Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62388

⸱

1 lipca 2021

 ,  ,  , 
1National Institute of Optics, National Research Council, 2LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, 3Physics Department, University of Florence

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Streszczenie

Ultraszybka spektroskopia siłowo-zaciskowa (UFFCS) to technika pojedynczej cząsteczki oparta na pęsetach laserowych, która pozwala na badanie chemomechaniki zarówno konwencjonalnych, jak i niekonwencjonalnych miozyn pod obciążeniem z niespotykaną dotąd rozdzielczością czasową. W szczególności możliwość sondowania silników miozyny pod stałą siłą zaraz po utworzeniu wiązania aktyna-miozyna, wraz z wysoką szybkością siłowego sprzężenia zwrotnego (200 kHz), wykazała, że UFFCS jest cennym narzędziem do badania zależności obciążenia od szybkiej dynamiki, takiej jak skok roboczy miozyny. Co więcej, UFFCS umożliwia badanie, w jaki sposób intensywność i kierunek przyłożonej siły wpływają na procesyjne i nieprocesowe interakcje miozyna-aktyna.

Postępując zgodnie z tym protokołem, możliwe będzie przeprowadzanie ultraszybkich eksperymentów z siłą zacisku na procesyjnych silnikach miozyny-5 oraz na różnych niekonwencjonalnych miozynach. Dzięki pewnym modyfikacjom protokół można również łatwo rozszerzyć na badania nad innymi klasami silników procesowych, takimi jak kinezyny i dyneiny. Protokół obejmuje wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, procedury kalibracji, gromadzenie i analizę danych.

Wprowadzenie

W ostatnich dziesięcioleciach pęsety optyczne były cennym narzędziem do wyjaśnienia mechanochemii oddziaływań białek na poziomie pojedynczej cząsteczki, ze względu na uderzającą możliwość jednoczesnej manipulacji i pomiaru zmian konformacyjnych i kinetyki enzymatycznej 1,2. W szczególności zdolność do przykładania i mierzenia sił w zakresie sił wywieranych przez silniki molekularne w komórce, wraz ze zdolnością do pomiaru subnanometrowych zmian konformacyjnych, sprawiły, że pęseta optyczna stała się unikalnym narzędziem jednocząsteczkowym do odkrywania właściwości chemomechanicznych białek motorycznych i ich mechanicznej regulacji.

Ultraszybka spektroskopia siłowo-zaciskowa (UFFCS) to technika spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki oparta na pęsetach optycznych, opracowana do badania szybkiej kinetyki silników molekularnych pod obciążeniem w geometrii trzech kulek (Rysunek 1a)3,4. UFFCS skraca opóźnienie czasu przyłożenia siły do białka motorycznego do fizycznego limitu pęsety optycznej, tj. czasu mechanicznego relaksacji systemu, umożliwiając w ten sposób szybkie przyłożenie siły po rozpoczęciu przebiegu miozyny (kilkadziesiąt mikrosekund)3. Ta zdolność została wykorzystana do zbadania wczesnych zdarzeń mechanicznych w szybkim układzie kostnym 3 i cardiac5 miozyny mięśniowej, aby ujawnić zależność obciążenia skoku siłowego, stany słabego i silnego wiązania, a także kolejność zdarzeń biochemicznych (Pi) i mechanicznych (udar siłowy).

