Wykorzystanie nanocząstek lipidowych do dostarczania chemicznie zmodyfikowanego mRNA do komórek ssaków

Podsumowanie

Protokół przedstawia transkrypcję in vitro (IVT) chemicznie zmodyfikowanego mRNA, kationowe przygotowanie liposomów oraz analizę funkcjonalną transfekcji mRNA w komórkach ssaków.

Streszczenie

W ostatnich latach, chemicznie modyfikowany informacyjny RNA (mRNA) okazał się silnym cząsteczką kwasu nukleinowego do rozwoju szerokiego zakresu zastosowań terapeutycznych, w tym nowej klasy szczepionek, terapii zastępczych białek i terapii immunologicznych. Wśród wektorów dostarczania stwierdzono, że nanocząstki lipidowe są bezpieczniejsze i skuteczniejsze w dostarczaniu cząsteczek RNA (np. siRNA, miRNA, mRNA), a kilka produktów jest już w użyciu klinicznym. Aby zademonstrować dostarczanie mRNA za pośrednictwem nanocząstek lipidowych, przedstawiamy zoptymalizowany protokół syntezy funkcjonalnego mRNA eGFP zmodyfikowanego me1Ψ-UTP, przygotowania liposomów kationowych, tworzenia kompleksu elektrostatycznego mRNA z liposomami kationowymi oraz oceny skuteczności transfekcji w komórkach ssaków. Wyniki pokazują, że modyfikacje te skutecznie poprawiły stabilność mRNA dostarczanego za pomocą liposomów kationowych oraz zwiększyły wydajność i stabilność translacji mRNA eGFP w komórkach ssaków. Protokół ten może być wykorzystany do syntezy pożądanego mRNA i transfekcji liposomami kationowymi w celu ekspresji docelowego genu w komórkach ssaków.

Wprowadzenie

Jako cząsteczka terapeutyczna, mRNA oferuje kilka zalet ze względu na swoją nieintegracyjną naturę i zdolność do transfekcji komórek niemitotycznych w porównaniu do plazmidowego DNA (pDNA)¹. Chociaż dostarczanie mRNA zostało zademonstrowane na początku lat 90., zastosowania terapeutyczne były ograniczone ze względu na brak stabilności, brak aktywacji immunologicznej i słabą wydajność translacyjną². Niedawno zidentyfikowane modyfikacje chemiczne, takie jak 5'-trifosforan pseudourydyny (Ψ-UTP) i 5'-trifosforan pseudourydyny metylowej (me1Ψ-UTP) na mRNA, pomogły przezwyciężyć te ograniczenia, zrewolucjonizowały badania nad mRNA, a co za tym idzie, sprawiły, że mRNA stało się obiecującym narzędziem zarówno w badaniach podstawowych, jak i stosowanych. Zakres zastosowań obejmuje generowanie iPSC do szczepień i terapii genowej^3,4.

Równolegle z postępem w technologii mRNA, znaczący postęp w systemach dostarczania niewirusów sprawił, że dostarczanie mRNA stało się skuteczne, co czyni tę technologię wykonalną dla wielu zastosowań terapeutycznych⁵. Stwierdzono, że wśród wektorów niewirusowych nanocząstki lipidowe są skuteczne w dostarczaniu kwasów nukleinowych^6,7. Niedawno Alnylam otrzymał zgodę FDA na leki siRNA na bazie lipidów do leczenia chorób wątroby, w tym Patisiran na dziedziczną amyloidozę za pośrednictwem transtyretyny (amyloidoza hATTR) i Givosiran na ostrą porfirię wątrobową (AHP)⁸. Podczas pandemii COVID19 szczepionki na bazie mRNA kapsułkowane lipidami firm Pfizer-BioNtech i Moderna wykazały swoją skuteczność i otrzymały aprobaty FDA^9,10. Tak więc dostarczanie mRNA za pomocą lipidów ma ogromny potencjał terapeutyczny.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół produkcji chemicznie modyfikowanego, transkrybowanego in vitro mRNA eGFP, preparatu liposomów kationowych, optymalizacji kompleksu mRNA-lipid i transfekcji do komórek ssaków (Rysunek 1).

