Artykuł metodologiczny

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

DOI:

10.3791/62399

⸱

18 maja 2022

 , 
1Department of Biology, Valparaiso University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siatkówka piskląt od dawna jest ważnym systemem modelowym w neurobiologii rozwojowej, z zaletami, takimi jak jej duży rozmiar, szybki rozwój i dostępność do wizualizacji i eksperymentalnych manipulacji. Jednak jego głównym ograniczeniem technicznym był brak solidnych podejść do analizy funkcji genów w przypadku utraty funkcji. Protokół ten opisuje metodologię wyciszania genów w rozwijającej się siatkówce pisklęcia, która obejmuje transgeniczną ekspresję sztucznych mikroRNA (miRNA) przy użyciu systemu transpozonów Tol2. W tym podejściu plazmid transpozonu Tol2, który zawiera kasetę ekspresyjną dla markera EmGFP (szmaragdowo-zielonego białka fluorescencyjnego) i sztuczne sekwencje pre-miRNA przeciwko genowi docelowemu, jest wprowadzany do embrionalnej siatkówki pisklęcia z konstrukcją ekspresji transpozazy Tol2 za pomocą elektroporacji in ovo. W transfekowanych komórkach siatkówki transpozaza katalizuje wycięcie kasety ekspresyjnej z wektora transpozonu i jej integrację z chromosomami gospodarza, prowadząc do stabilnej ekspresji miRNA i białka EmGFP. W naszym poprzednim badaniu wykazaliśmy, że ekspresja Nel, glikoproteiny, która pełni wiele funkcji w rozwoju neuronalnym, może być znacznie stłumiona w rozwijającej się siatkówce pisklęcia przy użyciu tej techniki. Nasze wyniki wskazują, że ta metodologia indukuje stabilną i solidną supresję ekspresji genów, a tym samym zapewnia skuteczne podejście do utraty funkcji w badaniach nad rozwojem siatkówki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siatkówka kręgowców jest ważnym modelowym systemem do badania rozwoju neuronalnego. Pomimo swojego położenia obwodowego, siatkówka jest anatomicznie i rozwojowo przedłużeniem ośrodkowego układu nerwowego, a nerw wzrokowy, który składa się z aksonów komórek zwojowych siatkówki, stanowi drogę w ośrodkowym układzie nerwowym. Siatkówka pisklęcia ma znaczące zalety jako system modelowy do badania molekularnego mechanizmu rozwoju neuronalnego: jest duża i szybko się rozwija; Ma strukturalne i funkcjonalne podobieństwa do ludzkiej siatkówki; Jest wysoce dostępny do wizualizacji i manipulacji eksperymentalnych. Molekularne mechanizmy proliferacji i różnicowania komórek, morfogenezy i kierowania aksonami podczas rozwoju neuronalnego zostały szeroko zbadane przy użyciu siatkówki kurczaka.

Elektroporacja in ovo była z powodzeniem stosowana w ciągu ostatnich dwóch dekad do wprowadzania genów ektopowych do komórek w rozwijającym się zarodku pisklęcia. Technika ta pozwala na znakowanie rozwijających się komórek, śledzenie losu komórek oraz śledzenie migracji komórek i dróg aksonowych, a także ektopową ekspresję genów do analizy funkcji genów in vivo. Warunki elektroporacji in ovo dla efektywnej ektopowej ekspresji genów w zarodkach piskląt zostały dobrze ustalone1,2,3.

