Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja, oczyszczanie i profilowanie gangliozydów

4.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62385

⸱

12 marca 2021

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Gangliozydy to glikosfingolipidy zawierające kwas sjalowy, których szczególnie dużo występuje w mózgu. Ich amfipatyczny charakter wymaga technik ekstrakcji i oczyszczania organicznego/wodnego, aby zapewnić optymalny odzysk i dokładne analizy. Ten artykuł zawiera omówienie ekstrakcji gangliozydów w skali analitycznej i preparatywnej, oczyszczania i analizy chromatografii cienkowarstwowej.

Streszczenie

Gangliozydy to glikosfingolipidy, które zawierają jedną lub więcej reszt kwasu sjalowego. Znajdują się one we wszystkich komórkach i tkankach kręgowców, ale szczególnie obfite występują w mózgu. Ulegające ekspresji głównie na zewnętrznej ulotce błon plazmatycznych komórek, modulują aktywność białek powierzchniowych komórek poprzez asocjację boczną, działają jako receptory w interakcjach komórka-komórka i są celem dla patogenów i toksyn. Genetyczna dysregulacja biosyntezy gangliozydów u ludzi prowadzi do poważnych wrodzonych zaburzeń układu nerwowego. Ze względu na ich amfipatyczny charakter, ekstrakcja, oczyszczanie i analiza gangliozydów wymagają technik, które zostały zoptymalizowane przez wielu badaczy w ciągu 80 lat od ich odkrycia. W tym miejscu opisujemy laboratoryjne metody ekstrakcji, oczyszczania oraz wstępnych analiz jakościowych i ilościowych głównych gangliozydów z tkanek i komórek, które można wykonać w ciągu kilku godzin. Opisujemy również metody izolacji i oczyszczania głównych gatunków gangliozydów z mózgu na większą skalę. Łącznie metody te zapewniają analityczny i preparatywny dostęp do tej klasy cząsteczek bioaktywnych.

Wprowadzenie

Gangliozydy definiuje się jako glikosfingolipidy posiadające jedną lub więcej reszt kwasu sialowego1. Są one eksprymowane głównie na powierzchni komórki, przy czym ich hydrofobowa część lipidowa w postaci ceramidu jest osadzona w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej, a ich hydrofilowe glikany rozciągają się w przestrzeń zewnątrzkomórkową2. Choć występują powszechnie w komórkach i tkankach kręgowców, są szczególnie obficie reprezentowane w mózgu kręgowców3, gdzie zostały po raz pierwszy odkryte i nazwane4.

Struktury glikanów gangliozydów są zróżnicowane i stanowią podstawę ich nomenklatury (Rysunek 1). Glikany gangliozydów składają się z neutralnego rdzenia cukrowego, który posiada różną liczbę i rozmieszczenie kwasów sjalowych. Najmniejszy gangliozyd, GM4, posiada tylko dwa cukry (kwas sjalowy związany z galaktozą)5. Większe, naturalnie występujące gangliozydy mogą zawierać łącznie ponad tuzin cukrów6 lub do siedmiu kwasów sjalowych na jednym neutralnym rdzeniu7. Ich lipidowe części ceramidowe również są zróżnicowane, wykazując różną długość sfingozyny oraz różnorodność amidów kwasów tłuszczowych. W mózgu kręgowców przeważają cztery rodzaje gangliozydów: GM1, GD1a, GD1b i GT1b. Ekspresja gangliozydów jest regulowana rozwojowo, specyficzna dla tkanki oraz specyficzna dla typu komórek.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Główne gangliozydy mózgowe i ich prekursory biosyntetyczne. Struktury przedstawiono zgodnie z systemem Symbol Nomenclature for Glycans11. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Gangliozydy działają na poziomie molekularnym poprzez angażowanie i modulowanie białek w obrębie własnych błon (regulacja cis) lub poprzez angażowanie białek wiążących glikany w środowisku zewnątrzkomórkowym, w tym toksyn bakteryjnych oraz lektyn na innych komórkach (rozpoznawanie trans)3. Specyficzne wiązanie gangliozydów z białkami regulatorowymi i/lub samoorganizacja z innymi cząsteczkami w tratwy lipidowe prowadzi do zmian w zachowaniu komórek, które wpływają na strukturę i funkcję układu nerwowego, progresję nowotworów, metabolizm, stan zapalny, proteinopatie neuronalne oraz choroby zakaźne8. Ze względu na ich zróżnicowane role komórkowe, metody ich izolacji i analizy mogą dostarczyć pogłębionej wiedzy na temat regulacji procesów fizjologicznych i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiono zwalidowane metody szybkiej ekstrakcji i analizy w małej skali oraz izolację gangliozydów z mózgu w skali preparatywnej. Omówiono możliwości i wyzwania związane z zastosowaniem tych metod w odniesieniu do innych tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Pobieranie tkanek przeprowadzono zgodnie z warunkami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johns Hopkins.