Geometria trzech koralików jest zwykle stosowana do badania silników nieprocesowych, geometria pojedynczego koralika z zaciskiem siły jest powszechnie używana do badania procesyjnych niekonwencjonalnych miozyn, takich jak miozyna Va6. Istnieje jednak kilka powodów, dla których warto preferować test UFFCS z trzema kulkami również w przypadku miozyn procesowych. Po pierwsze, szybkie przyłożenie obciążenia zaraz po związaniu aktyny-miozyny pozwala na pomiar wczesnych zdarzeń w rozwoju siły, jak w silnikach nieprocesowych. Dodatkowo, w przypadku silników procesowych pozwala to również na dokładny pomiar długości i czasu trwania pracy silnika pod stałą siłą przez cały czas ich progresji (Rysunek 1b). Co więcej, ze względu na wysoki współczynnik sprzężenia zwrotnego siły, system może utrzymać stałą siłę podczas szybkich zmian pozycji, takich jak skok roboczy miozyny, gwarantując w ten sposób stałe obciążenie podczas stepowania silnika. Wysoka rozdzielczość czasowa systemu pozwala na wykrycie oddziaływań sub-ms, otwierając możliwość badania słabego wiązania miozyny z aktyną. Wreszcie, geometria testu gwarantuje, że siła jest przyłożona wzdłuż włókna aktynowego, przy znikomych poprzecznych i pionowych składowych siły. Ten punkt jest szczególnie istotny, ponieważ wykazano, że składowa siły pionowej znacząco wpływa na zależność kinetyki silnika od obciążenia7,8. Korzystając z tej techniki, możemy zastosować szereg obciążeń wspomagających i rezystancyjnych do procesowej miozyny-5B i bezpośrednio zmierzyć zależność obciążenia jej procesywności dla szerokiego zakresu sił4.

Jak pokazano w Rysunek 1a, w tym systemie pojedyncze włókno aktynowe jest zawieszone pomiędzy dwoma polistyrenowymi kulkami uwięzionymi w ognisku podwójnej pęsety optycznej ("hantle"). Niezrównoważona siła wypadkowa F= F1-F 2 jest nakładana na żarnik za pośrednictwem systemu szybkiego sprzężenia zwrotnego, który sprawia, że żarnik porusza się ze stałą prędkością w jednym kierunku, aż osiągnie zdefiniowany przez użytkownika punkt odwrócenia, w którym siła wypadkowa jest odwrócona w przeciwnym kierunku. Gdy białko motoryczne nie wchodzi w interakcję z włóknem, hantle mogą swobodnie poruszać się do przodu i do tyłu w kształcie trójkątnej fali (Rysunek 1b, dolny panel) obejmujący koralik postumentu, do którego przymocowane jest pojedyncze białko motoryczne. Po ustaleniu interakcji siła przenoszona przez hantle jest bardzo szybko przenoszona na białko motoryczne, a silnik zaczyna przemieszczać włókno, przechodząc pod intensywnością siły i kierunkiem, które zostały przyłożone przez system sprzężenia zwrotnego w momencie interakcji, aż miozyna odłączy się od aktyny. Będąc przemieszczeniem wytworzonym przez stopniowanie silnika zależnym od biegunowości uwięzionego włókna aktynowego, w zależności od kierunku przyłożonej siły obciążenie może być albo pomocnicze, tj. pchające w tym samym kierunku, co przemieszczenie silnika (pchanie w Rysunek 1b górny panel), albo rezystancyjne, tj. ciągnące w przeciwnym kierunku w stosunku do przemieszczenia silnika (ciągnięcie w Rysunek 1b górny panel) umożliwiający badanie chemomechanicznej regulacji procesywności ruchowej zarówno przez intensywność, jak i kierunkowość przyłożonego obciążenia.

W następnych sekcjach wszystkie kroki do pomiaru oddziaływań aktyna-miozyna-5B pod różnymi obciążeniami za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siła-cęgi są w pełni opisane, w tym 1) ustawienie układu optycznego, wyrównanie pułapek optycznych i procedury kalibracji, 2) przygotowanie wszystkich komponentów i ich montaż w komorze próbki, 3) procedura pomiaru, 4) reprezentatywne dane i analiza danych w celu wyodrębnienia ważnych parametrów fizycznych, takich jak długość biegu, rozmiar kroku i prędkość białka motorycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Układ optyczny

UWAGA: Układ eksperymentalny składa się z podwójnych pęset optycznych o nanometrycznej stabilności celowania i fluktuacjach intensywności lasera < 1%. W tych warunkach stabilność hantla na poziomie nanometrycznym jest gwarantowana przy typowej sztywności pułapki (0,1 pN/nm) i naprężeniu (1 pN – kilkanaście pN). Rysunek 2 przedstawia szczegółowy schemat układu optycznego.

