Artykuł metodologiczny

Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62379

⸱

9 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University, 2Viral Information Institute, San Diego State University, 3Big Rose Web Design, LLC

W tym artykule

Podsumowanie

Obywatelski projekt naukowy miał na celu rekrutację mieszkańców San Diego do pobierania próbek środowiskowych na obecność SARS-CoV-2. Stworzono wielojęzyczną platformę internetową do przesyłania danych za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu urządzenia mobilnego. System zarządzania informacjami laboratoryjnymi ułatwił gromadzenie tysięcy próbek zróżnicowanych geograficznie dzięki śledzeniu wyników w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Aby kontrolować przenoszenie koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) podczas globalnej pandemii w 2020 roku, większość krajów wdrożyła strategie oparte na bezpośrednich testach na ludziach, zakrywaniu twarzy i dezynfekcji powierzchni. Przy założeniu, że główną drogą transmisji są aerozole i kropelki oddechowe, wysiłki mające na celu wykrycie SARS-CoV-2 w ogniskach skoncentrowały się na miejscach podejrzanych o wysoką częstość występowania (np. oddziały szpitalne, statki wycieczkowe i systemy transportu masowego). Aby zbadać obecność SARS-CoV-2 na powierzchniach w środowisku miejskim, które rzadko są czyszczone i rzadko dezynfekowane, zwerbowano 350 obywateli z aglomeracji hrabstwa San Diego. W sumie ci naukowcy-amatorzy zebrali 4080 próbek. Stworzono platformę internetową do monitorowania dostarczania i odbierania zestawów do pobierania próbek, a także do gromadzenia danych dotyczących próbek. Zestawy do pobierania próbek zostały w większości zbudowane z zapasów dostępnych w sklepach dotkniętych pandemią. Próbki były przetwarzane przy użyciu odczynników, które były łatwo dostępne pomimo powtarzających się braków w dostawach. Zastosowane metody były bardzo czułe i odporne na inhibitory, które są powszechnie obecne w próbkach środowiskowych. Zaproponowane metody projektowania i przetwarzania eksperymentów z powodzeniem zaangażowały wielu naukowców-amatorów, którzy skutecznie zebrali próbki z różnych obszarów powierzchniowych. Opisany tutaj przepływ pracy i metody są istotne dla badania środowiska miejskiego pod kątem innych wirusów, które stanowią zagrożenie dla zdrowia publicznego i stanowią zagrożenie dla przyszłych pandemii.

Wprowadzenie

SARS-CoV-2 jest uważany za przenoszony głównie przez wdychanie skażonych aerozoli i kropelek pochodzących z bezpośredniego kontaktu z zakażonymi osobami1,2,3,4. Jednak w początkowych fazach globalnej pandemii COVID-19 wysiłki mające na celu kontrolę transmisji SARS-CoV-2 koncentrowały się silnie na dezynfekcji powierzchni, myciu rąk i odkażaniu się. Do końca 2020 r. wytyczne Światowej Organizacji Zdrowia (WHO)5 oraz amerykańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC)6 uznały, że przenoszenie drogą powietrzną stanowi zagrożenie głównie w bliskim kontakcie (<2 m) z osobą zakażoną lub w obecności procedur medycznych generujących aerozol. Samozaszczepienie po kontakcie ze skażonymi powierzchniami lub wdychanie fomitów w aerozolu nie zostało jeszcze wykluczone jako droga przenoszenia SARS-CoV-2.

Przypadki COVID-19 zostały zgłoszone, w przypadku których transmisja drogą powietrzną wydaje się mało prawdopodobna7,8. Wiriony SARS-CoV-2 pozostają zakaźne na miedzi do 8 godzin, na kartonie i stali nierdzewnej do 24 godzin, a na plastiku do 48 godzin9. W kabinach statków wycieczkowych RNA SARS-CoV-2 wykryto 17 dni po odlocie pasażerów7. Próbki powietrza i powierzchni ze szpitali i systemów transportu zbiorowego dały wynik pozytywny na obecność SARS-CoV-2 i innych koronawirusów8,10,11,12,13,14. Badanie przeprowadzone na zewnętrznym opakowaniu cukierków na Halloween obsługiwanych przez bezobjawowych i umiarkowanych/łagodnie objawowych pacjentów z COVID-19 wykazało, że połączenie mycia rąk przez opiekuna i mycia cukierków mydłem do rąk zmniejszyło RNA SARS-CoV-2 poniżej poziomów progowych15.

Opublikowano kilka metod diagnostyki SARS-CoV-2 opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)16,17, amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP)11,18,19,20,21 oraz technologie CRISPR-Cas18,19,22,23. Większość z nich wymaga zestawów do ekstrakcji RNA, których często brakuje w okresach znacznego globalnego popytu, a bardzo niewiele z nich zostało wykorzystanych do badań przesiewowych wirusa w środowisku 24. Wykazano, że wykrywanie RNA SARS-CoV-2 za pomocą RT-LAMP jest w ponad 83% zgodne z użyciem RT-qPCR. Co więcej, RT-LAMP spowodował zmniejszenie o 25% liczby niejednoznacznych wyników w porównaniu z RT-qPCR15.

RT-LAMP to prosta technika, która wykorzystuje odwrotną transkryptazę do syntezy cDNA z matrycy RNA25, a następnie polimerazy DNA o silnej aktywności przemieszczenia nici, która syntetyzuje DNA w stałej temperaturze (tj. amplifikacji izotermicznej)26. Większą specyficzność wykrywania genomu wirusa uzyskuje się dzięki zastosowaniu czterech lub sześciu starterów, które rozpoznają sześć lub osiem regionów docelowego DNA. Amplifikacja jest inicjowana z wewnętrznego startera i daje półdwuniciową strukturę DNA. Pasmo wiodące jest następnie wzmacniane przez zewnętrzny starter. Wzmocnienia te są powtarzane dla starterów odwrotnych. Wewnętrzne i zewnętrzne startery na obu końcach mają wewnętrzne odwrócone samokomplementarne miejsce, które tworzy pętlę w produkcie amplifikacji26,27. W izotermicznym przemieszczeniu nici asynchroniczna synteza DNA generuje duże ilości amplifikowanego produktu, gdzie ciągła polimeryzacja wzmacnia sygnał zaledwie 10 kopii na reakcję11,20,28. Kolorymetryczna mieszanka RT-LAMP jest słabo buforowana i wykorzystuje czerwień fenolową jako wskaźnik pH. Gdy polimeraza zawiera nukleotyd, uwalnia proton, a wystarczająca ilość protonów zmieni pH roztworu, a także jego kolor z różowego na żółty11,20,28,29.

RT-LAMP został opracowany do wykrywania chorób przenoszonych przez komary w peryferyjnych placówkach opieki zdrowotnej, które nie mają w pełni wyposażonych laboratoriów25 oraz do szybkiego wykrywania innych wirusów RNA, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności30. Populacje najbardziej narażone na wybuchy epidemii – zgodnie z definicją WHO – często nie mają wystarczających zasobów ekonomicznych i odpowiedniego sprzętu do przeprowadzenia wykrywania (Globalna Agenda Zdrowia Publicznego ONZ). W obecnej pandemii SARS-CoV-2 materiały takie jak wymazy klasy medycznej i odczynniki do zestawów do ekstrakcji RNA nie były w stanie zaspokoić globalnego popytu, zwłaszcza w krajach nieprodukcyjnych. W proponowanym protokole wykorzystano ekstrakcję surowego RNA na bazie tiocyjanianu guanidyny (GITC), która skutecznie zachowała RNA w sposób niezależny od łańcucha chłodniczego i znacznie zmniejszyła trwałość inhibitorów z próbki. Co więcej, protokół ekstrakcji chloroformem GITC opiera się na oddzieleniu RNA od DNA i białek, a następnie odpowiednim wytrąceniu, co pozwala na odzyskanie większości materiału genetycznego. Korzyści te przeważają nad potencjalnymi zagrożeniami związanymi z naukowcami-amatorami mającymi do czynienia z substancją chemiczną, jeśli zostaną podjęte środki w celu odpowiedniego poinformowania ich o ryzyku.

