Artykuł metodologiczny

Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i identyfikacja epitopów komórek T CD4 ograniczonych do HLA-DR na podstawie matrycy peptydowej

DOI:

10.3791/62387

⸱

20 października 2021

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na podstawie matrycy peptydowej pochodzącej z wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficzne dla HBV mogą być oceniane równolegle z identyfikacją epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Limfocyty T CD4 odgrywają ważną rolę w patogenezie przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B. Jako wszechstronna populacja komórek, limfocyty T CD4 zostały sklasyfikowane jako odrębne podzbiory funkcjonalne w oparciu o wydzielane przez nie cytokiny: na przykład IFN-γ dla komórek pomocniczych 1 CD4 T, IL-4 i IL-13 dla komórek pomocniczych T CD4, IL-21 dla pęcherzykowych komórek pomocniczych T CD4 i IL-17 dla komórek pomocniczych T CD4. Analiza limfocytów T CD4 specyficznych dla wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) na podstawie wydzielania cytokin po stymulacji peptydami pochodzącymi z HBV może dostarczyć informacji nie tylko na temat wielkości odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV, ale także na temat funkcjonalnych podzbiorów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV. Nowatorskie podejścia, takie jak transkryptomika i analiza metabolomiczna, mogą dostarczyć bardziej szczegółowych informacji funkcjonalnych na temat limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV. Podejścia te zwykle wymagają izolacji żywotnych limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV w oparciu o multimery peptydowo-durowego kompleksu zgodności tkankowej II, podczas gdy obecnie informacje o epitopach limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV są ograniczone. W oparciu o matrycę peptydową pochodzącą z HBV opracowano metodę oceny odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i jednoczesnej identyfikacji epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV przy użyciu próbek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od pacjentów z przewlekłym zakażeniem HBV.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecnie istnieją 3 główne podejścia do analizy limfocytów T specyficznych dla antygenu. Pierwsze podejście opiera się na interakcji między receptorem limfocytów T a peptydem (epitopem). Limfocyty T specyficzne dla antygenu mogą być bezpośrednio barwione multimerami peptydowego głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC). Zaletą tej metody jest to, że można uzyskać żywotne limfocyty T specyficzne dla antygenu, odpowiednie do dalszej analizy transkryptomicznej/metabolomicznej. Ograniczeniem tej metody jest to, że nie może ona dostarczyć informacji o całej odpowiedzi limfocytów T na określony antygen, ponieważ wymaga zwalidowanych peptydów epitopowych, podczas gdy liczba zidentyfikowanych epitopów dla określonego antygenu jest na razie ograniczona. W porównaniu z epitopami limfocytów T CD8 specyficznymi dla wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), zidentyfikowano mniej epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla wirusa HBV1,2, co sprawiło, że ta metoda jest obecnie mniej przydatna do analizy limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.

Drugie podejście opiera się na regulacji w górę szeregu markerów wywołanych aktywacją po stymulacji peptydów antygenowych3. Powszechnie używane markery to CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Metoda ta została teraz wykorzystana do analizy odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu u osób zaszczepionych5,6, pacjenci z ludzkim wirusem niedoboru odporności7, oraz pacjenci z zakażeniem koronawirusem zespołu ostrej niewydolności oddechowej 28,9. W przeciwieństwie do testu opartego na multimerach peptyd-MHC, metoda ta nie jest ograniczona zwalidowanymi epitopami i może uzyskać żywe komórki do dalszej analizy. Ograniczeniem tej metody jest to, że nie może ona dostarczyć informacji na temat profilu cytokin limfocytów T specyficznych dla antygenu. Ponadto ekspresja tych markerów indukowanych aktywacją przez niektóre aktywowane komórki niespecyficzne dla antygenu może przyczyniać się do sygnałów tła w analizie, co może stanowić problem, zwłaszcza gdy limfocyty T specyficzne dla docelowego antygenu są rzadkie. Obecnie zastosowanie tej metody w odniesieniu do limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV jest ograniczone4. To, czy ta metoda może być wykorzystana do wiarygodnej analizy limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV, wymaga dalszych badań.

