Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62387

⸱

20 października 2021

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

W tym artykule

Podsumowanie

Na podstawie matrycy peptydowej pochodzącej z wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficzne dla HBV mogą być oceniane równolegle z identyfikacją epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.

Streszczenie

Limfocyty T CD4 odgrywają ważną rolę w patogenezie przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B. Jako wszechstronna populacja komórek, limfocyty T CD4 zostały sklasyfikowane jako odrębne podzbiory funkcjonalne w oparciu o wydzielane przez nie cytokiny: na przykład IFN-γ dla komórek pomocniczych 1 CD4 T, IL-4 i IL-13 dla komórek pomocniczych T CD4, IL-21 dla pęcherzykowych komórek pomocniczych T CD4 i IL-17 dla komórek pomocniczych T CD4. Analiza limfocytów T CD4 specyficznych dla wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) na podstawie wydzielania cytokin po stymulacji peptydami pochodzącymi z HBV może dostarczyć informacji nie tylko na temat wielkości odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV, ale także na temat funkcjonalnych podzbiorów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV. Nowatorskie podejścia, takie jak transkryptomika i analiza metabolomiczna, mogą dostarczyć bardziej szczegółowych informacji funkcjonalnych na temat limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV. Podejścia te zwykle wymagają izolacji żywotnych limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV w oparciu o multimery peptydowo-durowego kompleksu zgodności tkankowej II, podczas gdy obecnie informacje o epitopach limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV są ograniczone. W oparciu o matrycę peptydową pochodzącą z HBV opracowano metodę oceny odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i jednoczesnej identyfikacji epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV przy użyciu próbek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od pacjentów z przewlekłym zakażeniem HBV.

Wprowadzenie

Obecnie istnieją 3 główne podejścia do analizy limfocytów T specyficznych dla antygenu. Pierwsze podejście opiera się na interakcji między receptorem limfocytów T a peptydem (epitopem). Limfocyty T specyficzne dla antygenu mogą być bezpośrednio barwione multimerami peptydowego głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC). Zaletą tej metody jest to, że można uzyskać żywotne limfocyty T specyficzne dla antygenu, odpowiednie do dalszej analizy transkryptomicznej/metabolomicznej. Ograniczeniem tej metody jest to, że nie może ona dostarczyć informacji o całej odpowiedzi limfocytów T na określony antygen, ponieważ wymaga zwalidowanych peptydów epitopowych, podczas gdy liczba zidentyfikowanych epitopów dla określonego antygenu jest na razie ograniczona. W porównaniu z epitopami limfocytów T CD8 specyficznymi dla wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), zidentyfikowano mniej epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla wirusa HBV1,2, co sprawiło, że ta metoda jest obecnie mniej przydatna do analizy limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.

Drugie podejście opiera się na regulacji w górę szeregu markerów wywołanych aktywacją po stymulacji peptydów antygenowych3. Powszechnie używane markery to CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Metoda ta została teraz wykorzystana do analizy odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu u osób zaszczepionych5,6, pacjenci z ludzkim wirusem niedoboru odporności7, oraz pacjenci z zakażeniem koronawirusem zespołu ostrej niewydolności oddechowej 28,9. W przeciwieństwie do testu opartego na multimerach peptyd-MHC, metoda ta nie jest ograniczona zwalidowanymi epitopami i może uzyskać żywe komórki do dalszej analizy. Ograniczeniem tej metody jest to, że nie może ona dostarczyć informacji na temat profilu cytokin limfocytów T specyficznych dla antygenu. Ponadto ekspresja tych markerów indukowanych aktywacją przez niektóre aktywowane komórki niespecyficzne dla antygenu może przyczyniać się do sygnałów tła w analizie, co może stanowić problem, zwłaszcza gdy limfocyty T specyficzne dla docelowego antygenu są rzadkie. Obecnie zastosowanie tej metody w odniesieniu do limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV jest ograniczone4. To, czy ta metoda może być wykorzystana do wiarygodnej analizy limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV, wymaga dalszych badań.