Proponowany przepływ pracy wykorzystuje materiały i odczynniki, które są powszechnie używane. Wymaga to sprzętu, który jest dostępny w podstawowych, często wiejskich warunkach laboratoryjnych. Metody te są niedrogie, wysoce odporne na inhibitory często znajdujące się w próbkach środowiskowych lub próbkach, których nie można przetworzyć za pomocą zestawów do ekstrakcji, i eliminują potrzebę stosowania precyzyjnego termocyklera. W pracy przedstawiono proces pobierania próbek i wykrywania wirusa SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych na powszechnie dotykanych i rzadko dezynfekowanych powierzchniach gospodarstw domowych i środowiska miejskiego.

Protokół

Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółową listę odczynników i materiałów eksploatacyjnych, w tym numery katalogowe, producenta i odpowiednie koszty.

1. Pobieranie próbek środowiska miejskiego

  1. Działania popularyzatorskie dla naukowców obywatelskich
    1. Rekrutuj naukowców-amatorów za pomocą bezpośredniego i jasnego wezwania do działania opublikowanego za pośrednictwem mediów lokalnych i społecznościowych. Utwórz uchwyt mediów społecznościowych (np. #swab4corona), aby połączyć temat z treściami w mediach społecznościowych.
    2. Utwórz konto e-mail do bezpośredniej komunikacji między zespołem laboratoryjnym a każdym naukowcem-obywatelem, zarządzane przez osobę biegle posługującą się głównymi językami regionu zainteresowania (np. hiszpańskim i angielskim dla hrabstwa San Diego).
    3. Zbuduj bezpieczną internetową platformę zarządzania próbkami (SMP), która będzie służyć jako baza danych, system zarządzania informacjami laboratoryjnymi (LIMS) i komunikować się z naukowcami-obywatelami.
      UWAGA: SMP zapewnia scentralizowaną lokalizację, w której użytkownicy proszą o zestaw, uzyskują dostęp do protokołów pobierania próbek, przesyłają metadane próbek i żądają odbioru kompletnych zestawów próbek.
    4. Utwórz link do SMP (np. https://demo.covidsample.org/) (Rysunek 1) dla osób, które mogą ubiegać się o udział w próbach pobierania próbek środowiskowych, odpowiadając na pytania związane z bezpieczeństwem biologicznym określone w formularzu online.
    5. Bezpieczny dostęp do SMP za pomocą interfejsu programowania aplikacji uwierzytelniającej (Authentication Application Programming Interface) udostępnianego przez dostawcę usług komputerowych w chmurze. Przyznawanie zatwierdzonym użytkownikom dostępu do pliku SMP.
      UWAGA: Zapoznaj się z literaturą, aby zapoznać się z opisem protokołu OAuth 2.031 w celu uwierzytelniania i autoryzacji. Zapewnia bezproblemowy proces logowania dla ochotników-naukowców-amatorów. Umożliwia także użytkownikom logowanie się przy użyciu istniejącego konta, eliminując potrzebę tworzenia niestandardowego rozwiązania do logowania i zarządzania poświadczeniami użytkownika, co oszczędza znaczną ilość czasu i zachęca do uczestnictwa. Według ostatnich doniesień, bezpłatna usługa poczty e-mail dostępna dla wybranego dostawcy usług komputerowych w chmurze ma około 1,5 miliarda aktywnych użytkowników poczty e-mail miesięcznie; Wymaganie posiadania konta e-mail od tego usługodawcy w celu uczestnictwa nie jest uważane za czynnik zniechęcający.
    6. Wyjaśnij cel badania i kwestie bezpieczeństwa biologicznego naukowcom z SMP, zanim poproszą o swój pierwszy zestaw. Udostępnij wielojęzyczną wtyczkę, aby umożliwić nawigację w dowolnym języku dostępnym w wielojęzycznej usłudze neuronowego tłumaczenia maszynowego udostępnianej przez dostawcę usług komputerowych w chmurze.
    7. Dołącz do sekcji dotyczącej próbkowania protokoły graficzne i audiowizualne w języku angielskim i hiszpańskim.
    8. Przypisz unikalny identyfikator do każdego zestawu i zaprojektuj interfejs użytkownika tak, aby wykorzystywał przyciski powiązane z identyfikatorem próbki w celu usprawnienia procesu wprowadzania danych ( Rysunek 1A).
    9. Korzystaj z oprogramowania do planowania tras dostaw z aplikacją na urządzenia mobilne, które mogą być używane przez kierowców do optymalizacji tras dostaw/odbioru i powiadamiania naukowców amatorów o dokładnym szacowanym czasie przybycia.
    10. Zbuduj platformę LIMS na stosie usług internetowych PHP i hostuj ją na komercyjnej platformie hostingowej (sugerowany system operacyjny, oprogramowanie serwera WWW i oprogramowanie bazy danych są określone w tabeli materiałów).
    11. Zapewnij bezpieczny interfejs aplikacji internetowej, aby umożliwić personelowi laboratoryjnemu szybkie i łatwe zarządzanie danymi w systemie LIMS. Zapewnij wizualizację danych przy użyciu interfejsu programowania aplikacji do tworzenia wykresów danych udostępnianego przez dostawcę usług komputerowych w chmurze.
    12. Wizualizacja danych geoprzestrzennych za pomocą interfejsu programowania aplikacji geoprzestrzennych obsługiwanego przez dostawcę usług komputerowych w chmurze. Przechowywanie danych przesyłanych do systemu LIMS za pośrednictwem SMP w celu ułatwienia (1) scentralizowanego przechowywania danych projektowych; (2) śledzenie przepływów pracy związanych z próbkowaniem/przetwarzaniem danych; oraz (3) zarządzanie logistyką dystrybucji zestawów próbek do naukowców-amatorów.
    13. Zabezpiecz przesłane metadane przy użyciu najlepszych praktyk (np. https://demo.covidsample.org/).
    14. Wstępnie załaduj informacje, takie jak identyfikator zestawu próbki, identyfikator próbki, data, godzina i współrzędne globalnego systemu pozycjonowania (GPS) (automatycznie zbierane ze zdjęcia miejsca), aby umożliwić zgodność z typami danych i zminimalizować przesyłanie błędnych lub brakujących danych przez użytkownika ( Rysunek 1B). Uwzględnij następujące pola, które mają być wypełnione ręcznie i szybko (<1 min) przez naukowca-amatora: data i godzina pobrania, krótki opis miejsca pobierania próbek oraz zdjęcie miejsca pobierania próbek.
    15. Oczyść wszystkie przekazane dane i zweryfikuj typ danych. Na przykład zweryfikuj dane obrazów przekazane przez użytkowników, aby wybrać .jpg pliki, zmień ich nazwy na Sample ID w celu szybkiego skojarzenia z próbką i przechowuj przekazane obrazy w oddzielnej bezpiecznej lokalizacji niedostępnej dla użytkowników.
    16. Aktywuj opcję, aby zamówić dostawę i odbiór zestawu, gdy wszystkie próbki (16) zostaną skompletowane. Dodatkowo aktywuj opcję zamówienia nowego zestawu, który zostanie dostarczony po odbiorze poprzedniego (Rysunek 1A).
      UWAGA: Dla wolontariuszy, którzy preferują platformę nieinternetową oraz dla tych, którzy obawiają się ujawnienia swojej lokalizacji GPS (np. członkowie społeczności zaniepokojeni swoim statusem migracyjnym), zestawy mogą zostać dostarczone w uzgodnionym miejscu spotkania, a wolontariusze mogą zostać poproszeni o nagranie pisemnej wersji zbierania danych. Do komunikacji między laboratorium a każdym naukowcem-obywatelem należy zapewnić dwujęzycznego członka projektu, który będzie dostępny do rozmów telefonicznych i wysyłania wiadomości tekstowych.
  2. Wacik do korony
    1. Określić epidemiologicznie istotny przedział czasowy dla pobierania próbek.
    2. Zbuduj zestaw, który zawiera wszystkie materiały do pobierania próbek, w tym niezbędne środki ochrony osobistej (np. maskę, rękawiczki), protokół pobierania próbek i informacje dotyczące bezpieczeństwa biologicznego (Rysunek 2). Wstępnie oznacz każdą probówkę przypisanym unikalnym identyfikatorem (identyfikatorem próbki).
    3. Wymaz rzadko dezynfekuje powierzchnie, które są narażone na działanie aerozoli w gospodarstwach domowych i środowisku miejskim.
      1. Noś dołączoną maskę w miejscach publicznych i nową parę rękawiczek do pobierania każdej próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Po zakończeniu pobierania próbek użyj dołączonego środka do dezynfekcji rąk.
      2. Zwilż wacik absorpcyjny o grubości 1 cm2 (np. nakładki do mopa) detergentem (np. 0,5% dodecylosiarczanem sodu (SDS)) w celu dezaktywacji wirusa poprzez przerwanie jego otoczki i ustabilizowania nagiego RNA poprzez wywołanie rozwijania RNaz32.
      3. Przetrzyj powierzchnię 10 cm2. Wspomagany wykałaczką, całkowicie zanurz każdy wacik z próbką w odpowiedniej, wstępnie oznakowanej probówce zawierającej 200 μl roztworu tiocyjanianu guanidyny (GITC). Probówki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ich transportu do laboratorium. Po dostarczeniu próbek do laboratorium należy je przechowywać w temperaturze -80 °C.
        UWAGA: GITC jest toksycznym środkiem drażniącym; Unikać kontaktu ze skórą. Roztwór GITC jest prosty do przygotowania z popularnych chemikaliów laboratoryjnych, dla przepisu zobacz33,34. Dezaktywuje wirusa, stabilizuje RNA poprzez denaturację RNaz34,35,36 i stabilizuje próbki w temperaturze pokojowej. Zestaw zawiera jednak wkłady z lodu, które utrzymują próbki w niskiej temperaturze bez konieczności używania domowych lodówek do przechowywania.

