiędzy oponą twardą (DM) a zatoką esowatą wraz z częścią łuskową kości skroniowej (TB).
(F) Do wycięcia obszaru wokół worka endolimfatycznego (zgodnie z żółtymi liniami przerywanymi na panelu D) używa się cienkiej igły.
(G) Preparat jest ostrożnie oddzielany od kości skroniowej poprzez trzymanie tkanki w pozycji wskazanej przez gwiazdkę (*, pokazaną również w panelu E) i jej delikatne odrywanie.
(H) Wyizolowany cały worek endolimfatyczny z otaczającymi tkankami.
(I) Wersja schematyczna wyizolowanego worka endolimfatycznego z otaczającymi tkankami.
(J) Wyizolowany worek endolimfatyczny bez otaczających tkanek.
Skala: 2 mm (B), 1 mm (J). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2Disekcja otwieranego woreczka endolimfatycznego myszy typu dzikiego w 5. dobie po urodzeniu (P5).
(A) W kroku 2.4 linia nacięcia na akwedukcie przedsionkowym znajduje się nieco bardziej przednio (czerwona przerywana linia), aby wykonać nacięcie do światła woreczka błędnikowego.
(B) Chwyć część trzoniową preparatu, wprowadź igłę 27G do światła i przesuń ją tak, aby rozciąć woreczek treściny na dwie płaty.
(C) Schematyczny rysunek panelu B.
(D) Chwyć krawędź każdego arkusza pęsetą i oddziel je od siebie.
(E) Schematyczny rysunek panelu D.
(F) Worek endolimfatyczny zostaje rozdzielony na dwie warstwy, obejmujące nabłonek oraz tkanki otaczające. Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.
Rysunek 3. Disekcja worka endolimfatycznego myszy R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn w dniach E16.5, P5 i P30.Wszystkie przedstawione obrazy ukazują fluorescencję tdTomato uzyskaną przy użyciu stereomikroskopu z obiektywem 1x przystosowanym do detekcji fluorescencji tdTomato.
(A, B) Przekrój pośrodkowy czaszki myszy R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn w dniu E16.5 przed (A) i po (B) usunięciu połowy mózgu. Fluorescencja tdTomato wyznacza położenie ucha wewnętrznego. Worek endolimfatyczny jest wyraźnie widoczny nawet bez disekcji (grot strzałki).
(C, E, G) Izolowane ucha wewnętrzne odpowiednio z myszy w dniach E16.5, P5 i P30.
(D, F i H) Obrazy przy większym powiększeniu odpowiadających im mikrodisekowanych worków i przewodów endolimfatycznych. W dniu P30 przewód endolimfatyczny jest otoczony kością, co sprawia, że jego izolacja jest szczególnie trudna. Paski skali: 2 mm (A, B, C, E, G), 500 µm (D, F, H). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4. Anatomia makroskopowa torebki słuchowej z powiększonym workiem endolimfatycznym.Ucha wewnętrzne rodzeństwa myszy Slc26a4+/- (lewo) i Slc26a4-/- (prawo) w dniu P105. Przewód błędnikowy, worek oraz przewód endolimfatyczny (czarne linie przerywane) są powiększone u myszy Slc26a4-/- w porównaniu z myszą Slc26a4+/-. Pasek skali: 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5. Ekspresja SLC26A4 w komórkach bogatych w mitochondria w nabłonku woreczka endolimfatycznego w dniach E16.5 i P5.
(A, B) Izolowany woreczek endolimfatyczny myszy w dniu E16.5, znakowany przeciwciałem przeciwko SLC26A4 (zielony) oraz faloidyną znakującą β-aktynę (ACTB, czerwony).
(C) Obraz przy małym powiększeniu otwartego woreczka endolimfatycznego myszy w dniu P5, znakowanego przeciwciałem przeciwko SLC26A4 (zielony). Faloidyna (ACTB, czerwony) może być stosowana do uwydatnienia obecności woreczka endolimfatycznego oraz otaczającej go tkanki łącznej.
