Artykuł metodologiczny

Solidna metoda pakowania kolumn C18 RP-nano-HPLC o wysokiej rozdzielczości

DOI:

10.3791/62380

⸱

14 maja 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine at UCLA

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy i oceniamy protokół do tworzenia tanich kolumn do chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami nanoprzepływowymi do charakteryzacji peptydów przy użyciu proteomicznych przepływów pracy LC-MS/MS.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysoka złożoność występująca w próbkach biologicznych wymaga separacji chromatograficznych o wysokiej czułości i rozdzielczości, aby mogły być skutecznie analizowane. W tym miejscu przedstawiamy solidny, powtarzalny i niedrogi protokół przygotowania kolumn do wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami nanoprzepływowymi (RP-HPLC) do separacji on-line peptydów analitycznych przed wprowadzeniem i wykryciem przez spektrometr mas w tradycyjnych przepływach pracy proteomiki oddolnej. W zależności od celu eksperymentu i właściwości chemicznych rozdzielanych analitów, optymalne parametry kolumn mogą różnić się ich średnicami wewnętrznymi lub zewnętrznymi, długością, wielkością cząstek, wielkością porów, składem chemicznym cząstek fazy stacjonarnej oraz obecnością lub brakiem zintegrowanego emitera elektrorozpylania na końcówce. Własny system pakowania kolumn nie tylko umożliwia szybkie wytwarzanie kolumn o pożądanych właściwościach, ale także znacznie obniża koszty procesu. Zoptymalizowany protokół pakowania kolumny C18 AQ (wodnej) ze stopionej krzemionki jest kompatybilny z szeroką gamą przyrządów do chromatografii cieczowej w celu uzyskania skutecznej separacji analitów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolumny HPLC ogromnie przyczyniły się do produktywności w dziedzinie badań farmaceutycznych, medycznych i środowiskowych1,2,3,4. Dostęp do wysokiej jakości kolumn chromatograficznych jest kluczowym krokiem we frakcjonowaniu złożonych analitów. W proteomice shotgun wysoka czułość analityczna jest rutynowo osiągana przez sprzężenie spektrometrii mas (MS) jonizacji elektrorozpylania (ESI) z chromatografią nanoprzepływową5,6,7,8. Skuteczna separacja tysięcy peptydów ma kluczowe znaczenie w tym zastosowaniu, ponieważ pozwala spektrometrowi mas na identyfikację i ilościowe określenie analitów z wysoką czułością i rozdzielczością.

Dziedzina upakowania kolumn do zastosowań spektrometrycznych mas odnotowała ogromny wzrost w ostatnich latach dzięki postępom w zrozumieniu podstawowych zasad upakowania kolumn związanych z morfologią fazy stacjonarnej, interakcjami rozpuszczalnik-cząstka i projektowaniem sprzętu, umożliwiając szczegółową charakterystykę szerokiego zakresu biomolekuł w złożonych ustawieniach biologicznych9,10,11,12,13,14. Wysiłki mające na celu zwrócenie uwagi na praktyczne aspekty pakowania kolumn analitycznych do celów LC-MS utorowały drogę laboratoriom proteomicznym do opracowania własnych systemów pakowania, które spełniają ich specyficzne zainteresowania z obietnicą maksymalnej wydajności15,16,17,18.

Kolumny nanospray o średnicach wewnętrznych w zakresie 50-150 μm i zwężających się końcach są dobrze przystosowane do jonizacji elektrorozpylanej. W dziedzinie proteomiki typu shotgun separacje są zwykle przeprowadzane przy użyciu gradientu rozpuszczalnika przepływającego przez upakowaną niepolarną fazę stacjonarną, najczęściej hydrofobową krzemionkę związaną łańcuchem węglowym (C8-C30) o rozmiarach cząstek wahających się od 1,7 do 3,5 μm19,20,21,22. Anality eluujące są emitowane przez emiter ESI zintegrowany z kolumną, który zapewnia miękką jonizację analitów w fazie roztworu do jonów gazowych. Sprzężenie kolumn ciekłych z ESI-MS znacznie przyczyniło się do postępu w zastosowaniu tandemowej spektrometrii mas w strategiach proteomicznych w naukach biomedycznych.