2. Wykrywanie SARS-CoV-2

  1. Całkowita izolacja RNA
    1. Zdezynfekować powierzchnie, sprzęt i pipetory roztworem 2 mM siarczanu miedzi i 3% nadtlenku wodoru, a następnie roztworem 10% wybielacza, 90 mM wodorowęglanu sodu, 5% SDS i 2,5% NaOH. Dokładnie przetrzyj wodą destylowaną, a następnie 75% etanolem.
      UWAGA: Rozwiązania te stanowią alternatywę dla rozwiązań dostępnych na rynku.
    2. Rozmrozić próbki na lodzie. Wirować próbki przez 2 minuty ze średnią prędkością.
    3. Aby zwiększyć szybkość przesiewania, próbki należy przetwarzać w kałużach. Jeśli pula jest dodatnia, należy niezależnie ekstrahować RNA z każdej próbki, aby znaleźć dodatnią próbkę. Połączyć próbki z każdego zestawu do pobierania próbek (w sumie 16 próbek) w 2 pule po 8 próbek.
      UWAGA: Posiadanie 8 próbek w puli oznacza, że w jednym zestawie muszą być przetwarzane tylko 2 próbki. Jeśli pula jest dodatnia, poszczególne próbki są ponownie przetwarzane do indywidualnej analizy RT-LAMP. Skraca to czas, koszty i zmniejsza ilość odczynników.
    4. Zebrać 50 μl każdej z 8 próbek do probówki mikrowirówkowej (całkowita objętość 400 μl); zachować pozostałą próbkę w temperaturze -80 °C. Dodać 0,2 objętości (80 μl) chloroformu, wirować przez 15 s, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Wirować przy 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieść warstwę wody (klarownej cieczy) do nowej probówki do mikrowirówki. Przechowuj pozostały interfejs i różowy płyn w zamrażarce o temperaturze -80 °C; te frakcje zawierają DNA i białka33,36.
    6. Dodaj równą objętość izopropanolu (~200 μL) i 2,6 μL glikogenu koprecypitantu (15 mg mL-1)37. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę, a następnie w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu wytrącenia RNA.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, inkubując próbki w temperaturze -20 °C przez noc zamiast przez 1 godzinę.
    7. Wirować w temperaturze 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu. Zawiesić osad w 50 μl wody uzdatnionej dietylowęglanem (DEPC) i dodać równą objętość (50 μl) wolnego od RNaz octanu 5 M amonu i 2,5 objętości (250 μl) 100% etanolu7,38.
      nuta: Jony amonowe hamują kinazę polinukleotydową, jeśli są używane w procesie końcowym38. Mieszanina wytrąca RNA, pozostawiając trifosforany deoksynukleozydowe i oligosacharydy w roztworze38.
    8. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę, a następnie w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu wytrącenia RNA.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, inkubując próbki w temperaturze -20 °C przez noc zamiast przez 1 godzinę.
    9. Wirować w temperaturze 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Umyć granulki 1 ml zimnego (-20 °C), świeżo przygotowanego 75% etanolu. Wirować przy 8 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety P10, aby uniknąć naruszenia osadu.
    10. Suszyć pelety na powietrzu przez 10-15 minut, aż nie pozostanie etanol. Zawiesić osad w 50 μl wody uzdatnionej DEPC, dodać 5 μl 10x buforu DNazy + 1 μl DNazy (2 jednostki μL-1) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    11. Dodać 0,1 objętości (5,6 μl) odczynnika do inaktywacji DNazy, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i delikatnie mieszać co minutę. Odwirować przy 13 000 × g przez 2 minuty i przenieść supernatant do nowej probówki (~50 μL). Umieść probówkę na lodzie natychmiast podczas przygotowywania reakcji RT-qPCR lub RT-LAMP lub przechowuj w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Wykonaj izolację RNA w pomieszczeniu wolnym od amplikonów, aby uniknąć przeniesienia zanieczyszczenia.
  2. Multipleksowa amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP)
    1. Przygotować 20-krotny roztwór mieszający starter (Tabela 1) dla każdego zestawu podkładów (Tabela 2). Przygotować mieszaninę reakcyjną RT-LAMP (Tabela 3) w temperaturze pokojowej z 10% nadmiarem objętości, aby uwzględnić straty pipetowania.
      UWAGA: Kolorymetryczna mieszanka główna LAMP 2X z antarktyczną termolabilną glikozylazą uracylo-DNA (UDG) zapobiega amplifikacji zanieczyszczenia DNA z poprzednich reakcji20,28.
    2. Zwiruj i odkręć mieszaninę. Dozować 20 μl mieszaniny do każdej probówki reakcyjnej: próbki, wzbogaconej, kontroli pozytywnej i kontroli ujemnej. Inkubować reakcje w probówkach w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić UDG działanie na potencjalne zanieczyszczenie przeniesione.
    3. Dodać 5 μL RNA do reakcji próbki, 5 μL RNA + 2,5 μL (450 kopii) syntetycznego RNA SARS-CoV-2 do reakcji wzbogaconej, 2,5 μL (450 kopii) syntetycznego RNA SARS-CoV-2 do pozytywnej reakcji kontroli i 5 μLH2Odo reakcji kontroli negatywnej. Dobrze wymieszaj i odkręć reakcje; rozmrozić całe RNA na lodzie.
    4. Podczas gdy termocykler lub łaźnia wodna jest podgrzewana do 65 °C, pozwól, aby wszystkie reakcje pozostały w temperaturze pokojowej. UDG zostanie dezaktywowany w temperaturze >50 °C. Umieścić reakcje w termocyklerze (użyć pokrywy grzewczej), inkubować w temperaturze 65 °C przez 40 minut i pozwolić reakcjom osiągnąć temperaturę pokojową (~22 °C przez 5 minut) lub schłodzić na lodzie przez 1 minutę. Analizuj wyniki za pomocą funkcji kolorymetrycznej (prosta obserwacja) lub uruchamiając produkty w żelu agarozowym.
      UWAGA: Chociaż granica wykrywalności (LOD) wynosi 10 kopii na reakcję, częstotliwość wykrywania wzrasta, gdy liczba kopii zbliża się do 500 kopii na reakcję (Rysunek 3A). W przypadku obserwacji kolorymetrycznej należy zauważyć, że wynik ujemny jest oznaczony kolorem różowym (pH = 8,8), podczas gdy wynik dodatni jest oznaczony kolorem żółtym (pH = 5) (Rysunek 3B). Opcja kolorymetryczna pozwala uniknąć otwierania lamp RT-LAMP po amplifikacji, co zmniejszy objętość produktów RT-LAMP w środowisku pracy i przenoszenie zanieczyszczeń. Do elektroforezy żelowej należy przygotować 1,5% żel agarozowy z 1X barwnikiem żelowym DNA w 0,5% buforze Tris/Boran/EDTA (TBE). Załadować 25 μL reakcji + 5 μL 6-krotnie obciążającego barwnika do każdej studzienki. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 60 minut. Marker molekularny nie jest potrzebny, ponieważ dodatnie próbki wykazują wzór drabinkowy (Rysunek 3C).