Trzecie podejście opiera się na wydzielaniu cytokin po stymulacji peptydem antygenowym. Podobnie jak analiza oparta na markerach indukowanych aktywacją, metoda ta nie jest ograniczona zwalidowanymi epitopami. Metoda ta może bezpośrednio ujawnić profil cytokin limfocytów T specyficznych dla antygenu. Czułość tej metody jest niższa niż metody opartej na markerach indukowanych aktywacją, ponieważ opiera się ona na wydzielaniu cytokin przez limfocyty T specyficzne dla antygenu, a liczba badanych cytokin jest zwykle ograniczona. Obecnie metoda ta jest szeroko stosowana w analizie limfocytów T specyficznych dla HBV. Ponieważ limfocyty T specyficzne dla HBV wydzielające cytokiny są trudne do wykrycia przez bezpośrednią stymulację peptydami ex vivo10,11, profil cytokin limfocytów T specyficznych dla HBV jest zwykle analizowany po 10-dniowej ekspansji stymulowanej peptydem in vitro12,13,14,15,16. Układ pul peptydowych w formie matrycy został wykorzystany w celu ułatwienia identyfikacji epitopów specyficznych dla antygenu17,18. Dzięki połączeniu macierzy peptydowej i analizy wydzielania cytokin opracowano metodę oceny odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV i jednoczesnej identyfikacji epitopów limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV16. W tym protokole opisano szczegóły tej metody. Antygen rdzeniowy HBV został wybrany jako przykład demonstracji w tym protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pisemna świadoma zgoda została uzyskana od każdego pacjenta włączonego do badania. Protokół badania jest zgodny z wytycznymi etycznymi Deklaracji Helsińskiej z 1975 r., co znalazło odzwierciedlenie w wcześniejszym zatwierdzeniu przez komisję etyki medycznej Szpitala Południowo-Zachodniego.

1. Projekt matrycy peptydowej pochodzącej z HBV

  1. Pobierz sekwencje aminokwasowe antygenu rdzeniowego HBV z baz danych NCBI (GenBank: AFY98989.1).
  2. Zakup peptydów pochodzących z antygenu rdzeniowego HBV (panel 35 peptydów 15-merowych nakładających się na siebie 10 resztami, czystość > 90%, 4 mg / peptyd) od dostawcy usług syntezy peptydów.
  3. Ustaw kwadratową matrycę peptydową 6×6, w której każda pozycja w matrycy zawiera tylko 1 peptyd. Istnieje 12 pul peptydowych: 6 rzędowych pul peptydowych i 6 kolumnowych pul peptydowych, 5-6 peptydów w każdej puli16. Rzędowe pule peptydowe i kolumnowe pule peptydowe w matrycy reprezentują 2 oddzielne formacje antygenu rdzeniowego HBV.
  4. W przypadku 3/4 zakupionych peptydów wymieszaj peptydy w tym samym rzędzie/kolumnie matrycy w 12 oddzielnych pulach peptydowych, rozpuszczając je razem w dimetylosulfotlenku (DMSO) (2 μg/μL dla każdego peptydu). Przechowywać w temperaturze -80 °C w celu analizy odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.
  5. Pozostałe peptydy rozpuścić oddzielnie (10 μg/μl) i przechowywać w temperaturze -80 °C w celu identyfikacji epitopów.

2. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs)

  1. Próbka 5 ml krwi żylnej od pacjentów z przewlekłym zakażeniem HBV.
    UWAGA: Objętość krwi należy z grubsza oszacować na podstawie liczby pul peptydów plus 1 kontrola tła i 1 kontrola pozytywna. Analiza 1 puli peptydowej wymaga 3 x 105 PBMC. Średnio 1 x 106 PBMC można było uzyskać z 1 ml krwi.
  2. Wyizolować PBMC z krwi za pomocą wirowania w gradionym gradieniu gęstości Ficoll (800 × g, 20 min) i kriokonserwować wyizolowane PBMC w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania.
  3. Użyj pipety Pasteura, aby zebrać granulocyty między przezroczystą warstwą Ficollu a warstwą czerwonych krwinek. Ekstrakcja genomowego DNA z granulocytów za pomocą zestawu do oczyszczania genomowego DNA zgodnie z protokołem producenta.
  4. Wyślij próbkę DNA do dostawców usług genotypowania w celu określenia genotypu HLA-DRB1.

3. Ekspansja in vitro PBMC za pomocą matrycy peptydowej HBV

  1. Rozmrozić PBMC.
    1. Ciepły RPMI 1640 uzupełniony benzonazą w stosunku 1:10 000 (25 U/ml) do 37 °C w łaźni wodnej.
      UWAGA: Benzonaza pomaga ograniczyć zlepianie się komórek podczas rozmrażania. Każda próbka będzie wymagała 20 ml RPMI 1640 z benzonazą. Obliczyć ilość potrzebną do rozmrożenia wszystkich próbek i przygotować oddzielną porcję pożywki (37 °C) z benzonazą w proporcji 1:10 000 (25 U/ml). Rozmrażać nie więcej niż 5 próbek na raz.
    2. Pobrać próbki z ciekłego azotu i szybko rozmrozić zamrożone fiolki w łaźni wodnej (37 °C).
    3. Przenieść zawiesinę rozmrożonych komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać kroplami 1 ml benzonazy RPMI 1640 (37 °C) do probówki. Powoli dodać 6 ml benzonazy RPMI 1640 (37 °C) do probówki wirówkowej, przepłukać kriowial kolejnymi 2 ml benzonazy RPMI 1640 (37 °C), aby odzyskać wszystkie komórki. Kontynuuj z pozostałymi próbkami tak szybko, jak to możliwe.
      UWAGA: Powolne rozcieńczanie kriokonserwowanych próbek jest kluczem do utrzymania żywotności rozmrożonych komórek.
    4. Odwirować (400 × g, 10 min), usunąć supernatant i poluzować osad, stukając w probówkę.
    5. Delikatnie zawiesić granulkę w 1 ml ciepłej benzonazy RPMI 1640. Delikatnie wymieszać i w razie potrzeby przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 70 μm (tj. jeśli widoczne są grudki).
    6. Porcję zawiesiny o stężeniu 10 μl rozcieńczyć w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, dodać błękit trypanowy (0,04%), załadować na hemocytometr, odczekać 1 minutę i policzyć liczbę żywotnych komórek (komórek przezroczystych).
