Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Streszczenie

Ultraszybka spektroskopia siłowo-zaciskowa (UFFCS) to technika pojedynczej cząsteczki oparta na pęsetach laserowych, która pozwala na badanie chemomechaniki zarówno konwencjonalnych, jak i niekonwencjonalnych miozyn pod obciążeniem z niespotykaną dotąd rozdzielczością czasową. W szczególności możliwość sondowania silników miozyny pod stałą siłą zaraz po utworzeniu wiązania aktyna-miozyna, wraz z wysoką szybkością siłowego sprzężenia zwrotnego (200 kHz), wykazała, że UFFCS jest cennym narzędziem do badania zależności obciążenia od szybkiej dynamiki, takiej jak skok roboczy miozyny. Co więcej, UFFCS umożliwia badanie, w jaki sposób intensywność i kierunek przyłożonej siły wpływają na procesyjne i nieprocesowe interakcje miozyna-aktyna.

Postępując zgodnie z tym protokołem, możliwe będzie przeprowadzanie ultraszybkich eksperymentów z siłą zacisku na procesyjnych silnikach miozyny-5 oraz na różnych niekonwencjonalnych miozynach. Dzięki pewnym modyfikacjom protokół można również łatwo rozszerzyć na badania nad innymi klasami silników procesowych, takimi jak kinezyny i dyneiny. Protokół obejmuje wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, procedury kalibracji, gromadzenie i analizę danych.

Wprowadzenie

W ostatnich dziesięcioleciach pęsety optyczne były cennym narzędziem do wyjaśnienia mechanochemii oddziaływań białek na poziomie pojedynczej cząsteczki, ze względu na uderzającą możliwość jednoczesnej manipulacji i pomiaru zmian konformacyjnych i kinetyki enzymatycznej ^1,2. W szczególności zdolność do przykładania i mierzenia sił w zakresie sił wywieranych przez silniki molekularne w komórce, wraz ze zdolnością do pomiaru subnanometrowych zmian konformacyjnych, sprawiły, że pęseta optyczna stała się unikalnym narzędziem jednocząsteczkowym do odkrywania właściwości chemomechanicznych białek motorycznych i ich mechanicznej regulacji.

Ultraszybka spektroskopia siłowo-zaciskowa (UFFCS) to technika spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki oparta na pęsetach optycznych, opracowana do badania szybkiej kinetyki silników molekularnych pod obciążeniem w geometrii trzech kulek (Rysunek 1a)^3,4. UFFCS skraca opóźnienie czasu przyłożenia siły do białka motorycznego do fizycznego limitu pęsety optycznej, tj. czasu mechanicznego relaksacji systemu, umożliwiając w ten sposób szybkie przyłożenie siły po rozpoczęciu przebiegu miozyny (kilkadziesiąt mikrosekund)3. Ta zdolność została wykorzystana do zbadania wczesnych zdarzeń mechanicznych w szybkim układzie kostnym ³ i cardiac⁵ miozyny mięśniowej, aby ujawnić zależność obciążenia skoku siłowego, stany słabego i silnego wiązania, a także kolejność zdarzeń biochemicznych (Pi) i mechanicznych (udar siłowy).