Trzecie podejście opiera się na wydzielaniu cytokin po stymulacji peptydem antygenowym. Podobnie jak analiza oparta na markerach indukowanych aktywacją, metoda ta nie jest ograniczona zwalidowanymi epitopami. Metoda ta może bezpośrednio ujawnić profil cytokin limfocytów T specyficznych dla antygenu. Czułość tej metody jest niższa niż metody opartej na markerach indukowanych aktywacją, ponieważ opiera się ona na wydzielaniu cytokin przez limfocyty T specyficzne dla antygenu, a liczba badanych cytokin jest zwykle ograniczona. Obecnie metoda ta jest szeroko stosowana w analizie limfocytów T specyficznych dla HBV. Ponieważ limfocyty T specyficzne dla HBV wydzielające cytokiny są trudne do wykrycia przez bezpośrednią stymulację peptydami ex vivo10,11, profil cytokin limfocytów T specyficznych dla HBV jest zwykle analizowany po 10-dniowej ekspansji stymulowanej peptydem in vitro12,13,14,15,16. Układ pul peptydowych w formie matrycy został wykorzystany w celu ułatwienia identyfikacji epitopów specyficznych dla antygenu17,18. Dzięki połączeniu macierzy peptydowej i analizy wydzielania cytokin opracowano metodę oceny odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i jednoczesnej identyfikacji epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV16. W tym protokole opisano szczegóły tej metody. Antygen rdzeniowy HBV został wybrany jako przykład demonstracji w tym protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Od każdego pacjenta włączonego do badania uzyskano pisemną świadomą zgodę. Protokół badania jest zgodny z wytycznymi etycznymi Deklaracji Helsińskiej z 1975 roku, co potwierdza uprzednia zgoda komisji etyki medycznej Southwest Hospital.

1. Projekt macierzy peptydowej pochodzącej z HBV

  1. Pobrać sekwencje aminokwasowe antygenu rdzeniowego HBV z baz danych NCBI (GenBank: AFY98989.1).
  2. Zakupić peptydy pochodne od antygenu rdzeniowego HBV (panel 35 peptydów 15-merowych z zakładką 10 reszt, czystość > 90%, 4 mg/peptyd) od dostawcy usług syntezy peptydów.
  3. Przygotować kwadratową macierz peptydową 6×6, w której każda pozycja zawiera tylko 1 peptyd. Utworzyć 12 pul peptydowych: 6 pul wierszowych i 6 pul kolumnowych, po 5-6 peptydów w każdej puli16. Pule peptydowe wierszowe i kolumnowe w macierzy reprezentują 2 oddzielne formacje antygenu rdzeniowego HBV.
  4. Dla 3/4 zakupionych peptydów wymieszać peptydy znajdujące się w tym samym wierszu/kolumnie macierzy, tworząc 12 oddzielnych pul peptydowych poprzez ich wspólne rozpuszczenie w dimetylosulfotlenku (DMSO) (2 µg/µL dla każdego peptydu). Przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.
  5. Pozostałe peptydy rozpuścić oddzielnie (10 µg/µL) i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu identyfikacji epitopów.

2. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC)

  1. Pobrać 5 mL krwi żylnej od pacjentów z przewlekłym zakażeniem HBV.
    UWAGA: Objętość krwi należy oszacować w przybliżeniu na podstawie liczby pul peptydowych plus 1 kontrola tła i 1 kontrola dodatnia. Analiza 1 puli peptydowej wymaga 3 x 105 PBMC. Średnio z 1 mL krwi można uzyskać 1 x 106 PBMC.
  2. Wyizolować PBMC z krwi, wykorzystując wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll (800 × g, 20 min), a następnie kriokonserwować wyizolowane PBMC w ciekłym azocie do późniejszego użycia.
  3. Za pomocą pipety Pasteura zebrać granulocyty znajdujące się pomiędzy przezroczystą warstwą Ficoll a warstwą erytrocytów. Wyekstrahować genomowe DNA z granulocytów, używając zestawu do oczyszczania genomowego DNA zgodnie z protokołem producenta.
  4. Przekazać próbkę DNA do dostawców usług genotypowania w celu określenia genotypu HLA-DRB1.

