Ekstrakcja, oczyszczanie i profilowanie gangliozydów

Podsumowanie

Gangliozydy to glikosfingolipidy zawierające kwas sjalowy, których szczególnie dużo występuje w mózgu. Ich amfipatyczny charakter wymaga technik ekstrakcji i oczyszczania organicznego/wodnego, aby zapewnić optymalny odzysk i dokładne analizy. Ten artykuł zawiera omówienie ekstrakcji gangliozydów w skali analitycznej i preparatywnej, oczyszczania i analizy chromatografii cienkowarstwowej.

Streszczenie

Gangliozydy to glikosfingolipidy, które zawierają jedną lub więcej reszt kwasu sjalowego. Znajdują się one we wszystkich komórkach i tkankach kręgowców, ale szczególnie obfite występują w mózgu. Ulegające ekspresji głównie na zewnętrznej ulotce błon plazmatycznych komórek, modulują aktywność białek powierzchniowych komórek poprzez asocjację boczną, działają jako receptory w interakcjach komórka-komórka i są celem dla patogenów i toksyn. Genetyczna dysregulacja biosyntezy gangliozydów u ludzi prowadzi do poważnych wrodzonych zaburzeń układu nerwowego. Ze względu na ich amfipatyczny charakter, ekstrakcja, oczyszczanie i analiza gangliozydów wymagają technik, które zostały zoptymalizowane przez wielu badaczy w ciągu 80 lat od ich odkrycia. W tym miejscu opisujemy laboratoryjne metody ekstrakcji, oczyszczania oraz wstępnych analiz jakościowych i ilościowych głównych gangliozydów z tkanek i komórek, które można wykonać w ciągu kilku godzin. Opisujemy również metody izolacji i oczyszczania głównych gatunków gangliozydów z mózgu na większą skalę. Łącznie metody te zapewniają analityczny i preparatywny dostęp do tej klasy cząsteczek bioaktywnych.

Wprowadzenie

Gangliozydy są zdefiniowane jako glikosfingolipidy zawierające jedną lub więcej reszt kwasu sjalowego¹. Są one wyrażane głównie na powierzchni komórki za pomocą hydrofobowego ugrupowania lipidowego ceramidów osadzonego w zewnętrznej płatku błony plazmatycznej i ich hydrofilowych glikanów rozciągających się do przestrzeni zewnątrzkomórkowej². Chociaż są szeroko rozpowszechnione w komórkach i tkankach kręgowców, są szczególnie obfite w mózgu kręgowców ³, gdzie zostały po raz pierwszy odkryte i nazwane⁴.

Struktura glikanów gangliozydowych różni się i stanowi podstawę ich nomenklatury (Rysunek 1). Glikany gangliozydowe składają się z obojętnego rdzenia cukrowego o różnej liczbie i rozmieszczeniu kwasów sjalowych. Najmniejszy gangliozyd, GM4, ma tylko dwa cukry (kwas sjalowy związany z galaktozą)⁵. Większe, naturalnie występujące gangliozydy mogą zawierać znacznie więcej niż tuzin cukrów ogółem⁶ lub do siedmiu kwasów sjalowych na jednym neutralnym rdzeniu⁷. Ich ugrupowania lipidowe ceramidów również się różnią, mają różną długość sfingozyny i różne amidy kwasów tłuszczowych. W mózgu kręgowców przeważają cztery gatunki gangliozydów: GM1, GD1a, GD1b i GT1b. Ekspresja gangliozydów jest regulowana rozwojowo, specyficzna dla tkanki i typu komórki.