(D) Izolowany woreczek endolimfatyczny znakowany przeciwciałem przeciwko SLC26A4 (zielony).
(E) Schematyczne przedstawienie nabłonka woreczka endolimfatycznego, uwydatniające obecność dwóch typów komórek: komórek bogatych w mitochondria, których powierzchnia apikalna pokryta jest mikrokosmkami, oraz komórek bogatych w rybosomy.
(F-G) Obrazy przy dużym powiększeniu nabłonka woreczka endolimfatycznego w dniu P5, po otwarciu woreczka i znakowaniu przeciwciałem przeciwko SLC26A4 (zielony) oraz faloidyną (ACTB, czerwony). Reprezentacyjny obraz na poziomie błony apikalnej przedstawiono w G, a zrekonstruowany przekrój poprzeczny ze stosu z (z-stack) na poziomie punktowej białej linii przedstawiono w F. Jądra komórkowe są znakowane DAPI (niebieski).
Paski skali: 100 μm (A, B); 200 μm (C, D); 20 μm (F, G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek uzupełniający 1. Obrazy w świetle padającym oraz odpowiadające im obrazy fluorescencji tdTomato ucha wewnętrznego myszy P5 R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn na trzech etapach sekcji. Worek i przewód endolimfatyczny można łatwo zwizualizować za pomocą fluorescencji tdTomato.
(A-B) Obszar ucha wewnętrznego w tylnej części nienaruszonej połowy czaszki myszy P5 R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn.
(C-D) Usunięcie skóry i części czaszki pozwala na lepszą wizualizację obszaru worka endolimfatycznego.
(E, F) Wyizolowane ucho wewnętrzne z workiem endolimfatycznym wciąż związanym z tkanką łączną.
(A, C, E) Obrazy zarejestrowane w świetle padającym. (B, D, F) Fluorescencja tdTomato odpowiadających tkanek. Paski skali: 2 mm (A-B), 1 mm (C-F). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina dodatkowa 2. Porównanie fluorescencji wyizolowanych woreczków endolimfatycznych myszy R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn oraz myszy z miotu kontrolnego R26LSL-RCL-tdT/+ w dniach E16.5 i P5. Fluorescencja tdTomato znacznie ułatwia rozpoznanie woreczka i przewodu endolimfatycznego.
(A-C) Mikrodysekcyjne woreczki endolimfatyczne myszy E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (A) oraz myszy z miotu kontrolnego R26LSL-RCL-tdT/+ (B, C).
(D-F) Mikrodysekcyjne woreczki endolimfatyczne myszy P5 R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (D) oraz myszy z miotu kontrolnego R26LSL-RCL-tdT/+ (E, F).
(A, B, D, E) Fluorescencja tdTomato. (C, F) Obrazy w świetle przechodzącym odpowiadające obrazom B i E. Paski skali: 500 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Wielu badaczy wykorzystywało skrawki zatopione w parafinie lub zamrożone do badań morfologicznych worka endolimfatycznego. Wadą preparatów podzielonych na sekcje jest to, że może być trudno w pełni zaobserwować skomplikowane kontakty międzykomórkowe, ponieważ rozmiar i kształt każdej komórki nabłonkowej w woreczku endolimfatycznym jest niezwykle zmienny, tworząc pomarszczoną i pseudostratyfikowaną warstwę komórkową. Barwienie immunologiczne w całości i obrazowanie stosu z, opisane w tym protokole, pozwalają na lepszą wizualizację trójwymiarowej struktury worka endolimfatycznego.
Aby udana mikrodysekcja była krytyczna, krytycznym punktem jest mentalna wizualizacja całego zarysu worka endolimftycznego, nawet jeśli jest on niewidoczny u myszy typu dzikiego. Obserwacja fluorescencyjnego reportera pokazanego na rysunku 3 i na rysunku uzupełniającym 1-2 może być pomocna w rozpoznaniu lokalizacji i wielkości worka endolimfatycznego u myszy.