3. Ekspansja PBMC in vitro z wykorzystaniem macierzy peptydowej HBV

  1. Rozmrozić PBMC.
    1. Podgrzać RPMI 1640 uzupełnione benzonazą w stosunku 1:10 000 (25 U/mL) do 37 °C w kąpieli wodnej.
      UWAGA: Benzonaza pomaga ograniczyć agregację komórek podczas rozmrażania. Każda próbka wymaga 20 mL RPMI 1640 z benzonazą. Obliczyć ilość potrzebną do rozmrożenia wszystkich próbek i przygotować oddzielną alikwot pożywki (37 °C) z benzonazą w stosunku 1:10 000 (25 U/mL). Rozmrażać nie więcej niż 5 próbek jednocześnie.
    2. Wyjąć próbki z ciekłego azotu i szybko rozmrozić zamrożone fiolki w kąpieli wodnej (37 °C).
    3. Przenieść rozmrożoną zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej 15 mL. Do probówki dodawać pokroplowo 1 mL RPMI 1640 z benzonazą (37 °C). Powoli dodać 6 mL RPMI 1640 z benzonazą (37 °C) do probówki wirówkowej, a następnie wypłukać kriofiolkę kolejnymi 2 mL RPMI 1640 z benzonazą (37 °C), aby odzyskać wszystkie komórki. Postąpić tak samo z pozostałymi próbkami tak szybko, jak to możliwe.
      ​UWAGA: Powolne rozcieńczanie próbek kriokonserwowanych jest kluczowe dla zachowania żywotności rozmrożonych komórek.
    4. Odwirować (400 × g, 10 min), usunąć nadsącz i rozbić osad poprzez opukiwanie probówki.
    5. Delikatnie resuspendować osad w 1 mL ciepłego RPMI 1640 z benzonazą. Delikatnie wymieszać i w razie potrzeby przefiltrować komórki przez sito komórkowe 70 µm (np. w przypadku obecności widocznych skupisk).
    6. Pobrać alikwot 10 µL zawiesiny i rozcieńczyć w soli fosforanowej w PBS Dulbecco (DPBS), dodać błękit trypanu (0,04%), nanieść na hemocytometr, odczekać 1 min i zliczyć liczbę żywych komórek (komórki przejaśnione).
    7. Dodać 9 mL RPMI 1640 z benzonazą (37 °C) do probówki, odwirować (400 × g, 10 min), usunąć nadsącz i rozbić osad poprzez opukiwanie probówki.
  2. Resuspendować PBMC w RPMI 1640 uzupełnionym o 25 mM HEPES, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny oraz 10% ludzkiej surowicy AB (pełna pożywka hodowlana). Dostosować gęstość komórek do 1,5 x 106 komórek/mL. Wysiać PBMC na płytki 96-dołkowe (płaskie dno) w gęstości 3 x 105 komórek/dołek.
  3. Do każdego dołka dodać pulle peptydów pochodnych HBV (2 μg/mL dla każdego pojedynczego peptydu). Do dołków kontroli tła i kontroli dodatniej dodać taką samą ilość rozpuszczalnika (DMSO, 1 μL/mL). Dodać 10 U/mL IL-2 oraz 10 ng/mL IL-7. Inkubować w 37 °C i 5% CO2.
  4. W 3. dniu uzupełnić pożywkę hodowlaną o 50 U/mL IL-2 i 10 ng/mL IL-7.
    UWAGA: Od 1. do 3. dnia nie będzie zaobserwowano wyraźnej proliferacji limfocytów T. Całkowita liczba komórek zazwyczaj zmniejszy się o 1/3 do 1/2 z powodu śmierci komórek innych niż limfocyty T, takich jak limfocyty B, komórki NK, komórki NKT i monocyty.
  5. W 7. dniu wymienić połowę pożywki hodowlanej na świeżą pożywkę zawierającą peptydy (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) i IL-7 (20 ng/mL).
    UWAGA: Aby uniknąć naruszenia komórek osiadłych na dnie, ostrożnie pobrać pipetą około 90 μL pożywki hodowlanej z górnej warstwy. Od 3. do 7. dnia zaobserwuje się intensywną proliferację limfocytów T, a proliferujące limfocyty T zazwyczaj agregują, tworząc klastry.
  6. W 10. dniu delikatnie pipetować hodowlę komórkową w każdym dołku 7–9 razy, aby rozbić klastry komórkowe, zliczyć liczbę żywych komórek i przenieść 2×105 komórek z każdego dołka na płytkę 96-dołkową (okrągłe dno) w celu analizy odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.
  7. Kontynuować hodowlę pozostałych komórek w celu identyfikacji epitopów w 12. dniu, dostosować objętość pożywki hodowlanej do 100 μL (usuwając nadmiar pożywki) i uzupełnić hodowlę o 100 μL świeżej pełnej pożywki hodowlanej zawierającej peptydy (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) i IL-7 (20 ng/mL).
    UWAGA: Od 7. do 10. dnia limfocyty T nadal intensywnie proliferują. Jeśli pożywka zmieni kolor na żółty, wymienić pożywkę hodowlaną zgodnie z instrukcją w kroku 3.5. Zazwyczaj w 10. dniu liczba komórek przekroczy 6×105. Każdy dołek zazwyczaj wykazuje podobną liczbę komórek; należy zliczyć komórki w 3 dołkach i użyć wartości średniej jako szacunku liczby komórek dla wszystkich dołków.

4. Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV za pomocą cytometrii przepływowej z barwieniem wewnątrzkomórkowym

  1. Stymulowanie PBMCs pulami peptydów
    1. W przypadku komórek przeniesionych na płytkę 96-dołkową (do dna okrągłego), przemyć je 3 razy w płytce (550 × g, 3 min). Do każdego płukania użyć 200 µL medium (RPMI 1640 przez pierwsze 2 płukania, pełne medium hodowlane przy ostatnim płukaniu). Usunąć nadsączniki.
      UWAGA: Usunięcie resztkowych cytokin z hodowli poprzez wielokrotne płukanie może skutecznie zmniejszyć tło w analizie cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej.
    2. Do każdego dołka z komórkami stymulowanymi konkretną pulą peptydów dodać 200 µL pełnego medium hodowlanego uzupełnionego o te same pule peptydów (2 µg/mL dla każdego pojedynczego peptydy). Do dołka kontroli tła dodać pełne medium hodowlane uzupełnione o 1 µL/mL DMSO. Do dołka kontroli pozytywnej dodać pełne medium hodowlane uzupełnione o 1 µL/mL DMSO, 150 ng/mL octanu forbolu 12-mirystynianu 13-octanu (PMA) oraz 1 µmol/L jonomycyny.
      ​UWAGA: Wysoka dawka DMSO zablokuje wydzielanie cytokin przez limfocyty T (najbardziej znacząco dla TNF-α). Nie zaleca się stosowania dawki DMSO wyższej niż 5 µL/mL. Generalnie dawka DMSO w naszym eksperymencie nie przekracza 1 µL/mL.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 h.
    4. Po 1 h inkubacji dodać do hodowli monensynę (1,37 µg/mL).
  2. Cytometria przepływowa
    1. Po 6 h inkubacji usunąć nadsącznik po wirowaniu (550 × g, 3 min), przemyć komórki raz 200 µL DPBS (550 × g, 3 min), a następnie barwić markery powierzchniowe (CD3, CD4 i CD8) oraz marker żywotności (używając Fixable Viability Dye) w lodówce w temperaturze 4 °C przez 30 min.
    2. Przemyć raz 200 µL DPBS (550 × g, 3 min). Utrwalić i permeabilizować komórki, a następnie barwić wewnątrzkomórkowe cytokiny (TNF-α i IFN-γ) w lodówce w temperaturze 4 °C przez 45 min.
    3. Po ostatnim płukaniu podczas barwienia wewnątrzkomórkowego resuspendować komórki w 150 µL buforu do cytometrii przepływowej (DPBS + 0,5% BSA).
    4. Nabrać dane cytometrii przepływowej na cytometrze przepływowym.
  3. Analiza wyników cytometrii przepływowej
    1. Definicja dołka pozytywnego: uznać dołek za pozytywny, jeśli częstotliwość występowania limfocytów T wydzielających cytokiny jest co najmniej dwukrotnie wyższa niż w dołku kontroli tła (Rycina 1).
    2. Zgodnie z poniższym wzorem obliczyć odsetek odpowiedzi dla każdej analizowanej cytokiny (Rycina 2):
      Równanie odsetka odpowiedzi: Σ(częstość komórek wydzielających cytokiny w dołku pozytywnym - tło)/2.
      UWAGA: Pula peptydów w wierszu i pule peptydów w kolumnie w macierzy reprezentują 2 odrębne formacje antygenu rdzenia HBV, zatem końcowy odsetek odpowiedzi należy podzielić przez 2.