Rysunek 1: Główne gangliozydy mózgowe i ich biosyntetyczne prekursory. Struktury są wyświetlane przy użyciu nomenklatury symboli dla glikanów¹¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Gangliozydy funkcjonują na poziomie molekularnym poprzez angażowanie i modulowanie białek w ich własnych błonach (regulacja cis) lub poprzez angażowanie białek wiążących glikany w środowisku zewnątrzkomórkowym, w tym toksyn bakteryjnych i lektyn na innych komórkach (rozpoznawanie trans)³. Specyficzne wiązanie gangliozydów z białkami regulatorowymi i/lub samoasocjacja z innymi cząsteczkami w tratwy lipidowe powoduje zmiany w zachowaniu komórek, które wpływają na strukturę i funkcję układu nerwowego, progresję raka, metabolizm, stan zapalny, proteinopatie neuronalne i choroby zakaźne⁸. Ze względu na ich różnorodne role komórkowe, metody ich izolacji i analizy mogą zapewnić lepszy wgląd w regulację procesów fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu przedstawiono sprawdzone metody szybkiej ekstrakcji i analizy na małą skalę oraz preparatywnej izolacji gangliozydów z mózgu. Omówiono możliwości i wyzwania związane z zastosowaniem do innych tkanek.

Protokół

Pobieranie tkanek zostało przeprowadzone na warunkach zatwierdzonych przez Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.

1. Ekstrakcja gangliozydów na małą skalę i częściowe oczyszczanie

UWAGA: Używaj odpowiedniej wentylacji podczas pracy z lotnymi i toksycznymi rozpuszczalnikami. Unikaj plastiku przez cały czas; Rozpuszczalniki będą wydobywać składniki chemiczne z wielu tworzyw sztucznych, które zakłócają późniejsze analizy. Politetrafluoroetylen (PTFE) jest wyjątkiem; Do zakręcania szklanych fiolek do przechowywania należy używać zakrętek wyłożonych PTFE.

1. wydobywanie
   1. Zważyć pojedynczy świeży lub rozmrożony mózg myszy (lub strzałkowy półmózg, ~ 0,2-0,5 g) i umieścić w homogenizatorze Potter-Elvehjem wstępnie schłodzonym w wiadrze z lodem.
      UWAGA: Wcześniej zamrożone mózgi można wykorzystać po rozmrożeniu w temperaturze 0-4 °C.
   2. Dodać 4,1 ml na g mokrej masy tkanki wody i homogenizować za pomocą 10 pociągnięć.
      UWAGA: Dokładne proporcje rozpuszczalników są kluczem do optymalnej ekstrakcji i podziału, celem jest chloroform-metanol-wodny (4:8:3), zakładając, że tkanka mózgowa jest w 80% wodnista.
   3. Dodać 13 ml na g mokrej masy tkanki metanolu, zmienić temperaturę na temperaturę otoczenia (22 °C) i wymieszać.
      UWAGA: Roztwór będzie wyglądał na mętny. Dodanie metanolu na tym etapie, bez chloroformu, optymalizuje wytrącanie białek. Wszystkie kolejne kroki odbywają się w temperaturze otoczenia (22 °C).
   4. Przenieść do grubościennej szklanej rurki z nakrętką wyłożoną PTFE w temperaturze otoczenia (22 °C) i dokładnie wymieszać. Dodać 6,5 ml na g mokrej masy tkanki chloroformu, nakrętkę i dokładnie wymieszać. Wirować przy 450 x g przez 15 min. Przenieść klarowny supernatant do świeżej probówki z nakrętką i zmierzyć objętość, "objętość odzyskanego ekstraktu".
2. partycja
   1. Dodać 0,173x "odzyskaną objętość ekstraktu" wody do klarownego supernatantu, zakryć, energicznie odwirować i odwirować zgodnie z opisem w kroku 1.1.4.
      UWAGA: Celem jest uzyskanie chloroformu-metanolu-wodnego w stosunku 4:8:5,6. Mieszanina będzie mętna i rozpadnie się na dwie fazy: górną fazę bogatą w wodę i dolną fazę bogatą w chloroform w stosunku ~ 4:1. Odczekaj 60 minut lub odwiruj przy 450 x g przez 15 minut, aby całkowicie oddzielić fazy.
   2. Przenieś górną fazę, która zawiera gangliozydy, do świeżej szklanej rurki z nakrętką wyłożoną PTFE.
3. Chromatografia kartridżowa z odwróconymi fazami
   1. Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 5 ml umyć wkład ekstrakcyjny tC18 do fazy stałej (400 mg) 3 ml metanolu, a następnie 3 ml chloroformu, metanolu i wody (2:43:55). Załaduj górną fazę z kroku 1.2.2 na wkład tC18 za pomocą tej samej szklanej strzykawki, zbierz przepływ i ponownie załaduj go do kolumny, aby zoptymalizować adsorpcję.
   2. Za pomocą szklanej strzykawki przemyć wkład 3 ml chloroformu-metanolu-wody (2:43:55), a następnie 3 ml metanolu-wody (1:1).
   3. Usunąć gangliozydy za pomocą 3 ml metanolu do świeżej zakręcanej probówki. Odparować do sucha pod delikatnym strumieniem azotu w temperaturze ≤ 45 °C. Rozpuścić w metanolu w ilości 1 ml na g pierwotnej mokrej masy tkanki.