  1. Projekt i konstrukcja pęsety optycznej 9,10,11.
    1. Umieść wszystkie elementy układu na stole optycznym zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 2. Należy pamiętać, że stół optyczny posiada aktywne izolatory w celu zminimalizowania wibracji mechanicznych. Dodatkowo konstrukcja mikroskopu jest zamontowana na izolatorach elastomerowych, aby pochłaniać hałas akustyczny i rezonanse mechaniczne.
    2. Wstaw izolator optyczny blisko źródła lasera („OI” na Rysunku 2), aby uniknąć przypadkowych fluktuacji amplitudy spowodowanych sprzężeniem zwrotnym.
    3. Zamknij całą drogę optyczną w szczelnej skrzynce, aby ograniczyć prądy powietrzne i turbulencje, które mogłyby wpłynąć na stabilność kierunku wiązki lasera.
    4. Stwórz podwójną pęsetę optyczną, dzieląc główne źródło laserowe (laser Nd:YAG, długość fali 1 064 nm na Rysunku 2) na dwie gałęzie o ortogonalnych polaryzacjach za pomocą polaryzacyjnych dzielników wiązki (PBS). Należy unikać pułapek z podziałem czasu, ponieważ indukują one oscylacje hantla pod napięciem12.
    5. Użyj dwóch akustyczno-optycznych deflektorów (AOD na Rysunku 2) sterowanych przez cyfrowe syntezatory bezpośrednie (DDS), aby umożliwić precyzyjne i szybkie przemieszczanie dwóch pułapek oraz dokładną regulację napięcia aktyny poprzez bezpośrednie sterowanie DDS za pomocą wyjść cyfrowych z karty FPGA (patrz Rysunek 2).
      ​UWAGA: Całkowity czas odpowiedzi sprzężenia zwrotnego musi wynosić <10 µs, aby szybko korygować i utrzymywać stałą siłę w obu pułapkach podczas pomiarów, w tym w stanie niezwiązanym, podczas oddziaływania z miozyną i ruchu. W tym celu detektory pozycji muszą mieć pasmo >= 100 kHz, a dane muszą być zbierane z częstotliwością próbkowania >= 200 kHz. Dla każdego pozyskanego punktu danych (czas akwizycji 5 µs) FPGA oblicza proporcjonalne korekty dla dwóch pułapek i przesyła je do dwóch DDS sterujących AOD. Czas odpowiedzi AOD musi być krótszy niż 5 µs, aby spełnić wymagany czas odpowiedzi sprzężenia zwrotnego.
    6. W celu detekcji pozycji uwięzionych kulek z dokładnością do nm, umieść dwa detektory z fotodiodą kwadratową (QPD na Rysunku 2) w tylnej płaszczyźnie ogniskowej kondensora. Precyzyjne wyrównanie QPD w płaszczyźnie sprzężonej z tylną płaszczyzną ogniskową kondensora, a także AOD w płaszczyźnie sprzężonej z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu, zapewni, że sygnały QPD będą niezależne od częstotliwości AOD.
    7. Zamontuj AOD na translatorze liniowym z napędem mikrometrycznym i przemieszczaj go, aż krawędź kryształu znajdzie się blisko wiązki lasera. Następnie zastąp obiektyw przysłoną, wycentrowaną w gwintowanej oprawie obiektywu, i wyreguluj jej otwór tak, aby odpowiadał rozmiarowi tylnej apertury obiektywu.
    8. Przesuwaj translator w stronę wiązki lasera, aż część wiązki blokowana przez kryształ piezoelektryczny stanie się widoczna za przysłoną; następnie lekko przesuń translator z powrotem, aby wiązka ponownie całkowicie wypełniła otwór przysłony.