Wyniki

Próbki pobrane przez naukowców amatorskich w celu wykrycia SARS-CoV-2. W okresie 8 miesięcy (od połowy marca do trzeciego tygodnia listopada 2020 r.) 482 obywateli zostało dopuszczonych do udziału w tym projekcie, z czego 350 (73%) poprosiło o zestaw. W sumie dostarczono 362 zestawy (tj. niektórzy uczestnicy poprosili o wiele zestawów), a 246 (70%) zostało zwróconych (Rysunek 4A,B). Wszystkie 4 080 próbek zawartych w tych zestawach zostało przetworzonych. Punkty zbiórki zostały rozmieszczone w dystryktach North Coastal, North Central, Central i Southern hrabstwa, a także kilka w dystryktach wschodnich (Rysunek 4A). Dystrykty te mają największą gęstość zaludnienia w hrabstwie San Diego i najwięcej udokumentowanych przypadków COVID-19, zgodnie z raportem Agencji Służby Zdrowia Człowieka w San Diego39.

Obywatele poprosili o odbiór większości pobranych zestawów (tj. średni wskaźnik sukcesu: 70,4%). Każdego dnia zamawiano od 1 do 16 zestawów, a 0-14 zestawów zwracano do laboratorium (Rysunek 4B). Ankieta przeprowadzona wśród naukowców-amatorów wykazała, że zebranie kompletnego zestawu (16 próbek) zajęło 1-3 godziny i trwało średnio 8 dni (Rysunek 4A i Tabela 4). Zdecydowana większość zestawów była kompletna (91,1%), co oznacza, że zawierały wacik wewnątrz wszystkich 16 probówek z próbkami, a odpowiednie dane dotyczące pobierania próbek zostały przesłane do LIMS (Rysunek 4A i Tabela 4).

Wykrywanie SARS-CoV-2 za pomocą ekstrakcji GITC-chloroform i multipleksowej amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkryptazy (RT-LAMP). W teście kolorymetrycznym RT-LAMP użyto dwóch zestawów starterów11,20,28 do celowania w geny nukleokapsydu (N2) i otoczki (E1) (Tabela 2). Sekwencje rozpoznawane przez te startery znajdują się w tym samym regionie, co startery i sondy zatwierdzone przez CDC40 i Unię Europejską (UE)41 do diagnozowania COVID-19 u ludzi za pomocą RT-qPCR. Wyniki te potwierdzają to, co opisali Zhang et al.28, w którym dodanie 60 mM chlorowodorku guanidyny do reakcji zwiększa LOD podczas uruchamiania w multipleksie. LOD przy częstości 100% wynosił 500 kopii na 25 μL reakcji (Rysunek 3A,B). W kolorymetrycznej lampie RT-LAMP dodatnie próbki zmieniły kolor z różowego na żółty z powodu zmiany pH z ~8 do 5,5 (Rysunek 3B). Kiedy reakcja zmieniła kolor na pomarańczowy przy niskiej liczbie kopii, próbki przeprowadzono w 1,5% żelu agarozowym, aby potwierdzić, że są one pozytywne i dały wzór przypominający drabinę (Rysunek 3C). RT-LAMP wykorzystano do wykrycia SARS-CoV-2 w zbiorczych próbkach RNA.

Aby kontrolować fałszywie ujemne wyniki spowodowane inhibitorami reakcji, każda próbka została przetestowana w dodatkowej reakcji wzbogaconej o 500 kopii syntetycznego SARS-CoV-2. Dodatnie próbki zbiorcze poddano dereplikacji poprzez wyizolowanie RNA każdej pojedynczej próbki w puli i przeprowadzono w reakcji RT-LAMP w celu określenia tożsamości próbki dodatniej. Wyniki wykrywania zostały następnie przesłane do systemu LIMS, gdzie unikalny identyfikator próbki został sparowany z informacjami o dacie, godzinie, współrzędnych GPS, lokalizacji i obrazie próbki.

Tradycyjne metody RT-PCR w czasie rzeczywistym: hamowanie przez zanieczyszczenia próbki. Aby wybrać najlepszą metodę odpowiednią dla proponowanego procesu detekcji, przetestowano inne metody amplifikacji RNA z próbkami środowiskowymi pobranymi przez pilotażową kohortę naukowców obywatelskich. Przykłady wyników każdej z tych metod są przedstawione w Rysunek 5, aby zobrazować ich wrażliwość na inhibitory środowiskowe i szum sygnału tła przy niskich stężeniach liczby kopii wirusa.

Sześć preparatów RT-qPCR (Tabela Materiałów) zatwierdzonych przez CDC i WHO zostało przetestowanych pod kątem wykrycia wirusa na próbkach środowiskowych. Protokoły były przestrzegane zgodnie z instrukcjami producenta, a także wytycznymi CDC dotyczącymi wykrywania SARS-CoV-2 w warunkach klinicznych40. Reakcje zawierające różne stężenia syntetycznych kontroli RNA SARS-CoV-2 wzbogacono do próbek powierzchniowych wymazów po surowej izolacji RNA. Wszystkie mieszanki wzorcowe były wrażliwe na inhibitory przy stężeniach LOD kontroli pozytywnej (Rysunek 5A).

Aby ominąć inhibitory tych technologii czasu rzeczywistego, przetestowano tradycyjny system RT-PCR. Jednoetapowy system RT-PCR (Tabela materiałów) został użyty do amplifikacji genu nukleokapsydu przy użyciu zestawów starterów N1, N2 i genu otoczki przy użyciu zestawu starterów E1 zatwierdzonego odpowiednio przez CDC (USA) i ECDC (UE) (Tabela 2). Protokoły były przestrzegane zgodnie z instrukcjami producenta, a także wytycznymi CDC dotyczącymi wykrywania SARS-CoV-2 w warunkach klinicznych40. Zestawy starterów N1 i N2 zaprojektowane przez CDC dają produkt o stężeniu ~70 pz; jednak dodatnie wyniki o niskiej liczbie kopii nie zostały odróżnione od szumu tła wzmacniającego kontrolę negatywną (Rysunek 5B)), co wprowadziło do wyników wyniki fałszywie dodatnie. Produkt starterów E1 miał słaby sygnał przy niskiej liczbie kopii (Rysunek 5B)), wprowadzając do wyników fałszywie ujemne. Co więcej, testowana metoda RT-PCR była nadal wrażliwa na inhibitory obecne w próbkach środowiskowych (dane nie pokazane).