1. Małoskalowa ekstrakcja i częściowe oczyszczanie gangliozydów

OSTROŻNIE: Podczas pracy z lotnymi i toksycznymi rozpuszczalnikami należy zapewnić odpowiednią wentylację. Należy unikać stosowania tworzyw sztucznych; rozpuszczalniki mogą wyekstrahować z wielu plastików składniki chemiczne, które zakłócają późniejsze analizy. Wyjątkiem jest politetrafluoroetylen (PTFE); do zamykania szklanych fiolek do przechowywania należy używać zakrętek wyłożonych PTFE.

  1. Ekstrakcja
    1. Zważyć pojedynczy świeży lub rozmrożony mózg mysi (lub połowę mózgu w przekroju strzałkowym, ~ 0,2-0,5 g) i umieścić w homogenizatorze Pottera-Elvehjema schłodzonym w naczyniu z lodem.
      UWAGA: Wcześniej zamrożone mózgi można wykorzystać po rozmrożeniu w temperaturze 0-4 °C.
    2. Dodać 4,1 mL wody na 1 g masy mokrej tkanki i homogenizować za pomocą 10 pociągnięć.
      UWAGA: Precyzyjne proporcje rozpuszczalników są kluczowe dla optymalnej ekstrakcji i rozdziału; celem jest uzyskanie stosunku chloroform-metanol-woda (4:8:3), zakładając, że tkanka mózgowa składa się w 80% z wody.
    3. Dodać 13 mL metanolu na 1 g masy mokrej tkanki, pozostawić do osiągnięcia temperatury otoczenia (22 °C) i wymieszać.
      ​UWAGA: Roztwór stanie się mętny. Dodanie metanolu na tym etapie, bez chloroformu, optymalizuje wytrącanie białek. Wszystkie kolejne kroki wykonuje się w temperaturze otoczenia (22 °C).
    4. Przenieść do grubościennej szklanej probówki z nakrętką z wkładką PTFE w temperaturze otoczenia (22 °C) i dokładnie wymieszać. Dodać 6,5 mL chloroformu na 1 g masy mokrej tkanki, zakręcić i dokładnie wymieszać. Wirować przy 450 x g przez 15 min. Przenieść klarowny supernatant do nowej probówki z nakrętką i zmierzyć jego objętość, tzw. „objętość odzyskanego ekstraktu”.
  2. Rozdział
    1. Dodać do klarownego supernatantu wodę w ilości 0,173x „objętości odzyskanego ekstraktu”, zakręcić, energicznie wymieszać w wortexie i wirować zgodnie z opisem w punkcie 1.1.4.
      UWAGA: Celem jest uzyskanie stosunku chloroform-metanol-woda 4:8:5,6. Mieszanina będzie mętna i rozdzieli się na dwie fazy: górną fazę bogatą w wodę oraz dolną fazę bogatą w chloroform w stosunku ok. 4:1. Odczekać 60 min lub wirować przy 450 x g przez 15 min do całkowitego rozdzielenia faz.
    2. Przenieść górną fazę, zawierającą gangliozydy, do nowej szklanej probówki z nakrętką z wkładką PTFE.
  3. Chromatografia na kolumnach przeciwprądowych (odwrócona faza)
    1. Używając szklanej strzykawki o objętości 5 mL, przemyć wkład SPE tC18 (400 mg) 3 mL metanolu, a następnie 3 mL mieszaniny chloroform-metanol-woda (2:43:55). Nanieść górną fazę z punktu 1.2.2 na wkład tC18 za pomocą tej samej szklanej strzykawki, zebrać effluent i nanieść go ponownie na kolumnę w celu optymalizacji adsorpcji.
    2. Używając szklanej strzykawki, przemyć wkład 3 mL mieszaniny chloroform-metanol-woda (2:43:55), a następnie 3 mL mieszaniny metanol-woda (1:1).
    3. Eluować gangliozydy 3 mL metanolu do nowej probówki z nakrętką. Odparować do sucha pod delikatnym strumieniem azotu w temperaturze ≤ 45 °C. Rozpuścić w metanolu w ilości 1 mL na 1 g pierwotnej masy mokrej tkanki.