Protokół

1. Produkcja mRNA zmodyfikowanego me1 Ψ-UTP

1. Przygotowanie matrycy DNA do transkrypcji in vitro (IVT)
   UWAGA: W przypadku przygotowania matrycy DNA IVT (promotor T7 – otwarta ramka odczytu (ORF) genu) należy zaprojektować zestaw starterów specyficznych dla genu dla interesującego genu. Dodaj sekwencję promotora T7 (5'-NNNNNNTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3') przed specyficznym dla genu starterem do przodu.
   1. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR zgodnie z opisem w tabeli 1.
      UWAGA: Przeprowadź co najmniej cztery reakcje PCR, aby zwiększyć stężenie i jakość matrycy DNA IVT dla IVT.
   2. Mieszaninę reakcyjną należy całkowicie wymieszać za pomocą mikropipety i odwirować za pomocą mikrofugi.
   3. Uruchom protokół cykliczny PCR podany w Tabeli 2 na termocyklerze.
2. Oczyszczanie matrycy DNA IVT przez ekstrakcję organiczną/wytrącanie etanolu
   1. Dostosuj amplifikowaną mieszaninę reakcyjną PCR do całkowitej objętości 200 μl, używając wody uzdatnionej DEPC w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml (bez nukleazy).
   2. Dodać 200 μl nasyconego TE fenolu/chloroformu o pH 8,0. Wiruj energicznie przez 10 sekund.
   3. Odwirować przy 12 000 x g przez 5 minut w celu oddzielenia faz i przeniesienia górnej fazy wodnej (około 200 μl) do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
   4. Dodać 1/10⁽20 μl) objętości 3 M octanu sodu o pH 5,5 i dwie objętości (400 μl) 99-100% etanolu. Dobrze wymieszać, a następnie inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze -20 °C.
   5. Osadzać matrycę DNA przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Usunąć supernatant całkowicie bez naruszania osadu za pomocą mikropipety.
   7. Dodaj 0,5 ml 75% etanolu do granulki i odwróć 5-10 razy.
   8. Wirować przez 2 minuty w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Następnie całkowicie usuń etanol za pomocą pipety, nie naruszając osadu DNA.
   9. Pozostaw granulat do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aż pellet stanie się nieco przezroczysty.
   10. Dodaj 20 μl wody wolnej od nukleaz i dokładnie zawiesij na kilka sekund.
3. Kontrola jakości oczyszczonej matrycy DNA IVT
   1. Kwantyfikacji
      1. Zmierz stężenie i jakość oczyszczonej matrycy DNA IVT za pomocą mikrospektrofotometru.
         UWAGA: Oczekiwane stężenie DNA wyniesie około 300-600 ng/μL. Matrycę DNA IVT należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez długi czas.
   2. Elektroforeza w żelu agarozowym DNA
      UWAGA: Ten eksperyment ma na celu sprawdzenie, czy oczyszczona matryca DNA IVT ma prawidłowy rozmiar i jest pozbawiona niespecyficznego zanieczyszczenia produktem.
      1. Aby przygotować 1% żel agarozowy, dodaj 0,5 g agarozy i 50 ml 1x TAE w kolbie stożkowej. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Schłodzić agarozę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      2. Dodaj 1 μl barwnika kwasem nukleinowym (barwnik SafeView) do 50 ml roztworu agarozy.
      3. Wlej roztwór agarozy do tacki do odlewania żelu z grzebieniem i pozostaw do momentu, aż żel zastygnie.
      4. Wyjmij grzebień z żelu i przechowuj żel w 1x buforowanym zbiorniku TAE.
      5. Zmieszać 10 μl drabinki DNA o stężeniu 100-10000 pz i 100-200 ng oczyszczonego produktu matrycowego PCR z 2 μl 6-krotnego buforu ładującego DNA do całkowitej objętości 12 μl.
      6. Załaduj każdą próbkę do odpowiednich studzienek i pracuj pod napięciem 100 V przez co najmniej 45-60 minut.
      7. Wizualizacja prążków DNA na żelowym instrumencie do dokumentacji (Rysunek 2).
4. Synteza modyfikowanego me1Ψ-UTP RNA
   UWAGA: Przed rozpoczęciem tego eksperymentu obszar roboczy (laminarny przepływ powietrza) należy oczyścić 70% etanolem w wodzie uzdatnionej DEPC. Używaj sterylnych probówek o niskiej retencji i bez nukleaz i endotoksyn oraz końcówek bariery filtracyjnej. Często nakładaj 70% etanolu na dłonie w rękawiczkach.
   1. Przygotować mieszaninę reakcyjną IVT zgodnie z tabelą 3 w temperaturze pokojowej w probówce o pojemności 0,2 ml i dokładnie wymieszać za pomocą mikropipety.
   2. Wiruj probówkę przez 10 sekund w mikrofudze.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w termocyklerze.
5. Degradacja matrycy DNA IVT przez leczenie DNazą 1
   1. Dodać 1 μl 1 U/μL DNazy 1 (bez RNazy) do mieszaniny reakcyjnej IVT i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
6. Oczyszczanie RNA przez ekstrakcję organiczną/wytrącanie octanu amonu
   1. Dostosuj objętość mieszaniny reakcyjnej IVT do 200 μl za pomocą 179 μl wody uzdatnionej DEPC.
   2. Dodać 200 μl nasyconego TE fenolu/chloroformu o pH 8,0. Wiruj przez 10 sekund.