Pomimo tych zalet, brak stabilnej techniki utraty funkcji do badań nad funkcją genów był głównym technicznym ograniczeniem zarodka pisklęcia. Podczas gdy zarodki piskląt naelektryzowane małymi interferującymi RNA (siRNA) 4 lub wektory ekspresyjne dla krótkich RNA typu hairpin (shRNAs)5 wykazują knockdown docelowego genu, supresja genów w tych podejściach jest przejściowa, ponieważ efekty znikają, gdy komórki tracą wprowadzone RNA lub DNA. Bardziej stabilną supresję genów można osiągnąć poprzez dostarczanie siRNA do zarodków piskląt za pomocą RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a s plice acceptor) retrovirus system6. Wektor wirusowy integruje się z genomem gospodarza, a geny ektopowe ulegają stabilnej ekspresji. Jednak retrowirus może zintegrować się z genomem dzielących się komórek tylko podczas fazy mitotycznej (M) cyklu komórkowego, co może nakładać ograniczenia na etapy rozwoju i/lub typy komórek, dla których można zastosować to podejście polegające na utracie funkcji. Ponadto ekspresja transgenów przez RCAS wydaje się wolniejsza i mniej silna niż ta indukowana przez elektroporację in ovo 7.

Transpozony to elementy genetyczne, które przemieszczają się z jednego miejsca w genomie do drugiego. Pierwiastek Tol2 należy do rodziny elementów transpozycyjnych hAT i zawiera wewnętrzny gen kodujący transpozę, który katalizuje reakcję transpozonu elementu Tol2 8. Kiedy wektor plazmidowy, który przenosi kasetę ekspresji genów otoczoną sekwencjami lewego i prawego końca elementów Tol2 (odpowiednio 200 pz i 150 pz) jest wprowadzany do komórek kręgowców za pomocą konstruktu ekspresji transpozazy Tol2, kaseta ekspresji jest wycinana z plazmidu i integrowana z genomem gospodarza, co wspiera stabilną ekspresję genu ektopowego (Rysunek 1). Wykazano, że element transpozycyjny Tol2 może bardzo skutecznie indukować transpozycję genów u różnych gatunków kręgowców, w tym danio pręgowanego9,10, frogs11, chicks12 i myszy13, a zatem jest użyteczną metodą transgenezy i mutagenezy insercyjnej. System transpozonów Tol2 został z powodzeniem wykorzystany do warunkowego knockdown docelowego genu poprzez genomową integrację siRNA, który jest przetwarzany z długiego dwuniciowego RNA14.

Ten protokół opisuje podejście polegające na utracie funkcji w zarodku pisklęcia, które polega na wprowadzeniu sztucznych mikroRNA (miRNA) przez system transpozonów Tol215,16. W tym podejściu kaseta ekspresyjna dla markera EmGFP (szmaragdowozielonego białka fluorescencyjnego) i sztucznych miRNA przeciwko docelowemu genowi jest klonowana do wektora transpozonu Tol2. Konstrukt transpozonu Tol2 jest następnie wprowadzany do embrionalnej siatkówki pisklęcia za pomocą konstrukcji ekspresji transpozazy Tol2 za pomocą elektroporacji in ovo. W transfekowanych komórkach siatkówki transpozaza katalizuje wycięcie kasety ekspresyjnej z wektora transpozonu i jej integrację z chromosomami gospodarza, prowadząc do stabilnej ekspresji miRNA i białka EmGFP. W naszych poprzednich badaniach udało nam się obniżyć ekspresję Nel, zewnątrzkomórkowej glikoproteiny ulegającej głównie ekspresji w układzie nerwowym, w rozwijającej się siatkówce pisklęcia (patrz wyniki reprezentatywne). Nasze wyniki wskazują, że za pomocą tej techniki można osiągnąć stabilną i skuteczną supresję genów in ovo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa wektorów ekspresyjnych miRNA

UWAGA: Procedury konstruowania wektorów ekspresji miRNA (kroki 1.1-1.3, 1.5-1.6.) są zoptymalizowane dla zestawu do ekspresji miRNA, zestawu do ekspresji miRNA Block-iT Pol II miR z EmGFP, jak wcześniej opisano15,16. Zestaw zawiera wektor ekspresyjny przeznaczony do ekspresji miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), wektor kontrolny (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-ujemny plazmid kontrolny), dodatkowe odczynniki oraz instrukcje do wytwarzania wektorów ekspresyjnych miRNA (patrz Tabela materiałów)17.

  1. Projektowanie jednoniciowych oligonukleotydów DNA kodujących pre-miRNA względem genu docelowego: Projektowanie jednoniciowych oligonukleotydów DNA ("oligonukleotydów górnej nici" (docelowe pre-miRNA) i "dolnych nici" oligonukleotydów (dopełnienia oligonukleotydów górnej nici)) za pomocą narzędzia online RNAi Designer (patrz tabela materiałów). Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z wymaganymi cechami jednoniciowych oligonukleotydów (Rysunek 2A) oraz przykładami sekwencji docelowych (Rysunek 2B).
    UWAGA: Zaleca się wygenerowanie 5-10 sekwencji pre-miRNA dla danego genu docelowego i przeprowadzenie badań przesiewowych pod kątem działań knockdown in vitro (krok 1.4).
  2. Wyżarzanie górnych i dolnych nici oligonukleotydów w celu wytworzenia dwuniciowego oligonuklei
    1. Ustawić następującą reakcję wyżarzania (Tabela 1) w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
    2. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 95 °C przez 4 minuty. Wyżarzać górne i dolne nici oligonukleotydów, aby uzyskać dwuniciowy oligonukleocyt, pozwalając mieszaninie reakcyjnej schłodzić się do temperatury pokojowej (RT) przez 5-10 minut. Odwirować próbkę krótko (~5 s).
      UWAGA: Wyżarzone oligonukleotydy mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C bez degradacji przez co najmniej rok.
  3. Klonowanie dwuniciowych oligonukleotydów do wektora ekspresji miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (dostarczone w zestawie ekspresji miRNA)): Sklonuj poszczególne dwuniciowe oligonukleotydy do zlinearyzowanego wektora ekspresji miRNA, zgodnie z instrukcją producenta17.
  4. Ocena efektów knockdown
    UWAGA: Zaleca się, aby poszczególne sekwencje miRNA zostały przetestowane pod kątem skuteczności supresji genów in vitro przed ich zastosowaniem in ovo. Skuteczność knockdown można przetestować poprzez transfekcję plazmidów ekspresyjnych miRNA do linii komórkowej, która wyraża gen docelowy. Alternatywnie, pojedyncze plazmidy ekspresji miRNA mogą być współtransfekowane do linii komórkowych z konstruktem ekspresji dla genu docelowego. W przypadku docelowych genów kodujących białka, które nie są zakotwiczone w błonie w swoim naturalnym stanie (np. białka rozpuszczalne), do monitorowania ekspresji białka docelowego można zastosować białko fuzyjne fosfatazy alkalicznej (AP). Sekwencja cDNA kodująca białko docelowe może być połączona w ramce z ludzką fosfatazą alkaliczną łożyska w wektorach znaczników AP (APtag-1- APtag-5; patrz Tabela materiałów) i wprowadzona do komórek18. W przypadku ekspresji w komórkach hodowlanych (np. komórkach HEK293T), białko docelowe znakowane AP jest wydzielane na wysokich poziomach do pożywki hodowlanej, a zatem efekty knockdown sekwencji miRNA można ocenić, mierząc spadek aktywności AP w pożywce hodowlanej komórek transfekowanych miRNA (podkroki 1.4.1-1.4.4).
    1. Hodowla HEK293T komórek na 24-dołkowej płytce (8 x 104 komórki/basenik) przez noc. Przejściowo transfekuj komórki z indywidualnymi konstruktami ekspresji miRNA plazmidem ekspresyjnym białka docelowego znakowanego AP. Użyj plazmidu kontrolnego pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative (dostarczonego w zestawie ekspresji miRNA) jako kontroli. (Jeśli używane są linie komórkowe, które stabilnie wyrażają białko docelowe znakowane AP, transfekuj komórki tylko za pomocą indywidualnych konstruktów ekspresji miRNA).
      UWAGA: Do transfekcji używa się konwencjonalnego odczynnika do lipofekcji (patrz Tabela materiałów).
    2. Zebrać kondycjonowaną pożywkę 48-72 godziny po transfekcji i podgrzać dezaktywować endogenną aktywność AP w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 5 minut. Odwirować resztki w mikrowirówce biurkowej z maksymalną prędkością przez 5 minut.
    3. Zbuforować supernatant za pomocą 10 mM HEPES, pH 7,0 i przepuścić go przez filtr 0,45 μm.
    4. Pobrać 100 μl (do pomiaru w czytniku płytek) lub 500 μl (do spektrofotometru) supernatantu i dodać równą ilość 2x buforu substratu AP (Tabela 2). Sprawdź aktywność AP, mierząc OD405 w czytniku płytek lub spektrofotometrze.
      UWAGA: Jeśli aktywność AP kondycjonowanej pożywki jest zbyt wysoka, aby można ją było dokładnie zmierzyć, należy ją rozcieńczyć buforem HBAH (zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 20 mM HEPES (pH 7,0)) lub innym buforem zawierającym białko nośnikowe. Nie należy stosować zawierających fosforany (np. PBS), ponieważ fosforan nieorganiczny działa jako kompetycyjny inhibitor AP.
  5. Łańcuchowanie sekwencji miRNA
    UWAGA: Efekty knockdown można wzmocnić poprzez łączenie różnych miRNA z tym samym genem docelowym lub powtarzanie tego samego miRNA. Wektor ekspresji miRNA obsługuje łańcuchowanie wielu sekwencji pre-miRNA i ich ko-cistroniczną ekspresję17.
    1. Połącz dwie różne sekwencje pre-miRNA (przeciwko temu samemu genowi docelowemu), które wykazują najwyższą aktywność knockdown w testach in vitro (krok 1.4), zgodnie z instrukcjami producenta17.
    2. Oceń skuteczność supresji genów konstruktów łańcuchowych za pomocą testów in vitro, jak opisano w kroku 1.4. Jeśli trzy lub więcej sekwencji pre-miRNA wykazuje podobnie wysoką aktywność knockdownu, przetestuj różne kombinacje dwóch sekwencji i użyj kombinacji, które wykazują najwyższą aktywność knockdownu (patrz Reprezentatywne wyniki).
  6. Przenoszenie kasety ekspresji EmGFP-pre-miRNA do wektora transpozonu Tol2
    UWAGA: Kaseta ekspresyjna zawierająca cDNA EmGFP i dwie sekwencje pre-miRNA jest przenoszona do wektora transpozonu Tol2 (wektor pT2K-CAGGS, patrz tabela materiałów). W tym celu kaseta ekspresyjna (obejmująca od końca 3' promotora CMV do miejsca startera odwrotnego sekwencjonowania miRNA wektora ekspresyjnego miRNA) jest amplifikowana metodą PCR przy użyciu starterów ze sztucznym miejscem enzymu restrykcyjnego, a produkt PCR jest klonowany do wektora transpozonu Tol2. Wektor transpozonu Tol2 zawiera wszechobecny promotor CAGGS, który steruje ekspresją wstawionej kasety ekspresji. Promotor CAGGS i kaseta wyrażenia są otoczone sekwencjami Tol2 (Rysunek 1).
    1. Amplifikacja PCR kasety ekspresji EmGFP-pre-miRNA: Postępuj zgodnie z konfiguracją reakcji i warunkami termocyklingu opisanymi w Tabeli 3.
    2. Związać oczyszczony żelem produkt PCR (ok. 1,3 kb) z wektorem transpozonu Tol2 trawionym enzymem restrykcyjnym. Elektroportować plazmid do właściwych komórek E. coli (patrz tabela materiałów) i wybrać rekombinanty (konstrukty miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x).
    3. Przygotuj plazmid za pomocą konwencjonalnego zestawu maxiprep (patrz Tabela materiałów). Sprawdź strukturę i sekwencję plazmidu, odpowiednio mapując restrykcje i używając starterów używanych do PCR.

2. Przechowywanie i inkubacja jaj

  1. Kupuj zapłodnione jaja białego leghorna (Gallus gallus) z lokalnych gospodarstw lub komercyjnych sprzedawców.
    UWAGA: Jaja mogą być przechowywane w temperaturze 12-16 °C lub 4 °C przez okres do 1 tygodnia przed inkubacją bez znaczącej utraty żywotności lub opóźnienia rozwoju podczas inkubacji.
  2. Oznacz jaja datą rozpoczęcia inkubacji i zaznacz górną stronę jaja (miejsce, w którym zostanie umieszczony zarodek). Inkubować zapłodnione jaja w pozycji poziomej w temperaturze 38 °C, aż zarodki osiągną etapy Hamburger i Hamilton (HH) 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)19.

3. Elektroporacja in ovo

  1. Preparat do elektroporacji in ovo
    1. Przygotowanie 0,25% roztworu Fast Green: Rozpuścić 25 mg Fast Green FCF w 10 ml PBS. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Roztwór może być przechowywany w RT.
    2. Koktajl DNA: Przygotować roztwór do wstrzykiwań, mieszając poszczególne plazmidy miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x (podkrok 1.6.3) z plazmidem ekspresji transpozazy Tol2 (wektor pCAGGS-T2TP; patrz Tabela materiałów) (5 μg/μL każdy) w stosunku 2:1. Dodaj 1/10 objętości 0,25% szybkiego zielonego roztworu, aby uwidocznić wstrzyknięty obszar.
      UWAGA: Optymalne stężenie DNA może się różnić w zależności od konstruktów.
    3. Konfiguracja aparatu do mikroiniekcji (Rysunek 3A, B): Aparat do mikroiniekcji składa się z następujących elementów (patrz tabela materiałów): strzykawka Hamilton, igła 18 G (długość igły = 2"), rurka PVC (polichlorek winylu) (długość 2 cm), igła do mikropipet (może być wykonana przez pociągnięcie rurki kapilarne z włóknem omega dot (1 mm OD X 0,75 mm średnica wewnętrzna) za pomocą ściągacza do mikropipet).
      1. Napełnij strzykawkę Hamilton ciężkim olejem mineralnym. Podłączyć igłę 18 G do strzykawki i wypełnić wewnętrzną przestrzeń igły olejem, naciskając tłok strzykawki.
      2. Przymocuj kawałek rurki PVC o długości 2 cm do końca igły i napełnij rurkę olejem.
      3. Przymocuj ciągniętą igłę do mikropipety do rurki. Odłamać końcówkę igły do mikropipety do średnicy 10-20 μm za pomocą drobnych kleszczy, aby zrobić mały otwór. Napełnij całą igłę olejem.
        UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie uwięzić żadnych pęcherzyków powietrza w systemie, ponieważ mogłyby one zahamować przepływ roztworu DNA.
    4. Umieścić 5 μl kolorowego koktajlu DNA (podkrok 3.1.2) na sterylnej szalce Petriego. Pod mikroskopem preparacyjnym umieścić końcówkę igły do mikropipety w roztworze DNA na sterylnej szalce Petriego i powoli wciągnąć roztwór do igły.
    5. Poczekaj, aż ciśnienie wyrówna się wewnątrz i na zewnątrz igły (aby uniknąć przedostania się powietrza do igły) i wyjmij końcówkę igły z roztworu DNA. Końcówkę igły należy trzymać zanurzoną w jałowym PBS w małej zlewce do czasu wstrzyknięcia.
    6. Ustawianie aparatu do elektroporacji (Rysunek 3A,C):
      1. Ustaw parę platynowych elektrod z uchwytem elektrody na mikromanipulatorze. Dostosuj odstęp między końcówkami elektrod do 2 mm (Rysunek 3C,E).