Geometria trzech koralików jest zwykle stosowana do badania silników nieprocesowych, geometria pojedynczego koralika z zaciskiem siły jest powszechnie używana do badania procesyjnych niekonwencjonalnych miozyn, takich jak miozyna Va⁶. Istnieje jednak kilka powodów, dla których warto preferować test UFFCS z trzema kulkami również w przypadku miozyn procesowych. Po pierwsze, szybkie przyłożenie obciążenia zaraz po związaniu aktyny-miozyny pozwala na pomiar wczesnych zdarzeń w rozwoju siły, jak w silnikach nieprocesowych. Dodatkowo, w przypadku silników procesowych pozwala to również na dokładny pomiar długości i czasu trwania pracy silnika pod stałą siłą przez cały czas ich progresji (Rysunek 1b). Co więcej, ze względu na wysoki współczynnik sprzężenia zwrotnego siły, system może utrzymać stałą siłę podczas szybkich zmian pozycji, takich jak skok roboczy miozyny, gwarantując w ten sposób stałe obciążenie podczas stepowania silnika. Wysoka rozdzielczość czasowa systemu pozwala na wykrycie oddziaływań sub-ms, otwierając możliwość badania słabego wiązania miozyny z aktyną. Wreszcie, geometria testu gwarantuje, że siła jest przyłożona wzdłuż włókna aktynowego, przy znikomych poprzecznych i pionowych składowych siły. Ten punkt jest szczególnie istotny, ponieważ wykazano, że składowa siły pionowej znacząco wpływa na zależność kinetyki silnika od obciążenia^7,8. Korzystając z tej techniki, możemy zastosować szereg obciążeń wspomagających i rezystancyjnych do procesowej miozyny-5B i bezpośrednio zmierzyć zależność obciążenia jej procesywności dla szerokiego zakresu sił⁴.

Jak pokazano w Rysunek 1a, w tym systemie pojedyncze włókno aktynowe jest zawieszone pomiędzy dwoma polistyrenowymi kulkami uwięzionymi w ognisku podwójnej pęsety optycznej ("hantle"). Niezrównoważona siła wypadkowa F= F_{1-F 2} jest nakładana na żarnik za pośrednictwem systemu szybkiego sprzężenia zwrotnego, który sprawia, że żarnik porusza się ze stałą prędkością w jednym kierunku, aż osiągnie zdefiniowany przez użytkownika punkt odwrócenia, w którym siła wypadkowa jest odwrócona w przeciwnym kierunku. Gdy białko motoryczne nie wchodzi w interakcję z włóknem, hantle mogą swobodnie poruszać się do przodu i do tyłu w kształcie trójkątnej fali (Rysunek 1b, dolny panel) obejmujący koralik postumentu, do którego przymocowane jest pojedyncze białko motoryczne. Po ustaleniu interakcji siła przenoszona przez hantle jest bardzo szybko przenoszona na białko motoryczne, a silnik zaczyna przemieszczać włókno, przechodząc pod intensywnością siły i kierunkiem, które zostały przyłożone przez system sprzężenia zwrotnego w momencie interakcji, aż miozyna odłączy się od aktyny. Będąc przemieszczeniem wytworzonym przez stopniowanie silnika zależnym od biegunowości uwięzionego włókna aktynowego, w zależności od kierunku przyłożonej siły obciążenie może być albo pomocnicze, tj. pchające w tym samym kierunku, co przemieszczenie silnika (pchanie w Rysunek 1b górny panel), albo rezystancyjne, tj. ciągnące w przeciwnym kierunku w stosunku do przemieszczenia silnika (ciągnięcie w Rysunek 1b górny panel) umożliwiający badanie chemomechanicznej regulacji procesywności ruchowej zarówno przez intensywność, jak i kierunkowość przyłożonego obciążenia.

W następnych sekcjach wszystkie kroki do pomiaru oddziaływań aktyna-miozyna-5B pod różnymi obciążeniami za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siła-cęgi są w pełni opisane, w tym 1) ustawienie układu optycznego, wyrównanie pułapek optycznych i procedury kalibracji, 2) przygotowanie wszystkich komponentów i ich montaż w komorze próbki, 3) procedura pomiaru, 4) reprezentatywne dane i analiza danych w celu wyodrębnienia ważnych parametrów fizycznych, takich jak długość biegu, rozmiar kroku i prędkość białka motorycznego.

Protokół

1. Konfiguracja optyczna

UWAGA: Eksperymentalny zestaw składa się z podwójnej pęsety optycznej o nanometrowej stabilności celowania i < 1% fluktuacji intensywności lasera. W tych warunkach stabilność hantli na poziomie nanometrów jest gwarantowana przy typowej sztywności pułapki (0,1 pN/nm) i naprężeniu (1 pN - kilkadziesiąt pN). Rysunek 2 pokazuje szczegółowy schemat układu optycznego.