Kolumny LC o wąskich średnicach wewnętrznych skutkują węższymi pikami chromatograficznymi i wyższą czułością w porównaniu do kolumn mikroprzepływowych o większej średnicy, a zatem są szczególnie korzystne w proteomicznych przepływach pracy. Chociaż dostępne na rynku wstępnie zapakowane kolumny LC są atrakcyjną opcją ze względu na ich wygodę i łatwość użytkowania, mogą być zbyt drogie i mniej elastyczne niż opcje wewnętrzne. Celem tej pracy jest opisanie technicznie prostego i taniego podejścia do pakowania gnojowicy w celu przygotowania kolumn HPLC o odwróconej fazie o wąskiej średnicy wewnętrznej przy użyciu kapilar ze stopioną krzemionką i zbudowanego we własnym zakresie systemu bomb ciśnieniowych do zastosowań proteomicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie końcówki kapilarnej

  1. Za pomocą ceramicznego kamienia do rozłupywania wytnij około 60-70 cm pokrytej poliimidem kapilary z topionej krzemionki o średnicy wewnętrznej (ID) 75 μm i średnicy zewnętrznej (OD) 360 μm.
  2. Przytrzymaj kapilarnę rękami mniej więcej w połowie jej długości, pozostawiając 4-5 cm odstępu między palcami i podgrzej obszar w szczelinie, obracając go nad płomieniem lampy alkoholowej. Wypoleruj spalony obszar do czysta za pomocą nasączonej metanolem chusteczki o niskiej ilości kłaczków, aż szkło będzie widoczne. (Rysunek 1).
    UWAGA: 4-5 cm kapilary ze stopionej krzemionki pokrytej poliimidem należy naświetlić i wypolerować, zanim będzie można ją załadować do ściągacza laserowego.
  3. Aby wyciągnąć emiter w kształcie stożka dla ESI, należy użyć ściągacza do końcówek laserowych ze specjalnymi ustawieniami programu o wartości ciepła 300 (odpowiednik 2 watów mocy lasera), prędkości 10 (odpowiednik 0,25 mm/s) i opóźnieniu 180 milisekund w celu uzyskania końcówki o średnicy ~1-5 μm (Rysunek 2 i Rysunek 3A). Załaduj wypolerowaną część kapilary do ściągacza laserowego i naciśnij pociągnięcie, w wyniku czego dwie puste kolumny kapilarne będą gotowe do zapakowania.
    UWAGA: Częsta kontrola końcówki na każdym etapie odbywa się za pomocą mikroskopu. Ustawienia będą się prawdopodobnie różnić w zależności od ściągaczy laserowych i będą musiały zostać określone empirycznie.

