Artykuł metodologiczny

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

DOI:

10.3791/62409

⸱

28 kwietnia 2022

 ,  ,  , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology IRCCS (IEO), 2European School of Molecular Medicine (SEMM), c/o Campus IFOM-IEO

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białko Arginina (R)-metylacja jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną białka (PTM) zaangażowaną w regulację kilku szlaków komórkowych, w tym przetwarzanie RNA, transdukcję sygnału, odpowiedź na uszkodzenie DNA, biogenezę miRNA i translację.

W ostatnich latach, dzięki biochemicznemu i analitycznemu rozwojowi, proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) stała się najskuteczniejszą strategią charakteryzowania komórkowego proteomu metylowego z rozdzielczością pojedynczego miejsca. Jednak identyfikacja i profilowanie in vivo R-metylacji białek przez SM pozostaje trudne i podatne na błędy, głównie ze względu na substechiometryczny charakter tej modyfikacji oraz obecność różnych podstawień aminokwasów i chemicznej estryfikacji metylowej reszt kwasowych, które są izobaryczne do metylacji. W związku z tym potrzebne są metody wzbogacania w celu poprawy identyfikacji peptydów R-metylowych i ortogonalnych strategii walidacji w celu zmniejszenia liczby fałszywych odkryć (FDR) w badaniach proteomiki metylowej.

Tutaj opisany jest protokół specjalnie zaprojektowany do identyfikacji i kwantyfikacji R-metylowych peptydów o wysokim poziomie pewności z próbek komórkowych, który łączy metaboliczne znakowanie komórek za pomocą ciężkiej izotopowej kodowanej metioniny (hmSILAC) i trawienie w roztworze podwójnej proteazy ekstraktu z całych komórek, a następnie frakcjonowanie metodą chromatografii off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) i wzbogacanie powinowactwa peptydów R-metylowych za pomocą przeciwciał anty-pan-R-metylowych. Po analizie MS o wysokiej rozdzielczości, surowe dane są najpierw przetwarzane za pomocą pakietu oprogramowania MaxQuant, a wyniki są następnie analizowane przez hmSEEKER, oprogramowanie przeznaczone do dogłębnego wyszukiwania par pików MS odpowiadających lekkiemu i ciężkiemu peptydowi metylowemu w plikach wyjściowych MaxQuant.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arginina (R)-metylacja to potranslacyjna modyfikacja (PTM), która zdobi około 1% proteomu ssaków1. Metylotransferazy białkowo-argininowe (PRMT) są enzymami katalizującymi reakcję metylacji R poprzez odkładanie jednej lub dwóch grup metylowych na atomy azotu (N) grupy guanidynowej łańcucha bocznego R w sposób symetryczny lub asymetryczny. U ssaków PRMT można podzielić na trzy klasy - typ I, typ II i typ III - w zależności od ich zdolności do deponowania zarówno monometylacji (MMA), jak i asymetrycznej dimetylacji (ADMA), MMA i symetrycznej dimetylacji (SDMA) lub tylko MMA, odpowiednio2,3. PRMT celują głównie w reszty R znajdujące się w regionach bogatych w glicynę i argininę, znane jako motywy GAR, ale niektóre PRMT, takie jak PRMT5 i CARM1, mogą metylować motywy bogate w prolinę, glicynę i metioninę (PGM)4. R-metylacja pojawiła się jako modulator białek w kilku procesach biologicznych, takich jak splicing RNA5, naprawa DNA6, biogeneza miRNA7, oraz translation2, wspierając badania nad tym PTM.

Spektrometria mas (MS) jest uznawana za najbardziej efektywną technologię do systematycznego badania globalnej metylacji R-metylacji w rozdzielczości białek, peptydów i miejsc. Ten PTM wymaga jednak pewnych szczególnych środków ostrożności w celu jego identyfikacji z dużą pewnością przez państwa członkowskie. Po pierwsze, R-metylacja jest substechiometryczna, przy czym niezmodyfikowana forma peptydów jest znacznie bardziej obfita niż zmodyfikowane, tak więc spektrometry mas działające w trybie akwizycji zależnej od danych (DDA) będą fragmentować niezmodyfikowane peptydy o wysokiej intensywności częściej niż ich metylowane odpowiedniki o niższej intensywności8. Co więcej, większość procesów pracy opartych na stwardnieniu rozsianym do identyfikacji miejsc zmetylowanych przez R cierpi z powodu ograniczeń na poziomie analizy bioinformatycznej. Rzeczywiście, obliczeniowa identyfikacja peptydów metylowych jest podatna na wysokie wskaźniki fałszywych odkryć (FDR), ponieważ ten PTM jest izobaryczny na różne substytucje aminokwasów (np. glicynę do alaniny) i modyfikacje chemiczne, takie jak estryfikacja metylowa asparaginianu i glutaminianu9. W związku z tym metody oparte na znakowaniu izotopowym grup metylowych, takie jak znakowanie ciężkich stabilnych izotopów metylu za pomocą aminokwasów w hodowli komórkowej (hmSILAC), zostały wdrożone jako ortogonalne strategie do pewnej identyfikacji metylacji in vivo przez MS, znacznie zmniejszając odsetek fałszywie dodatnich adnotacji10.