Inne metody zostały opracowane do wykrywania bardzo małych ilości sekwencji docelowej. Jedną z tych metod jest amplifikacja toczącego się koła (RCA), po której rozpoznanie docelowej sekwencji, RNA lub DNA, przez określoną sondę liniową, ligaza krąży wokół matrycy. Używając starterów zaprojektowanych do hybrydyzacji z sondą, polimeraza DNA o aktywności przemieszczenia nici amplifikuje sondę w reakcji izotermicznej42. To sonda zidentyfikowała cel, który jest wzmacniany, a nie sekwencja docelowa, co sprawia, że ta metoda jest bardzo czuła43. Wang i wsp.44 opublikowali protokół RCA do bezpośredniego wykrywania RNA SARS-CoV-1. Metoda została zmodyfikowana w celu wykorzystania starterów specyficznych dla SARS-CoV-2. Niestety, w kontroli bez matrycy (NTC) sonda krąży i daje produkt przy braku matrycy RNA, nawet przy użyciu szerokiej gamy ligaz, w tym ligazy wrażliwej na SNP. W przypadku braku ligazy, NTC nie wykazywał wzmocnienia z sondy linearyzowanej (Rysunek 5C)".

figure-results-1
Rysunek 1: Internetowa platforma próbkowania z interfejsem danych do zbierania próbek dla urządzeń mobilnych. (A) Stworzono stronę internetową, zawierającą wielojęzyczną wtyczkę, która pośredniczyła w interakcji między laboratorium a naukowcami-obywatelami. Platforma została wykorzystana do zamówienia/dostawy zestawu próbek i przesłania przykładowych danych. Platforma zawierała szczegółowe protokoły próbkowania grafiki i materiałów audiowizualnych w języku angielskim i hiszpańskim. (B) Widok urządzenia mobilnego służący do przesyłania przykładowych danych: daty, godziny, współrzędnych GPS, przykładowego opisu miejsca zbiórki oraz obrazu miejsca zbiórki. Skróty: SARS-CoV-2 = koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2; GPS = Globalny System Pozycjonowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zestaw do pobierania próbek. Naukowcy-amatorzy otrzymali lodówkę zawierającą dwa okłady z lodu, kartę charakterystyki informującą ochotników o zagrożeniach związanych z obchodzeniem się z roztworem GITC, szczegółowy protokół pobierania próbek i noszenia maski, maskę KN95, worek na odpady, butelkę ze spryskiwaczem ze środkiem do dezynfekcji rąk, butelkę ze spryskiwaczem z 0,5% SDS, 16 par rękawiczek, małą torbę z 16 wykałaczkami i 16 wacikami poliestrowymi. 16 wstępnie znakowanych probówek do mikrowirówek zawierających 200 μl roztworu GITC, pudełko zawierające probówki do pobierania próbek oraz worek używany jako dodatkowy pojemnik na probówki w przypadku rozlania. Skróty: GITC = tiocyjanian guanidyny; SDS = dodecylosiarczan sodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Test multipleksowanej amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Reakcje multipleksowane z wykorzystaniem starterów dla genów nukleokapsydu (N2) i otoczki (E1) SARS-CoV-2 w celu wykrycia zaledwie 10 kopii wirusa w reakcji. Jako kontrolę pozytywną zastosowano syntetyczne RNA SARS-CoV-2. (A) Częstotliwość wykrywania SARS-CoV-2 w kolorymetrycznej lampie multipleksowej RT-LAMP przy różnej liczbie kopii genomu na reakcję. Średnia wartość z pięciu powtórzeń w kolorze różowym. (B) Granica wykrywalności (LOD) SARS-CoV-2 w kolorymetrycznej lampie multipleksowej RT-LAMP; żółty = dodatni (pH ~ 5); różowy = ujemny (pH ~ 8). (C) Schemat drabinkowy dodatnich reakcji SARS-CoV-2 RT-LAMP w elektroforezie w 1,5% żelu agarozowym. Skróty: SARS-CoV-2 = koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2; Rxn = reakcja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Lokalizacja zestawów do pobierania próbek przez naukowców-amatorów w hrabstwie San Diego i wskaźnik sukcesu zamówionych zestawów. (A) Pomarańczowe kropki reprezentują lokalizację 1 zestawu do pobierania próbek, który zawiera 16 próbek. Niebieski wykres kołowy pokazuje procent zestawów, które potrzebowały różnych dni od momentu dostarczenia ich do naukowców-amatorów do momentu, gdy zostały zwrócone do laboratorium. Liczba dni w nawiasach. Pomarańczowy wykres kołowy przedstawia odsetek zestawów z różną liczbą ukończonych próbek z łącznej liczby 16 próbek. Liczba wypełnionych próbek zawierających wymazówkę znajdującą się w probówce z próbką oraz odpowiadające im dane dotyczące pobierania próbek przesłane do systemu LIMS w nawiasach. (B) Procent zestawów, które zostały zwrócone do laboratorium (kropki) oraz łączna liczba zamówionych zestawów (słupków) w stosunku do dnia, w którym zestaw został zamówiony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Alternatywne metody wykrywania RNA SARS-CoV-2. (A) Wykrywanie RT-qPCR genu nukleokapsydu (N) SARS-CoV-2 przy użyciu zestawu starterów N2. Połączone próbki środowiskowe wzbogacone były o 900 (zielone) lub 9 (pomarańczowe) kopie SARS-CoV-2. Kontrole pozytywne tych samych numerów egzemplarzy w kolorze niebieskim. Strzałka wskazuje spadek detekcji fluorescencji kontroli pozytywnej o niskiej liczbie kopii, gdy obecna jest próbka środowiskowa. (B) Tradycyjne wykrywanie SARS-CoV-2 metodą RT-PCR. U góry: Produkty RT-PCR genu nukleokapsydu przy użyciu zestawów starterów N1 i N2. W kontrolce bez szablonu obserwuje się słaby sygnał tła. Na dole: Produkty RT-PCR genu otoczki przy użyciu zestawu starterów E1. Przy stężeniu LOD obserwuje się bardzo niski sygnał. Niebieskie strzałki pokazują oczekiwany dodatni produkt: (na górze) ~70 pz i (na dole) 113 pz w 2% elektroforezie w żelu agarozowym. (C) RCA RNA SARS-CoV-2. Sonda kołowa wzmacnia się w obecności ligazy i braku matrycy RNA (NTC cir); w przypadku braku ligazy i matrycy RNA sonda liniowa nie amplifikuje (NTC lin). Skróty: SARS-CoV-2 = koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2; RFU = względne jednostki fluorescencji; bp = pary zasad; rxn = reakcja; MM = marker molekularny; RT-PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją; RT-qPCR = ilościowy RT-PCR w czasie rzeczywistym; RCA = wzmocnienie okręgu tocznego; NTC = kontrola bez szablonu; LOD = granica wykrywalności; Rxn = reakcja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt.
podkład20-krotna koncentracja (μM)1X Koncentracja (μM)
FipRozdział 321.6
Krajowy Fundusz WyborczyRozdział 321.6
F340,2
Klasa B340,2
Pętla F80,4
Pętla B80,4

Tabela 1: Formuła mieszanki podkładów 20X RT-LAMP. W reakcji RT-LAMP 6 starterów rozpoznaje 8 regionów docelowego DNA. Skróty: amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji; FIP = przednie wewnętrzne podłoże; BIP = podkład wewnętrzny odwrócony; F3 = spłonka do przemieszczenia do przodu; B3 = podkład z przemieszczeniem wstecznym; LoopF = podkład do pętli przedniej; Pętla B = podkład pętli wstecznej.