    7. Dodać 9 ml benzonazy RPMI 1640 (37 °C) do probówki, odwirować (400 × g, 10 min), usunąć supernatant i poluzować osad, stukając w probówkę.
  2. Ponownie zawiesić PBMC w RPMI 1640 uzupełnionym 25 mM HEPES, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10% ludzkiej surowicy AB (kompletna pożywka hodowlana). Dostosuj gęstość komórek do 1,5 x 106 komórek/ml. Płytki PBMC w 96-dołkowych płytkach (płaskie dno) o gęstości 3 x 105 komórek/dołek.
  3. Dodaj pule peptydów pochodzących z HBV (2 μg/ml dla każdego pojedynczego peptydu) do każdej studzienki. W przypadku studzienek kontroli tła i kontroli dodatniej dodać taką samą ilość rozpuszczalnika (DMSO, 1 μL/ml). Dodać 10 j./ml IL-2 i 10 ng/ml IL-7. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. W dniu 3 uzupełnij pożywkę hodowlaną 50 j./ml IL-2 i 10 ng/ml IL-7.
    UWAGA: W okresie od 1 do 3 dnia nie będzie obserwowana żadna wyraźna proliferacja limfocytów T. Całkowita liczba komórek zwykle zmniejsza się o 1/3 do 1/2 z powodu śmierci komórek innych niż T, takich jak komórki B, komórki NK, komórki NKT i monocyty.
  5. W 7 dniu zastąp połowę pożywki hodowlanej świeżą pożywką zawierającą peptydy (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) i IL-7 (20 ng/ml).
    UWAGA: Aby uniknąć naruszania komórek na dole, należy ostrożnie odpipetować około 90 μl pożywki hodowlanej od góry pożywki. W okresie od 3 do 7 dnia obserwuje się silną proliferację limfocytów T, a proliferujące limfocyty T zwykle agregują się, tworząc klastry.
  6. W dniu 10 delikatnie pipetuj hodowlę komórek w każdym dołku 7-9 razy, aby zdezagregować klastry komórek, policzyć liczbę żywotnych komórek i przenieść 2×105 komórek w każdym dołku na 96-dołkową płytkę (okrągłe dno) w celu analizy odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV.
  7. Kontynuuj hodowlę pozostałych komórek w celu identyfikacji epitopów w dniu 12, dostosuj objętość pożywki hodowlanej do 100 μl (odrzucając nadmierną pożywkę) i uzupełnij hodowlę 100 μl świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej zawierającej peptydy (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) i IL-7 (20 ng/ml).
    UWAGA: W okresie od 7 do 10 dnia limfocyty T kontynuują energiczną proliferację. Wymień pożywkę hodowlaną jak w kroku 3.5, jeśli pożywka zmieni kolor na żółty. Ogólnie rzecz biorąc, liczba komórek przekroczy 6×105 w dniu 10. Każda studzienka zwykle pokazuje podobny numer komórki, policz numer komórki w 3 dołkach i użyj średniej wartości jako oszacowania liczby komórek dla wszystkich studzienek.