Ostatnio zoptymalizowano różne protokoły badania białek R-metylowanych dla całego proteomu. Opracowanie opartych na przeciwciałach strategii wzbogacania peptydów R-metylowych w powinowactwo immunologiczne doprowadziło do adnotacji kilkuset miejsc R-metylowanych w komórkach ludzkich11,12. Ponadto wiele badań3,13 wykazało, że sprzężenie wzbogacania opartego na przeciwciałach z technikami separacji peptydów, takimi jak frakcjonowanie chromatograficzne HpH-RP, może zwiększyć ogólną liczbę zidentyfikowanych peptydów metylowych.

Ten artykuł opisuje eksperymentalną strategię zaprojektowaną do systematycznej i wysoce pewnej identyfikacji miejsc R-metylowanych w komórkach ludzkich, opartą na różnych krokach biochemicznych i analitycznych: ekstrakcja białka z komórek znakowanych hmSILAC, równoległe podwójne trawienie enzymatyczne z trypsyną i proteazami LysargiNase, a następnie chromatograficzne frakcjonowanie trawionych peptydów metodą HpH-RP, połączone z immunologicznym wzbogaceniem MMA-, SDMA-, opartym na przeciwciałach. i peptydy zawierające ADMA. Wszystkie peptydy wzbogacone w powinowactwo są następnie analizowane za pomocą chromatografii cieczowej o wysokiej rozdzielczości (LC)-MS/MS w trybie DDA, a surowe dane MS są przetwarzane przez algorytm MaxQuant w celu identyfikacji R-metylopeptydów. Na koniec wyniki wyjściowe MaxQuant są przetwarzane za pomocą hmSEEKER, opracowanego przez nas narzędzia bioinformatycznego do wyszukiwania par ciężkich i lekkich peptydów metylowych. Krótko mówiąc, hmSEEKER odczytuje i filtruje identyfikacje peptydów metylowych z pliku msms, a następnie dopasowuje każdy peptyd metylowy do odpowiadającego mu piku MS1 w pliku allPeptides, a na koniec przeszukuje pik odpowiednika peptydu ciężkiego/lekkiego. Dla każdej przypuszczalnej pary ciężkie-lekkie obliczany jest stosunek Log2 H/L (LogRatio), różnica czasu retencji (dRT) i błąd masy (ME), a dublety, które znajdują się w zdefiniowanych przez użytkownika punktach odcięcia, są oznaczane jako prawdziwie dodatnie. Przebieg protokołu biochemicznego jest opisany w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórek i ekstrakcja białek (wymagany czas: 3 - 4 tygodnie)

  1. Hoduj komórki HeLa równolegle w pożywkach dostarczanych odpowiednio z lekką (L) lub ciężką (H) metioniną (patrz Tabela 1 dla składu pożywki). Po co najmniej ośmiu podziałach komórkowych zebrać porcję komórek z każdego kanału SILAC i przeprowadzić test inkorporacji.
    UWAGA: Aby sprawdzić skuteczność włączenia, przetestuj za pomocą analizy LC-MS/MS, czy procent ciężkiej metioniny (Met-4) w kanale ciężkim jest jak najbardziej zbliżony do 100%. Przeanalizuj podwielokrotność komórek z ciężkimi znacznikami za pomocą LC-MS/MS (dla ustawień patrz Tabela 2), a następnie przetwórz dane MS za pomocą MaxQuant przy użyciu parametrów wskazanych w Tabeli 3. Aby sprawdzić, czy Met-4 jest włączony do Met-4, opracowany przez nas skrypt jest dostępny pod adresem https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/.
  2. Uważa się, że intensywna inkorporacja metioniny jest zakończona, gdy osiągnie >97%. Gdy każdy kanał osiągnie łączną liczbę około 60 x 10,6 komórek (co odpowiada około 40 szalkom po 15 cm każda przy 85% zbiegu dla komórek HeLa, z różnicami w zależności od typu komórki), zbierz je. Dokładnie je policzyć, wymieszać w proporcji 1:1 i osadzać przez odwirowanie w 335 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Aby ocenić prawidłowe mieszanie 1:1 L/H, zachowaj porcję i uruchom ją na plasterku żelu, o którym wiadomo, że zawiera dużą obfitość i silnie metylowane białko R (np. fibrylaryna). Jeśli znakowanie zakończyło się sukcesem i osiągnięto mieszanie 1:1, w próbce powinien być obecny stosunek 1:1 lekkich i ciężkich wersji R-metylowanych peptydów. Alternatywnie, zachowaj podwielokrotność mieszanej próbki do analizy przez LC-MS/MS, a następnie przetwórz dane MS za pomocą MaxQuant, korzystając z parametrów wskazanych w Tabeli 3 i wykreśl rozkład stosunku Log2 H/L, jak pokazano na Rysunek 2C. Protokół można tutaj zatrzymać, zamrażając granulat i przechowując go w temperaturze -80 °C.
  3. Ponownie zawiesić osad komórkowy w czterech objętościach buforu do lizy (patrz tabela 1 w celu zapoznania się ze składem buforu do lizy) w odniesieniu do objętości osadu komórkowego. Na przykład użyj 6 ml buforu do lizy dla osadu z 120 x 106 komórek Hela (60 x 106 Lekkie + 60 x 106 Ciężkie), co odpowiada objętości 1,5 ml.
    UWAGA: Ekstrakcja białka musi być przeprowadzana w temperaturze pokojowej (RT), ponieważ bufor do lizy zawiera czynnik chaotropowy 9 M Mocznik, który wytrąca się w temperaturze lodu; dlatego ważne jest dodanie szerokiego spektrum inhibitorów proteazy seryny i cysteiny, a także inhibitorów fosfataz, aby jednocześnie chronić białka przed degradacją proteolityczną i defosforylacją, koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy jest dostępny w handlu w postaci małych tabletek, patrz Tabela 1 i Tabela materiałów.
  4. Poddaj próbkę sonikatorowi za pomocą sonikatora zaburzającego komórki z mikrokońcówką przez co najmniej pięć cykli po 15 s włączenia i 30 s wyłączenia, aby zapewnić skuteczne pękanie błon komórkowych oraz uwalnianie i ścinanie DNA. Sprawdź lepkość ekstraktu, pipetując roztwór w górę iw dół. Jeśli jest zbyt lepki z powodu niepełnego ścinania DNA i rozpuszczania błony, powtórz cykle sonikacji.
    UWAGA: Upewnij się, że próbka nie przegrzewa się podczas sonikacji, ponieważ wysoka temperatura może uszkodzić białka. Nie jest jednak możliwe umieszczenie próbki na lodzie pomiędzy cyklami sonikacji, ze względu na obecność 9M Mocznika; dlatego zaleca się przerwę na 60 s OFF między różnymi cyklami sonikacji. Ponadto należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas sonikacji, ponieważ zmniejszają one skuteczność sonikacji.
  5. Odwirować ekstrakt przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia zanieczyszczeń i przeniesienia supernatantu do nowej probówki o pojemności 15 ml.
  6. Zmierz zawartość białka w ekstrakcie za pomocą testu kolorymetrycznego, takiego jak kwas Bradforda lub kwas bicinchoninowy (BCA)14,15. Optymalna początkowa ilość ekstraktu białkowego dla tego protokołu wynosi od 20 do 30 mg.
    UWAGA: do lizy zawierające mocznik o wysokim stężeniu są kompatybilne zarówno z testem ilościowym Bradforda, jak i BCA; inne rodzaje do lizy, takie jak te, w tym dodecylosiarczanu sodu o wysokim stężeniu (SDS), nie są kompatybilne z Bradfordem.