2. Wielkoskalowa ekstrakcja i oczyszczanie gangliozydów

UWAGA: Podczas pracy z lotnymi rozpuszczalnikami należy używać blenderów w wykonaniu przeciwwybuchowym. Nie należy stosować tworzyw sztucznych z wyjątkiem PTFE. Tetrahydrofuran, chloroform i eter etylowy są toksycznymi lotnymi związkami organicznymi. Pracować w dygestorium, stosując rękawice ochronne i okulary ochronne.

  1. Ekstrakcja
    1. Rozmrozić zamrożony mózg bydlęcy w temperaturze 4 °C przez kilka godzin. Oddzielić szarą istotę od opon mózgowych i białej istoty.
      UWAGA: Poniższa procedura jest opisana dla 100 ± 20 g wyizolowanej szarej istoty mózgu i jest skalowalna.
    2. Umieścić 100 g szarej istoty mózgu w blenderze i dodać 1 mL na g mokrej masy mózgu schłodzonego 10 mM buforu fosforanowego potasu o pH 6,8. Homogenizować na niskich obrotach przez 20 s. Dodać 8 mL tetrahydrofuranu na g mokrej masy mózgu i homogenizować na niskich obrotach przez 10 s. Przelać do szklanych butelek do wirowania i wirować przy 5 000 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej (22 °C).
    3. Zebrać nadfiltr, zmierzyć jego objętość i przenieść do szklanego rozdzielacza. Dodać 0,3 mL eteru etylowego na 1 mL nadfiltru. Wstrząsnąć energicznie, a następnie pozostawić w spokoju na 30 min, aż oddzielą się dwie fazy: górna faza eterowa i dolna faza wodna. Zebrać dolną fazę, zawierającą gangliozydy, do szklanej butelki z nakrętką wyłożoną PTFE.
    4. Do górnej (eterowej) fazy pozostałej w rozdzielaczu dodać 0,1 mL wody na 1 mL pierwotnego nadfiltru (krok 2.1.3). Wstrząsnąć energicznie, pozwolić fazom się rozdzielić, zebrać dolną (wodną) fazę i połączyć z poprzednią dolną fazą. Odparować połączone fazy dolne do postaci suchego proszku i zważyć.
  2. Saponifikacja
    1. Do szczelnej probówki dodać 10 mL 100 mM wodnego NaOH na g proszku. Wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 h. Pozostawić do ostygnięcia i doprowadzić do pH 4,5 poprzez kroplowe dodawanie 100 mM wodnego HCl. Zmierzyć objętość i przenieść do szklanego rozdzielacza.
      UWAGA: Kwasy sialowe są labilne w środowisku kwasowym; należy unikać zakwaszania poniżej pH 4,5.
    2. W zależności od objętości wodnej dodać 2,67 objętości metanolu, delikatnie wymieszać, a następnie dodać 1,33 objętości chloroformu, aby utworzyć jednofazowy roztwór chloroform-metanol-woda (4:8:3). Dobrze wymieszać.
    3. W zależności od pierwotnej objętości wodnej dodać 2,6 objętości wody, aby doprowadzić mieszaninę chloroform-metanol-woda do stosunku 4:8:5,6. Wstrząsnąć energicznie, a następnie pozostawić w spokoju, aby oddzieliły się dwie fazy: polarna faza górna zawierająca gangliozydy i niepolarna faza dolna. Zebrać fazę górną do szklanej butelki z nakrętką wyłożoną PTFE.
