Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji białek związanych z heterochromatyną w gruczołach ślinowych Drosophila

Podsumowanie

Ten protokół ma na celu wizualizację agregatów heterochromatyny w komórkach Drosophila polytene.

Streszczenie

Wizualizacja agregatów heterochromatyny za pomocą barwienia immunologicznego może być wyzwaniem. Wiele ssaczych składników chromatyny jest konserwatywnych w Drosophila melanogaster. Dlatego jest to doskonały model do badania powstawania i utrzymywania heterochromatyny. Upoliteizowane komórki, takie jak te znajdujące się w gruczołach ślinowych larw D. melanogaster w trzecim stadium rozwojowym, stanowią doskonałe narzędzie do obserwacji chromatyny wzmocnionej prawie tysiąckrotnie i pozwoliły naukowcom badać zmiany w rozmieszczeniu heterochromatyny w jądrze. Chociaż obserwację składników heterochromatyny można przeprowadzić bezpośrednio w preparatach chromosomów politenowych, lokalizacja niektórych białek może być zmieniona przez nasilenie leczenia. Dlatego bezpośrednia wizualizacja heterochromatyny w komórkach uzupełnia ten rodzaj badania. W tym protokole opisujemy techniki barwienia immunologicznego stosowane w tej tkance, zastosowanie wtórnych przeciwciał fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej w celu obserwacji tych agregatów heterochromatyny z większą precyzją i szczegółowością.

Wprowadzenie

Od wczesnych badań Emila Heitza¹, heterochromatyna jest uważana za ważny regulator procesów komórkowych, takich jak ekspresja genów, mejotyczne i mitotyczne rozdzielanie chromosomów oraz utrzymanie stabilności genomu^2,3,4.

Heterochromatyna dzieli się głównie na dwa typy: konstytutywną heterochromatynę, która charakterystycznie definiuje powtarzające się sekwencje, oraz elementy transpozycyjne, które są obecne w określonych miejscach chromosomów, takich jak telomery i centromery. Ten typ heterochromatyny jest głównie definiowany epigenetycznie przez specyficzne znaczniki histonowe, takie jak di lub trimetylacja lizyny 9 histonu H3 (H3K9me3) i wiązanie białka heterochromatyny 1a (HP1a) ^5,6. Z drugiej strony, fakultatywna heterochromatyna lokalizuje się w ramionach chromosomu i składa się głównie z genów wyciszonych rozwojowo^7,8. Barwienie immunologiczne bloków heterochromatyny w komórkach metafazy, lub obserwacja agregatów heterochromatyny w komórkach interfazowych, odsłoniło wiele światła w zrozumieniu powstawania i funkcji regionów heterochromatycznych⁹.

Użycie Drosophila jako systemu modelowego pozwoliło na opracowanie niezbędnych narzędzi do badania heterochromatyny bez użycia mikroskopii elektronowej¹⁰. Od czasu opisu zmienności efektu pozycji i odkrycia białek związanych z heterochromatyną, takich jak HP1a, oraz modyfikacji potranslacyjnych histonów, wiele grup opracowało kilka technik immunohistochemicznych, które umożliwiają wizualizację tych regionów heterochromatycznych^10,11.

Te techniki opierają się na użyciu specyficznych przeciwciał, które rozpoznają białka związane z heterochromatyną lub znaczniki histonowe. Dla każdego typu komórki i przeciwciała warunki wiązania i przepuszczalności muszą być określone empirycznie. Ponadto warunki mogą się różnić, jeśli stosowane są dodatkowe procesy mechaniczne, takie jak techniki zgniatania. W tym protokole opisujemy zastosowanie gruczołów ślinowych Drosophila do badania ognisk heterochromatycznych. Gruczoły ślinowe mają politeizowane komórki, które zawierają ponad 1000 kopii genomu, zapewniając w ten sposób wzmocniony widok większości cech chromatyny, z wyjątkiem satelitarnego DNA i niektórych regionów heterochromatycznych, które są niedostatecznie replikowane. Niemniej jednak regiony heterochromatyny są łatwo wizualizowane w preparatach chromosomów politenowych, ale techniki zgniatania mogą czasami zakłócać charakterystyczne kompleksy związane z chromatyną lub architekturę chromatyny. Dlatego immunolokalizacja białek w całej tkance gruczołów ślinowych może przewyższyć te niepożądane efekty. Użyliśmy tego protokołu do wykrycia kilku białek związanych z chromatyną i wykazaliśmy, że ten protokół w połączeniu ze zmutowanymi stadami Drosophila może być wykorzystany do badania zakłóceń heterochromatyny¹².

Protokół

1. Kultura larw trzeciego stadium rozwojowego

1. Przygotuj 1 litr standardowej pożywki, dodając 100 g drożdży, 100 g nierafinowanego całego cukru trzcinowego, 16 g agaru, 10 ml kwasu propionowego i 14 g żelatyny. Rozpuść wszystkie składniki oprócz drożdży w 800 ml wody z kranu, a następnie rozpuść drożdże. Natychmiast w autoklawie na 30 minut.
   1. Następnie pozwól pożywce ostygnąć do 60 °C i dodaj kwas propionowy do końcowego stężenia 0,01%. Odstaw butelkę, aż utworzy się żelatyna.
2. Aby zoptymalizować hodowlę larw w stadium 3o, najpierw zbierz dorosłe osobniki w wieku od 5 do 10 dni i umieść 50 (25 samców i 25 samic) w butelce ze standardową pożywką z szeroką szyjką.
3. Umieścić butelkę z muszkami w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 25 °C, aż liczba złożonych jaj wyniesie 50 (około 12 godzin w przypadku szczepu dzikiego).
4. Po upływie czasu inkubacji usuń dorosłe osobniki i przenieś je do nowej butelki, aby powtórzyć procedurę. Pozwól zarodkom rosnąć w temperaturze 18 °C przez 72 godziny
   UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat warunków utrzymania stada Drosophila, zobacz Tennessen & Thymmel¹³.

2. Kolekcja larw

1. Do zbierania larw wybierz larwy wędrowne, które nie mają przetchlinki. Po wywinięciu przetchlinków larwa wchodzi w stadium przedsłupkowe, zachowując przy tym doskonałe chromosomy politenowe nadające się do analizy. Dopiero po 12 godzinach komórki gruczołu ślinowego zaczynają przygotowywać się do zaprogramowanej śmierci komórki^14,15.
2. Weź piętnaście larw 3° instar i włóż je do szkiełka zegarka, aby je umyć. Następnie przenieś je do lodowatego roztworu soli fizjologicznej lub PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, dostosuj pH do 7,4).
3. Wypreparuj od 15 do 30 par gruczołów ślinowych (lub jak najwięcej w ciągu 30 minut) w zimnym PBS z inhibitorami proteazy pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś gruczoły ślinowe do probówki o pojemności 1,5 ml z lodowatym PBS.
4. Przemyć raz 1 ml PBS plus inhibitory proteazy. Poczekaj, aż tkanka dotrze do dna probówki.
5. Po umyciu wyjmij PBS za pomocą pipety o pojemności 1000 μl. Uważaj, aby nie dotykać tkanki.
   1. Alternatywnie, należy rozciąć gruczoły ślinowe w 5 ml PBS, aby wyeliminować potrzebę tego etapu płukania i przejść do kroku 3, przenosząc gruczoły ślinowe do 0,5 ml buforu utrwalającego Ruvkun opisanego poniżej.

3. Utrwalenie tkanki gruczołu ślinowego

1. Po usunięciu PBS z ostatniego kroku, bezpośrednio dodaj 0,5 ml 1x bufor utrwalający Ruvkun, z 50% metanolem (dodać 0,5 ml metanolu) i 2% formaldehydu.
   UWAGA: 2x roztwór Ruvkun to 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM RURY o pH 7,4.
2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C z łagodnymi obrotami.

4. Mycie tkanek gruczołów ślinowych

1. Przeprowadź jedno 5-minutowe płukanie rotacyjne 1 ml buforu Tris/Triton (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 i 1 mM EDTA).
   UWAGA: Poczekaj, aż chusteczka dotrze do dna probówki.

5. Przepuszczalność

1. Inkubować gruczoły ślinowe w 1 ml Tris/Triton X-100 (tak samo jak powyżej). W przypadku niektórych białek może być konieczne dodanie 1% β-merkaptoetanolu.
2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 ° C z łagodnym wstrząsaniem (300 obr./min).

6. Krok konserwacji (opcjonalnie)

UWAGA: Jeśli nie przejdziesz natychmiast do inkubacji z przeciwciałem, zachowaj tkankę w następujący sposób.

1. Przemyć 1 ml buforu BO₃ (0,01 M_H3BO₃ pH 9,2 + 0,01 M NaOH), a następnie inkubować w BO₃/10 mM DTT w temperaturze 37 ° C z łagodnym wytrząsaniem (300 obr./min) przez 15 minut.
2. Pod koniec okresu inkubacji przepłukać 1 ml samego buforu BO₃.
   UWAGA: Poczekaj, aż chusteczka dotrze do dna probówki.
3. Dodaj 1 ml PBS. Przechowywać tkankę w tym roztworze w temperaturze 4 °C przez okres do 72 godzin, a następnie przejść do następnego etapu. Ten krok jest szczególnie przydatny podczas pracy z różnymi zmutowanymi szczepami, które mogą mieć opóźniony cykl życiowy, dzięki czemu immunodetekcja może być wykonywana w tym samym czasie wraz z kontrolami.

7. Blokowanie tkanek

1. Inkubować gruczoły ślinowe w 1 ml buforu B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z rotacją.

8. Barwienie immunologiczne

1. Usuń cały bufor B i dodaj bufor A (PBS + 0,1% BSA) plus przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania.
   UWAGA: Używamy HP1a C1A9c (skoncentrowane przeciwciało) z Hybridoma Bank do 1:3000. Stosując C1A9s (supernatant), próbowaliśmy rozcieńczenia od 1:100 do 1:500 i każde rozcieńczenie między tą rangą działa dobrze) przez noc w temperaturze 4 oC z rotacją. W tym momencie ważne jest, aby potrząsanie nie powodowało powstania pęcherzyków, które mogłyby uszkodzić przeciwciało.

9. Mycie immunologiczne

1. Wykonaj 3 x 15-minutowe płukanie buforem B mieszając w temperaturze pokojowej, używając za każdym razem 1 ml.
2. Przenieść gruczoły do buforu B razem z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem przez 2 godziny pod rotacją w temperaturze 4 oC (zastosowano przeciwciało drugorzędowe Alexa fluor 568 Invitrogen w stosunku 1:3000).
   1. Przykryj probówkę aluminiową folią papierową, aby chronić przeciwciało wtórne przed światłem.
3. Przeprowadzić 2 x 15-minutowe płukanie w temperaturze pokojowej podczas obracania z 1 ml buforu B.
4. Inkubować z markerem DNA, takim jak Sytox (wziąć 2 μl 5 mM bulionu i rozpuścić w 1 ml buforu B) lub Hoechst (wziąć 1 μl 10 mg/ml bulionu i rozpuścić w 1 ml buforu B) przez 10 minut w temperaturze pokojowej z rotacją.
5. Przeprowadzić jedno płukanie buforem B i raz PBS, przy czym każde pranie trwa 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Pamiętaj, aby chronić go przed światłem.

10. Obrazowanie

1. Zamontuj gruczoły ślinowe na zjeżdżalni, tworząc basen z szkiełkiem nakrywkowym.
2. Umieść gruczoły ślinowe na środku basenu i przykryj citifluorem AF1, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków rozciągających lepką ciecz na całe miejsce. Następnie uszczelnij wszystkie boki przezroczystym lakierem do paznokci.
3. Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym. Jeżeli próbka nie będzie obserwowana tego samego dnia, należy ją przechowywać z dala od światła w temperaturze 4 °C.
4. Użyj GraphPad Prism 6 do generowania wszystkich wykresów i analiz statystycznych.
5. Przeanalizuj dane z dystrybucji HP1a w gruczołach ślinowych za pomocą testu Kruskala-Wallisa. Istotność statystyczną ustalono na poziomie (p < 0,05*, < 0,01**, < 0,001***, < 0,0001****).

Wyniki

Reprezentatywne wyniki barwienia immunologicznego HP1a w gruczołach ślinowych Drosophila są pokazane w Rysunek 1. Pozytywnym wynikiem jest obserwacja jednego ogniska (Rysunek 1a) (agregat heterochromatyczny lub kondensat). Wynik ujemny to brak sygnału lub sygnał rozproszony. Czasami można zaobserwować podwójny sygnał, czyli z podwójnym punktem (Rysunek 1c), ale zwykle występuje on w mniejszych ilościach.

Dyskusja

Funkcja komórkowa organizmów eukariotycznych może definiować strukturę 3D w jądrze, która jest wspierana przez interakcje między różnymi białkami z chromatyną i różnymi cząsteczkami, w tym RNA. W ciągu ostatnich trzech lat kondensaty biologiczne, które miały znaczenie, w tym heterochromatyna, odegrały fundamentalną rolę w określaniu separacji faz, promując odrębną organizację przestrzenną jądra chromatyny ^aktywnej i represyjnej ^16,17,18

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Axygen MCT-150-C	11351904	marka niekrytyczna
16% formaldehydu	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, klasa biologii molekularnej	Roche	10735078001	marka niekrytyczna
Kompletne inhibitory proteazy Ultra EDTA-free proteaza inhibitory	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22x22, marka niekrytyczna
DTT	Sigma	d9779	marka niekrytyczna
EDTA	Sigma	E5134	marka niekrytyczna
EGTA			nie jest krytyczna
Szkiełko	Złota uszczelka	3011	marka nie jest krytyczna
H3BO3	Baker	0084-01	marka nie jest krytyczna
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Formularz produktu  Koncentrat 0,1 ml
KCl	Baker	3040-01	marka niekrytyczna
Metanol	Baker	9070-03	marka niekrytyczna
NaCl	Sigma	71376	marka niekrytyczna
NaOH			niekrytyczna Marka
RURY			Marka nie krytyczna
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1,5 ml
Tris	Milipore	648311	marka niekrytyczna
Triton X-100	Sigma	T8787	100 ml, marka niekrytyczna
β-merkaptoetanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, marka nie krytyczna