2. Trawienie lizatu (orientacyjny czas wymagany 2 godziny)

  1. Przeprowadzić redukcję grupy tiolowej (-SH) białek przy użyciu roztworu podstawowego ditiotreitolu (DTT) rozpuszczonego w wodzie ultraczystej o końcowym stężeniu 4,5 mM i pozostawić reakcję na 30 minut w temperaturze 55 °C.
    UWAGA: Możliwe jest przygotowanie 1 M podstawowego roztworu DTT i przechowywanie go w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca, rozmrażając tylko porcje potrzebne do każdego eksperymentu. Alternatywnie, reduktor sulfhydrylu tris-(2-karboksetylo)-fosfina (TCEP) może być stosowany do przeprowadzania redukcji grup -SH; szczególnie w przypadku długotrwałego przechowywania białek, TCEP jest znacznie bardziej stabilny niż DTT bez chelatów metali, takich jak EGTA w buforze, podczas gdy DTT jest bardziej stabilny, jeśli obecne są chelaty metali16.
  2. Przeprowadzić alkilację grupy tiolowej (-SH) białek przez dodanie jodoacetamidu (IAA) o stężeniu 10 mM i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przeprowadzić inkubację wyekstrahowanych białek z roztworem IAA w ciemności, ponieważ IAA jest światłoczuły.
    UWAGA: Roztwór podstawowy IAA o stężeniu 100 mM powinien być przygotowany na świeżo przed każdym eksperymentem. Alternatywnie, chloroacetamid może być użyty do przeprowadzenia alkilacji grup -SH, zwłaszcza jeśli celem eksperymentu jest analiza wzajemnych oddziaływań między metylacją a ubikwitynacją, ponieważ artefakt indukowany przez IAA naśladuje ubikwitynację17.
  3. Przed przystąpieniem do etapu trawienia białek należy zachować porcję ekstraktu białkowego (1/1 000 początkowego niestrawionego lizatu) do późniejszej analizy na żelu barwionym SDS-PAGE Coomassie i porównania z odpowiednią ilością próbki po trawieniu; test ten służy do sprawdzenia skuteczności proteolizy (patrz punkt 4).
  4. Rozcieńczyć pozostały ekstrakt białkowy czterema objętościami 20 mM HEPES pH 8,0, aby osiągnąć końcowe stężenie mocznika 2 M (które jest stężeniem zgodnym z aktywnością enzymatyczną proteaz). Podzielić próbkę na dwie części: w pierwszej dodać zmodyfikowaną trypsynę klasy sekwencjonowania, a w drugiej dodać proteazę LysargiNase (patrz Tabela materiałów) w proporcji 1:100 (w/w) w stosunku do mg materiału wyjściowego. Pozostawić na noc w temperaturze 37 °C w termomikserze z prędkością 600 obr./min, aby umożliwić trawienie enzymatyczne.
    UWAGA: Trypsyna, najpowszechniejszy enzym trawienny w proteomice, rozszczepia się na C-końcu R i lizyny (K), wytwarzając peptydy o rozkładzie ładunku, który powoduje widma fragmentacji zdominowane przez jony typu y po dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID). Lizarginaza rozszczepia się na N-końcu R i K, odzwierciedlając zatem specyficzność rozszczepienia trypsyny i generując peptydy, które uwalniają głównie jony typu b podczas fragmentacji CID. Ta połączona analiza prowadzi do znacznie zwiększonego pokrycia sekwencji peptydów i większej pewności w identyfikacji R-metylacji specyficznych dla danego miejsca18.