2. Polimeryzacja/trawienie końcówki

  1. W celu zatrzymania cząstek fazy stacjonarnej w rurce kapilarnej należy przygotować porowatą frytę z mieszaniny dwóch roztworów krzemianu potasu i formamidu. Przygotuj roztwór bezpośrednio przed użyciem w probówce o pojemności 2 ml i wymieszaj za pomocą wiru.
    1. Zmieszać dwa roztwory krzemianu potasu o stosunku SiO2/K2O odpowiednio 2,50 (m/w) i 1,65 (w/w) oraz formamidu w stosunku 1:3:1 (v/v/v). Na przykład zmieszaj 100 μl krzemianu potasu ze stosunkiem SiO2/K2O 2,50 (w/w), 300 μl krzemianu potasu ze stosunkiem SiO2/K2O 1,65 (w/w)) i 100 μl formamidu, a następnie wiruj. Roztwór ten polimeryzuje po podgrzaniu i wytwarza porowatą frytę.
  2. Zanurz naciąganą laserowo końcówkę kapilarną w przezroczystym roztworze macierzystym zawiesiny fryty (nie w osadzie) na około 10-20 sekund, pozwalając jej wniknąć na około 5 mm w głąb końcówki poprzez działanie kapilarne. W zależności od szerokości końcówki może być wymagane dłuższe zanurzenie końcówki w roztworze fryty. Ogólnie rzecz biorąc, czas zanurzania jest krótszy, jeśli końcówka jest szersza, ponieważ roztwór może szybciej dostać się do końcówki.
  3. Umieść gorącą lutownicę (ustawioną na 350 ° F) wzdłuż końcówki, aby zainicjować polimeryzację roztworu fryty podczas sprawdzania kapilary pod mikroskopem. Proszę zapoznać się z Rysunek 3, aby zobaczyć wyciągniętą końcówkę przed (Rysunek 3A) i po polimeryzacji (Rysunek 3B).
  4. Aby zapobiec zablokowaniu emitera po polimeryzacji fryty, zanurz końcówkę kolumny w 50% roztworze kwasu fluorowodorowego (HF) na 5 minut (konfiguracja jest zilustrowana na Rysunek 4). Wytrawianie HF nadaje również kolumnie płaską geometrię w kształcie stożka, zwiększając jej żywotność. Po wytrawieniu HF upewnij się, że końcówka kolumny jest dokładnie umyta, najpierw neutralizatorem HF, a następnie obficie wodą, aby zabezpieczyć się przed kontaktem z kwasem.
    UWAGA: HF jest bardzo niebezpieczną i substancją chemiczną. Zaleca się szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z produktem, aby zapobiec narażeniu. Upewnij się, że HF jest zawsze traktowany z odpowiednią ochroną wewnątrz dygestorium, który jest oznaczony znakiem "Niebezpieczeństwo! Ostre toksyny".
    1. Ze względów bezpieczeństwa podczas pracy z HF.
      należy używać zarówno zwykłych, jak i niepalnych fartuchów laboratoryjnych, a także podwójnych warstw rękawic nitrylowych i neoprenowych. UWAGA: Smażenie końcówek kapilarnych jest opcjonalne; Sprawia jednak, że kolumna jest znacznie bardziej odporna na zapychanie i wydłuża jej żywotność. Puste kolumny kapilarne ze stopionej krzemionki ze zintegrowanym emiterem elektrorozpylania są dostępne na rynku i w razie potrzeby mogą być użyte do zastąpienia stopni 1 i 2.

3. Przygotowanie fazy stacjonarnej

  1. W 300 μl metanolu zawiesić 25-50 mg całkowicie porowatych cząstek krzemionki ReproSil-Pur 120 C18-AQ o wielkości cząstek 1,9 μm i wielkości porów 120 μm. Pipetować w górę i w dół przez około 20 razy, aby zapewnić jednorodną mieszaninę cząstek zawiesiny w metanolu.
  2. Umieść rurkę zawierającą zawiesinę gnojowicy w komorze komory ciśnieniowej zbudowanego przez nas systemu bomb do pakowania kolumnowego, który z kolei jest umieszczony na mieszadle magnetycznym, dzięki czemu cząstki zawiesiny mogą pozostać w zawiesinie. Podłącz bombę do zbiornika helu (<1500 psi), który działa pod stałym ciśnieniem, aby uniknąć zakłócenia zawiesiny HPLC podczas pakowania. (Schemat przedstawiony w Rysunek 5).
  3. Zabezpiecz pokrywę komory ciśnieniowej, dokręcając ją, jak pokazano na Rysunek 6A.
    UWAGA: Ważne jest, aby docenić różnicę w działaniu pompy HPLC i bomby uszczelniającej HPLC. Podczas gdy ten pierwszy jest zaprojektowany do pracy przy stałym natężeniu przepływu, niezależnie od ciśnienia wstecznego wywieranego przez fazę stacjonarną w kolumnie, systemy ciśnieniowe HPLC działają przy stałym ciśnieniu, aby zapewnić nieprzerwane i gęste upakowanie cząstek fazy stacjonarnej na całej długości kolumny kapilarnej.