4. Analiza odpowiedzi limfocytów T CD4 specyficznych dla HBV za pomocą wewnątrzkomórkowej cytometrii przepływowej

  1. Stymulacja PBMC za pomocą pul peptydowych
    1. W przypadku komórek przeniesionych na płytkę 96-dołkową (okrągłe dno) należy przemyć 3 razy w płytce (550 × g, 3 min). Użyj 200 μl pożywki do każdego prania (RPMI 1640 dla pierwszych 2 prań, kompletna pożywka hodowlana dla ostatniego prania). Odrzucić supernatanty.
      UWAGA: Usunięcie pozostałych cytokin w kulturze przez wielokrotne mycie może skutecznie zmniejszyć tło w analizie wewnątrzkomórkowej cytometrii przepływowej.
    2. Do każdej studzienki komórek stymulowanych określoną pulą peptydów dodać 200 μl kompletnej pożywki hodowlanej uzupełnionej tymi samymi pulami peptydowymi (2 μg/ml dla każdego pojedynczego peptydu). Do studzienki kontroli tła dodać kompletną pożywkę hodowlaną uzupełnioną 1 μl/ml DMSO. Do studzienki kontroli pozytywnej dodać kompletną pożywkę hodowlaną uzupełnioną 1 μl/ml DMSO, 150 ng/ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) i 1 μmol/l jonomycyny.
      UWAGA: Wysoka dawka DMSO zablokuje wydzielanie cytokin przez limfocyty T (najbardziej istotne dla TNF-α). Nie zaleca się stosowania dawki DMSO większej niż 5 μL/ml. Ogólnie rzecz biorąc, dawka DMSO w naszym eksperymencie nie przekracza 1 μL/mL.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 godzin.
    4. Po 1 godzinie inkubacji dodać Monenzynę (1,37 μg/ml) do kultury.
  2. Cytometria przepływowa
    1. Po 6 godzinach inkubacji. Usunąć supernatant po odwirowaniu (550 × g, 3 min), przemyć komórki raz 200 μl DPBS (550 × g, 3 min), markerami powierzchni barwienia (CD3, CD4 i CD8) i markerem żywotności (przy użyciu barwnika do utrwalenia żywotności) w lodówce o temperaturze 4 °C przez 30 min.
    2. Przemyć raz 200 μl DPBS (550 × g, 3 min). Utrwalać i przenikać komórki oraz barwić cytokiny wewnątrzkomórkowe (TNF-α i IFN-γ) w lodówce o temperaturze 4 °C przez 45 minut.
    3. Po ostatecznym przepłukaniu w barwieniu wewnątrzkomórkowym ponownie zawiesić komórki w 150 μl buforu cytometrii przepływowej (DPBS + 0,5% BSA).
    4. Pozyskiwanie danych cytometrii przepływowej na cytometrze przepływowym.
  3. Analiza wyników cytometrii przepływowej
    1. Definicja studni dodatniej: rozważ studnię jako pozytywną, jeśli ma częstotliwość wydzielania cytokin przez limfocyty T co najmniej dwa razy większą niż studzienka kontrolna tła (Rysunek 1).
    2. Zgodnie z poniższym wzorem oblicz wskaźnik odpowiedzi dla każdej analizowanej cytokiny (Rysunek 2):
      figure-protocol-1
      UWAGA: Pula peptydów w rzędzie i pule peptydów w kolumnie w matrycy reprezentują 2 odrębne formacje antygenu rdzeniowego HBV, więc ostateczny wskaźnik odpowiedzi należy podzielić przez 2.