      2. Podłącz elektrody do generatora impulsów fali prostokątnej za pomocą (patrz Tabela materiałów).
  2. Mikroiniekcja roztworu DNA (Rysunek 3D)
    1. Wyjmij jajo kurze z inkubatora i przetrzyj powierzchnię jajka bibułą nasączoną 70% etanolem.
    2. Podłączyć igłę 18 G do strzykawki o pojemności 10 ml. Włóż igłę przez koniec jajka, pod kątem w dół (45°), aby uniknąć uszkodzenia żółtka.
    3. Pobrać 2-3 ml albuminy z jajka. Uszczelnij otwór kawałkiem taśmy klejącej. Upewnij się, że zarodek i błona witeliny są oderwane od skorupy poprzez "przeświecanie" jaja światłem.
    4. Usuń kawałek skorupki jajka (okrąg o średnicy 2-3 cm) z wierzchu jajka za pomocą nożyczek i kleszczy, aby odsłonić zarodek. Nie otwierać więcej niż pięciu jaj jednocześnie, aby zapobiec wysychaniu zarodków podczas elektroporacji.
      UWAGA: Jeśli trudno jest otworzyć okno bez rozbicia jajka, całą górną część jajka można przykryć taśmą Sellotape lub taśmą klejącą przed usunięciem kawałka skorupki jajka.
    5. Włóż końcówkę igły do pęcherzyka wzrokowego od jego bliższej strony pod kątem 45° i wstrzyknij koktajl DNA, powoli wciskając (lub stukając) w tłok, aż niebieski roztwór wypełni światło (Rysunek 3D).
      UWAGA: Alternatywnie, do wstrzykiwania roztworów DNA można użyć ciśnieniowego systemu mikroiniekcji (patrz Tabela materiałów).
    6. Wyjąć igłę i umieścić jej końcówkę z powrotem w PBS.
  3. Elektroporacja (Rysunek 3E)
    1. Ustaw parametry impulsu elektroporatora w następujący sposób: Napięcie: 15 V, Długość impulsu: 50 ms, Interwał impulsów: 950 ms, Liczba impulsu: 5
    2. Dodaj kilka kropli HBSS na błonę witeliny nad zarodkiem. Opuść elektrody do HBSS za pomocą mikromanipulatora, prostopadle do osi przednio-tylnej zarodka.
      UWAGA: Alternatywnie tę procedurę można wykonać bez dodawania HBSS, ponieważ albumina jest dobrym przewodnikiem elektrycznym, który umożliwia wydajną elektroporację.
    3. Umieść elektrody po obu stronach (przedniej (nosowej) i tylnej (skroniowej)) pęcherzyka wzrokowego (Rysunek 3E). Upewnij się, że elektrody nie dotykają zarodka ani naczyń krwionośnych. Zastosuj pulsacyjne pola elektryczne.
    4. Wyjmij elektrody i delikatnie wyczyść elektrody sterylnym wacikiem nasączonym wodą, aby uniknąć gromadzenia się albuminy.
    5. Uszczelnij okno taśmą klejącą i ponownie inkubuj zarodek do pożądanego etapu rozwoju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Budowa konstruktów transpozonów Tol2 do ekspresji sztucznych miRNA przeciwko Nel
Nel (Neural Epidermalny czynnik wzrostu (EGF)-Like; znany również jako Nell2) jest zewnątrzkomórkową glikoproteiną. Wykazuje strukturalne podobieństwa do trombospondyny-1 i ulega ekspresji głównie w układzie nerwowym20,21. Wcześniej wykazaliśmy, że Nel reguluje różnicowanie i przeżywalność komórek zwojowych siatkówki15...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zawiera szczegółowy przewodnik po wyciszaniu genów w rozwijającej się siatkówce pisklęcia poprzez transgeniczną ekspresję sztucznych miRNA przy użyciu elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2.