2. Ekstrakcja i oczyszczanie gangliozydów na dużą skalę

UWAGA: Podczas pracy z lotnymi rozpuszczalnikami, używaj mieszadeł odpornych na wybuch. Nie używaj tworzyw sztucznych z wyjątkiem PTFE. Tetrahydrofuran, chloroform i eter etylowy są toksycznymi lotnymi związkami organicznymi. Pracować pod wyciągiem z rękawicami ochronnymi i okularami ochronnymi.

1. wydobywanie
   1. Zamrożony móżdżek bydlęcy rozmrażać w temperaturze 4 °C przez kilka godzin. Wypreparuj istotę szarą z opon mózgowych i istoty białej.
      UWAGA: Poniższa procedura jest opisana dla 100 ± 20 g izolowanej istoty szarej mózgu i jest skalowalna.
   2. Umieścić 100 g istoty szarej mózgu w blenderze i dodać 1 ml na g mokrej masy mózgu schłodzonego 10 mM buforu fosforanu potasu o pH 6,8. Homogenizować na niskim poziomie przez 20 s. Dodaj 8 ml tetrahydrofuranu na g mokrej masy mózgu i homogenizuj na małym ogniu przez 10 sekund. Przelać do szklanych butelek wirówkowych i odwirować przy 5 000 x g przez 15 minut w temperaturze otoczenia (22 °C).
   3. Zebrać supernatant, zmierzyć jego objętość i przenieść do szklanego lejka rozdzielającego. Dodać 0,3 ml eteru etylowego na ml supernatantu. Wstrząśnij energicznie, a następnie pozostaw na 30 minut, podczas których rozdzielają się dwie fazy, górna faza eterowa i dolna faza wodna. Zbierz dolną fazę, która zawiera gangliozydy, do szklanej butelki z nakrętką wyłożoną PTFE.
   4. Do górnej fazy (eteru) pozostałej w rozdzielaczu dodać 0,1 ml wody na ml oryginalnego supernatantu (krok 2.1.3). Wstrząśnij energicznie, poczekaj, aż fazy się rozdzielą, zbierz dolną (wodną) fazę i połącz z poprzednią dolną fazą. Odparować połączone dolne fazy na suchy proszek i zważyć.
2. zmydlanie
   1. Dodać 10 ml 100 mM wodnego roztworu NaOH na g proszku do szczelnie zamkniętej probówki. Wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Pozostawić do ostygnięcia i dostosować do pH 4,5 przez kroplowe dodawanie 100 mM wodnego roztworu HCl. Zmierzyć objętość i przenieść do szklanego lejka separatora.
      UWAGA: Kwasy sjalowe są kwasotrwałe; unikać zakwaszania poniżej pH 4,5.
   2. W oparciu o objętość roztworu wodnego dodać 2,67 objętości metanolu, delikatnie wymieszać, a następnie dodać 1,33 objętości chloroformu, aby uzyskać jednofazowy roztwór chloroformu-metanolu-wodnego roztworu (4:8:3). Dobrze wymieszaj.
   3. W oparciu o pierwotną objętość roztworu wodnego dodać 2,6 objętości wody, aby doprowadzić mieszaninę do stanu chloroform-metanol-wodny w stosunku 4:8:5,6. Wstrząśnij energicznie, a następnie pozostaw w spokoju, aby oddzielić dwie fazy, polarną górną fazę zawierającą gangliozydy i niepolarną dolną fazę. Zbierz górną fazę do szklanej butelki z nakrętką wyłożoną PTFE.
      UWAGA: Niesjalizowane lipidy nie pojawią się na płytkach chromatografii cienkowarstwowej (TLC) barwionych przy użyciu rezorcyny, ale pojawią się przy użyciu barwienia aldehydem p-aniszowym. Celem tego zmydlania jest usunięcie związków O-acetylowanych, takich jak fosfolipidy.
3. Chromatografia z odwróconymi fazami
   1. Umyć wstępnie duży (10 g) wkład do ekstrakcji tC18 do fazy stałej, przepuszczając 50 ml każdego z następujących trzech rozpuszczalników przez kolumnę za pomocą podciśnienia lub ciśnienia (<1 min każde płukanie): metanol, metanol-woda (1:1), a następnie chloroform-metanol-woda (2:43:55). Załaduj górną fazę z kroku 2.2.3 na kolumnę za pomocą podciśnienia lub ciśnienia, zbierz przepływ, ponownie załaduj i zbierz przepływ.
   2. Przemyć kolumnę 30 ml chloroformu-metanolu-wody (2:43:55), następnie 30 ml metanolu-wody (1:1), następnie wymyć gangliozydy 50 ml metanolu i ponownie 10 ml metanolu, zbierając oddzielnie każde przepłukanie i każdą elucję. Stosując TLC (poniżej) potwierdzić, że gangliozyd jest nieobecny w przepływie i przemywa się i eluuje w pierwszej elucji (50 ml metanolu). Odparować eluowane gangliozydy na suchy proszek i zważyć.
      UWAGA: Celem chromatografii tC18 jest oddzielenie gangliozydów zarówno od mniejszych, jak i bardziej polarnych zanieczyszczeń. Wydajność mieszanych gangliozydów mózgowych po zmydleniu wynosi ~ 120 mg na g suchego ekstraktu z mózgu (krok 2.1.4). Pojawienie się gangliozydów przez TLC w przepływie lub płukaniu wskazuje, że kolumna ekstrakcyjna do fazy stałej była nasycona. Po elucji metanolu kolumna może być dalej eluowana chloroformem-metanolem (1:1) w celu wychwycenia mniej polarnych lipidów.
4. Oczyszczanie HPLC poszczególnych gangliozydów
   1. Przygotować HPLC Rozpuszczalnik A: acetonitryl-5 mM wodny bufor fosforanu sodu o pH 5,6 (83:17) i rozpuszczalnik B: acetonitryl-20 mM bufor fosforanu sodu, pH 5,6 (1:1). Odgazować oba rozpuszczalniki przez 5 minut.
   2. Wstępnie zrównoważyć kolumnę HPLC (kolumna 20 x 250 mm wypełniona kulkami krzemionkowymi związanymi aminami (NH₂), o średnicy 5 μm, wielkości porów 100 A) ze 100% rozpuszczalnikiem A przez 20 minut przy 5 ml / min. Ustawić detektor ścieków kolumny UV HPLC na 215 nm.
   3. Rozpuścić proszek gangliozydu z eluatu fazy odwrotnej w wodzie o stężeniu 5 mg/ml. Wstrzyknąć 0,5 ml mieszaniny gangliozydów do HPLC i uruchomić gradient rozpuszczalnika (Tabela 1) z prędkością 5 ml/min, zbierając frakcje. Gangliozydy pojawią się jako piki A₂₁₅ z czasami retencji (główne gangliozydy mózgu) 25-70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Ponownie zrównoważyć 20 minut rozpuszczalnikiem A po każdym przebiegu. Analiza frakcji metodą chromatografii cienkowarstwowej.

szt. szt. szt. szt.

Czas (min)	%A	%B
0	100	0
7	100	0
12	Rozdział 63	37
Rozdział 82	54 Rozdział 54	Rozdział 46
82.01	0	100
Rozdział 92	0	100

Tabela 1: Gradient rozpuszczalnika dla HPLC.

3. Analiza gangliozydów metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)

UWAGA: Chloroform jest toksycznym lotnym związkiem organicznym. Pracować pod wyciągiem z rękawicami ochronnymi i okularami ochronnymi.

1. Przygotowanie rozpuszczalnika i płytki TLC
   1. Przygotować bieżący rozpuszczalnik chloroformu, metanolu o stężeniu 0,25% KCl (60:35:8 objętościowo). Wlać do szklanej studzienki TLC o wymiarach 10 cm x 10 cm z pokrywą ze stali nierdzewnej tak, aby głębokość rozpuszczalnika wynosiła ~ 0,5 cm. Przykryć i pozostawić do zrównoważenia w miejscu wolnym od prądów powietrza przez >10 min.
      UWAGA: Aby odizolować komorę TLC od prądów powietrza, można zbudować lub zakupić akrylowe 5-stronne pudełko ( Rysunek 2). Nie używaj bibuły filtracyjnej nasączonej rozpuszczalnikiem wewnątrz komory.
   2. Umieścić wysokowydajną płytkę TLC o wymiarach 10 cm x 10 cm lub 5 cm x 10 cm, pokrytą żelem krzemionkowym, w suszarce w temperaturze 125 °C na 10 minut. Pozostawić do ostygnięcia. Użyj stępionego ołówka #2, aby narysować 5-milimetrowe linie punktowe z 2-milimetrowymi odstępami wzdłuż linii 1 cm nad dnem płytki i co najmniej 1 cm z każdej strony (Rysunek 3). Unikaj naruszania warstwy krzemionki podczas znakowania.
   3. Przygotować wzorcową mieszaninę czystych gangliozydów w metanolu zawierającą 100 μM GM1, po 50 μM GD1a i GD1b oraz 33 μM GT1b.
      UWAGA: Ta mieszanina zawiera 100 pmol gangliozydu kwasu sjalowego na μl dla każdego z czterech gangliozydów, ilość, która zapewnia silny sygnał kolorymetryczny poprzez barwienie rezorcyną, które jest zależne od kwasu sjalowego.
2. Rozdzielczość gangliozydów
   1. Umyj 10-μl strzykawkę Hamiltona za pomocą skośnej igły z metanolem. Pobrać 1 μl metanolu do szklanej strzykawki w celu napełnienia martwej objętości igły, a następnie 1 μl próbki lub wzorca. Umieścić próbkę równomiernie na zaznaczonych liniach o średnicy 5 mm, aż w strzykawce pozostanie <1 μl rozpuszczalnika (metanolu). Pozostawić płytkę do wyschnięcia w temperaturze otoczenia (22 °C) po wykryciu wszystkich próbek.
      UWAGA: Umyć strzykawkę metanolem między załadowaniem próbki. Nieogrzewana dmuchawa powietrza ustawiona na niskim poziomie może być użyta do przyspieszenia suszenia.
   2. Umieść nakrapianą i wysuszoną płytkę w komorze TLC ze wstępnie zrównoważoną krawędzią zanurzoną w działającym rozpuszczalniku, przykryj i chroń przed prądami powietrza (Rysunek 2). Pozwól, aby płynący rozpuszczalnik przesuwał się w górę płytki poprzez działanie kapilarne, aż czoło rozpuszczalnika znajdzie się w odległości 1 cm od górnej części płytki. Usunąć ołówkiem czoło rozpuszczalnika na krawędzi płytki i oznaczyć go wodą. Pozwól, aby rozpuszczalniki całkowicie odparowały, bez zakłóceń lub pod łagodnym przepływem powietrza.

Rysunek 2: Sprzęt do TLC z gangliozydem i konfiguracja. Podwójna komora rynnowa jest wypełniona po obu stronach do ≈ 0,5 cm bieżącym rozpuszczalnikiem. Płytkę umieszcza się z jednej strony, a koniec początkowy jest zanurzony w pracującym buforze. Komora pokryta jest akrylową skrzynką, aby uniknąć prądów powietrza. Panel A, widok z boku przed włożeniem blachy. Poziom rozpuszczalnika jest widoczny kilka mm powyżej dna komory; Panel B, widok z przodu podczas projektowania. Czoło rozpuszczalnika jest widoczne w około 40% wysokości płytki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Barwienie gangliozydowe
   UWAGA: Plamy odczynników są toksyczne. Kwas solny jest i toksyczny. Przygotuj i rozpyl odczynniki w dygestoriach z rękawicami ochronnymi i okularami ochronnymi.
   UWAGA: Płytkę można obrazować w celu jakościowej analizy obrazu lub przechowywać po zdjęciu zacisków i zabezpieczeniu pokrywy na miejscu przezroczystą taśmą. Analizę ilościową można przeprowadzić, mierząc densytometrię wzorców gangliozydów wykrytych na sąsiednich pasach ruchu.
   1. Przygotuj odczynnik w sprayu rezorcyny do wykrywania gangliozydów na podstawie ich kwasów sjalowych. Rozpuścić 6 g rezorcyny w 100 ml wody, aby uzyskać 6% zapas rezorcyny. Rozpuść 1 g CuSO₄ w 100 ml wody, aby uzyskać 1% bulionu. Do 64,7 ml wody dodaj 5 ml 6% bulionu rezorcyny, 0,31 ml 1% bulionu CuSO₄, a następnie powoli dodaj 30 ml stężonego HCl i delikatnie wymieszaj. Może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez miesiąc.
   2. W okapie oparowym umieść płytkę TLC z rozwiązanymi gangliozydami, początkowo do góry, w wyciętym kartonowym pudełku, aby chronić ścianki okapu przed rozpryskami kwasu. Umieść odczynnik do rozpylania rezorcyny w szklanym opryskiwaczu TLC, podłącz do źródła azotu pod ciśnieniem i lekko spryskaj płytkę po przekątnej w kierunku pionowym i poziomym. Spryskać powierzchnię sorbentu TLC równomiernie, ale lekko.
   3. Natychmiast przykryj płytkę czystą, suchą szklaną pokrywą o tych samych wymiarach i zabezpiecz pokrywę na miejscu za pomocą spinaczy do segregatorów (Rysunek 3). Podgrzewać przykrytą płytę w temperaturze 125 °C przez 20 min. Gangliozydy będą ciemnofioletowe na białym tle.
      UWAGA: Płyta nie powinna wydawać się mokra po zakończeniu natryskiwania. Pokrywy można kształtować poprzez zeskrobywanie sorbentu z wcześniej używanych płytek TLC za pomocą jednoostrzowej żyletki.
      UWAGA: Krzemionka w proszku jest toksyczna dla płuc. Użyj maski i wyrzuć krzemionkę do szczelnie zamkniętego pojemnika.

Rysunek 3: Płytka TLC z rozdzielonym mieszanym gangliozydem. Płytka TLC z rozłożonymi mieszanymi wzorcami gangliozydów (lewe pasie) i oczyszczonymi mieszanymi gangliozydami istoty szarej bydła (prawa droga) po barwieniu rezorcynolem i ogrzewaniu z zaciśniętą szklaną płytką pokrywy. Standardowe gangliozydy (od góry do dołu) to GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b i GQ1b. Po schłodzeniu płytkę można zobrazować i/lub przykleić pokrywę taśmą do przechowywania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Ogólne barwienie lipidów pod kątem gangliozydów i fosfolipidów.
   UWAGA: Kwas siarkowy jest toksyczny i. Dodawanie stężonego kwasu do etanolu jest egzotermiczne i musi odbywać się powoli. Przygotować odczynnik barwiący w dygestoriach z rękawicami ochronnymi i okularami ochronnymi.
   1. Przygotować barwnik p-aldehydowy, powoli dodając 15 ml stężonego kwasu siarkowego do 500 ml etanolu. Mieszaj przez 30 minut, aby roztwór ostygł przed kontynuowaniem. Dodaj 15 ml aldehydu p-aniżowego i delikatnie wymieszaj. Lek może być przechowywany w temperaturze pokojowej (22 °C) do sześciu miesięcy.
   2. W chemicznym okapie oparowym zanurzyć płytkę TLC z rozwiązanymi gangliozydami, początkowym końcem do dołu, w zlewce zawierającej barwnik p-aldehydu aniżowego. Zanurz się w czole jezdnym na ≥ 2 s. Usuń TLC z plamy i pozwól mu spłynąć. Podgrzej płytkę TLC na płycie grzejnej w niskiej temperaturze, aby się rozwinąć.
      UWAGA: Lipidy będą ciemne na fioletowym tle. Roztwór barwiący można odzyskać do wielokrotnego użycia.