1. Projektowanie i budowa pęset optycznych ^9,10,11.
   1. Umieść wszystkie elementy zestawu na stole optycznym zgodnie ze schematem w Rysunek 2. Należy pamiętać, że stół optyczny zawiera aktywne izolatory w celu zminimalizowania drgań mechanicznych. Dodatkowo konstrukcja mikroskopu jest zamontowana na izolatorach elastomerowych, które pochłaniają szumy akustyczne i rezonanse mechaniczne
   .
   2. Umieść izolator optyczny w pobliżu źródła lasera ("OI" w Rysunek 2), aby uniknąć losowych wahań amplitudy spowodowanych optycznym sprzężeniem zwrotnym.
   3. Uszczelnij całą ścieżkę w zamkniętym pudełku, aby zmniejszyć prąd powietrza i turbulencje, które mogą mieć wpływ na stabilność wskazywania laserowego.
   4. Utwórz podwójną pęsetę optyczną, dzieląc główne źródło lasera (laser Nd:YAG, długość fali 1,064 nm w Rysunek 2) na dwie gałęzie o polaryzacji ortogonalnej za pomocą rozdzielaczy wiązki polaryzacyjnej (PBS). Należy unikać pułapek z podziałem czasu, ponieważ wywołują one drgania hantli pod napięciem¹².
   5. Użyj dwóch deflektorów akustyczno-optycznych (AOD-y w Rysunek 2) napędzanych przez bezpośrednie syntezatory cyfrowe (DDS), aby umożliwić precyzyjne i szybkie ruchy dwóch pułapek oraz precyzyjną regulację napięcia aktyny poprzez bezpośrednie sterowanie DDS przez wyjścia cyfrowe z programowalnej przez pole programowalnej płytki FPGA z matrycą bramek (patrz Rysunek 2).
      UWAGA: Całkowity czas reakcji sprzężenia zwrotnego musi wynosić <10 μs, aby szybko skorygować i utrzymać stałą siłę działającą na obie pułapki podczas pomiarów, w tym stanu niezwiązanego, interakcji i ruchu miozyny. W tym celu detektory położenia muszą mieć szerokość pasma > = 100 kHz, a dane muszą być pozyskiwane z częstotliwością próbkowania > = 200 kHz. Dla każdego pozyskanego punktu danych (czas akwizycji 5 μs) proporcjonalne poprawki dla dwóch pułapek są obliczane przez FPGA i wysyłane do dwóch DDS sterujących AD. Czas odpowiedzi AOD musi być niższy niż 5 μs, aby spełnić wymagany czas reakcji sprzężenia zwrotnego.
   6. W celu wykrycia nm położenia uwięzionych kulek, umieść dwa kwadrantowe detektory fotodiod (QPD w Rysunek 2) w tylnej płaszczyźnie ogniskowej kondensatora. Dokładne wyrównanie QPD w płaszczyźnie sprzężonej z tylną płaszczyzną ogniskową kondensatora, a także AOD-ów w płaszczyźnie sprzężonej z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu, zapewni, że sygnały QPD będą niezależne od częstotliwości AD.
   7. Zamontuj AOD na translatorze liniowym z napędem mikrometrycznym i przesuwaj go, aż krawędź kryształu zbliży się do wiązki laserowej. Następnie wymień obiektyw na przysłonę, wyśrodkowaną na gwintowanej obudowie obiektywu i wyreguluj jego przysłonę, aby dopasować ją do rozmiaru tylnego otworu obiektywu.
   8. Przesuń translator w kierunku wiązki laserowej, aż część wiązki zablokowana przez kryształ piezoelektryczny będzie widoczna po tęczówce, obróć translator lekko do tyłu, aby wiązka ponownie całkowicie wypełniła otwór tęczówki.