    9. Powtórz kroki 1.1.7-1.1.8 dla drugiego AOD. Sprawdź czas odpowiedzi pętli sprzężenia zwrotnego, mierząc opóźnienie czasowe z QPD podczas szybkiego przemieszczania wiązki na kulce przyklejonej do powierzchni szkiełka podstawowego13.
      ​UWAGA: Powyższe trzy kroki (1.1.7-1.1.9) służą do dokładnego wyrównania kryształów AOD. Kroki te są ważne dla optymalizacji czasu odpowiedzi zarówno odchylenia wiązki, jak i sprzężenia zwrotnego13.
  2. Za pomocą fotodiody zmierz fluktuacje intensywności lasera pułapkującego na wejściu do mikroskopu, które muszą być poniżej 1%. Należy pamiętać, że pasmo fotodiody musi być większe niż szybkość obrazowania.
  3. Sprawdź stabilność kierunku obu pułapek.
    1. Przygotuj kulki krzemionkowe w buforze fosforanowym (PB), rozcieńczając 20 µL kulek krzemionkowych (1,2 µm, 10% ciał stałych) w 1 mL acetonu, sonikuj przez 30 s, krótko wymieszaj w wirówce (vortex) i wiruj przez 2 min przy 19 000 x g.
    2. Usuń nadfiltr, resuspenduj w 1 mL acetonu i powtórz płukanie. Resuspenduj w 1 mL 50 mM PB, przemyj 2 razy. Na koniec resuspenduj w 100 µL 50 mM PB.
    3. Przeprowadź kalibrację pęsety optycznej za pomocą kulek krzemionkowych, przyklejając szkiełko podstawowe do płytki mikroskopowej za pomocą dwustronnej taśmy (o grubości ok. 60 µm), aby zbudować komorę przepływową. Wypełnij komorę 1 mg/mL BSA (białko surowicy bydlęcej) i odczekaj 3 min.
    4. Wprowadź do komory rozcieńczenie 1:1000 kulek krzemionkowych w PB. Użyj strzykawki wypełnionej smarem silikonowym, aby starannie uszczelnić komorę. Uwięź pojedynczą kulkę w każdej pułapce i zastosuj metodę widma mocy14 w celu ich kalibracji.
    5. Przygotuj kulki krzemionkowe w octanie pentylu (w temperaturze pokojowej), rozpuszczając 20 µL kulek krzemionkowych (średnica 1,2 µm, 10% ciał stałych) w 1-1,5 mL acetonu, wymieszaj w wirówce i sonikuj przez 30 s.
    6. Wiruj przy 18 500 x g przez 2 min. Odrzuć nadfiltr i resuspenduj w 1 mL acetonu, a następnie powtórz płukanie. Resuspenduj w 1 mL octanu pentylu i powtórz płukanie (wirowanie i resuspensję) w octanie pentylu 2 razy. Resuspenduj osad w 100 µL 1% nitrocelulozy i 900 µL octanu pentylu. Przechowywać w 4 °C przez 2 miesiące.
    7. Weź szklane szkiełko podstawowe o wymiarach 24 x 24 mm i dokładnie oczyść je papierem nasączonym czystym etanolem. Następnie, trzymając je czystą pęsetą, wypłucz je drugi raz, myjąc bezpośrednio czystym etanolem. Pozostaw do wyschnięcia pod delikatnym strumieniem azotu. W razie potrzeby powtórz tę operację, aby usunąć wszystkie widoczne pozostałości z powierzchni szkła.
    8. Weź zapas kulek krzemionkowych, wymieszaj w wirówce i krótko sonikuj przez ok. 30 s.
    9. Po oczyszczeniu drugiego szkiełka (24 x 60 mm), użyj go do naniesienia 2 µL roztworu kulek krzemionkowych na jedną powierzchnię szkiełka i odczekaj do wyschnięcia.
    10. Dokładnie oczyść płytkę mikroskopową (26 x 76 mm), która posłuży do stworzenia komory przepływowej.
    11. Odetnij dwa pasy dwustronnej taśmy klejącej (szerokość ok. 3 mm, grubość 60-100 µm) i przytwierdź je po jednej stronie płytki mikroskopowej, jak pokazano na Rysunku 3.
    12. Używając czystej pęsety, zamknij komorę (końcowa objętość ok. 20 µL), przykładając powlekłe szkiełko (1.3.9) do pasów taśmy klejącej, tak aby warstwa nitrocelulozy i kulek była skierowana do wnętrza komory, jak pokazano na Rysunku 3a. Wypełnij komorę przepływową 50 mM buforem fosforanowym i uszczelnij smarem silikonowym.
    13. Wykonaj obrazowanie pojedynczej kulki krzemionkowej w mikroskopii w jasnym polu przy powiększeniu >200x, używając kamery CCD (charge-coupled device) lub CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor) z rozdzielczością >1,4 megapiksela. Użyj oprogramowania do sprzężenia zwrotnego, aby przesuwać stół piezoelektryczny (z dokładnością nanometryczną lub lepszą) w celu kompensacji dryftów termicznych10.
    14. Nałóż środek lewej pułapki na środek kulki (poziomy sygnału x-y z QPD powinny odpowiadać tym z kalibracji). Następnie zmierz szum pozycji i odchylenie standardowe sygnałów pozycji dla tej pułapki.
    15. Powtórz poprzedni krok dla prawej pułapki15.
  4. Kalibracja pozycji pułapki: MHz na nm
    1. Przygotuj komorę przepływową z kulkami krzemionkowymi przytwierdzonymi do powierzchni szkiełka (1.3.5-1.3.12) oraz pływającymi kulkami polistyrenowymi (użyj kulek koniugowanych z α-aktyniną przygotowanych zgodnie z następną sekcją 2.1).
    2. Skup kulkę krzemionkową na powierzchni szkiełka, lekko przesuniętą (~5 µm) od środka pola widzenia (FOV) i wykonaj obraz FOV. Przesuń kulkę o 10 µm w stronę centrum FOV za pomocą stołu piezoelektrycznego i wykonaj drugi obraz. Oblicz środek kulki na obu obrazach za pomocą algorytmu centroidu lub podobnego i oblicz odległość w pikselach między dwiema kulkami, aby uzyskać kalibrację nm/piksel kamery w jasnym polu.
    3. Uwięź pojedynczą pływającą cząstkę w jednej pułapce. Następnie przesuwaj pułapkę za pomocą AOD w małych krokach (0,2 MHz) i wykonaj obraz cząstki oraz zapisz odpowiadającą mu częstotliwość AOD dla każdego kroku. Oblicz pozycję cząstki w FOV, używając algorytmu centroidu jak wcześniej, i przelicz ją na nm, korzystając z kalibracji nm/piksel uzyskanej w poprzednim kroku.
    4. Wykonaj dopasowanie liniowe do danych częstotliwość-pozycja i oblicz stałą kalibracji w nm/MHz.
    5. Powtórz kalibrację dla drugiej pułapki
  5. Kalibracja mocy i sztywności pułapki (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
    1. Przygotuj komorę przepływową z kulkami krzemionkowymi przytwierdzonymi do powierzchni szkiełka (1.3.5-1.3.12) oraz pływającymi kulkami polistyrenowymi (użyj kulek koniugowanych z α-aktyniną przygotowanych zgodnie z następną sekcją 2.1) i uwięź pojedynczą cząstkę w jednej pułapce. Następnie przemieszczaj obie pułapki za pomocą AOD w małych krokach (0,2 MHz) i rejestruj ruchy Browna cząstki w obu pułapkach za pomocą QPD oraz odpowiadającą częstotliwość AOD.
    2. Oblicz średnią moc na detektorach dla każdej pozycji i wyznacz sztywność pułapki oraz stałą kalibracyjną beta QPD, dopasowując funkcję Lorentza do widma mocy zarejestrowanego ruchu Browna13.