podkładSekwencjacelRozmiar produktu
RT-LAMP9,18,19
E1-F3TGAGTACGAACTTATGTACTCATEwzór przypominający drabinę
E1-B3TTCAGATTTTTAACACGAGAGT
Certyfikat E1-FIPACCACGAAAGCAAGAAAAAAGTTCGTTTCGGAAGAGACAG
E1-BIP (E1-Mikrodruk)TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT
Pętla E1GCGCTTCGATTGTGCGT
E1-Pętla FCGCTATTAACTATTAACG powiedział:
N2-F3ACCAGGAACTAATCAGACAAGN
N2-B3GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCT
Protokół N2-FIPTTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC
N2-BIP (Protokół N2-BIP)CGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA
N2-Pętla FGGGGGCAAATTGTGCAATTTG
N2-Pętla BCTTCGGGAACGTGGTTGACC
RT-qPCR38
2019-nCoV_N1-FGACCCCAAAATCAGCGAAATN72 punktów bazowych
2019-nCoV_N1-RTCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
2019-nCoV_N1-P5'-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'
2019-nCoV_N2-FTTACAAACATTGGCCGCAAAN67 pz
2019-nCoV_N2-RGCGCGACATTCCGAAGAA
2019-nCoV_N2-P5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3'
RT-PCR39
E1_Sarbeco_FACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTE113 punktów bazowych
E1_Sarbeco_RATATTGCAGCAGTACGCACACA

Tabela 2: Startery używane do RT-LAMP, RT-qPCR i RT-PCR. Wymienione są sekwencje starterów, gen docelowy, oczekiwany rozmiar produktu i odpowiednie odniesienie. Skróty: RT-LAMP = amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji; RT-PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją; bp = pary zasad; RT-qPCR = ilościowy RT-PCR w czasie rzeczywistym; E1 = gen otoczki; N2 = gen nukleokapsydu; F = starter do przodu; R = odwrócony podkład; P = sonda ; FIP = przednie wewnętrzne podłoże; BIP = podkład wewnętrzny odwrócony; F3 = spłonka do przemieszczenia do przodu; B3 = podkład z przemieszczeniem wstecznym; LoopF = podkład do pętli przedniej; Pętla B = podkład pętli wstecznej.

OdczynnikObjętość (μL)
WarmStart Lampa kolorymetryczna 2X Master Mix z UDGRozdział 12,5
Mieszanka podkładowa N2 (20x)Wydanie orzeczenia 1,25
Mieszanka podkładów E1 (20x)Wydanie orzeczenia 1,25
Chlorowodorek guanidyny (600 mM)*Rozdział 2.5
Docelowy RNA5
H2O wolne od nukleazRozdział 2.5
Całkowita objętość25

Tabela 3: Główna mieszanka reakcji dla multipleksowej kolorymetrycznej lampy RT-LAMP. (*) Wykazano, że chlorowodorek guanidyny zwiększa czułość i szybkość reakcji za pomocą niescharakteryzowanego mechanizmu28. Skróty: LAMP = amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli; UDG = glikozylaza uracylo-DNA; N2 = gen nukleokapsydu; E1 = gen otoczki; DEPC = węglan dietylopylowęglanu.

Zatwierdzeni obywateleObywatele, którzy poprosili o zestawDostarczone zestawyZwrócone zestawy z próbkamiDni poświęcone na próbkowanie% kompletnych zestawów% Zestawy niekompletnePrzetworzone próbki
48272.6% (350/482)36270.4% (255/362)znaczyć891.1 (224/246)8.9 (22/246)4,080
mediana3

Tabela 4:Wymaz na obecność SARS-CoV-2 według liczb. Wskaźniki sukcesu w zakresie zasięgu i pobierania próbek. Skrót: SARS-CoV-2 = koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2.

Dyskusja

Zaangażowanie naukowców obywatelskich. Naukowcy-amatorzy zostali zrekrutowani do pobrania wymazów z powierzchni w całym hrabstwie San Diego w celu pobrania próbek i wykrycia obecności SARS-CoV-2 w środowisku miejskim. Większość dostarczonych zestawów do pobierania próbek (70%) została zwrócona do laboratorium, a spośród nich prawie wszystkie próbki były kompletne (91%) (ryc. 3A, B i tabela 4). Ochotnicy mogli łatwo poprosić o dostarczenie/odbiór zestawu za pośrednictwem platformy internetowej, a oprogramowanie do planowania tras dostaw informowało naukowców-amatorów o szacowanym czasie przybycia, co prawdopodobnie miało istotny wpływ na zaobserwowany sukces. Średni czas od momentu dostarczenia zestawu do naukowca amatora do momentu jego zwrotu do laboratorium wynosił 8 dni, przy medianie 3 dni i zakresie od 1 do 64 dni (Rysunek 3A i Tabela 4). Częstsze przypomnienia dla ochotników prawdopodobnie skróciłyby ten czas opóźnienia.

Platforma do zbierania danych była z powodzeniem wykorzystywana przez zdecydowaną większość użytkowników (73%) (tab. 4). Chociaż wysiłki naukowców-amatorów nie były mierzone, testy terenowe wykazały, że platforma gromadzenia danych znacznie zmniejszyła wysiłek i czas potrzebny do prawidłowego zakończenia pobierania próbek. W ten sposób zmniejszenie ilości księgowości zachęciło naukowców obywatelskich do zaangażowania. Platforma internetowa miała na celu przezwyciężenie ograniczeń demograficznych poprzez zapewnienie wielojęzycznej usługi neuronowego tłumaczenia maszynowego oraz dostarczenie protokołów graficznych i audiowizualnych w języku angielskim i hiszpańskim. Udało się to tylko częściowo, ponieważ pobrano mniej próbek zarówno z South Bay, jak i North County, gdzie mieszka większość populacji latynoskiej/latynoskiej w hrabstwie(45). Obszary te zawierały również 63% (1 700 przypadków na 100 000) wszystkich przypadków COVID-19 w hrabstwie San Diego z najwyższą częstością występowania choroby46 i wskaźnikiem hospitalizacji (62%)47,48. Chociaż większość próbek pochodziła z hrabstwa Central, reprezentatywna liczba została pobrana z okręgów najbardziej dotkniętych COVID-19 i tylko niewielka część próbek była pozytywna, co sugeruje, że powierzchniowe rezerwuary SARS-CoV-2 w środowisku miejskim są stosunkowo rzadkie.

Przetwarzanie próbek. Wymazy z próbek zwilżono SDS, który inaktywował wirusa poprzez rozerwanie jego otoczki i ustabilizował nagie RNA poprzez rozwinięcie RNaz32. Dogodnie podczas pobierania detergent w waciku oczyścił pobraną powierzchnię. Próbki środowiskowe często zawierają bardzo małe ilości RNA. Aby zmaksymalizować regenerację, izolację RNA przeprowadzono przy użyciu opartej na GITC, bezkolumnowej, surowej metody ekstrakcji. GITC, silny środek chaotropowy, rozbija wiązania wodorowe, które utrzymują fałdowanie białek (tj. efekt hydrofobowy). Działanie to powoduje inaktywację cząstek wirusa, a RNA pozostaje stabilne dzięki hamowaniu RNAz 34,35,36. Rozwiązanie opracowane w ramach projektu GITC pozwoliło utrzymać stabilność próbek RNA bez ścisłych względów związanych z łańcuchem chłodniczym, co pozwoliło obywatelom na utrzymanie próbek w temperaturze pokojowej, jeśli zamrażarka na dostarczone wkłady z lodem nie była dostępna. Aby zmniejszyć potencjalne zagrożenie, jakie stwarza ten odczynnik w przypadku bezpośredniego kontaktu ze skórą lub błoną śluzową, obywatele zostali poinformowani o tych zagrożeniach poprzez dołączenie karty charakterystyki substancji niebezpiecznej dostarczonej do zestawu oraz umieszczenie plomby ostrzegawczej w pudełku zawierającym probówki.

Surowa metoda ekstrakcji chloroformem GITC pomogła w odzyskaniu śladów RNA z wymazów, a jak wykazano w amplifikacji próbek wzbogaconych, inhibitory rzadko utrzymywały się w próbkach po ekstrakcji. Próbki, które były ujemne dla SARS-CoV-2 i nie wykazywały hamowania RT-LAMP, reprezentowały prawdziwie ujemne lub miały niższą liczbę kopii niż LOD przy 100% częstości. I odwrotnie, wykrycie wirusowego RNA na powierzchni nie oznacza bezpośrednio ryzyka przeniesienia przez kontakt, ponieważ zakaźność wirusa z próbek dodatnich musi zostać przetestowana. Szybkie badania przesiewowe środowiska, nieograniczone dostępnością zaawansowanych materiałów eksploatacyjnych lub wysoko wykwalifikowanego personelu, mają kluczowe znaczenie dla oceny, czy powierzchnie stanowią rezerwuar wirusa, oraz dla lepszego kierowania działaniami zapobiegawczymi i powstrzymującymi rozprzestrzenianie się wirusa.

RT-LAMP została wybrana jako najlepsza metoda odpowiednia dla proponowanego rurociągu detekcji. Okazało się, że jest to szybka i niedroga metoda, która była wysoce odporna na większość pozostałych inhibitorów oraz tak samo czuła i specyficzna jak inne metody RT-qPCR. Ze względu na ich zastosowanie w warunkach klinicznych podczas pandemii SARS-CoV-2, na dostępność zestawów RT-qPCR wpłynęło globalne zapotrzebowanie. Co więcej, techniki RT-qPCR – nawet te opracowane w celu odporności na inhibitory – były wrażliwe na substancje zawarte w próbkach środowiskowych pobranych przez pilotażową kohortę naukowców amatorskich, nawet po zastosowaniu innych powszechnych strategii w celu zmniejszenia konkurencji inhibitorów o wiązanie enzymów49. Wyniki te zostały potwierdzone w niedawnym badaniu, w którym porównano obie metody wykrywania SARS-CoV-2 na próbkach wymazów z cukierków obsługiwanych przez pacjentów z COVID-19 i stwierdzono ponad 83% zgodność wyników, z 25% niższą inhibicją, w próbkach analizowanych przez RT-LAMP15. Co więcej, ekstrakcja surowego chloroformu GITC, w połączeniu z RT-LAMP, obniżyła koszty odczynników i materiałów eksploatacyjnych o 42% w porównaniu z ekstrakcją zestawu RNA i RT-qPCR (Tabela Materiałów).

Metoda ta pozwoliła na wysokoprzepustową analizę tysięcy próbek wymazów powierzchniowych. Do 80 pul, reprezentujących 640 próbek, zostało przetworzonych w ciągu 2 dni od ekstrakcji RNA do wykrycia SARS-CoV-2 przez RT-LAMP. Proponowany protokół jest półilościowy, ogranicza się do wykrywania wirusowego RNA i nie wskazuje na obecność zakaźnych cząstek wirusa. Konieczna jest dalsza analiza w celu oceny ryzyka przeniesienia SARS-CoV-2 z zakażonych komórek obecnych na pobranych powierzchniach.

W badaniu tym przedstawiono protokół szybkiego opracowania strategii testowania, która obejmuje skuteczny przepływ pracy w obliczu zagrożenia zdrowia związanego z chorobą zakaźną. Proponowany protokół pobierania próbek jest prosty i wykorzystuje materiały powszechnie spotykane w gospodarstwach domowych, a metoda wykrywania wirusa jest przeprowadzana na sprzęcie dostępnym w podstawowych warunkach laboratoryjnych, takich jak łaźnia wodna zamiast termocyklera. Koszty odczynników RT-LAMP są znacznie niższe niż te potrzebne do RT-qPCR i mniej podatne na scenariusze wysokiego globalnego popytu. Badanie to służy jako ramy do oceny środowiskowych rezerwuarów wirusa w przyszłych epidemiach i globalnych pandemiach.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie istnieją sprzeczne interesy.

Podziękowania

Dziękujemy badaczom z Instytutu Informacji Wirusowej (VII), dr Ance M. Segall, Willow Segall, Patricii L. Rohwer, Gary'emu Rohwerowi, Cary'emu L. Rohwerowi, Magdzie Silvii Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, dr Gregory'emu Petersowi, dr Stuartowi A. Sandinowi i dr Jennifer Smith za poświęcenie czasu na zebranie licznych próbek. Dziękujemy również dr Robowi Knightowi, dr Jackowi Gilbertowi, dr Pedro Balda-Ferre i dr Sarah Allard z wydziału pediatrii w School of Medicine University of San Diego California (UCSD) za ułatwienie kontroli pozytywnych i przydatne informacje zwrotne. Dziękujemy Stacey Carota (SDSU College of Sciences) i Ginie Spidel (SDSU) za wsparcie logistyczne oraz Juanowi Rodríguezowi za grafikę i projekt graficzny protokołu pobierania próbek. Dziękujemy wszystkim uczestnikom za zaangażowanie i poświęcenie dla tego projektu w bardzo trudnych czasach. Prace te zostały wsparte hojną darowizną od dr Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) oraz grantu National Science Foundation RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 (numer nagrody: 2030479).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SMP, LIMS i działania społecznościowe:
Uwierzytelnianie Interfejs programowania aplikacjiGoogleGoogle Logowanie
Komercyjna platforma hostingowaGoDaddy
Data Charting Interfejs programowania aplikacjiGoogle Charts
MySQL 
Oprogramowanie do planowania tras dostaw Circuit Circuit dla drużyn Bezpłatna
usługa poczty e-mailGoogleGoogle Email
Interfejs programowania aplikacji geoprzestrzennychGoogleGoogle Maps API
Wielojęzyczna neuronowa usługa tłumaczenia maszynowegoGoogleTranslate
Online FormularzGoogle
Tworzenie
 Big Rose Web Design
Oprogramowanie serwera WWWApache 
Zestaw do pobierania próbek:
CoolersColeman (Amazon)B00363X3F2Koszt (US$) za 100 rxns: 70
galonów Worki ZiplocSolimo (Amazon)B07BJ495GLKoszt (US$) za 100 rxns: 18
Glicerol (środek do dezynfekcji rąk)FischerScientificG33-4Koszt (US$) za 100 rxns: 9
Okłady z loduIce-Brix (Amazon)B075GLD3X1Koszt (US$) za 100 rxns: 110
Izopropanol (płyn do dezynfekcji rąk)FischerScientificAA36644K7Koszt (US$) za 100 rxns: 43
Maski KN95Echo-SigmaEcho-SigmaKoszt (US$) za 100 rxns: 400
Papier do protokołów i karty bezpieczeństwa Trizol OfficeDepot348037Koszt (US$) za 100 rxns: 36
Butelki z rozpylaczem 30 ml (SDS i środek do dezynfekcji rąk)Anyumocz (Amazon)B07T64FHXRKoszt (US$) za 100 rxns: 80
RNazy, DNazy, DNA i Wolne od inhibitorów PCR Probówki do mikrowirówekGenesee Scientific22-281Koszt (US$) za 100 rxns: 83
Identyfikator próbki etykiety odporne na rozpuszczalnikiLABTAGXST-10C1-1WHKoszt (US$) za 100 rxns: 68
Podkładki Swiffer WetJet (waciki)Swiffer (Amazon)B001F0RBT2Koszt (US$) za 100 rxns: 8
WykałaczkiNiezbędnik kuchenny (Amazon)B00PBK4NG6Koszt (US$) za 100 rxns: 8
Odczynnik Trizol (roztwór izotiocyjanianu guanidyny - GITC), nie LSInvitrogen15596018Koszt (US$) za 100 rxns: 40
Pudełka tuboweGenesee Scientific21-119Koszt (US$) za 100 rxns: 180
Małe torebki ZiplocZiploc (Amazon)B01LRKEI9KKoszt (US$) za 100 rxns: 8
Biurkowa drukarka termotransferowa Zebra ZebraGK420t
Całkowity koszt zestawu do pobierania próbek (US$) za 100 rxns: 1,160
Ekstrakcja RNA Trizol:
InvitrogenAM9070Gamonu bez RNazKoszt (US$) za 100 rxns: 2
ChloroformFisherScientificC298-500Koszt (US$) za 100 rxns: 2
GlycoBlue (glikogen 15 mg / ml)InvitrogenAM9515Koszt (US$) za 100 rxns: 80
Absolutny molekularny (200 proof) EtanolFisherScientificBP2818500Koszt (US$) za 100 rxns: 30
Isopropanol klasy molekularnejFisherScientificBP2618500Koszt (US$) za 100 rxns: 3
Zestaw TURBO bez DNA InvitrogenAM1907Koszt (US$) za 100 rxns: 110
Multiplexed kolorymetryczny RT-LAMP:
guanidyna chlorowodorekAlfa AesarAAJ6548522Koszt (US$) za 100 rxns: 1
RT-LAMP E1-PrimersIDTn/aKoszt (US$) za 100 rxns: 7
RT-LAMP N2-PrimersIDTn/aKoszt (US$) za 100 rxns: 7
Syntetyczny SARS-CoV-2 RNAATCCVR-3276SDKoszt (US$) za 100 rxns: 14
Lampa kolorymetryczna WarmStart 2X Master Mix z UDGNEBM1800SKoszt (US$) za 100 rxns: 210
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal CyclerEppendorf950030010
Całkowita ekstrakcja RNA Trizol + LAMP Koszt (US$) za 100 rxns: 470
Kit do ekstrakcji RNA:
QIAamp DSP Viral RNA Mini KitQiagen61904Koszt (US$) za 100 rxns: 570
RT-qPCR:
Synthetic SARS-CoV-2RNA ATCCVR-3276SDKoszt (US$) za 100 rxns: 14
TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixApplied Biosystems4444432Koszt (US$) za 100 rxns: 180
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Startery i sondyIDT10006713 Koszt (US$) za 100 rxns: 20
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMixQuantabio95132-100
Patogen QuantiNova Sonda Qiagen208652
QuantiNovaQiagen208352
UltraPlex 1-Step ToughMix Quantabio95166-100
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBioRad1855196
Zestaw do ekstrakcji RNA + RT-qPCR Koszt (US$) za 100 rxns: 790 
RT-PCR:
SuperScript IV One-Step RT-PCR Czyszczenie12594025
Lab:
DNAZapInvitrogenAM9890
RNAZapInvitrogenAM9780
Google Google System operacyjny Google Form stron internetowych i baz danych w systemie Linux octanu