   9. Powtórz kroki 1.1.7-1.1.8 dla drugiego AOD. Sprawdź czas odpowiedzi pętli sprzężenia zwrotnego, mierząc opóźnienie czasowe od QPD podczas szybkiego przesuwania wiązki na koraliku przyklejonym do powierzchni szkiełka nakrywkowego¹³.
      UWAGA: Powyższe trzy kroki (1.1.7-1-1-9) prowadzą do starannego wyrównania kryształów AOD. Te kroki są ważne, aby zoptymalizować reakcję czasową zarówno ugięcia belki, jak i sprzężenia zwrotnego¹³.
2. Za pomocą fotodiody zmierz fluktuacje natężenia lasera pułapkującego przy wejściu do mikroskopu, które muszą wynosić poniżej 1%. Należy pamiętać, że szerokość pasma fotodiody musi być większa niż szybkość obrazowania.
3. Sprawdź stabilność wskazywania obu pułapek.
   1. Przygotować kulki krzemionkowe w buforze fosforanowym (PB), rozcieńczając 20 μl kulek krzemionkowych (1,2 μm, 10% ciał stałych) w 1 ml acetonu, sonikować przez 30 s, krótko wirować i wirować przez 2 minuty przy 19 000 x g.
   2. Usunąć supernatant, ponownie zamieszać w 1 ml acetonu i powtórzyć pranie. Zawiesić ponownie w 1 ml 50 mM PB, przemyć 2 razy. Na koniec zawiesić ponownie w 100 μl 50 mM PB.
   3. Wykonaj kalibrację pęsety optycznej za pomocą kulek krzemionkowych, przyklejając szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego za pomocą taśmy dwustronnej (o grubości około 60 μm) w celu zbudowania komory przepływowej. Napełnij komorę 1 mg/ml BSA (białko albuminy surowicy bydlęcej) i odczekaj 3 minuty.
   4. Wlej do komory rozcieńczone w stosunku 1:1000 kulki krzemionki w PB. Użyj strzykawki wypełnionej smarem silikonowym, aby dokładnie uszczelnić komorę. Umieść pojedynczy koralik w każdej pułapce i zastosuj metodę widma mocy¹⁴, aby je skalibrować.
   5. Przygotować kulki krzemionkowe w octanie pentylu (w temperaturze pokojowej), rozpuszczając 20 μl kulek krzemionkowych (o średnicy 1,2 μm, 10% ciała stałego) w 1-1,5 ml acetonu, wirować i sonikować przez 30 s.
   6. Wirować przy 18 500 x g przez 2 minuty. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml acetonu, a następnie powtórzyć mycie. Zawiesić ponownie w 1 ml octanu pentylu i powtórzyć mycie (odwirowanie i ponowne wymieszanie) w octanie pentylu 2 razy. Zawiesić osad w 100 μl nitrocelulozy 1% i 900 μl octanu pentylu. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 miesiące.
   7. Weź szkiełko nakrywkowe ze szkła o wymiarach 24 x 24 mm i dokładnie wyczyść je papierem nasączonym czystym etanolem. Następnie, trzymając go czystą pęsetą, spłucz go po raz drugi, myjąc bezpośrednio czystym etanolem. Pozostaw do wyschnięcia pod delikatnym przepływem azotu. W razie potrzeby powtórz tę operację, aby usunąć wszystkie widoczne pozostałości z powierzchni szkła.
   8. Weź bulion z kulek krzemionki, zwiruj go i krótko sonikuj przez ~30 s.
   9. Po oczyszczeniu drugiego szkiełka nakrywkowego (24 x 60 mm) rozsmaruj nim 2 μl roztworu kulek krzemionkowych na jednej powierzchni szkiełka nakrywkowego i poczekaj, aż wyschnie.
   10. Dokładnie wyczyść szkiełko mikroskopowe (26 x 76 mm), które zostanie użyte do stworzenia komory przepływowej.
   11. Wytnij dwie linie podwójnej taśmy klejącej (~3 mm grubości, 60-100 μm grubości) i przymocuj je po jednej stronie szkiełka mikroskopowego, jak pokazano na Rysunek 3.