4. Pakowanie kolumny z fazą stacjonarną

  1. Najpierw przeciągnij spód kolumny (niespiekany otwarty koniec) przez szczelne złącze palcowe na górze bomby ciśnieniowej tak, aby końcówka kolumny była skierowana do góry. Przepchnij kolumnę, aż dotknie podstawy fiolki zawierającej gnojowicę i wsuń ją 1-2 mm powyżej podstawy. Dokręć złączkę palcową, aby zabezpieczyć kolumnę na miejscu.
  2. Podłącz bombę uszczelniającą do zbiornika helu (zalecane ciśnienie < 1500 psi) i włącz ją do ciśnienia ~ 1300 psi. Gazowy hel dostaje się do komory ciśnieniowej, w której znajduje się fiolka zawierająca gnojowicę, przez zawór trójdrogowy. Otwórz zawór, powoli obracając go o 180° zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
    UWAGA: Gdy tylko gazowy hel zacznie przepływać do wnętrza komory, wypycha gnojowicę z rurki do kapilary. Gdy zawiesina przechodzi przez kolumnę, cząstki są zatrzymywane w kapilarze, podczas gdy rozpuszczalnik tworzy kroplę cieczy na końcu kolumny (Rysunek 6B).
    1. Jeśli tworzenie się kropelki cieczy na końcówce kolumny jest opóźnione, szybko podpal końcówkę, aby upewnić się, że jest otwarta. Na tym etapie źródło światła umieszczone za kolumną może pomóc w obserwacji postępu procesu pakowania (Rysunek 7). W przypadku kolumny o średnicy wewnętrznej 75 μm spakowanie o długości około 30 cm zajmuje zwykle ~30-60 minut.
    2. Jeśli przepływ gnojowicy przez kolumnę zatrzyma się lub zwolni, przytrzymaj kapilarnę mocno powyżej szczelnego dopasowania bomby pakującej i lekko ją poluzuj, obracając o około ćwierć obrotu (może być słyszalny syczący dźwięk rozhermetyzowania).
      UWAGA: Pozwala to na zmianę położenia kolumny bez konieczności całkowitego rozhermetyzowania bomby.
    3. Teraz delikatnie zmień położenie kolumny, przesuwając ją w górę i w dół, a następnie ponownie dokręć złączkę palcową, upewniając się, że kolumna nie dotyka podstawy fiolki. Zapewnia to równomierny przepływ gnojowicy przez kapilarę przez cały czas.
    4. Jeśli wyżej wymieniony środek nie wznowi pakowania, zamknij zawór, odpowietrz bombę uszczelniającą, odkręć pokrywę i sprawdź gnojowicę, aby upewnić się, że nie ma osadów. Możliwe jest również, że koniec kolumny jest zatkany stałymi cząstkami fazy stacjonarnej, w którym to przypadku przecięcie niewielkiej długości od tyłu kapilary może pomóc w wznowieniu przepływu.
  3. Opakowanie o kilka centymetrów dłuższe niż żądana długość na końcu kolumny, aby zapewnić całkowite upakowanie nieruchomych cząstek i zminimalizować możliwość dostania się pęcherzyków helu do wypełnionej kolumny.