3. Oczyszczanie peptydów (orientacyjny wymagany czas 1 godzina)

  1. Zachować podwielokrotność strawionych peptydów z obu reakcji, zbierając takie same objętości jak w ppkt 2.3 do porównania na SDS-PAGE Żel barwiony Coomassie w celu oceny skuteczności trawienia proteazy (patrz punkt 4).
  2. Zatrzymać trawienie poprzez zakwaszenie próbek dodatkiem kwasu trifluorooctowego (TFA) do końcowego stężenia 5%. Dobrze wymieszaj i zmierz pH próbek papierkiem lakmusowym (pH powinno wynosić około 3). Krótko odwirować i odwirować zakwaszone próbki przed przeniesieniem ich do nowych probówek o pojemności 15 ml.
  3. Oczyść próbki za pomocą dwóch wkładów próżniowych C18 (masa sorbentu 1 g, patrz tabela materiałów), jeden dla próbki trawionej trypsyną, a drugi dla próbki trawionej za pomocą LysargiNase. Przygotować rozpuszczalnik A, rozpuszczalnik B i bufor do przemywania (skład buforu znajduje się w Tabeli 1).
  4. Używając szklanych pipet, nawodnij każdy wkład 6 ml ACN 100% 3 razy. Następnie zrównoważyć kolejno każdy wkład z 3-9-18 ml rozpuszczalnika A. Załaduj próbki (żywice powinny zmienić kolor na żółty). Przemyć ponownie kolejno 3-9-18 ml rozpuszczalnika A, a następnie dodać 6 ml buforu do mycia. Przenieść każdą kolumnę do czystych probówek o pojemności 15 ml i wymyć próbki za pomocą 7 ml rozpuszczalnika B. Powtórzyć etap elucji z 7 ml rozpuszczalnika B, aby uzyskać końcową objętość 14 ml.
    UWAGA: Wykonaj wszystkie te kroki, pozwalając i roztworowi przejść przez kolumny grawitacyjnie. Aby sprzyjać przepływowi przez kolumnę, należy powoli popychać każdy roztwór za pomocą strzykawki, aby naśladować podciśnienie.
  5. Zaoszczędź 50 μl eluowanych peptydów, 50 μl przepływowego (FT), 50 μl płukania rozpuszczalnikiem A i 50 μl ostatniego płukania do późniejszej oceny peptydów przez SDS-PAGE (patrz punkt 4).

4. Żel SDS-PAGE barwiony Coomassie (orientacyjny wymagany czas 2 godziny)

  1. Zebrane porcje nanieść na 17,5% żel SDS-PAGE i zabarwić barwnikiem Instant-Blu Coomassie (patrz Tabela Materiałów). Oczekiwany wynik jest reprezentowany przez Rysunek 2A.

5. Liofilizacja peptydów (orientacyjny czas 2 dni)

  1. Przykryj probówki o pojemności 15 ml zawierające eluowane peptydy folią parafinową, którą następnie przebija się igłą 20 G, aby utworzyć 3-5 otworów. Umieścić probówki w suchym lodzie na co najmniej 30 minut, aż próbki zostaną całkowicie zamrożone.
  2. Liofilizować zamrożone frakcje przez 48 godzin, w odstępie czasu zwykle wystarczającym do zapewnienia pełnej liofilizacji próbek, nawet jeśli może wystąpić pewna zmienność, ze względu na wydajność liofilizatora.
    UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, przechowując liofilizowane próbki w temperaturze -80 °C.

6. Frakcjonowanie chromatograficzne peptydów metodą off-line HpH-RP (czas orientacyjny 4 dni)

  1. Do frakcjonowania peptydów na 60 frakcji należy zastosować chromatografię cieczową HpH-RP, przy użyciu systemu HPLC wyposażonego w kolumnę C12-RP HPLC (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A).
  2. Przed biegiem należy przygotować świeży bufor A i bufor B (skład opisano w tabeli 1).
  3. Przefiltruj cały roztwór filtrem 0,22 μm i odgazuj go w kąpieli sonicyjnej przez co najmniej 30 minut.
  4. Rozpuść liofilizowane peptydy w 1 ml buforu A. Przefiltruj peptydy przez filtr 0,45 μm z politetrafluoroetylenu (PTFE) za pomocą strzykawki.
  5. Ustawić szybkość frakcjonowania na przepływ 1 ml/min i zebrać 1 ml frakcji, używając następującego gradientu chromatograficznego: 5% B do 30% B w 60 min; 30% B do 60% w 2 min; 70% B przez 3 min.
  6. Ustawić HPLC tak, aby w tym momencie zbieranie frakcji zostało zatrzymane, a gradient utrzymywał się na poziomie 70% buforu B przez 5 minut przed intensywnym myciem kolumny z szybkim gradientem do 100% buforu B, po którym nastąpiło końcowe płukanie (100% bufor B przez 10 minut).
    UWAGA: Na koniec każdej serii chromatograficznej zawsze równoważyć kolumnę ze 100% buforem A przez 20 minut.
  7. Frakcjonować obie próbki oddzielnie trawione trypsyną i lizarginazą za pomocą gradientów chromatograficznych HpH RP off-line, jak opisano w ppkt 6.5.
  8. Dla każdego gradientu chromatograficznego zbierz wszystkie frakcje na głęboką płytkę 96-dołkową.
  9. Połącz ułamki zebrane przed gradientem w jedną frakcję o nazwie PRE. Połącz 60 frakcji z gradientu chromatografii cieczowej (LC) HpH-RP, łącząc je w sposób nieciągły w 14 końcowych frakcji. Aby uzyskać taką nieciągłą konkatenację, połącz frakcje HpH-RP zgodnie z poniższym schematem.
    1. Frakcja 1 (objętość końcowa 5 ml): Basen 1-15-29-43-57
    2. Frakcja 2 (objętość końcowa 5 ml): Basen 2-16-30-44-58
    3. Frakcja 3 (końcowa objętość 5 ml): Pula 3-17-31-45-59
    4. Frakcja 4 (objętość końcowa 5 ml): Basen 4-18-32-46-60
    5. Frakcja 5 (objętość końcowa 4 ml): Basen 5-19-33-47
    6. Frakcja 6 (objętość końcowa 4 ml): Basen 6-20-34-48
    7. Frakcja 7 (objętość końcowa 4 ml): Basen 7-21-35-49
    8. Frakcja 8 (objętość końcowa 4 ml): Basen 8-22-36-50
    9. Frakcja 9 (objętość końcowa 4 ml): Basen 9-23-37-51
    10. Frakcja 10 (objętość końcowa 4 ml): Basen 10-24-38-52
    11. Frakcja 11 (objętość końcowa 4 ml): Pula 11-25-39-53
    12. Frakcja 12 (objętość końcowa 4 ml): Basen 12-26-40-54
    13. Frakcja 13 (objętość końcowa 4 ml): Pula 13-27-41-55
    14. Frakcja 14 (objętość końcowa 4 ml): Pool 14-28-42-56
      UWAGA: Konkatenacja nieciągła polega na łączeniu frakcji wczesnych, średnich i późno eluujących, co pozwala na zwiększenie niejednorodności składu peptydów w obrębie frakcji zbiorczych. W związku z tym mieszanina peptydów każdej frakcji zbiorczej jest skutecznie oddzielana, z ograniczoną koelucją, w późniejszej nanoprzepływowej chromatografii o niskim pH-RP-LC bezpośrednio sprzężonej ze spektrometrem masowym.
  10. Połącz ułamki zebrane po nachyleniu w unikatowy ułamek o nazwie POST.
    UWAGA: Uwzględniając frakcje gradientu PRE i POST, uzyskuje się w sumie 16 frakcji w probówkach o pojemności 15 ml (patrz Rysunek 3A).
  11. Przykryj probówki o pojemności 15 ml folią parafinową i przebij je igłą 20 G, aby uzyskać 3-5 otworów. Zamroź je, inkubując probówki wirówkowe w suchym lodzie, aż każda frakcja zostanie całkowicie zamrożona.
  12. Liofilizować frakcje przez około 48 godzin. Upewnij się, że każda próbka jest całkowicie wysuszona przed zatrzymaniem liofilizatora.
    UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, przechowując liofilizowane próbki w temperaturze -80 °C.

7. Wzbogacenie immunopowinowactwa peptydowego R-metylowanego (orientacyjny czas 2 dni)

  1. Przeprowadzić sekwencyjne wzbogacanie immunopowinowactwa zmodyfikowanego peptydu w przeciwciała anty-pan-R-metylacji równolegle, ale oddzielnie dla dwóch próbek z trawienia trypsyny i lizarginazy. Bufor do oczyszczania immunopowinowactwa (IAP) jest dostarczany przez firmę kupującą przeciwciała anty-pan-R-metylowe do wzbogacania powinowactwa do zmodyfikowanych peptydów (szczegóły znajdują się w Materiałach tabelowych i odczynnikach). Bufor IAP jest skoncentrowany 10x i powinien być rozcieńczony 10 razy przed użyciem.
    UWAGA: Bufor IAP 1x może być przechowywany w temperaturze -20 °C do 1 roku.
  2. Odwirować liofilizowane peptydy w temperaturze 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby odwirować peptydy na dno probówki o pojemności 15 ml. Ponownie zawiesić liofilizowane peptydy w 250 μl 1x buforu IAP na probówkę o pojemności 15 ml i przenieść w 1,5 ml probówce o niskim stopniu wiązania. Sprawdź za pomocą papierka lakmusowego, czy pH wynosi >6.
  3. Przechowywać małą podwielokrotność (około 5 % objętości) każdej frakcji jako dane wejściowe do kolejnej analizy w państwie członkowskim.
  4. Podzielić każdą frakcję na dwie podwielokrotności, aby równolegle przeprowadzić immunowzbogacenie peptydów asymetrycznie dimetylowanych (ADMA) i symetrycznie dimetylowanych (SDMA).
  5. Użyć trzech fiolek z wybranymi przeciwciałami anty-pan-R-metylowanymi sprzężonymi z kulkami agarozy białka A na 10 mg początkowego ekstraktu białkowego.
  6. Przygotować odpowiednią ilość przeciwciała sprzężonego z kulkami agarozy, odwirowując każdą fiolkę przy 2 000 x g przez 30 s i usuwając bufor z kulek. Umyj koraliki trzy razy 1 ml 1x PBS, zawsze odwirowując je przy 2,000 x g przez 30 s.
  7. Po ostatnim przemyciu ponownie zawiesić kulki w 40 μl 1x PBS na każdą fiolkę; połączyć je i na koniec podzielić równo na 16 frakcji (tak, aby do każdej frakcji dodać 2,5 μl kulek przeciwciała).
  8. Dodać 250 μl 1x buforu IAP do każdej probówki, wymieszać przez odwrócenie i pozostawić do inkubacji na obracającym się kole przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Próbki należy wymieszać, odwracając probówki o pojemności 1,5 ml, a nie pipetując je mikrokońcówkami, ponieważ może to spowodować uszkodzenie kulek lub ich zgubienie.
  9. Po 2 godzinach inkubacji odwirować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające peptydy i kulki sprzężone z przeciwciałami metylowymi w temperaturze 2 000 x g przez 30 s w celu osadzenia kulek; przenieść FT z każdej frakcji do czystych probówek o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,5 ml.
  10. Dodaj kulki sprzężone z przeciwciałami przeciwko R-monometylacji (MMA) do FT i powtórz kroki od 7,7 do 7,9.
  11. Podczas inkubacji próbek peptydów z kulkami MMA, należy przemyć dwukrotnie frakcje, które zostały uprzednio immunoprecypitowane anty-ADMA i SDMA, buforem IAP o pojemności 250 μl (odwracając, a nie pipetując) i odrzucając supernatant przy każdym przemyciu.
  12. Powtórz pranie z LC-MS klasa H2O trzy razy.
  13. Eluować symetrycznie i asymetrycznie R-di-metylowane peptydy wzbogacone o powinowactwo z kulek agarozy, dodając 50 μl 0,15% TFA do każdej probówki (silne warunki kwasowe w rzeczywistości denaturują epitop, prowadząc do uwolnienia antygenów z przeciwciał). Pozostaw ten roztwór na 10 minut w temperaturze pokojowej, odwracając rurki co 2-3 minuty.
  14. Przenieść pierwszą elucję do czystych probówek o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,5 ml i powtórzyć elucję z 50 μl 0,15% TFA; zebrać 2 frakcje w jednej probówce.
  15. Powtórz kroki od 7.11 do 7.14 dla peptydów R-monometylowanych, które inkubowano z kulkami przeciwciała anty-MMA.

8. Odsalanie i zagęszczanie peptydów metylowych wzbogaconych o powinowactwo za pomocą mikrokolumn C18 (orientacyjny czas wymagany 30 minut)

  1. Zrównoważyć metanolem mikrokolumny C18-RP wykonane z wkładów ekstrakcyjnych 3M do fazy stałej do odsalania i zagęszczania peptydów przed analizą MS19.
  2. Załadować próbki (odpowiadające oddzielnym frakcjom wzbogaconym w powinowactwo immunologiczne i frakcjom wejściowym) na mikrokolumny C18 w dwóch etapach (50 μl + 50 μl na każdą mikrokolumnę C18) przez odwirowanie przy 600 x g przez 6 minut.
  3. Przemyć mikrokolumny 55 μl buforu A (patrz tabela 1 dla składu buforu), zawsze przez odwirowanie przy około 900 x g przez 5 min.
    UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, pozostawiając mikrokolumny C18-RP w temperaturze 4 °C, gdzie można je przechowywać do 2 tygodni.

9. Drugie trawienie enzymatyczne (orientacyjny czas wymagany 3 godziny)

  1. Przemyć mikrokolumny C18-RP 55 μl buforu A (patrz tabela 1 w celu zapoznania się ze składem buforu) dwa razy, przez odwirowanie przy około 850 x g przez 5 minut.
  2. Dwukrotnie wypłukać peptydy za pomocą 20 μl buforu B (patrz tabela 1 dla składu buforu) i połączyć dwie frakcje.
  3. Wysuszyć eluowane peptydy w koncentratorze próżniowym (szczegółowe informacje znajdują się w tabeli Materiał i odczynniki). W międzyczasie należy przygotować roztwór do wytrawiania, który składa się z 50 mM wodorowęglanu amonu, który jest rozcieńczony ze świeżo przygotowanego 1 M roztworu podstawowego (patrz Tabela 1).
  4. Dodać trypsynę lub lizarginazę do odpowiednich próbek, do końcowego stężenia 25 ng/μl. Inkubować każdą próbkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  5. Dodać 1 μl 5% TFA, aby zatrzymać trawienie; odwirować i odwirować próbki.
    UWAGA: Rozszczepienie enzymatyczne przez trypsynę może być hamowane na C-końcu metylowanych R i K, powodując pominięte rozszczepienia, które zwiększają długość i ładunek peptydu, co z kolei wytwarza złożone i niekompletne widma fragmentacji, utrudniając identyfikację peptydów i specyficzne dla miejsca przypisywanie miejsc metylacji. Wykazano, że drugie trawienie enzymatyczne może zmniejszyć częstotliwość takich pominiętych rozszczepień, z lepszym pokryciem sekwencji i atrybucją miejsca20.

10. Peptydy odsalające (orientacyjny wymagany czas 30 minut)

  1. Załadować zakwaszone roztwory peptydów do nowych mikrokolumn C18-RP, które zostały wcześniej zrównoważone zgodnie z tymi samymi krokami opisanymi w punkcie 8.
  2. Peptyd załadowany na mikrokolumny C18-RP może być przechowywany w temperaturze 4 °C do czasu elucji do analizy LC-MS/MS.

11. Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) (orientacyjny czas 5 dni)

  1. Eluować peptydy z mikrokolumn C18-RP, przepuszczając 10 μl buforu B, odwirowując przy 615 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwukrotnie i połącz eluaty.
  2. Zmniejszyć objętość eluatów w koncentratorze próżniowym, aż będą prawie suche, unikając nadmiernego wysuszenia.
  3. Ponownie zawiesić peptydy w 10 μl buforu A do analizy LC-MS/MS.
  4. Analizować każdą frakcję R-metylowych peptydów za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) w spektrometrze masowym o wysokiej rozdzielczości (patrz tabela materiałów), sprzężonym z systemem ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej nanoprzepływowej (UHPLC). Ustaw parametry przyrządu zgodnie z opisem w Tabeli 2.
  5. Załaduj 2 μl każdej próbki na nano-kolumnę analityczną (łatwa kolumna natryskowa o średnicy wewnętrznej 75 μm, długości 25 cm), wypełnioną żywicą C18-RP (wielkość cząstek 2 μm).
  6. Próbki przepuszcza się przez nanokolumnę C18 RP z natężeniem przepływu 300 nL/min, z następującym gradientem liniowym: 3%-30% B przez 89 min, 30%-60% B przez 5 min, 60%-95% B przez 1 min i 95% B przez 5 min.
  7. Spektrometr mas działa w trybie akwizycji zależnej od danych (DDA), aby automatycznie przełączać się między akwizycją MS z pełnym skanowaniem a akwizycją MS/MS. Ustaw pełny skan MS badania do analizy w detektorze spektrometru z rozdzielczością R = 70 000. Piętnaście najintensywniejszych jonów peptydowych jest sekwencyjnie izolowanych do wartości docelowej 3 x 106 i fragmentowanych przez względną energię zderzenia wynoszącą 28%. Ustaw maksymalny dozwolony czas akumulacji jonów na 20 ms dla pełnych skanów i 50 ms dla MS/MS i ustal wartość docelową dla MSMS na 1 x 106. Czas dynamicznego wyłączania jest ustawiony na 20 s.

12. Przeprowadzanie analizy danych za pomocą MaxQuant i hmSEEKER

  1. Po zakończeniu przebiegów LC-MS/MS należy zaimportować surowe dane MS do wyszukiwarki peptydów, aby zidentyfikować peptydy metylowe metodą opartą na prawdopodobieństwie w referencyjnej bazie danych. W tym protokole do naszej analizy użyto MaxQuant w wersji 1.6.2.10. MaxQuant wymaga do działania co najmniej 2 GB pamięci RAM, a także wystarczającej ilości miejsca na dysku do przechowywania wszystkich surowych danych i wszystkich plików wyjściowych.
    UWAGA: Zapoznaj się z oficjalną dokumentacją pod adresem https://www.maxquant.org, aby uzyskać wszystkie szczegółowe informacje na temat instalacji oraz wymagań sprzętowych i programowych.
  2. Zduplikuj każdy plik z nieprzetworzonymi danymi. Zmień nazwy oryginałów, dodając "_light" do ich nazwy, a następnie zmień nazwy kopii, dodając "_heavy".
    UWAGA: hmSEEKER, skrypt do dalszej analizy, rozróżnia wielkość liter.
  3. Uruchom wyszukiwanie MaxQuant/Andromeda w celu identyfikacji peptydów z ustawieniami wskazanymi w Tabeli 3. Spośród kilku danych wyjściowych generowanych przez MaxQuant tylko pliki allPeptides.txt i msms.txt (znajdujące się w podfolderze combined/txt) są wymagane do etapu przetwarzania końcowego.
  4. Przetwarzanie końcowe danych wyjściowych MaxQuant odbywa się za pomocą algorytmu hmSEEKER. Pobierz hmSEEKER z: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Skrypt jest dostępny jako notes Jupyter napisany w języku Python 3.7 i zawiera przykładowy zestaw danych do celów testowych. Dla nowych użytkowników zaleca się pobranie i zainstalowanie platformy Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual). Najnowsza wersja zawiera domyślnie Pythona 3.8, Jupyter i wszystkie pakiety, które są wymagane do uruchomienia hmSEEKER (np. Scikit-learn 0.23.1).
  5. Utwórz folder i przechowuj w nim pliki allPeptides.txt i msms.txt z danych wyjściowych MaxQuant.
  6. Uruchom program Jupyter (z wiersza polecenia lub z nawigatora Anaconda).
  7. Przejdź do folderu hmSEEKER i otwórz plik hmSEEKER.ipynb.
  8. W sekcji Parametry wejściowe notesu wskaż ścieżki do bazy danych FASTA i do folderów zawierających pliki tekstowe MaxQuant.
  9. Uruchom kod w każdej komórce, zaznaczając komórkę i klikając przycisk Odtwórz w górnej części interfejsu Jupyter.
  10. Skrypt tworzy rozdzielany przecinkami plik wyjściowy dla każdego analizowanego zestawu danych oraz plik połączony. Ostateczna lista dubletów znajduje się w pliku o nazwie "[data]-[godzina]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
    (Tabela 4 zawiera krótki opis kolumn w tabeli wyników).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł opisuje proces identyfikacji globalnej metylacji białka R, który opiera się na połączeniu enzymatycznego trawienia ekstraktu białkowego z dwoma odrębnymi proteazami równolegle, a następnie frakcjonowaniu peptydów proteolitycznych metodą chromatografii cieczowej HpH-RP i wzbogacaniu immunopowinowactwa peptydów R-metylowych przeciwciałami anty-pan-R-metylowymi (Rysunek 1).