Chociaż ta metoda rozbioru całego wierzchowca została wykorzystana do barwienia immunologicznego w powyższym protokole, technika ta może być również stosowana do zbierania tkanki worka endolimfatycznego do analizy ekspresji genów, takiej jak RT-qPCR, ekspresja mikromacierzy, a nawet sekwencja RNA pojedynczej komórki. Wyniki analizy sekwencyjnej RNA pojedynczej komórki przy użyciu tkanki przygotowanej za pomocą tego protokołu zostały wcześniej opisane16. Do analizy ekspresji genów komórek nabłonka worka endolimfatycznego zaleca się pobranie izolowanego nabłonka, aby nie doszło do zanieczyszczenia innymi sąsiednimi tkankami. Chociaż embrionalny worek endolimfatyczny można oddzielić od sąsiednich tkanek łącznych, jest to znacznie trudniejsze w późniejszym wieku. W przypadku próbek pochodzących od starszych myszy zaleca się inkubację z kolagenazą/dypazą przez 5 minut w temperaturze 37 °C, co ułatwia izolację nabłonka worka endolimfatycznego.
Jedną z wad barwienia immunologicznego typu full-mount opisanego w tym protokole jest to, że oryginalna trójwymiarowa struktura może zostać naruszona przez uraz podczas preparacji lub montażu preparatu między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Należy uważać, aby uniknąć artefaktów spowodowanych manipulacją.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program NIH, NIDCD (NIH Intramural Research Funds Z01-DC000060 i ZIC DC000081 to the Advanced Imaging Core). Jesteśmy wdzięczni doktorom Raoulowi D. Nelsonowi i R. Lance'owi Millerowi (University of Utah, Salt Lake City, UT) oraz dr Susan Wall (Emory University School of Medicine, Atlanta, GA) za podzielenie się myszami Tg(ATP6V1B1-Cre) oraz personelowi placówki dla zwierząt NIDCD za opiekę nad naszymi zwierzętami. Wyrażamy naszą wdzięczność dr Philine Wangeman za piękną ilustrację ucha wewnętrznego. Dziękujemy doktorom Thomasowi B. Friedmanowi i Robertowi J. Morellowi za krytyczną recenzję tego manuskryptu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| EDTA 0,5 M | Crystalgen | 221-057 | |
| 1 ml strzykawka TUBERCULIN z 27G x 13mm | BD | 309623 | |
| 9-dołkową płytką ze szkła punktowego | Pyrex | 13-748B | |
| Alexa Fluor 555-sprzężona falloidyna | ThermoFisher | Scientific A34055 | |
| Tętnica Nożyczki - Końcówka kulowa | Fine Science Tools | 14080-11 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Aparat do robienia zdjęć w padającym świetle | Aparat Leica | DFC 495 | |
| do robienia obrazów fluorescencyjnych | Leica | DFC 7000 GT | |
| Probówki wirówkowe 15 ml | Corning | 430053 | |
| Probówki wirówkowe 50 ml | Corning | 430829 | |
| Kolagenaza/Rozkład | Roche | 10269638001 | |
| Mikroskop konfokalny | Zeiss | LSM 880 | |
| Szkło osłonowe | Corning | 2940-223 | |
| Dumont #4 Kleszcze | Narzędzia do nauki | 11241-30 | |
| Dumont #5 Kleszcze | Narzędzia do nauki | 11251-20 | |
| Dumont #55 Kleszcze | Narzędzia do nauki | 11255-20 | |
| Bardzo cienkie nożyczki do bonn | Narzędzia do nauki o czystości | 14084-08 | |
| Alternatywa: Bardzo cienkie mikronożyczki preparacyjne; Prosty; Ostre punkty; 20mm Długość ostrza; 3 1/2" Długość całkowita | Roboz | RS-5880 | |
| Koza anty-królik Alexa Fluor 488-sprzężone przeciwciało wtórne | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| MicroSlides Superfrost | VWR | 48311-702 | |
| Wytrząsarka orbitalna, na przykład Mini Shaker | Daigger | 980275 | |