5. Wykończenie kolumny i wykonanie frytki

  1. Po osiągnięciu żądanej długości upakowania zamknij główny zawór zbiornika helu i odczekaj co najmniej 15 minut, aby zapewnić równomierne upakowanie kolumny i umożliwić samorozhermetyzowanie systemu.
    UWAGA: Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków He w wyniku pustej stopionej krzemionki na końcu kolumny, zaleca się dłuższe upakowanie. Bardzo ważne jest, aby proces pakowania był kontynuowany nawet po upakowaniu części kolumny widocznej dla oka, aby uwzględnić długość kapilary wewnątrz komory ciśnieniowej. Dodatkowo, w przypadkach, gdy wymagana jest wielokrotna zmiana położenia kolumny, zalecana jest dłuższa długość upakowania, ponieważ skutkuje to mniejszą ilością pęcherzyków powietrza i wyższą wydajnością pakowania.
  2. Delikatnie rozhermetyzuj komorę, obracając zawór o 180 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara do jego pierwotnego położenia. Przytrzymaj mocno kolumnę, odkręć złączkę dokręcaną i stopniowo zdejmuj kolumnę. Ten krok należy wykonać bardzo delikatnie, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza.
  3. Przytnij koniec kolumny na długość 25,5 cm. Podczas kontroli pod mikroskopem użyj gorącej lutownicy o temperaturze 350 ° F, aby usunąć 0.5 cm gnojowicy z tylnego końca kolumny.
    1. Zanurz tylny koniec kolumny w pozostałym roztworze fryty z kroku 2.1 na około 10 sekund i spolimeryzuj go, umieszczając gorącą lutownicę wzdłuż tylnej części kolumny, jednocześnie sprawdzając ją pod mikroskopem. Frytka tylna zapewnia, że cząstki ReproSil-Pur 120 C18-AQ pozostają w kolumnie i zapobiegają cofaniu się podczas płukania chromatograficznego.
      UWAGA: Fryta z tyłu kolumny jest również opcjonalna, ale sprawia, że kolumna jest bardziej wytrzymała, jak zauważono również w przypadku frytki przedniej w kroku 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić wydajność kolumn, 750 ng trawienia peptydów tryptycznych przygotowanych z lizatów całych komórek HEK293 zostało pofrakcjonowanych online przy użyciu kapilary z topionej krzemionki o długości 25 cm, 75 μm, wypełnionej we własnym zakresie cząstkami ReproSil-Pur 120 C18-AQ, zgodnie z opisem w protokole. Przed załadowaniem próbki kolumnę przemyto przy użyciu 6 μl mieszaniny acetonitrylu, izopropanolu iH2Ow stosunku 6:2:2 i wstępnie zrównoważono buforem A (bufor A: woda z 3% DMSO). Trawienie peptydów try...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowoczesne strategie proteomiczne opierają się na wysokiej jakości separacjach chromatograficznych w celu skutecznej analizy złożonych systemów biologicznych. W związku z tym wysokowydajne i ekonomiczne nanoprzepływowe kolumny cieplne są kluczowymi elementami udanego reżimu tandemowej spektrometrii mas, którego celem jest scharakteryzowanie tysięcy białek w jednym przepływie pracy.

W tym badaniu oceniliśmy wydajność i niezawodność szeregu kolumn LC dla LC-MS/MS wykonanych przy użyciu protokołu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health GM089778 dla J.A.W.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
99,99% Kwas formamidowySigma-Aldrichdo produkcji
lampy alkoholowejDowolna markaDo dostarczania ciepła
Ogniwo ciśnieniowe helu BrechbuehlerBioSurplusdo kolumny pakującej
Ceramiczny obcinak kolumnowyDowolna markado cięcia kapilary krzemionkowej
Dimetylosulfotlenek (DMSO) ≥ 99%Sigma-AldrichPrzechowywany w łatwopalnej szafie
Formamid  ≥ 99,5%Sigma-Aldrichdo produkcji fryty
Kwas fluorowodorowy (HF) (50%)Fisher Scientificdo otwarcia emitera po polimeryzacji
KASIL (roztwór krzemianu potasu)PQ Corporationdo produkcji fryty
Orbitrap Fusion LumosThermo Fisher Scientificdo akwizycji danych
MS Ściągacz laserowy P2000 Sutterdo ciągnięcia kapilary
PTFE 1/16" Tuleja 0,4 mm ID (długa) do łącznika rurkiChromre214104Do ustawiania bomby
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1,9 um, 1gDr. Masch GmbHr119.aq.0001Partia 5910
dowolnej markiDo inicjowania polimeryzacji
Złączka rurowa ze stali nierdzewnej, złączka sześciokątna, 1/4 cala. Żeński NPTSwagelokSS-4-HCGdo ustawiania bomby
TSP075375 topionej krzemionki, 75 i mikro; m ID x 360 &mikro; ODMOLEX/Polymicro1068150019Do rur kolumnowych
Ultimate 3000 UHPLCDionexHPLC typ
z frytą