Następujące czynniki mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wykonania tej techniki. Po pierwsze, bardzo ważne jest użycie sekwencji miRNA, które mają potwierdzone działanie na zasadzie knockdownu. Przed zastosowaniem ich do elektroporacji in ovo należy przetestować...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory pT2K-CAGGS i pCAGGS-T2TP zostały uprzejmie dostarczone odpowiednio przez Yoshiko Takahashi (Uniwersytet Kioto, Kioto, Japonia) i Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japonia). Dziękujemy Michaelowi Berberoglu za jego kluczowe odczytanie manuskryptu. Prace te były wspierane przez granty Royal Society oraz Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC) (Wielka Brytania) dla M.N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła 18 G, 2"VWR89219-320
AP-TAG zestaw A i zestaw AP-TAG BGenHunter CorpQ201 i Q202Wektory plazmidowe do wytwarzania białek fuzyjnych AP (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi DesignerInvitrogenNarzędzie online do wyboru sekwencji docelowych i projektowania sekwencji pre-miRNA (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mgSigma-AldrichA2153
C115CBSonidelC115CBhttps://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117SonidelC117https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Rurki kapilarne z włóknem omega dot (igły do mikropipet)FHC30-30-11 mm OD 0,75 mm ID ID
CUY21 elektroporator falowy prostokątnyNepa GeneCUY21
Dietanoloamina (pH 9,8)Sigma-AldrichD8885
Mikroskop
Jajko inkubatorKurlB-Lab-600-110https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Uchwyt elektrodySonidelCUY580https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
ElektrodyNepa GeneCUY611P3-1https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10BInvitrogen18290-015Elektrokompetentne komórki E. coli
Fast green FCFSigma-AldrichF7258
Zapłodnione jaja kurze (Gallus gallus)Pozyskiwane od sprzedawców komercyjnych (np. Charles River) lub lokalnych rolników
Źródło
Odczynnik do transfekcji FuGene 6PromegaE2691
Strzykawka Hamilton (50 μ L)Sigma-Aldrich20715Hamilton Nr kat.  80901
Zrównoważony roztwór soli HanksaSigma-AldrichH6648
Ciężki olej mineralnySigma-Aldrich330760
HEPESGIBCO15630080
L-HomoargininaSigma-AldrichH10007
MgCl2Sigma-Aldrich13112
MikromanipulatorNarishige (Japonia)MM3http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Ściągacz do mikropipetPrzyrząd do migawkiP97
p-NitrofenylofosforanSigma-Aldrich20-106
PBSSigma-AldrichD8662
wektor pCAGGS-T2TPPlazmid ekspresji transpozazy Tol2. Hojny dar od Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japonia). Dostępne również w Addgene.
PfuThermoFisherF566S
Picospritzer (opcjonalnie)ParkerSystem mikroiniekcji ciśnieniowej
Zestaw maxi plazmiduQiagen12163Zestaw maxiprep plazmidu
wektor pT2K-CAGGSTol2. Uprzejmie dostarczone przez Yoshiko Takahashi (Uniwersytet w Kioto, Japonia)
Rurki PVCVWR (Wielka Brytania)228-3830
SpectinomycinSigma-AldrichS9007-5
T4 Ligaza DNAPromegaM1801
Zestaw do ekspresji RNA BLOCK-iT Pol II miR z EmGFPInvitrogenK493600Zawiera wektor ekspresyjny miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), wektor kontrolny (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-ujemny plazmid kontrolny), dodatkowe odczynniki i instrukcje (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
Termocykler
preparacyjnyświatła z włókna na gęsiej szyi Wektor transpozonu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
  2. Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
  3. Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
  4. Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
  5. Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
  6. Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2(2006).
  7. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
  8. Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
  9. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  10. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  11. Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
  12. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
  13. Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
  14. Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
  15. Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
  16. Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
  17. BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
  18. Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  20. Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
  21. Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
  22. Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
  23. Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
  24. Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
  25. Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

In Ovo ElectroporationGene SilencingRetinal DevelopmentMicroRNA KnockdownRetinal Ganglion CellsCell Differentiation

Powiązane artykuły