2. Przygotowanie próbek

  1. Przygotowanie fluorescencyjnych kulek sprzęganych z α-aktyniną
    1. Przeprowadzenie sprzęgania16: Należy pobrać kulki polistyrenowe z grupami aminowymi (średnica 1 µm, 2,5% substancji stałej), przemyć je dwukrotnie w 500 μL wody destylowanej i resuspender w 500 μL PBS (pH 7,0). Należy dodać 1 mM ligandu estru succynimidylowego HaloTag O2 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h. Przemyć trzykrotnie 500 μL PBS i resuspender w 100-200 µM HaloTag α-aktyniny. Inkubować przez 1 h w 37 °C i przemyć trzykrotnie w 500 μL PBS (użyć kulek w ciągu 1,5 tygodnia lub zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w −80 °C).
    2. Znakowanie: Inkubować 200 µL zawiesiny kulek z Rodaminą-BSA przy końcowym stężeniu 5 µg/mL przez 10 min. Przemyć trzykrotnie 50 mM PB i resuspender w 500 µL 50 mM PB. Preparat ten można przechowywać w alikwotach w - 80 °C przez wiele miesięcy).
  2. Ekspresja i oczyszczanie biotynilowanej miozyny-5B zgodnie z wcześniejszymi opisami4,17.
  3. Polimeryzacja i znakowanie F-aktyny13:
    1. Polimeryzacja F-aktyny: Wymieszać 69 µL wody ultrapurej, 10 µL 10x buforu do polimeryzacji aktyny (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM węglanu guanydyny pH 7,5), 20 µL G-aktyny 10 mg/mL oraz 1 µL 1 M ditiotreitolu (DTT). Pozostawić na lodzie przez ponad 1 h.
    2. Znakowanie F-aktyny rodaminą (Ex/Em: 546/575 nm): Pobrać 25 µL spolimeryzowanej F-aktyny i dodać 19,5 µL wody ultrapurej, 2,5 µL 10x buforu do polimeryzacji aktyny (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM węglanu guanydyny pH 7,5), 1 µL 1 M DTT oraz 2 µL 250 µM faloidyny z rodaminą. Pozostawić na lodzie przez noc. Do eksperymentów z pułapkowaniem F-aktynę z rodaminą można przechowywać na lodzie i wykorzystać w ciągu tygodnia.
  4. Montaż próbki
    1. Pobrać komorę przepływową (1.3.5-1.3.12) i inkubować z 1 mg/mL biotynilowanym BSA przez 5 min. Po przemyciu buforem AB (25 mM MOPS ,25 mM KCl, 4mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH 7,2) inkubować z 1 mg/mL streptawidyną przez 5 min i ponownie przemyć buforem AB. Inkubować biotynilowaną ciężką meromiozynę miozyny-5B o stężeniu 3 nM w buforze M5B (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3) z 2 µM kalmoduliną (CaM) przez 5 min. Przemyć trzykrotnie objętością 1 mg/mL biotynilowanego BSA uzupełnionego o 2 µM CaM w buforze AB i inkubować przez 3 min.
    2. Podczas inkubacji przygotować mieszaninę reakcyjną (RM): 0,005% kulek funkcjonalizowanych α-aktyniną (sekcja 2.1), 1 nM F-aktyny z rodaminą (sekcja 2.3) w buforze obrazowym (IB: bufor AB z 1,2 µM oksydazą glukozową, 0,2 µM katalazą, 17 mM glukozą, 20 mM DTT, 2 µM CaM oraz ATP w stężeniu wymaganym dla danego eksperymentu).
    3. Przemyć mieszaniną RM i uszczelnić komorę smarem silikonowym. Próbka jest teraz gotowa do obserwacji pod mikroskopem.

3. Pomiar

  1. Zmontuj „hantel” (dumbbell).
    1. Znajdź pływające kuleczki α-actinin, przemieszczając próbkę za pomocą translatorów dalekiego zasięgu, włącz jedną pułapkę i uwięź jedną kuleczkę.
    2. Po zajęciu pierwszej pułapki przesuń translator tak, aby uwięziona kuleczka znajdowała się blisko powierzchni szkiełka nakrywkowe, aby uniknąć uwięzienia wielu kuleczek, a następnie uwięź kolejną kuleczkę w drugiej pułapce.
    3. Dostrój obie pułapki do równej sztywności, regulując moc fal akustycznych AOD. Sztywność ustawia się zazwyczaj w zakresie od 0,03 do 0,14 pN/nm. Im mniejsza sztywność, tym mniejszy szum siły, szczególnie przy niskich wartościach sił.
    4. Następnie obróć zmotoryzowane lustro M (Rysunek 2), aby przełączyć na mikroskopię fluorescencyjną, i znajdź włókno aktyny pływające w roztworze, przemieszczając próbkę za pomocą translatorów dalekiego zasięgu13. Wybieraj długie włókna (>5 µm), ponieważ procesywna miozyna będzie je przemieszczać o kilka mikrometrów przed odłączeniem się.
    5. Przesuń próbkę tak, aby jedna z uwięzionych kuleczek zbliżyła się do jednego z końców włókna, aż do momentu ich połączenia. Następnie dostosuj odległość między kuleczkami do przybliżonej długości włókna i wytwórz przepływ w kierunku niezwiązanej drugiej kuleczki, przesuwając stoлик w jej stronę. Włókno zostanie rozciągnięte przez przepływ i w końcu z nim zwiąże13. Kompleks kuleczka-aktyna-kuleczka nazywany jest „hantlem”.
  2. Nawiąż kontakt aktyna-miozyna.
    1. Delikatnie rozsuń obie pułapki, aby wstępnie naprężyć włókno do około 3 pN i zbadaj sztywność hantla, wprowadzając jedną pułapkę w oscylacje w postaci fali trójkątnej poprzez zmianę częstotliwości jednego z dwóch AOD oraz weryfikując następczą transmisję ruchu na kuleczkę podążającą za pomocą sygnału jej pozycji.
    2. Przesuń stoLik, aby umieścić hantel w pobliżu krzemionkowej kuleczki postumentowej i umożliwić kontakt między włóknem a białkiem przytwierdzonym do powierzchni kuleczki, dostosowując wysokość centrów uwięzionych kuleczek nieco poniżej średnicy kuleczki krzemionkowej. Następnie ustaw centrum kuleczki krzemionkowej pomiędzy uwięzionymi kuleczkami.
  3. Klemowanie siły (force clamp) i sprzężenie zwrotne stabilizacji nanometrycznej:
    1. Włącz ultraszybki klem siły z siłą 2-3 pN i oscylacją 200 nm i przeskanuj kuleczkę postumentową w dyskretnych krokach około 20-30 nm w kierunku prostopadłym do włókna aktyny. Odczekaj kilka sekund w każdej pozycji na wystąpienie oddziaływań, a następnie wykonaj kolejny krok, jeśli nie zaobserwowano interakcji. Po ustanowieniu oddziaływania białko-włókno znajdź pozycję, w której interakcje występują najczęściej.
    2. Upewnij się, że gdy procesywna miozyna porusza się w stronę jednego z końców włókna aktyny (zazwyczaj końca +), uwięziona kuleczka przyczepiona do końca + porusza się w stronę kuleczki krzemionkowej. Przesuń stoLik w stronę końca - włókna tak, aby kuleczka krzemionkowa znajdowała się jak najbliżej uwięzionej kuleczki przyczepionej do końca - włókna w momencie, gdy miozyna nie jest związana, i uruchom sprzężenie zwrotne stabilizacji nanometrycznej. W ten sposób zminimalizowano prawdopodobieństwo zderzenia uwięzionej kuleczki przyczepionej do końca + włókna z kuleczką krzemionkową.
  4. Zarejestruj dane.

4. Analiza danych4

UWAGA: Opisana metoda analizy pozwala na detekcję i pomiar przebiegów procesywnych oraz szybkich zdarzeń skokowych na podstawie zmian prędkości hantla, wywołanych skokami miozyny. Analiza przebiegów procesywnych jest przeprowadzana w oparciu o metodę analizy danych dla silników nieprocesywnych opisaną w referencjach3,4,13.

  1. Ustal próg zmian prędkości, aby umożliwić detekcję zdarzeń skokowych. Ponieważ w tym przypadku spodziewane są zarówno kroki do przodu, jak i do tyłu, przekroczenie progu jest akceptowane w obu kierunkach.
  2. Przypisz każdy krok do odpowiadającego mu przebiegu (run): jeśli odstęp czasowy między dwoma kolejnymi krokami jest krótszy niż 3 ms, a amplituda kroków wynosi < 90 nm, kroki są przypisywane do tego samego przebiegu, w przeciwnym razie kroki są przypisywane do różnych przebiegów4.
  3. Skoryguj długość przebiegu dla sił wspomagających4.
    1. Skoryguj długości przebiegów pod wpływem sił wspomagających, obliczając rzeczywistą wartość długości przebiegu RL z pomierzonej średniej wartości długości przebiegu <RLm> na podstawie następującego równania, gdzie D to zakres oscylacji:
      Równanie matematyczne ilustrujące gęstość prawdopodobieństwa i obliczanie wartości oczekiwanej.
      UWAGA: Szczegóły wyprowadzenia tego równania znajdują się w referencji4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne dane składają się z zapisów pozycji w czasie, co przedstawiono w Rysunek 4W zapisie pozycji widoczne są dwa rodzaje przemieszczenia. Po pierwsze, gdy silnik miozynowy nie oddziałuje z filamentem aktynowym, uwięzione kulki poruszają się ze stałą prędkością przeciwko sile oporu lepkości roztworu, wykazując liniowe przemieszczenie oscylujące w zakresie oscylacji ustawionym przez operatora w postaci fali trójkątnej.3 (niewidoczne w

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż techniki jednocząsteczkowe, takie jak test z trzema kulkami, są technicznie trudne i mają niską przepustowość, UFFCS poprawia wykrywanie interakcji molekularnych dzięki wysokiemu stosunkowi sygnału do szumu w danych. UFFCS pozwala na badanie zależności białek motorycznych od obciążenia, z głównymi zaletami bardzo szybkiego przyłożenia siły po związaniu silnika z włóknem w celu zbadania wczesnych i bardzo szybkich zdarzeń w wytwarzaniu siły i słabych stanach wiązania pod kontrolowaną siłą; Utrzymywanie stałej siły...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez program Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 871124 Laserlab-Europe, przez włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) oraz Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk otrzymał wsparcie w ramach stypendium interdyscyplinarnego Human Frontier Science Program LT008/2020-C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Koraliki alifatyczne aminowo-lateksoweThermoFisherA373621.0-μ m średnica, 2% (w/v)
AcetonSigma32201
Bufor polimeryzacyjny aktynyCytoszkieletBSA0210X
ADED (deflektory akustyczno-optyczne)AA Opto ElectronicDTS-XY 250Deflektory wiązki laserowej
ATPSigmaA7699
Biotynylowane-BSAThermoFisher29130
BSASigmaB4287
Kalmodulina z mózgu świni (CaM)Merck Millipore208783
Katalaza z wątroby bydlęcejSigmaC40
KondensatorOlympusOlympusU-AAC, Aplanat, AchromatNA 1.4, zanurzenie w oleju
Tetrahydrat fosforanu kreatyny sól disodowaSigma27920
Fosfokinaza kreatynowa z mięśnia królikaSigmaC3755
DDsAA Opto ElectronicAA. DDS. XXDwukanałowy syntezator cyfrowy
DL-Dithiothreitol (DTT)/td>Sigma43819
EGTASigma E4378
Cytoszkieletbiałka G-aktynyAKL99
GlukozaSigmaG7528
Oksydaza glukozowa z Aspergillus nigerSigma  G7141
HaloTag ligand o2 ester sukcynimidylowyPromegaP1691
Wysokopróżniowy smar silikonowy ciężkiMerck Millipore107921
KClSigmaP9541
KH2PO4 / K2HPO4SigmaP5379 / P8281
LabviewNational Instrumentswersja 8.1Akwizycja danych
Labview Moduł FPGANational Instrumentswersja 8.1Fast Force-Clamp
MatlabMathWorks2016Analiza danych
MgCl2Fluka63020
Mikroskop ObiektywNikonPlan-Apo 60XNA 1.2, WD 0.2 mm, woda imm.
MOPSSigmaM1254
NitrocelulozaSigmaN82670,45 wielkość porów
Roztwór octanu pentyluSigma46022
Czysty etanol  Sigma2860
QPDsUDTDLS-20D Wykrywanie pozycji
Rodaminy BSASondy molekularneA23016
Rodamina falloidyna  SigmaP1951
Koraliki krzemionkoweBangslabsSS04N1,21 mm, 10% ciał stałych
Azydek sodu  SigmaS2002
Białko Streptawidyny  Sigma189730
powiedział:

Bibliografia

  1. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
  2. Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
  3. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
  4. Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  5. Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266(2019).
  6. Clemen, A. E. -M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
  7. Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
  8. Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
  9. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157(2007).
  10. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
  11. Capitanio, M. Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , CRC Press. (2017).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
  13. Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
  14. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687(2002).
  15. Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446(2014).
  16. Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
  17. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  18. Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 8/25/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.

The title was updated from:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

to:

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Tagi

Pinceta laserowatechnika pojedynczych cząsteczekskurcz roboczy miozynyoddziaływanie aktyna z miozynąsprzężenie zwrotne siłykalibracja pułapki optycznejbiotynilowana miozyna-5Bakustooptyczne deflektory
Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.