   12. Za pomocą czystej pęsety zamknij komorę (około 20 μl końcowej objętości), umieszczając powlekane szkiełko nakrywkowe (1.3.9) w kontakcie z liniami taśmy klejącej, z warstwą nitrocelulozy + kulek skierowaną do wnętrza komory, jak pokazano na Rysunek 3a. Napełnij komorę przepływową buforem fosforanowym o pojemności 50 mM i uszczelnij ją smarem silikonowym.
   13. Zobrazuj pojedynczą kulkę krzemionki w mikroskopii jasnego pola w powiększeniu >200x za pomocą kamery CCD (Charge-coupled Device) lub kamery CMOS (Metal-Oxide-Semiconductor) o rozdzielczości >1,4 megapiksela. Użyj oprogramowania do informacji zwrotnej, aby przesunąć stolik piezoelektryczny (z dokładnością nanometrową lub lepszą), aby skompensować dryfty termiczne¹⁰.
   14. Nałóż na siebie środek lewej pułapki ze środkiem koralika (poziomy sygnału x-y z QPD powinny być zgodne z tymi z kalibracji). Następnie zmierz szum położenia i odchylenie standardowe sygnałów położenia dla tej pułapki.
   15. Powtórz poprzedni krok dla prawej pułapki¹⁵.
4. Kalibracja pozycji pułapki: MHz do nm
   1. Przygotować komorę przepływową z kulkami krzemionkowymi przymocowanymi do powierzchni szkiełka nakrywkowego (1.3.5-1.3.12) i pływającymi kulkami polistyrenowymi (użyć kulek sprzężonych α-aktyniną przygotowanych jak w następnej sekcji 2.1).
   2. Skoncentruj kulkę krzemionki na powierzchni szkiełka nakrywkowego lekko zdecentrowaną (~5 μm) od środka pola widzenia (FOV) i uzyskaj obraz pola widzenia. Przesuń koralik o 10 μm w kierunku środka pola widzenia za pomocą stolika piezoelektrycznego i uzyskaj drugi obraz. Oblicz środek ściegu na dwóch obrazach za pomocą algorytmu centroidy lub podobnego i oblicz odległość w pikselach między dwoma koralikami, aby uzyskać kalibrację nm/piksel kamery w jasnym polu.
   3. Uwięzij pojedynczą unoszącą się cząstkę w jednej pułapce. Następnie przesuwaj pułapkę za pomocą AOD małymi krokami (0,2 MHz) i uzyskaj obraz cząstki i odpowiadającą jej częstotliwość AOD dla każdego kroku. Oblicz położenie cząstki w polu widzenia za pomocą algorytmu środka ciężkości jak poprzednio i przelicz je na nm, korzystając z kalibracji nm/pikseli uzyskanej w poprzednim kroku.
   4. Wykonać dopasowanie liniowe do danych dotyczących położenia częstotliwościowego i obliczyć stałą kalibracji w nm/MHz.
   5. Powtórz kalibrację dla drugiej pułapki
5. Kalibracja mocy i sztywności pułapki (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
   1. Przygotować komorę przepływową z kulkami krzemionkowymi przymocowanymi do powierzchni szkiełka nakrywkowego (1.3.5-1.3.12) i pływającymi kulkami polistyrenowymi (użyć kulek sprzężonych α-aktyniną przygotowanych jak w następnej sekcji 2.1) i uwięzić pojedynczą cząstkę w jednej pułapce. Następnie przesuwaj obie pułapki przez AOD-y małymi krokami (0,2 MHz) i rejestruj ruch Browna cząstki w obu pułapkach za pomocą QPD i odpowiedniej częstotliwości AOD.
   2. Oblicz średnią moc detektorów w każdej pozycji i uzyskaj sztywność pułapki oraz stałą kalibracji QPD beta, dopasowując funkcję Lorentza do widma mocy zarejestrowanego ruchu Browna¹³.