Wyniki

Metody opisane w sekcji 1 (mała skala) dostarczają gangliozydów w wystarczającej ilości i czystości do jakościowego i ilościowego określenia głównych gangliozydów mózgu. Odzysk z mózgu myszy wynosi ~ 1 μmol gangliozydu na g mokrej masy mózgu (1 nmol/μl), gdy jest przygotowany zgodnie z opisem. Rozdzielczość TLC wynosząca 1 μL (1 nmol) przy użyciu sekcji 3 zapewnia wystarczającą ilość materiału do wykrywania rezorcyny i rozwiązuje wszystkie główne gangliozydy mózgowe, jak pokazano dla myszy typu dzikiego i genetycznie zmo...

Dyskusja

Opisane tutaj metody ekstrakcji i izolacji gangliozydów na małą i dużą skalę nie są unikalne - istnieje wiele różnych podejść do ekstrakcji i oczyszczania rozpuszczalnikiem, które zapewniają doskonałe wyniki¹². Opisane tutaj metody oczyszczania mózgu na małą skalę, opracowane przez Fredmana i Svennerholma¹³, wykazały, że optymalizują regenerację i okazały się solidne i proste przez wiele lat w naszym laboratorium. Izolację i oczyszczanie odpowiednie dla TLC i SM można łatwo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mózg bydlęcy, pozbawiony	PelFreez	57105-1
Wzorce gangliozydowe	Matreya	GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063
Szklana butelka z nakrętką wyłożoną PTFE	Fisher Scientific	02-911-739
Szklana butelka wirówkowa	Fisher Scientific	05-586B
Szklane probówki hodowlane, 16 x 125 mm	VWR	60825-430	do zbierania frakcji HPLC
Szklany lejek separacyjny (2 L)	Pyrex	6400-2L
Strzykawka iniekcyjna - Hamilton 1750 gazoszczelne 500 i mikro; l	Hamilton	81265
p-Aldehyd anusowy, 98%	Sigma-Aldrich	A88107
Homogenizator Potter-Elvhjem	Fisher Scientific	08-414-14A	Wybierz odpowiednią opcję objętości
Reprosil 100 NH2 10µ m Kolumny ochronne 5x4mm	Analytics-Shop	AAVRS1N-100540-5
Reprospher 100 NH2, 5 μ m, 250 mm x 20 mm Kolumna HPLC	Analytics-Shop	pakowane na zamówienie	dostępne inne rozmiary
Rezorcinol	Sigma-Aldrich	30752-1
Parownik obrotowy	Buchi	R-300
Pętla próbki do wtryskiwacza model 7725 (5 ml)	Sigma-Aldrich	57632
Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)	Wody	WAT043350
Sep-Pak tC18 Plus Krótki wkład, 400 mg	wody	WAT036810
strzykawka do plam - Hamilton 701N 10 µ l	Hamilton	80300
Grubościenne probówki o średnicy 13 mm z nakrętkami wyłożonymi PFTE	Fisher Scientific	14-933A
Gwintowane fiolki 2 ml z nakrętkami wyłożonymi PFTE	Fisher Scientific	14-955-323	Do przechowywania gangliozydów
Płytki TLC, HPTLC Żel krzemionkowy 60 F254 Multiformat	Fisher Scientific	M1056350001	Impregnacja fluorescencyjna (F254) stabilizuje sorbent powierzchniowy
odczynnik TLC	Fisher Scientific	05-723-26A
Komora jezdna TLC do płytek 10 x 10 cm	Camag	22.5155
Waring 1-litrowy blender przeciwwybuchowy ze stali nierdzewnej	Waring	E8520