5. Identyfikacja HBV-specyficznych epitopów limfocytów T CD4 ograniczonych przez HLA-DR

  1. Rozmrażanie i hodowla allogenicznych linii limfoblastoidalnych komórek B (BLCL) w kolbach T-75 (5-20 ×106 komórki, 20 mL pełnej pożywki hodowlanej).
    UWAGA: Aby zagwarantować dobrą kondycję BLCL, etap ten należy rozpocząć na 2 tygodnie przed rozmrożeniem PBMC pacjentów. BLCL muszą być homozygotyczne pod względem allelu HLA-DRB1. Zgodnie z wynikiem genotypowania, pacjenci powinni posiadać ten sam allel HLA-DRB1 co BLCL.
  2. Przesiewowe badanie peptydów kandydackich w celu identyfikacji (Rysunek 3)
    1. Na podstawie wyników odpowiedzi limfocytów T w 10. dniu, należy wyselekcjonować 2 pule peptydów o najwyższym wskaźniku odpowiedzi (jedną pulę peptydów w rzędzie i jedną pulę peptydów w kolumnie).
    2. Uznaj peptyd w tych 2 pulach za peptyd kandydujący, jeśli inna pula peptydów zawierająca ten peptyd również wykazuje pozytywny wynik w analizie odpowiedzi limfocytów T. Do późniejszej identyfikacji epitopów wykorzystaj PBMC wyekspandowane z drugą pulą peptydów.
  3. Impulsowanie BLCL peptydem
    1. W 12. dniu należy policzyć liczbę żywych linii komórkowych BLCL, przenieść komórki do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml, odwirować (350 × g, 10 min) i usunąć nadsącz. Osad komórkowy należy resuspender w pełnym medium hodowlanym, a następnie nanieść BLCL do płytki 96-dołkowej (z dnem okrągłym) w stężeniu 4×104 komórek/dołek w 80 µL pełna pożywka hodowlana.
    2. Dodaj pojedynczy peptyd (10 µg/mL), inkubować w 37 °C oraz 5% CO22 przez 2 h. Przygotowano dwie kontrole tła: inkubację z peptydem przy jednoczesnym blokowaniu HLA-DR (wcześniejsza inkubacja z przeciwciałem anty-HLA-DR (10 µg/mL) przez 1 h); DMSO (1 µL/mL) pulsacji. Końcowa objętość pełnej pożywki hodowlanej w każdej studzience wynosi 100 µL.
    3. Dodaj mitycomycynę C (100 µg/mL), inkubować przy 37 °C oraz 5% CO22 przez 1 h.
    4. Przemyć 3 razy za pomocą 200 µL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) w płytce w celu usunięcia nieprzyłączonego peptydy i mitomycyny C. Podczas pierwszego przemywania uzupełnić kulturę inkubacyjną o 100 µL pożywki RPMI 1640.
    5. Resuspendować komórki w 120 µL pełnej pożywki hodowlanej.
  4. Stymulowanie PBMC za pomocą BLCL obciążonych peptydami.
    1. W 12. dniu przenieść PBMC do płytki 96-dołkowej (o okrągłym dnie).
    2. Usunąć supernatant po wirowaniu (550 × g, 3 min) w płytce, a następnie dwukrotnie przemyć za pomocą 200 µL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) na płytce.
      UWAGA: Usunięcie resztkowych cytokin i peptydów z hodowli poprzez wielokrotne przemywanie jest kluczowym etapem zmniejszania tła w analizie cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej. W szczególności resztkowe peptydy będą wiązać się z liniami BLCL, co znacząco zwiększy tło.
    3. Resuspender PBMC w każdej studzience w 210 µL pełnej pożywki hodowlanej.
    4. Dla studzienki z PBMC wybranej do identyfikacji epitopów, wymieszać alykwot (70 µL (każda) z liniami komórkowymi BLCL stymulowanymi peptydem (3 studzienki, w tym 2 kontrole tła).
      UWAGA: W 12. dniu liczba PBMC po ekspansji w pulach peptydowych zazwyczaj osiąga wartość powyżej 5-7×10^6.5 na studzienkę, tak aby stosunek PBMC do BLCL wynosił od około 6:1 do 4:1.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez 6 h.
    6. Po 1 h inkubacji dodać monensynę (1.37 µg/mL) do hodowli. Końcowa objętość pełnej pożywki w każdej studzience wynosi 200 µL.
  5. Cytometria przepływowa
    1. Powtórz czynności opisane w kroku 4.2.
  6. Analiza wyników cytometrii przepływowej
    1. Potwierdź, czy peptyd jest epitopem komórek T CD4 z ograniczeniem do HLA-DR, jeżeli PBMC inkubowane z tym peptydem w obecności impulsowanych nim komórek BLCL wykazują częstotliwość wydzielających cytokiny komórek T CD4 co najmniej dwukrotnie wyższą niż w przypadku PBMC inkubowanych z kontrolami tła (impulsowanie peptydem przy wcześniejszym blokowaniu HLA-DR; impulsowanie DMSO).Rycina 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Częstość występowania wydzielających cytokiny limfocytów T CD4 oblicza się jako sumę producentów pojedynczych oraz podwójnych cytokin. Jak pokazano na Rysunku 1, częstość występowania wydzielających TNF-α limfocytów T CD4 oraz częstość występowania wydzielających IFN-γ limfocytów T CD4 w kontroli tła (DMSO) wynosi odpowiednio 0,154% i 0,013%. Częstość występowania wydzielających TNF-α limfocytów T CD4 oraz częstość występowania wydzielających IFN-γ limfocytów T CD4 swoistych dla puli peptydó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najbardziej krytyczne kroki w tym protokole są wymienione w następujący sposób: 1) wystarczająca liczba PBMC o wysokiej żywotności, aby rozpocząć ekspansję PBMC; 2) odpowiednie środowisko do rozbudowy PBMC; oraz 3) całkowite usunięcie resztkowych pul peptydowych w hodowli PBMC przed identyfikacją epitopów.