   3. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C w celu rozdzielenia dwóch faz.
   4. Przenieść górną fazę wodną (200 μl) do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 200 μl 5 M octanu amonu. Dobrze wymieszaj, a następnie inkubuj przez 15 minut na lodzie, aby wytrącić RNA.
   5. Wytrącony RNA osadzać przez odwirowanie w temperaturze 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i całkowicie usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
   6. Umyj osad RNA przy użyciu 70% etanolu i odwróć 5-10 razy. Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   7. Całkowicie usunąć supernatant za pomocą mikropipety, nie naruszając osadu RNA.
   8. Pozostaw granulkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aż stała się półprzezroczysta. Następnie ponownie zawiesić osad w 60-75 μl wody wolnej od RNaz.
7. Kontrola jakości oczyszczonego RNA
   1. Kwantyfikacji
      1. Zmierzyć stężenie i jakość oczyszczonego RNA za pomocą mikrospektrofotometru.
         UWAGA: Oczekiwana wydajność RNA wyniesie 140-180 μg dla niezmodyfikowanego RNA i 100-150 μg dla zmodyfikowanego RNA me1Ψ-UTP na reakcję, w zależności od wielkości interesującego genu i jakości matrycy DNA IVT. Optymalna jakość powinna to być stosunek OD₂₆₀/OD₂₈₀ około 1,9-2,0 i stosunek OD₂₆₀/OD₂₃₀ >2,0. Przechowywać RNA w temperaturze -20 °C przez krótki czas.
   2. Denaturyzacja RNA w żelu agarozowym elektroforeza
      UWAGA: Ten eksperyment jest przeprowadzany w celu sprawdzenia, czy zsyntetyzowane RNA ma odpowiednią długość i jest pozbawione zanieczyszczenia produktem ubocznym IVT.
      1. Aby przygotować 1% żel agarozowy, dodaj 0,5 g agarozy i 50 ml 1x TAE w kolbie stożkowej. Roztwór podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Roztwór agarozy należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby ostygł.
      2. Dodać 1 μl barwnika kwasu nukleinowego na 50 ml 1% roztworu agarozy.
      3. Wlej roztwór agarozy do tacki do odlewania żelu za pomocą grzebienia i pozostaw do momentu, aż żel zastygnie.
      4. Wyjmij grzebień z żelu i przechowuj żel w 1x buforowanym zbiorniku TAE.
      5. Przygotować próbkę barwnika ładującego RNA zgodnie z opisem w tabeli 4.
      6. Podgrzewać próbki w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie przechowywać próbki na lodzie.
      7. Załaduj każdą próbkę do odpowiednich dołków i pracuj pod napięciem 100 V przez co najmniej 45-60 minut.
      8. Wizualizuj prążki RNA na żelowym instrumencie dokumentacyjnym (Rysunek 3).
8. Synteza mRNA zmodyfikowanego me1Ψ-UTP metodą enzymatycznego cappingu i ogonowania poli-A
   UWAGA: Skuteczność cappingu RNA IVT metodą enzymatyczną wynosi 100%. W związku z tym zastosowaliśmy enzymatyczne ograniczanie Cap-1 w syntezie mRNA w tym protokole. Dodaliśmy ogony poli-A o długości >150 zasad A na cząsteczkę, aby poprawić wydajność translacyjną mRNA.
   1. Dodać 55-60 μg oczyszczonego RNA IVT i uzupełnić do 72 μl wodą wolną od RNaz w probówce o pojemności 1,5 ml.
   2. Denaturować RNA w temperaturze 65 °C przez 10 minut w termomikserze, a następnie natychmiast umieścić probówkę na lodzie na 5 minut.
   3. W międzyczasie należy przygotować mieszaninę reakcyjną zamykania, jak pokazano w tabeli 5.
   4. Dodać mieszaninę reakcyjną zamykania i 4 μl enzymu zamykającego do zdenaturowanego RNA i dobrze wymieszać za pomocą mikropipety. Wiruj probówkę przez 10 sekund w mikrofudze.
   5. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
   6. Po 2 godzinach trzymaj probówkę na lodzie i przygotuj główną mieszankę Poly A do odpadów, jak podano w tabeli 6.
   7. Dodaj główną mieszankę ogonów Poly A do zasklepionego roztworu RNA i dobrze wymieszaj za pomocą mikropipety. Wiruj probówkę przez 10 sekund w mikrofudze.
   8. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
      UWAGA: mRNA można natychmiast poddać dalszemu oczyszczaniu lub surowe mRNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc.
9. Oczyszczanie mRNA IVT
   1. Oczyść mRNA przez ekstrakcję organiczną/wytrącanie octanu amonu, jak podano w sekcji 1.6 protokołu.
   2. Ponownie zawiesić osad mRNA za pomocą 60 μl wody wolnej od RNaz.
10. Kontrola jakości oczyszczonego mRNA
    1. Postępuj zgodnie z protokołem kontroli jakości, jak opisano w sekcji protokołu 1.7.
       UWAGA: Pasmo mRNA powinno pojawić się powyżej pasma RNA ze względu na dodanie ogonowania Poly-A w elektroforezie w żelu agarozowym RNA denaturującym (Rysunek 3). Ponadto ogon Poly-A zwiększa wydajność mRNA (powinien być > stężenie RNA). Po kwantyfikacji umieścić wiele podwielokrotności mRNA przy stężeniu 1 μg/μl i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania RNA, aby zapobiec degradacji zsyntetyzowanego mRNA.

2. Przygotowanie liposomów kationowych i ocena właściwości transfekcji mRNA in vitro

1. Przygotowanie liposomów
   1. Do przygotowania liposomu kationowego 1 mM należy użyć lipidu kationowego: DOPE: cholesterol w stosunku molowym 1:1:0,5.
   2. Rozpuść odpowiednie proporcje molowe lipidów kationowych, cholesterolu i DOPE (1,2-dioleoilo-sn-glicerol-3-fosfoetanoloaminy) w chloroformie (200 μl) w szklanej fiolce.
   3. Do usuwania rozpuszczalnika należy użyć cienkiego strumienia azotu pozbawionego wilgoci.
   4. Suszone lipidy należy przechowywać w wysokiej próżni do dalszego suszenia przez 2 godziny.
   5. Dodaj 1 ml sterylnej wody dejonizowanej do wysuszonych lipidów po suszeniu próżniowym i pozostaw mieszaninę do spęcznienia przez noc.
   6. Wirować fiolkę w temperaturze pokojowej, aby uzyskać pęcherzyki wielojednowarstwowe (MUV).
   7. Zastosować sonikację kąpieli, a następnie sonikację sondy o mocy 25 W, aby uzyskać małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV) z pęcherzyków wielowarstwowych (MUV).
      UWAGA: SUV-y powinny wyglądać jak półprzezroczysty roztwór liposomu. Jeśli nie, zwiększ liczbę 30-sekundowych impulsów włączanych i wyłączanych w odstępie 1 minuty. Średnice hydrodynamiczne i potencjały powierzchniowe są mierzone (Rysunek 4) w analizatorze wielkości cząstek.
2. Tworzenie kompleksu mRNA/liposomów i test opóźnienia żelu
   1. W celu przygotowania różnych proporcji ładunku lipid-RNA od 1:1 do 8:1 należy oddzielnie rozcieńczyć mRNA i liposom kationowy w wodzie dejonizowanej, jak podano w tabeli 7.
   2. Wymieszaj rozcieńczone mRNA z roztworem liposomowym, jak wskazano w tabeli 7 i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu utworzenia lipoplexu.
   3. Dodaj 20 μl barwnika ładującego 2x RNA do kompleksu i załaduj do studzienki. Samo mRNA służy jako kontrola.
   4. Załadować próbki na 1% żel agarozowy do 1x bufora TAE i pracować pod napięciem 100 V przez 45 minut.
   5. Wizualizuj prążki RNA na żelowym instrumencie do dokumentacji (Rysunek 5).
3. Transfekcja mRNA in vitro
   1. Wysiewać 45 000 komórek ssaków na dołek z 48 dołków w kompletnych pożywkach, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 do 20 godzin transfekcji.
   2. Po 16 do 20 godzinach sprawdź gęstość komórek. W momencie transfekcji zbieg komórek powinien wynosić około 80%.
   3. Do probówek o pojemności 0,5 ml dodaj 150 ng kompleksu mRNA kodującego białko GFP o stosunku ładunku 1:1 liposomów kationowych i mRNA w pożywce DMEM bez surowicy. Całkowita objętość wynosi do 20 μL.
   4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   5. Dodać lipoplex do komórek i inkubować przez 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   6. Usuń pożywkę, nie naruszając komórek. Dodać 250 μl kompletnych pożywek z 10% FBS (Tabela 8) do każdego dołka.
   7. Po 72 godzinach od transfekcji obejrzyj ekspresję GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym (Rysunek 6, 7).
   8. Aby określić ilościowo wyrażenie GFP, należy przetworzyć komórki do analizy cytometrem przepływowym.
   9. Wyjmij nośnik i umyj dwukrotnie 1x PBS. Trypsynizuj komórki i przetwarzaj komórki w celu ilościowego określenia procentu komórek GFP dodatnich w cytometrze przepływowym.
   10. Pozyskaj komórki w cytometrze przepływowym za pomocą lasera 488. Odsuń żywą populację od tego i przeanalizuj procent komórek GFP dodatnich. Określ ilościowo średnią intensywność fluorescencji (MFI) (Rysunek 6, 7).

Wyniki

Zoptymalizowaliśmy protokół dla zmodyfikowanej produkcji mRNA me1Ψ-UTP, przygotowania liposomów i eksperymentów transfekcji mRNA z liposomami kationowymi do wielu komórek ssaków (Rysunek 1). Aby zsyntetyzować mRNA, zoptymalizowana pod kątem kodonów ssaków matryca eGFP IVT została amplifikowana z wektora ekspresji ssaków mEGFP-N1 i oczyszczona metodą ekstrakcji organicznej / wytrącania etanolu (Rysunek 2). Później zmodyfikowane me1Ψ-UTP RNA i mRNA zostały wytworzone w procesie IVT. ...

Dyskusja

Zastosowania terapeutyczne niezmodyfikowanych mRNA były ograniczone ze względu na ich krótszy okres półtrwania i zdolność do aktywacji wewnątrzkomórkowych wrodzonych odpowiedzi immunologicznych, co z kolei prowadzi do słabej ekspresji białek w transfekowanych komórkach¹¹. Katalin i wsp. wykazali, że RNA zawierające zmodyfikowane nukleozydy, takie jak m5C, m6A, ΨU i me1Ψ-UTP, mogą uniknąć aktywacji TLR¹². Co ważniejsze, włączenie ΨU lub me1Ψ-UTP do mRNA IVT wykazało lepszą w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarose	Lonza	50004
Sonikator do kąpieli	DNMANM Industries	USC-100
Kationowy lipid	syntetyzowany w laboratorium
Chlorofrom	MP biomedicals	67-66-3	"Uwaga"
Cholesterol	Himedia	GRM335
DEPC woda	SRL BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA Ladder	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA sól sodowa	MP biomedicals	194822
Etanol	Hayman	F204325	"Uwaga"
Surowica bydlęca płodu	Gibco	10270
Cytometria przepływowa	BD	FACS Celesta
Fluroscence Microscope	Leica	MI6000B
System dokumentacji żelowej	Cell Biosciences	Flurochem E
Lodowcowy kwas octowy	Fisher Scientific	85801	"Uwaga"
mEGFP-N1, wektor ekspresji ssaków	Addgene	54767
N1-Methylpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Fenol:chloroform:izoamyl alchol (25:24:1), pH 8,0	SRL BioLit	136112-00-0	"Uwaga"
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS), pH 7,4	CellClone	CC3041
Sonics	Vibra Cells	VCX130
Drabinka RNA	NEB	N0362S
Inhibitor RNazy	Thermo Scientific	N8080119
SafeView barwnik	abm	G108
Octan sodu	Sigma	S7545
Termocykler	Zastosowane biosystemy	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Bufor Tris	SRL BioLit	71033
Trypsyna	Gibco	25200056