| Paraformaldehyd (PFA) 16% wodny roztwór | Mikroskopia elektronowa Sciences | 15710 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X) pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| ProLong Gold Anti-Blaknięcie Mocowanie z DAPI | ThermoFisher Scientific | P36931 | |
| Królicze przeciwciała anty-pendrynowe | Własne | RRID:AB_2713943, PB826 (Choi et al., 2011) | |
| Kleszcze pierścieniowe | Narzędzia | do nauki11106-09 | |
| Wytrząsarka bujana, na przykład GyroMini | Labnet | S0500 | |
| Mikroskop stereoskopowy wyposażony w obiektyw PlanApo 1.0x | Leica | ||
| Ostrza jednokrawędziowe ze stali nierdzewnej, .009" | GEM Personna | 62-0176 | |
| Naczynie do hodowli tkankowych 60 mm | Falcon | 353002 | |
| Przezroczysty lakier | |||
| Triton X-100 | ACROS Organics | 32737-1000 |
Bibliografia
- Dror, A. A., Brownstein, Z., Avraham, K. B. Integration of human and mouse genetics reveals pendrin function in hearing and deafness. Cellular Physiology and Biochemistry. 28 (3), 535-544 (2011).
- Reardon, W., CF, O. M., Trembath, R., Jan, H., Phelps, P. D. Enlarged vestibular aqueduct: a radiological marker of pendred syndrome, and mutation of the PDS gene. QJM. 93 (2), 99-104 (2000).
- Griffith, A. J., Wangemann, P. Hearing loss associated with enlargement of the vestibular aqueduct: mechanistic insights from clinical phenotypes, genotypes, and mouse models. Hearing Research. 281 (1-2), 11-17 (2011).
- Gurkov, R., Pyyko, I., Zou, J., Kentala, E. What is Meniere's disease? A contemporary re-evaluation of endolymphatic hydrops. Journal of Neurology. 263, Suppl 1 71-81 (2016).
- Eckhard, A., et al. Water channel proteins in the inner ear and their link to hearing impairment and deafness. Molecular Aspects of Medicine. 33 (5-6), 612-637 (2012).
- Choi, B. Y., et al. Mouse model of enlarged vestibular aqueducts defines temporal requirement of Slc26a4 expression for hearing acquisition. Journal of Clinical Investigation. 121 (11), 4516-4525 (2011).
- Miyashita, T., et al. Presence of FXYD6 in the endolymphatic sac epithelia. Neuroscience Letters. 513 (1), 47-50 (2012).
- Royaux, I. E., et al. Localization and functional studies of pendrin in the mouse inner ear provide insight about the etiology of deafness in pendred syndrome. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 4 (3), 394-404 (2003).
- Kim, H. M., Wangemann, P. Epithelial cell stretching and luminal acidification lead to a retarded development of stria vascularis and deafness in mice lacking pendrin. PLoS One. 6 (3), 17949(2011).
- Dahlmann, A., von During, M. The endolymphatic duct and sac of the rat: a histological, ultrastructural, and immunocytochemical investigation. Cell and Tissue Research. 282 (2), 277-289 (1995).
- Everett, L. A., et al. Targeted disruption of mouse Pds provides insight about the inner-ear defects encountered in Pendred syndrome. Human Molecular Genetics. 10 (2), 153-161 (2001).
- Miller, R. L., et al. The V-ATPase B1-subunit promoter drives expression of Cre recombinase in intercalated cells of the kidney. Kidney International. 75 (4), 435-439 (2009).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3643(2012).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. (2), 152(2007).
- Honda, K., et al. Molecular architecture underlying fluid absorption by the developing inner ear. Elife. 6, (2017).
Przedruki i uprawnienia