Komórki były hodowane w obecności metioniny, naturalnej (Light, L, Met-0) lub znakowanej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja metylacji białek/peptydów in vivo za pomocą globalnej proteomiki opartej na stwardnieniu rozsianym jest trudna ze względu na ryzyko wysokiego FDR, przy czym podczas przygotowywania próbki zachodzi kilka podstawień aminokwasów i estryfikacji metylu, które są izobaryczne do metylacji i mogą powodować błędne przypisania w przypadku braku ortogonalnych strategii walidacji MS. Substechiometryczny charakter tego PTM dodatkowo komplikuje zadanie globalnej proteomiki metylowej, ale można go przezwyciężyć d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MM i EM są doktorantami w Europejskiej Szkole Medycyny Molekularnej (SEMM). EM jest odbiorcą 3-letniego stypendium FIRC-AIRC (kod projektu: 22506). Globalne analizy proteomów R-metylowych w grupie gruźlicy są wspierane przez grant AIRC IG (kod projektu: 21834).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wodorowęglan amonu (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Nadsiarczan amonu (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Kolumny Sep-Pak vacc 6cc (1g)WodyWAT036905
Koloidalne barwienie Coomassie InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, wolne od EDTARoche-Sigma Aldrich11836170001Inhibitor proteazy
Dializowana płodowa surowica bydlęca (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Ditiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherżądany  ze stabilną glutaminą i bez metioniny
System chromatograficzny EASY-nano LC 1200Kolumny HPLC ThermoFisher
EASY-SprayThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
Ogniwa HeLaATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
Jodoacetamid (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP kolumnaPhenomenex00G-4396-E0
L-MetioninaSigma-AldrichM5308Lekki (L) Metionina
L-Metionina-(metylo-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Ciężki (H) Metionina
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
Sonifier z mikrokońcówką 250Branson
N,N,N′,N′ -Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicylina-StreptomycynaGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Inhibitor fosfatazy
Pierce C18 KońcówkiThermoFisher87782
Pierce  0,1% kwas mrówkowy (v/v) w acetonitrylu, klasaLC-MSThermoFisher85175LC-MS Rozpuszczalnik B
Pierce  0,1% kwas mrówkowy (v/v) w wodzie, klasa LC-MSThermoFisher85170LC-MS Rozpuszczalnik A
Pierce  Acetonitryl (ACN), klasa LC-MSThermoFisher51101
Pierce  Woda, klasa LC-MSThermoFisher51140
PoliakryloamidSigma-Aldrich92560
Precision Plus Białko  Wszystkie wzorce białek barwionych na niebieskoBio-Rad
PTMScan α-ADMACell Signaling Technology13474
Przeciwciała PTMScan α-MMACell Signaling Technology12235
Przeciwciała PTMScan α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrydowa masa kwadrupolowo-orbitrapowa SpektrometrThermoFisher
Sekwencjonowanie Stopień Zmodyfikowana TrypsynaPromegaV5113
Kwas trifluorooctowySigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
MocznikSigma-AldrichU5378
Koncentrator próżni 5301EppendorfSpeed vac
Przeciwciała 1610373

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  4. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  5. Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
  6. Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
  7. Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
  8. Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
  9. Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
  10. Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
  11. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  12. Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
  13. Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300(2019).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
  17. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
  18. Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
  19. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896(2007).
  20. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  21. Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
  22. Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
  23. Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
  24. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
  25. Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
  26. Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
  27. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  28. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  29. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  30. Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
  31. Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
  32. Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
  33. Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
  34. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  35. Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metylacja argininy bia ekproteomika ze spektrometri maspeptydy R zmetylowanemodyfikacja potranslacyjnaznakowanie metabolicznewysokozasadowa chromatografia odwr conawzbogacanie powinowactwemoczyszczanie immunoafinicyjnetrawienie trypsyntrawienie LysargiNase

Powiązane artykuły