Cała analiza w tym protokole zależy od silnej proliferacji limfocytów T CD4. Ogólnie rzecz biorąc, liczba PBMC po 10-dniowej ekspansji będzie 2-3 razy większa od początkowej liczby. Liczba k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) oraz Chinese Key
Projekt Specjalizacja w chorobach zakaźnych (2018ZX10723203).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina bydlęca V (BSA)BeyotimeST023
sprzężona z APC anty-ludzka TNF-&alfa;eBioscience17-7349-82Chronić przed światłem
Nukleaza benzonazowaSigma-AldrichE1014Ograniczenie zlepiania się komórek
linii komórkowych limfoblastoidów B (BLCL)CENTRUM BADAŃ NAD RAKIEM FRED HUTCHINSONIHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygota
B linie komórkowe limfoblastoidów (BLCL)FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTERhomozygota HLA-DRB1*1202
Kolba do hodowli komórkowych (T75)Corning430641
Płytka do hodowli komórkowych (96-dołkowa, z płaskim dnem)Corning3599Płaska
płytka do hodowli komórkowej (96-dołkowa, z okrągłym dnem)Corning3799Okrągłodenne
sitko do hodowli komórekCorningCLS431751Wielkość porów 70  μ m, biała, sterylna
probówka wirówkowa (15 ml)KIRGENKG2611sterylna
probówka wirówkowa (50 ml)Corning430829sterylna
wirówka, chłodzonaEppendorf5804R
ThermoST16R
, chłodzonaThermoLegend Micro 21R
Zestaw Cytofix/Cytoperm (zestaw czynnika transkrypcyjnego)BD Biosciences562574Przygotuj roztwór przed użyciem
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650Przechowywać w temperaturze pokojowej, aby zapobiec krystalizacji
Dulbecco' s Sól fizjologicznaPrzygotuj ddH2O (1000 ml) zawierający NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) i Na2HPO4,7H2O (2160  mg). Dostosuj PH do 7.4. Sterylizować w autoklawie.
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-03
Końcówki filtrujące (0,5-10)KirgenKG5131Sterylne
końcówki filtrujące (100-1000)KirgenKG5333Sterylne
końcówki filtrujące (1-200)KirgenKG5233Sterylny
anty-ludzki CD4 BioLegend 300506 sprzężony z FITCChronić przed światłem
Możliwy do naprawienia barwnik żywotności eFluor780eBioscience65-0865-14Chronić przed światłem
Inhibitor transportu białek GolgiStop (zawierający Monenzynę)BD Biosciences554724Inhibitor transportu białek
HemocytometrMarka718620
Peptydy rdzeniowe HBV pochodzące z antygenuChinyPeptydy
HEPESGibco15630080100 ml
Ludzka surowica ABGemini Bio-Products100-51100 ml
JonomycynaSigma-AldrichI0634
KClSangon BiotechA100395-0500
KH2PO4Sangon BiotechA100781-0500
LSRFortessa Cytometr przepływowyBD
L-glutaminaGibco25030081100 ml
probówka do mikrowirówek (1,5 ml)CorningMCT-150-CAutoklawizowana sterylizacja przed użyciem
Wytrząsarki do mikropłytekScientific IndustriesMicroPlate Genie
Mitomycyna CRoche10107409001
Na2HPO4.7H2OSangon BiotechA100348-0500
NaClSangon BiotechA100241-0500
Probówki PCR (0,2 ml)KirgenKG2331
PE/Cy7-sprzężony anty-ludzki CD8BioLegend300914Chronić przed światłem
Anty-ludzkim IFN-&gamma sprzężonym z PE;eBioscience12-7319-42Chronić przed światłem
Penicylina StreptomycynaGibco15140122100 ml
PerCP-Cy5.5-sprzężony anty-ludzki CD3eBioscience45-0037-42Chronić przed światłem
12-mirystynian 13-octan forbolu (PMA)Sigma-AldrichP1585
Rekombinowany ludzki IL-2PeproTech200-02
Rekombinowana ludzka IL-7PeproTech200-07
RPMI Medium 1640GibcoC11875500BT500 ml
Pirogonian sodu, 100mMGibco15360070
Trypanowa niebieska plama (0,4%)Gibco15250-061
Ultra-LEAF Oczyszczony anty-ludzki HLA-DRBioLegend307648
Wizard Genomic DNA Zestaw oczyszczającyPromegaA1125
IHW09121 wirówka , chłodzona wirówka buforowana fosforanami

Bibliografia

  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998(2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

limfocyty T CD4 specyficzne dla HBVepitopy ograniczone przez HLA DRmononuklearne kom rki krwi obwodowejgradient g sto ci Ficollsekrecja cytokincytometria przep ywowawewn trzkom rkowe barwienie cytokinidentyfikacja epitop wprzewlek e zapalenie w troby typu B
Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.