5. Identyfikacja specyficznych dla HBV epitopów limfocytów T CD4 z ograniczeniami HLA-DR

  1. Rozmrozić i utrzymać allogeniczne linie komórkowe limfoblastoidów B (BLCL) w kolbie T-75 (5-20 ×106 komórek, 20 ml kompletnej pożywki hodowlanej).
    UWAGA: Aby zagwarantować dobry stan BLCL, ten etap należy rozpocząć na 2 tygodnie przed rozmrożeniem PBMC pacjentów. BLCL muszą być homozygotyczne pod względem allelu HLA-DRB1. Zgodnie z wynikiem genotypowania, pacjenci powinni mieć ten sam allel HLA-DRB1 co BLCL.
  2. Badania przesiewowe peptydów kandydujących do identyfikacji (Rysunek 3)
    1. Zgodnie z wynikami wskaźnika odpowiedzi limfocytów T w dniu 10, przesiewaj 2 pule peptydów o najwyższym wskaźniku odpowiedzi (1 rzędowa pula peptydowa i 1 kolumnowa pula peptydowa).
    2. Ustaw peptyd w tych 2 pulach jako peptyd kandydujący, jeśli druga pula peptydowa zawierająca ten peptyd również wykazuje dodatni wynik w analizie odpowiedzi komórek T. Użyj PBMC rozszerzonych o inną pulę peptydów do późniejszej identyfikacji epitopów.
  3. Pulsujące BLCL z peptydem
    1. W dniu 12 policz liczbę żywotnych BLCL, przenieś komórki do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml, odwiruj (350 × g, 10 min) i usuń supernatant. Zawiesić osad komórkowy w kompletnym pożywce hodowlanej i poddzielić BLCL na 96-dołkową płytkę (okrągłe dno) w 4×104 komórki/basenik w 80 μl kompletnej pożywki hodowlanej.
    2. Dodać pojedynczy peptyd (10 μg/ml), inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny. Zestaw 2 kontrola tła: pulsowanie peptydu z blokowaniem HLA-DR (wstępne traktowanie anty-HLA-DR (10 μg/ml) przez 1 godzinę); DMSO (1 μL/mL) pulsacyjny. Ostateczna objętość kompletnej pożywki hodowlanej w każdym dołku wynosi 100 μl.
    3. Dodać mitomycynę C (100 μg/ml), inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.
    4. Przemyć 3 razy 200 μl RPMI 1640 (550 × g, 3 min) na płytce, aby usunąć niepulsacyjny peptyd i mitomycynę C. Do pierwszego prania uzupełnij kulturę inkubacyjną 100 μl RPMI 1640.
    5. Zawiesić komórki w 120 μl kompletnej pożywki hodowlanej.
  4. Stymulacja PBMC za pomocą peptydowych pulsacyjnych BLCL.
    1. W dniu 12 przenieś PBMC na 96-dołkową płytkę (okrągłe dno).
    2. Po odwirowaniu (550 × g, 3 min) usunąć sklarowany nad osadem na płytce, dwukrotnie przemyć 200 μl RPMI 1640 (550 × g, 3 min) na płytce.
      UWAGA: Usunięcie resztkowych cytokin i peptydów w kulturze przez wielokrotne mycie jest kluczowym krokiem w celu zmniejszenia tła w analizie cytometrii przepływu wewnątrzkomórkowego. Szczególnie w przypadku peptydów resztkowych wiąże się z BLCL i znacznie zwiększa tło.
    3. Zawiesić PBMC w każdym dołku za pomocą 210 μl kompletnej pożywki hodowlanej.
    4. W przypadku studzienki PBMC wybranej do identyfikacji epitopów, wymieszaj podwielokrotność (70 μl każdy) z pulsującymi peptydami BLCL (3 dołki, w tym 2 kontrole tła).
      UWAGA: W dniu 12 liczba pul peptydowych rozszerzonych PBMC zwykle osiąga ponad 5-7×105 na dołek, więc stosunek PBMC / BLCL wynosi około 6/1 do 4/1.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 godzin.
    6. Po 1 godzinie inkubacji dodać Monenzynę (1,37 μg/ml) do kultury. Ostateczna objętość kompletnej pożywki hodowlanej w każdym dołku wynosi 200 μl.
  5. Cytometria przepływowa
    1. Powtórz te same czynności, co w kroku 4.2.
  6. Analiza wyników cytometrii przepływowej
    1. Sprawdź, czy peptyd jest epitopem limfocytów T CD4 ograniczonym do HLA-DR, jeśli PBMC inkubowane z tym peptydem pulsacyjnym BLCL wykazują częstotliwość wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 co najmniej dwa razy większą niż PBMC inkubowane z kontrolami tła (peptyd pulsujący z wstępną blokadą HLA-DR; Pulsowanie DMSO) (Rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częstotliwość wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 jest obliczana jako suma zarówno pojedynczych, jak i podwójnych producentów. Jak wykazano w Rysunek 1, częstotliwość wydzielania limfocytów T CD4 przez TNF-α i częstotliwość wydzielania przez IFN-γ limfocytów T CD4 w kontroli tła (DMSO) wynoszą odpowiednio 0,154% i 0,013%. Częstość wydzielania limfocytów T CD4 przez TNF-α i częstotliwość wydzielania przez IFN-γ limfocytów T CD4 specyficznych dla puli peptydowej Core11 wynosi odpowiednio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej krytyczne kroki w tym protokole są wymienione w następujący sposób: 1) wystarczająca liczba PBMC o wysokiej żywotności, aby rozpocząć ekspansję PBMC; 2) odpowiednie środowisko do rozbudowy PBMC; oraz 3) całkowite usunięcie resztkowych pul peptydowych w hodowli PBMC przed identyfikacją epitopów.