      UWAGA: Lipidy niesjalilowane nie będą widoczne na płytkach do chromatografii cieczowej (TLC) barwionych rezorcynolem, ale pojawią się przy użyciu barwienia p-anisaldehydem. Celem tej saponifikacji jest usunięcie związków O-acetylowanych, takich jak fosfolipidy.
  3. Chromatografia w odwróconej fazie
    1. Wstępnie przemyć w dużej skali (10 g) wkład z ekstrakcji do fazy stałej tC18, przepuszczając przez kolumnę 50 mL każdego z trzech następujących rozpuszczalników za pomocą próżni lub ciśnienia (< 1 min na każde przemycie): metanol, metanol-woda (1:1), a następnie chloroform-metanol-woda (2:43:55). Nanieść fazę górną z kroku 2.2.3 na kolumnę za pomocą próżni lub ciśnienia, zebrać przepłuczynę, nanieść ponownie i zebrać przepłuczynę.
    2. Przemyć kolumnę 30 mL roztworu chloroform-metanol-woda (2:43:55), a następnie 30 mL metanol-woda (1:1), po czym eluować gangliozydy 50 mL metanolu, a następnie ponownie 10 mL metanolu, zbierając każde przemycie i każdą elucję oddzielnie. Za pomocą TLC (poniżej) potwierdzić, że gangliozydy nie występują w przepłuczynie i przemyciach, lecz są eluowane w pierwszej elucji (50 mL metanolu). Odparować eluowane gangliozydy do postaci suchego proszku i zważyć.
      UWAGA: Celem chromatografii tC18 jest oddzielenie gangliozydów od zanieczyszczeń mniej i bardziej polarnych. Wydajność mieszanych gangliozydów mózgu po saponifikacji wynosi ~ 120 mg na g suchego ekstraktu z mózgu (krok 2.1.4). Pojawienie się gangliozydów w przepłuczynie lub przemyciach w analizie TLC wskazuje na nasycenie kolumny do ekstrakcji w fazie stałej. Po elucji metanolem kolumnę można dalej eluować chloroformem i metanolem (1:1), aby wychwycić lipidy mniej polarne.
  4. Oczyszczanie poszczególnych gangliozydów metodą HPLC
    1. Przygotować rozpuszczalnik HPLC A: acetonitryl-5 mM wodny bufor fosforan sodu pH 5,6 (83:17) oraz rozpuszczalnik B: acetonitryl-20 mM bufor fosforan sodu, pH 5,6 (1:1). Odgazować oba rozpuszczalniki przez 5 min.
    2. Wstępnie wyrównać kolumnę HPLC (kolumna 20 x 250 mm wypełniona sferami krzemionkowymi z wiązaniami aminowymi (NH2), średnica 5 µm, rozmiar porów 100 Å) 100% rozpuszczalnika A przez 20 min przy przepływie 5 mL/min. Ustawić detektor UV effluentu kolumny HPLC na 215 nm.
    3. Rozpuścić proszek gangliozydowy z eluatu z fazy odwróconej w wodzie w stężeniu 5 mg/mL. Wstrzyknąć 0,5 mL mieszaniny gangliozydów do HPLC i przeprowadzić gradient rozpuszczalnika (Tabela 1) przy 5 mL/min, zbierając frakcje. Gangliozydy pojawią się jako piki A215 z czasami retencji (główne gangliozydy mózgu) od 25 do 70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Po każdym przebiegu ponownie wyrównać kolumnę przez 20 min rozpuszczalnikiem A. Analizować frakcje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.
Czas (min)%A%B
01000
71000
126337
825446
82.010100
920100