2. Przygotowanie próbki

1. Przygotuj koraliki fluorescencyjne sprzężone z α-aktyniną
   1. Wykonaj koniugację¹⁶: Weź aminowsko-funkcjonalizowane kulki polistyrenowe (średnica 1 μm, 2,5% ciał stałych), umyj je dwukrotnie w 500 μl wody destylowanej i ponownie zawiesij w 500 μl PBS (pH 7,0). Dodać 1 mM ligand sukcynimidydowego estru O₂ HaloTag i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przemyć trzykrotnie 500 μl PBS i ponownie zawiesić 100-200 μM HaloTag α-aktyniny. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i przemyć trzykrotnie w 500 μl PBS (użyć kulek w ciągu 1,5 tygodnia lub zamrożonych w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C).
   2. Etykietowanie: Inkubować 200 μl roztworu kulek z rodaminą-BSA w końcowym stężeniu 5 μg/ml przez 10 min. Przemyć trzykrotnie 50 mM PB i ponownie zawiesić w 500 μl PB 50 mM. Może być on przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C przez wiele miesięcy).
2. Ekspresuj i oczyszczaj biotynylowaną miozynę-5B zgodnie z wcześniejszym opisem^4,17.
3. Polimeryzuj i oznacz F-aktynę¹³:
   1. Polimeryzacja F-aktyny: Wymieszaj 69 μL ultraczystej wody, 10 μL buforu do polimeryzacji aktyny 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl₂, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM węglanu guanidyny pH 7,5), 20 μL G-aktyny 10 mg/ml i 1 μL DL-Ditiotreitolu (DTT) 1 M. Pozostaw na lodzie na dłużej niż 1 godzinę.
   2. znakowanie F-aktyny rodaminą (Ex/Em: 546/575 nm): Weź 25 μL spolimeryzowanej F-aktyny i dodaj 19,5 μl ultraczystej wody, 2,5 μL buforu do polimeryzacji aktyny 10x (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl₂, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM węglan guanidyny pH 7,5), 1 μL 1 M DTT, i 2 μL 250 μM falloidyny rodaminy. Pozostaw na lód na noc. Do eksperymentów z pułapkami F-aktyna rodaminy może być przechowywana na lodzie i zużyta w ciągu tygodnia.
4. Przykładowy montaż
   1. Pobrać komorę przepływową (1.3.5-1.3.12) i inkubować 1 mg/ml biotynylowanego BSA przez 5 minut. Po przemyciu buforem AB (25 mM MOPS, 25 mM KCl, 4mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH 7,2) inkubować 1 mg/ml streptawidyny przez 5 minut i ponownie przemywać buforem AB. Inkubować biotynylowaną miozynę-5B ciężką meromyozynę o stężeniu 3 nM w buforze M5B (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN₃) z 2 μM kalmoduliną (CaM) przez 5 minut. Przemyć trzema objętościami 1 mg/ml biotynylowanego BSA uzupełnionego 2 μM CaM w AB i inkubować przez 3 minuty.
   2. Podczas inkubacji przygotować Mieszaninę Reakcyjną (RM): 0,005% kulek funkcjonalizowanych α-aktyniną (sekcja 2.1), 1 nM F-aktyny rodaminy (sekcja 2.3) w buforze do obrazowania (IB: bufor AB z 1,2 μM oksydazy glukozowej, 0,2 μM katalazy, 17 mM glukozy, 20 mM DTT, 2 μM CaM i ATP w stężeniu potrzebnym do eksperymentu).
   3. Umyć RM i uszczelnić komorę smarem silikonowym. Próbka jest teraz gotowa do obejrzenia pod mikroskopem.

3. Pomiar

1. Złóż hantle.
   1. Poszukaj pływających kulek α-aktyniny, przesuwając próbkę za pomocą translatorów dalekiego zasięgu, włącz jedną pułapkę i złap jeden koralik.
   2. Gdy pierwsza pułapka zostanie zajęta, przesuń translator tak, aby umieścił uwięziony ścieg blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć przytrzaśnięcia wielu koralików, i uwięzić kolejny koralik w drugiej pułapce.
   3. Dostosuj dwie pułapki do równej sztywności, dostosowując moc fal akustycznych AOD. Sztywności są zwykle ustawiane w zakresie od 0,03 do 0,14 pN/nm. Im mniejsza sztywność, tym mniejsza siła, hałas, szczególnie przy małych siłach.
   4. Następnie obróć zmotoryzowane lustro M (Rysunek 2), aby przełączyć się na mikroskopię fluorescencyjną i poszukać filamentu aktyny unoszącego się w roztworze, przesuwając próbkę przez translatory dalekiego zasięgu¹³. Preferuj długie włókna (>5 μm), ponieważ procesywna miozyna przemieści ją i przesunie o kilka mikronów przed odłączeniem.
   5. Przesuń próbkę, aby jeden z uwięzionych koralików zbliżył się do jednego końca włókna, aż połączą się ze sobą. Następnie dostosuj odległość koralików do przybliżonej długości włókna i utwórz przepływ w kierunku niezwiązanego drugiego koralika, przesuwając stolik w jego kierunku. Filament zostanie rozciągnięty przez przepływ i ostatecznie się z nim zwiąże¹³. Kompleks koralików-aktyny-koralików nazywa się "hantlami".
2. Nawiąż kontakt aktyna-miozyna.
   1. Delikatnie oddziel dwie pułapki daleko od siebie, aby wstępnie napiąć włókno do około 3 pN i zbadaj sztywność hantli, wprawiając jedną pułapkę w drgania w fali trójkątnej, zmieniając częstotliwość jednego z dwóch ADED i sprawdzając konsekwentne przenoszenie ruchu na stopkę wleczoną za pomocą jej sygnału położenia.
   2. Przesuń stolik, aby umieścić hantle w pobliżu kulki krzemionkowej na cokole i umożliwić kontakt między filamentem a białkiem przyczepionym do powierzchni kulki, regulując wysokość uwięzionych środków koralików nieco poniżej średnicy kulki krzemionkowej. Następnie umieść środek koralika krzemionkowego pomiędzy uwięzionymi koralikami.
3. Siła docisku i sprzężenie zwrotne stabilizacji nm:
   1. Włącz ultraszybki zacisk siłowy o sile 2-3 pN i oscylacji 200 nm i skanuj koralik postumentu w dyskretnych krokach co około 20-30 nm w kierunku prostopadłym do filamentu aktynowego. Poczekaj, aż w każdej pozycji wystąpią interakcje (kilka sekund), a następnie zrób krok do przodu, jeśli nie zaobserwujesz żadnej interakcji. Po ustaleniu interakcji białko-filament poszukaj pozycji, w której interakcje są częstsze.
   2. Upewnij się, że gdy procesowa miozyna przesuwa się w kierunku jednego końca włókna aktynowego (zwykle końca +), uwięziony koralik przyczepiony do końca + przesuwa się w kierunku kulki krzemionkowej. Przesuń stolik w kierunku -końca filamentu, tak aby kulka krzemionki leżała jak najbliżej uwięzionego koralika przymocowanego do -końca filamentu, gdy miozyna nie jest związana, i rozpocznij sprzężenie zwrotne stabilizacji nanometrów. W ten sposób zminimalizowane jest prawdopodobieństwo, że uwięziony koralik przymocowany do końca + filamentu zderzy się z koralikiem krzemionkowym.
4. Rejestruj dane.

4. Analiza danych⁴

UWAGA: Opisana metoda analizy pozwala na wykrywanie i pomiar przebiegów procesowych i zdarzeń szybkiego kroku w oparciu o zmiany prędkości hantli, spowodowane steppingiem miozyny. Analiza przebiegów procesowych jest przeprowadzana w oparciu o metodę analizy danych dla silników nieprocesowych opisaną w references^3,4,13.

1. Ustaw próg zmian prędkości, aby umożliwić stopniowe wykrywanie zdarzeń. Ponieważ w tym przypadku spodziewane są zarówno kroki do przodu, jak i do tyłu, przekroczenie progu jest akceptowane w obu kierunkach.
2. Przypisz każdy krok do odpowiedniego przebiegu: jeśli odstęp czasu między dwoma kolejnymi krokami jest krótszy niż 3 ms, a amplituda kroków wynosi < 90 nm, kroki są przypisywane do tego samego przebiegu, w przeciwnym razie kroki są przypisywane do różnych przebiegów⁴.
3. Poprawna długość biegu dla sił wspomagających⁴.
   1. Skorygować długości biegu pod wpływem sił wspomagających, obliczając rzeczywistą wartość długości biegu RL ze zmierzonej wartości średniej długości biegu <RL_m> z poniższego równania, gdzie D jest zakresem oscylacji:
      
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat wyprowadzania tego równania można znaleźć w reference⁴.