Bibliografia

  1. Alsved, M., et al. Exhaled respiratory particles during singing and talking. Aerosol Science and Technology. 54 (11), 1245-1248 (2020).
  2. Morawska, L., Cao, J. Airborne transmission of SARS-CoV-2: The world should face the reality. Environment International. 139, 105730(2020).
  3. Stadnytskyi, V., Bax, C. E., Bax, A., Anfinrud, P. The airborne lifetime of small speech droplets and their potential importance in SARS-CoV-2 transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (22), 11875-11877 (2020).
  4. Yu, I. T. S., et al. Evidence of Airborne Transmission of the Severe Acute Respiratory Syndrome Virus. New England Journal of Medicine. 350 (17), 1731-1739 (2004).
  5. Coronavirus disease (COVID-19): How is it transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/question-and-answers-hub/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2020).
  6. How COVID-19 Spreads. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/how-covid-spreads.html (2020).
  7. Moriarty, L. F., et al. Public Health Responses to COVID-19 Outbreaks on Cruise Ships - Worldwide, February-March 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (12), 347-352 (2020).
  8. Cheng, V. C. -C., et al. Air and environmental sampling for SARS-CoV-2 around hospitalized patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19). Infection Control and Hospital Epidemiology. , 1-8 (2020).
  9. Van Doremalen, N., et al. Aerosol and surface stability of SARS-CoV-2 as compared with SARS-CoV-1. New England Journal of Medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  10. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582, 557-560 (2020).
  11. Butler, D. J., et al. Shotgun transcriptome and isothermal profiling of SARS-CoV-2 infection reveals unique host responses, viral diversification, and drug interactions. bioRxiv. , (2020).
  12. Döhla, M., et al. SARS-CoV-2 in environmental samples of quarantined households. medRxiv. , (2020).
  13. Ikonen, N., et al. Deposition of respiratory virus pathogens on frequently touched surfaces at airports. BMC Infectious Diseases. 18, 437(2018).
  14. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800(2020).
  15. Salido, R. A., et al. Handwashing and detergent treatment greatly reduce SARS-CoV-2 viral load on Halloween candy handled by COVID-19 patients. mSystems. 5, 01074(2020).
  16. Chan, J. F. W., et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), 00310-00320 (2020).
  17. Dao Thi, V. L., et al. A colorimetric RT-LAMP assay and LAMP-sequencing for detecting SARS-CoV-2 RNA in clinical samples. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  18. Rauch, J., et al. A scalable, easy-to-deploy, protocol for Cas13-based detection of SARS-CoV-2 genetic material. bioRxiv. , (2020).
  19. Zhang, F., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. , Available from: https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/COVID-119%20detection%20(updated).pdf (2020).
  20. Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
  21. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-185 (2020).
  22. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology. 38, 870-874 (2020).
  23. Lucia, C., Federico, P. -B., Alejandra, G. C. An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection method based on CRISPR-Cas12. bioRxiv. , (2020).
  24. Danko, D., et al. Global genetic cartography of urban metagenomes and anti-microbial resistance. bioRxiv. , (2020).
  25. Parida, M., et al. Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2895-2903 (2005).
  26. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research. 28 (12), 63(2000).
  27. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  28. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69 (3), 179-186 (2020).
  29. Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes. BioTechniques. 58 (2), 59-68 (2015).
  30. Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). Journal of Virological Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
  31. OAuth 2.0. Internet Engineering Task Force (IETF. , Available from: https://oauth.net/2/ (2012).
  32. Naidu, K. T., Prabhu, N. P. Protein-surfactant interaction: Sodium dodecyl sulfate-induced unfolding of ribonuclease A. Journal of Physical Chemistry B. 115 (49), 14760-14767 (2011).
  33. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  34. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
  35. Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-472 (2007).
  36. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  37. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Ethanol precipitation of RNA and the use of carriers. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
  38. Wallace, D. M. Precipitation of nucleic acids. Methods in Enzymology. 152, 41-48 (1987).
  39. COVID-19 Dashboard. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.arcgis.com/apps/opsdashboard/index.html#/96feda77f12f46638b984fcb1d17bd24 (2020).
  40. CDC 2019-novel Coronavirus (2019-nCoV) real-time RT-PCR diagnostic panel. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.fda.gov/media/134922/download (2020).
  41. Corman, V. M., et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 25 (3), 2000045(2020).
  42. Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nature Genetics. 19, 225-232 (1998).
  43. Johne, R., Müller, H., Rector, A., van Ranst, M., Stevens, H. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase. Trends in Microbiology. 17 (5), 205-211 (2009).
  44. Wang, B., et al. Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle amplification. Journal of Clinical Microbiology. 43 (5), 2339-2344 (2005).
  45. Population of Mexican origin in San Diego County. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/CHS/ENGLISH VERSION_Mexican Origin.pdf (2020).
  46. COVID-19 city of residence MAP. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/Epidemiology/COVID-19 City of Residence_MAP.pdf (2020).
  47. COVID-19 hospitalizations summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/phs/ Epidemiology/COVID-19 Hospitalizations Summary_ALL.pdf (2020).
  48. COVID-19 race and ethnicity Summary. County of San Diego Health and Human Services Agency. , Available from: https://www.sandiegocounty.gov/content/dam/sdc/hhsa/programs/ phs/Epidemiology/COVID-19 Race and Ethnicity Summary.pdf (2020).
  49. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie SARS CoV 2pobieranie pr bek rodowiskowychwymazy z powierzchni miejskichnauka obywatelskatest RT LAMPekstrakcja RNArezerwuary powierzchnioweelektroforeza w eluamplifikacja pier cieniowanadz r nad zdrowiem publicznym

Powiązane artykuły