Tabela 1: Gradient rozpuszczalnika dla HPLC.

3. Analiza gangliozydów za pomocą cienkowarstwowej chromatografii (TLC)

OSTRZEŻENIE: Chloroform jest toksycznym, lotnym związkiem organicznym. Pracuj pod wyciągiem laboratoryjnym, używając rękawic ochronnych i okularów ochronnych.

  1. Przygotowanie układu rozwijającego i płytek TLC
    1. Przygotować układ rozwijający składający się z chloroformu, metanolu i 0,25% KCl w wodzie (60:35:8 obj.). Wlać go do szklanej komory TLC o wymiarach 10 cm x 10 cm z pokrywą ze stali nierdzewnej tak, aby głębokość rozpuszczalnika wynosiła ~ 0,5 cm. Przykryć i pozostawić do wyrównania w miejscu wolnym od przeciągów przez >10 min.
      UWAGA: Aby odizolować komorę TLC od przeciągów, można zbudować lub kupić akrylowe pudełko zamknięte z pięciu stron  (Rysunek 2). Wewnątrz komory nie należy stosować nasyconego rozpuszczalnikiem papieru filtracyjnego.
    2. Umieścić wysokowydajną płytkę TLC z żelem krzemionkowym na szklanym podłożu o wymiarach 10 cm x 10 cm lub 5 cm x 10 cm w suszarce w temperaturze 125 °C na 10 min. Pozostawić do ostygnięcia. Za pomocą tępego ołówka nr 2 narysować linie nakładania próbek o długości 5 mm z odstępami 2 mm wzdłuż linii znajdującej się 1 cm nad dolną krawędzią płytki i co najmniej 1 cm od każdej z krawędzi bocznych (Rysunek 3). Podczas zaznaczania należy unikać uszkadzania warstwy krzemionki.
    3. Przygotować standardową mieszaninę czystych gangliozydów w metanolu zawierającą 100 µM GM1, po 50 µM GD1a i GD1b oraz 33 µM GT1b.
      UWAGA: Mieszanina ta zawiera po 100 pmol kwasu sialowego gangliozydów na µL dla każdego z czterech gangliozydów, co zapewnia silny sygnał kolorymetryczny podczas barwienia rezorcynolem, które jest zależne od obecności kwasu sialowego.
  2. Rozdzielanie gangliozydów
    1. Przepłukać strzykawkę Hamiltona o pojemności 10 µL z ściętą igłą metanolem. Nabrać 1 µL metanolu do szklanej strzykawki, aby wypełnić martwą przestrzeń igły, a następnie 1 µL próbki lub standardu. Równomiernie nanieść próbkę na wcześniej zaznaczone linie 5-mm, aż w strzykawce pozostanie <1 µL rozpuszczalnika (metanolu). Po naniesieniu wszystkich próbek pozostawić płytkę do wyschnięcia w temperaturze otoczenia (22 °C).
      UWAGA: Między nakładaniem poszczególnych próbek należy przepłukać strzykawkę metanolem. Do przyspieszenia suszenia można użyć niepodgrzewanego nawiewu powietrza ustawionego na niską moc.
    2. Umieścić naniesioną i wysuszoną płytkę w uprzednio wyrównanej komorze TLC tak, aby dolna krawędź była zanurzona w układzie rozwijającym; następnie przykryć i chronić przed przeciągami (Rysunek 2). Pozostawić rozpuszczalnik do przesunięcia się w górę płytki drogą kapilarną, aż czoło rozpuszczalnika dotrze na odległość 1 cm od górnej krawędzi płytki. Wyjąć płytkę i zaznaczyć ołówkiem linię czoła rozpuszczalnika na krawędzi. Pozostawić rozpuszczalniki do całkowitego odparowania, bez ingerencji lub pod wpływem łagodnego strumienia powietrza.

figure-protocol-1
Rycina 2: Wyposażenie i konfiguracja TLC gangliozydów. Komora z podwójną korytkiem jest wypełniona rozpuszczalnikiem ruchomym do poziomu ≈ 0.5 cm po obu stronach. Płytkę umieszcza się przy jednej ściance, tak aby koniec z linią startową był zanurzony w buforze ruchomym. Komora jest przykryta akrylowym pudełkiem, aby uniknąć prądów powietrza. Panel A, widok z boku przed włożeniem płytki. Poziom rozpuszczalnika jest widoczny kilka mm nad dnem komory; Panel B, widok z przodu podczas rozwijania. Front rozpuszczalnika jest widoczny na wysokości około 40% płytki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

  1. Barwienie gangliozydów
    UWAGA: Odczynniki barwiące są toksyczne. Kwas solny jest żrący i toksyczny. Przygotowywanie i rozpylanie odczynników należy przeprowadzać w dygestorium, stosując rękawice ochronne i gogle bezpieczeństwa.
    UWAGA: Płytkę można poddać obrazowaniu do jakościowej analizy obrazu lub przechowywać, zdejmując zaciski i mocując płytkę przykrywkową za pomocą przezroczystej taśmy. Analizę ilościową można przeprowadzić, mierząc densytometrię wzorców gangliozydów naniesionych w sąsiednich ścieżkach.
    1. Przygotować odczynnik do rozpylania z rezorcynolem do detekcji gangliozydów na podstawie ich kwasów sialowych. Rozpuścić 6 g rezorcynolu w 100 mL wody, aby uzyskać 6% roztwór stokowy rezorcynolu. Rozpuścić 1 g CuSO4 w 100 mL wody, aby przygotować 1% roztwór stokowy. Do 64,7 mL wody dodać 5 mL 6% roztworu stokowego rezorcynolu, 0,31 mL 1% roztworu stokowego CuSO4, następnie powoli dodać 30 mL stężonego HCl i delikatnie wymieszać. Roztwór może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez miesiąc.
    2. W dygestorium chemicznym umieścić płytkę TLC z rozdzielonymi gangliozydami (końcem startowym do góry) w wyciętym pudełku tekturowym, aby chronić ściany dygestorium przed rozpylonym kwasem. Odczynnik z rezorcynolem przelać do szklanego rozpylacza do TLC, podłączyć do źródła sprężonego azotu i lekko rozpylić na płytkę po przekątnej w kierunkach pionowym i poziomnym. Powierzchnię sorbentu TLC należy rozpylać równomiernie, lecz delikatnie.
    3. Płytkę natychmiast przykryć czystą, suchą szklaną płytką przykrywkową o tych samych wymiarach i zamocować ją za pomocą zacisków biurowych (Rycina 3). Przykrytą płytkę ogrzewać w temperaturze 125 °C przez 20 min. Gangliozydy pojawią się w ciemnofioletowym kolorze na białym tle.
      UWAGA: Po zakończeniu rozpylania płytka nie powinna wyglądać na mokrą. Płytki przykrywkowe można wykonać, zdrapując sorbent z wcześniej używanych płytek TLC za pomocą jednokrawędziowej żyletki.
      UWAGA: Pył krzemionkowy jest toksyczny dla płuc. Należy używać maski i utylizować krzemionkę w szczelnym pojemniku.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Płytka TLC z rozdziałem mieszanych gangliozydów. Płytka TLC z rozdziałem standardów mieszanych gangliozydów (lewy pas) oraz oczyszczonych mieszanych gangliozydów z szarej substancji mózgowej bydlęcej (prawy pas) po barwieniu rezorcynolem i podgrzewaniu z przypiętą szklaną płytką przykryciową. Standardowe gangliozydy (od góry do dołu) to GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b i GQ1b. Po ostygnięciu płytkę można sfotografować i/lub przymocować płytkę przykryciową taśmą w celu przechowywania. Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

  1. Ogólne barwienie lipidów w celu wykrycia gangliozydów i fosfolipidów.
    ​OSTROŻNIE: Kwas siarkowy jest toksyczny i żrący. Dodawanie stężonego kwasu do etanolu jest procesem egzotermicznym i musi być przeprowadzane powoli. Odczynnik barwiący należy przygotowywać w dygestorium, stosując rękawice ochronne i gogle bezpieczeństwa.
    1. Przygotuj pbarwienie p-anisaldehydem poprzez powolne dodanie 15 ml stężonego kwasu siarkowego do 500 ml etanolu. Mieszać przez 30 min, aby roztwór ostygł przed kontynuacją. Dodać 15 ml p-anizaldehyd i delikatnie wymieszać. Można przechowywać w temperaturze pokojowej (22 °C) do sześciu miesięcy.
    2. W dygestorium zanurzyć płytkę TLC z rozdzielonymi gangliozydami, zaczynając od linii startu w dół, do zlewki zawierającej pbarwienie p-anisaldehydem. Zanurzyć czoło przemieszczenia na ≥ 2 s. Wyjąć płytkę TLC z barwnika i pozwolić jej odcieknąć. Podgrzać płytkę TLC na płycie grzejnej w niskiej temperaturze w celu wywołania barwienia.
      UWAGA: Lipidy będą widoczne jako ciemne obszary na fioletowym tle. Roztwór barwiący można odzyskać do ponownego użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metody opisane w sekcji 1 (skala mikro) pozwalają na otrzymanie gangliozydów w ilości i czystości wystarczającej do jakościowego i ilościowego oznaczenia głównych gangliozydów mózgowych. Odzysk z mózgu mysiego wynosi ~ 1 µmol gangliozydu na g mokrej masy mózgu (1 nmol/µL), gdy są one przygotowane zgodnie z opisem. Rozdzielczość TLC dla 1 µL (1 nmol) z zastosowaniem sekcji 3 dostarcza wystarczającej ilości materiału do detekcji rezorcynolem i rozdziela wszystkie główne gangliozydy mózgowe, co pokazano dla myszy typu dziki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj metody ekstrakcji i izolacji gangliozydów na małą i dużą skalę nie są unikalne - istnieje wiele różnych podejść do ekstrakcji i oczyszczania rozpuszczalnikiem, które zapewniają doskonałe wyniki12. Opisane tutaj metody oczyszczania mózgu na małą skalę, opracowane przez Fredmana i Svennerholma13, wykazały, że optymalizują regenerację i okazały się solidne i proste przez wiele lat w naszym laboratorium. Izolację i oczyszczanie odpowiednie dla TLC i SM można łatwo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy twierdzą, że nie ma sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience U01CA241953. MJP był wspierany przez Chemistry-Biology Interface Program na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa (T32GM080189).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mózg bydlęcy, pozbawionyPelFreez57105-1
Wzorce gangliozydoweMatreyaGM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063
Szklana butelka z nakrętką wyłożoną PTFEFisher Scientific02-911-739
Szklana butelka wirówkowaFisher Scientific05-586B
Szklane probówki hodowlane, 16 x 125 mmVWR60825-430do zbierania frakcji HPLC
Szklany lejek separacyjny (2 L)Pyrex6400-2L
Strzykawka iniekcyjna - Hamilton 1750 gazoszczelne 500 i mikro; lHamilton81265
p-Aldehyd anusowy, 98%Sigma-Aldrich  A88107
Homogenizator Potter-ElvhjemFisher Scientific08-414-14AWybierz odpowiednią opcję objętości
Reprosil 100 NH2 10µ m Kolumny ochronne 5x4mmAnalytics-ShopAAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μ m, 250 mm x 20 mm Kolumna HPLCAnalytics-Shoppakowane na zamówieniedostępne inne rozmiary
RezorcinolSigma-Aldrich30752-1
Parownik obrotowyBuchiR-300
Pętla próbki do wtryskiwacza model 7725 (5 ml)Sigma-Aldrich57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)WodyWAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Krótki wkład, 400 mgwodyWAT036810
strzykawka do plam - Hamilton 701N 10 µ lHamilton80300
Grubościenne probówki o średnicy 13 mm z nakrętkami wyłożonymi PFTEFisher Scientific14-933A
Gwintowane fiolki 2 ml z nakrętkami wyłożonymi PFTEFisher Scientific14-955-323Do przechowywania gangliozydów
Płytki TLC, HPTLC Żel krzemionkowy 60 F254 MultiformatFisher ScientificM1056350001Impregnacja fluorescencyjna (F254) stabilizuje sorbent powierzchniowy
odczynnik TLCFisher Scientific05-723-26A
Komora jezdna TLC do płytek 10 x 10 cmCamag22.5155
Waring 1-litrowy blender przeciwwybuchowy ze stali nierdzewnejWaringE8520

Bibliografia

  1. Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
  2. DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces. Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).
  3. Schnaar, R. L. Gangliosides of the vertebrate nervous system. Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).
  4. Klenk, E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).
  5. Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells. Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).
  6. Nimrichter, L., et al. E-selectin receptors on human leukocytes. Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).
  7. Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).
  8. Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).
  9. Sturgill, E. R., et al. Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b. Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).
  10. Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy. Cells. 9 (3), (2020).
  11. Varki, A., et al. Symbol nomenclature for graphical representations of glycans. Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).
  12. Schnaar, R. L. Isolation of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).
  13. Svennerholm, L., Fredman, P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).
  14. Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).
  15. Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures. Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).
  16. Schnaar, R. L., Needham, L. K. Thin-layer chromatography of glycosphingolipids. Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).
  17. Ledeen, R. W., Yu, R. K. Gangliosides: structure, isolation, and analysis. Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).
  18. Lopez, P. H., et al. Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance. Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie gangliozyd wprofilowanie gangliozyd wchromatografia cienkowarstwowaekstrakcja do fazy sta ejgangliozydy m zgowebarwienie lipid wmetoda zmydlaniarozdzielczo HPLCanaliza spektrometryczna mas
Ekstrakcja, oczyszczanie i profilowanie gangliozydów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.