Cała analiza w tym protokole zależy od silnej proliferacji limfocytów T CD4. Ogólnie rzecz biorąc, liczba PBMC po 10-dniowej ekspansji będzie 2-3 razy większa od początkowej liczby. Liczba k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) oraz Chinese Key
Projekt Specjalizacja w chorobach zakaźnych (2018ZX10723203).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina bydlęca V (BSA)BeyotimeST023
sprzężona z APC anty-ludzka TNF-&alfa;eBioscience17-7349-82Chronić przed światłem
Nukleaza benzonazowaSigma-AldrichE1014Ograniczenie zlepiania się komórek
linii komórkowych limfoblastoidów B (BLCL)CENTRUM BADAŃ NAD RAKIEM FRED HUTCHINSONIHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygota
B linie komórkowe limfoblastoidów (BLCL)FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTERhomozygota HLA-DRB1*1202
Kolba do hodowli komórkowych (T75)Corning430641
Płytka do hodowli komórkowych (96-dołkowa, z płaskim dnem)Corning3599Płaska
płytka do hodowli komórkowej (96-dołkowa, z okrągłym dnem)Corning3799Okrągłodenne
sitko do hodowli komórekCorningCLS431751Wielkość porów 70  μ m, biała, sterylna
probówka wirówkowa (15 ml)KIRGENKG2611sterylna
probówka wirówkowa (50 ml)Corning430829sterylna
wirówka, chłodzonaEppendorf5804R
ThermoST16R
, chłodzonaThermoLegend Micro 21R
Zestaw Cytofix/Cytoperm (zestaw czynnika transkrypcyjnego)BD Biosciences562574Przygotuj roztwór przed użyciem
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650Przechowywać w temperaturze pokojowej, aby zapobiec krystalizacji
Dulbecco' s Sól fizjologicznaPrzygotuj ddH2O (1000 ml) zawierający NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) i Na2HPO4,7H2O (2160  mg). Dostosuj PH do 7.4. Sterylizować w autoklawie.
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-03
Końcówki filtrujące (0,5-10)KirgenKG5131Sterylne
końcówki filtrujące (100-1000)KirgenKG5333Sterylne
końcówki filtrujące (1-200)KirgenKG5233Sterylny
anty-ludzki CD4 BioLegend 300506 sprzężony z FITCChronić przed światłem
Możliwy do naprawienia barwnik żywotności eFluor780eBioscience65-0865-14Chronić przed światłem
Inhibitor transportu białek GolgiStop (zawierający Monenzynę)BD Biosciences554724Inhibitor transportu białek
HemocytometrMarka718620
Peptydy rdzeniowe HBV pochodzące z antygenuChinyPeptydy
HEPESGibco15630080100 ml
Ludzka surowica ABGemini Bio-Products100-51100 ml
JonomycynaSigma-AldrichI0634
KClSangon BiotechA100395-0500
KH2PO4Sangon BiotechA100781-0500
LSRFortessa Cytometr przepływowyBD
L-glutaminaGibco25030081100 ml
probówka do mikrowirówek (1,5 ml)CorningMCT-150-CAutoklawizowana sterylizacja przed użyciem
Wytrząsarki do mikropłytekScientific IndustriesMicroPlate Genie
Mitomycyna CRoche10107409001
Na2HPO4.7H2OSangon BiotechA100348-0500
NaClSangon BiotechA100241-0500
Probówki PCR (0,2 ml)KirgenKG2331
PE/Cy7-sprzężony anty-ludzki CD8BioLegend300914Chronić przed światłem
Anty-ludzkim IFN-&gamma sprzężonym z PE;eBioscience12-7319-42Chronić przed światłem
Penicylina StreptomycynaGibco15140122100 ml
PerCP-Cy5.5-sprzężony anty-ludzki CD3eBioscience45-0037-42Chronić przed światłem
12-mirystynian 13-octan forbolu (PMA)Sigma-AldrichP1585
Rekombinowany ludzki IL-2PeproTech200-02
Rekombinowana ludzka IL-7PeproTech200-07
RPMI Medium 1640GibcoC11875500BT500 ml
Pirogonian sodu, 100mMGibco15360070
Trypanowa niebieska plama (0,4%)Gibco15250-061
Ultra-LEAF Oczyszczony anty-ludzki HLA-DRBioLegend307648
Wizard Genomic DNA Zestaw oczyszczającyPromegaA1125
IHW09121 wirówka , chłodzona wirówka buforowana fosforanami

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998(2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

limfocyty T CD4 swoiste dla HBVepitopy ograniczone przez HLA DRmononuklearne kom rki krwi obwodowejgradient g sto ci Ficollsekrecja cytokincytometria przep ywowawewn trzkom rkowe barwienie cytokinidentyfikacja epitop wprzewlek e zapalenie w troby typu B

Powiązane artykuły