Wyniki

Dane reprezentatywne składają się z rekordów pozycji w czasie, jak pokazano w Rysunek 4. W zapisie pozycji widoczne są dwa rodzaje przemieszczeń. Po pierwsze, gdy silnik miozyny nie oddziałuje z włóknem aktyny, uwięzione kulki poruszają się ze stałą prędkością w stosunku do lepkiej siły oporu roztworu, wykazując przemieszczenie liniowe oscylujące w zakresie oscylacji ustawionym przez operatora w fali trójkątnej³ (niewidoczne w Rysu...

Dyskusja

Chociaż techniki jednocząsteczkowe, takie jak test z trzema kulkami, są technicznie trudne i mają niską przepustowość, UFFCS poprawia wykrywanie interakcji molekularnych dzięki wysokiemu stosunkowi sygnału do szumu w danych. UFFCS pozwala na badanie zależności białek motorycznych od obciążenia, z głównymi zaletami bardzo szybkiego przyłożenia siły po związaniu silnika z włóknem w celu zbadania wczesnych i bardzo szybkich zdarzeń w wytwarzaniu siły i słabych stanach wiązania pod kontrolowaną siłą; Utrzymywanie stałej siły...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koraliki alifatyczne aminowo-lateksowe	ThermoFisher	A37362	1.0-μ m średnica, 2% (w/v)
Aceton	Sigma	32201
Bufor polimeryzacyjny aktyny	Cytoszkielet	BSA02	10X
ADED (deflektory akustyczno-optyczne)	AA Opto Electronic	DTS-XY 250	Deflektory wiązki laserowej
ATP	Sigma	A7699
Biotynylowane-BSA	ThermoFisher	29130
BSA	Sigma	B4287
Kalmodulina z mózgu świni (CaM)	Merck Millipore	208783
Katalaza z wątroby bydlęcej	Sigma	C40
Kondensator	Olympus	OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat	NA 1.4, zanurzenie w oleju
Tetrahydrat fosforanu kreatyny sól disodowa	Sigma	27920
Fosfokinaza kreatynowa z mięśnia królika	Sigma	C3755
DDs	AA Opto Electronic	AA. DDS. XX	Dwukanałowy syntezator cyfrowy
DL-Dithiothreitol (DTT)/td>	Sigma	43819
EGTA		Sigma E4378
Cytoszkielet	białka G-aktyny	AKL99
Glukoza	Sigma	G7528
Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger	Sigma	G7141
HaloTag ligand o2 ester sukcynimidylowy	Promega	P1691
Wysokopróżniowy smar silikonowy ciężki	Merck Millipore	107921
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4 / K2HPO4	Sigma	P5379 / P8281
Labview	National Instruments	wersja 8.1	Akwizycja danych
Labview Moduł FPGA	National Instruments	wersja 8.1	Fast Force-Clamp
Matlab	MathWorks	2016	Analiza danych
MgCl2	Fluka	63020
Mikroskop Obiektyw	Nikon	Plan-Apo 60X	NA 1.2, WD 0.2 mm, woda imm.
MOPS	Sigma	M1254
Nitroceluloza	Sigma	N8267	0,45 wielkość porów
Roztwór octanu pentylu	Sigma	46022
Czysty etanol	Sigma	2860
QPDs	UDT	DLS-20	D Wykrywanie pozycji
Rodaminy BSA	Sondy molekularne	A23016
Rodamina falloidyna	Sigma	P1951
Koraliki krzemionkowe	Bangslabs	SS04N	1,21 mm, 10% ciał stałych
Azydek sodu	Sigma	S2002
Białko Streptawidyny	Sigma	189730