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Richards, A. L., et al. One-hour proteome analysis in yeast. Nature Protocols. 10 (5), 701-714 (2015).
  2. Shishkova, E., Hebert, A. S., Coon, J. J. Now, More Than Ever, Proteomics Needs Better Chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
  3. D'Atri, V., Fekete, S., Clarke, A., Veuthey, J. L., Guillarme, D. Recent Advances in Chromatography for Pharmaceutical Analysis. Analytical. Chemistry. 91 (1), 210-239 (2019).
  4. Gama, M. R., Collins, C. H., Bottoli, C. B. G. Nano-Liquid Chromatography in Pharmaceutical and Biomedical Research. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 694-703 (2013).
  5. Wilson, S. R., Vehus, T., Berg, H. S., Lundanes, E. Nano-LC in proteomics: recent advances and approaches. Bioanalysis. 7 (14), 1799-1815 (2015).
  6. Wilson, S. R., Olsen, C., Lundanes, E. Nano liquid chromatography columns. Analyst. 144 (24), 7090-7104 (2019).
  7. Cutillas, P. R. Principles of Nanoflow Liquid Chromatography and Applications to Proteomics. Current Nanoscience. 1 (1), 65-71 (2005).
  8. Dams, M., Dores-Sousa, J. L., Lamers, R. J., Treumann, A., Eeltink, S. High-Resolution Nano-Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometric Detection for the Bottom-Up Analysis of Complex Proteomic Samples. Chromatographia. 82 (1), 101-110 (2019).
  9. Stehling, O., et al. MMS19 Assembles Iron-Sulfur Proteins Required for DNA Metabolism and Genomic Integrity. Science. 337 (6091), 195-199 (2012).
  10. Mayank, A. K., et al. An Oxygen-Dependent Interaction between FBXL5 and the CIA-Targeting Complex Regulates Iron Homeostasis. Molecular cell. 75 (2), 282(2019).
  11. Nie, M., Oravcová, M., Jami-Alahmadi, Y., Wohlschlegel, J. W., Lazzerini-Denchi, E., Boddy, M. N. FAM111A induces nuclear dysfunction in disease and viral restriction. European Molecular Biology Organization. 22 (2), 50803(2021).
  12. Wahab, M. F., Patel, D. C., Wimalasinghe, R. M., Armstrong, D. W. Fundamental and Practical Insights on the Packing of Modern HighEfficiency Analytical and Capillary Columns. Analytical Chemistry. 89 (16), 8177-8191 (2017).
  13. Blue, L. E., Jorgenson, J. W. 1.1 µm Superficially porous particles for liquid chromatography: Part II: Column packing and chromatographic performance. Journal of Chromatography A. 1380, 71-80 (2015).
  14. Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-High Pressure (>30,000 psi) Packing of Capillary Columns Enhancing Depth of Shotgun Proteomic Analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
  15. Liu, H., Finch, J. W., Lavallee, M. J., Collamati, R. A., Benevides, C. C., Gebler, J. C. Effects of Column Length, Particle Size, Gradient Length and Flow Rate on Peak Capacity of Nano-Scale Liquid Chromatography for Peptide Separations. Journal of Chromatography A. 1147 (1), 30-36 (2007).
  16. Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A., , FlashPack. Fast and Simple Preparation of Ultrahigh-performance Capillary Columns for LC-MS. Molecular and cellular proteomics. 18 (2), 383-390 (2019).
  17. Capriotti, F., Leonardis, I., Cappiello, A., Famiglini, G., Palma, P. A Fast and Effective Method for Packing Nano-LC Columns with Solid-Core Nano Particles Based on the Synergic Effect of Temperature, Slurry Composition, Sonication and Pressure. Chromatographia. 76, 1079-1086 (2013).
  18. Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of High SlurryConcentration and Sonication to Pack High-Efficiency, Meter-Long Capillary Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography Columns. Journal of Chromatography A. 1462, 165-169 (2016).
  19. Pesek, J. J., Matyska, M. T. Our favorite materials: Silica hydride stationary phases. Journal of Separation Science. 32 (23), 3999-4011 (2009).
  20. Borges, E. M., Volmer, D. A. Silica, Hybrid Silica, hydride Silica and Non-Silica Stationary Phases for Liquid Chromatography. Part II: Chemical and Thermal Stability. Journal of Chromatographic Science. 53 (7), 580-597 (2015).
  21. Vyňuchalová, K., Jandera, P. Comparison of a C30 Bonded Silica Column and Columns with Shorter Bonded Ligands in Reversed-Phase LC. Chromatographia. 78 (13-14), 861-871 (2015).
  22. Novotny, M. V. Development of capillary liquid chromatography: A personal perspective. Journal of Chromatography A. 1523, 3-16 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

C18 RP HPLCpakowanie kolumnychromatografia przeciwpr dowarozdzia peptyd wspektrometria masproteomika bottom upkolumna z topionej krzemionkipeptydy analitycznerozdzia chromatograficzny
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły