Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Retinopatia indukowana tlenem (OIR) jest szeroko stosowana do badania nieprawidłowego wzrostu naczyń krwionośnych w chorobach niedokrwiennych siatkówki, w tym retinopatii wcześniaków (ROP), proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR) i niedrożności żył siatkówki (RVO). Większość badań OIR obserwuje neowaskularyzację siatkówki w określonych punktach czasowych; jednak dynamiczny wzrost naczyń krwionośnych u żywych myszy w czasie, który jest niezbędny do zrozumienia chorób naczyń związanych z OIR, był niedostatecznie zbadany. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół indukcji mysiego modelu OIR, podkreślając potencjalne pułapki i zapewniając ulepszoną metodę szybkiego ilościowego określania obszarów obliteracji naczyń krwionośnych (VO) i neowaskularyzacji (NV) za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Co ważniejsze, monitorowaliśmy odrastanie naczyń krwionośnych u żywych myszy od P15 do P25, wykonując angiografię dna oka fluoresceiny (FFA) w mysim modelu OIR. Zastosowanie FFA do mysiego modelu OIR pozwala nam obserwować proces przebudowy podczas odrastania naczyń.
Wprowadzenie
Neowaskularyzacja siatkówki (RNV), która jest definiowana jako stan, w którym nowe patologiczne naczynia pochodzą z istniejących żył siatkówki, zwykle rozciąga się wzdłuż wewnętrznej powierzchni siatkówki i rozrasta się do ciała szklistego (lub przestrzeni podsiatkówkowej w pewnych warunkach)1. Jest to cecha charakterystyczna i wspólna wielu retinopatii niedokrwiennych, w tym retinopatii wcześniaków (ROP), niedrożności żył siatkówki (RVO) i proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR)2.
Liczne obserwacje kliniczne i eksperymentalne wykazały, że główną przyczyną neowaskularyzacji siatkówki jes....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury związane z użyciem myszy zostały zatwierdzone przez komisję etyki eksperymentów na zwierzętach Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Chiny (autoryzowany numer: 2020-082), oraz zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Centrum Okulistycznego Zhongshan oraz Oświadczenia Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącej wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
1. Indukcja mysiego modelu OIR
- Użyj myszy z niższym wskaźnikiem wrodzonych wad rozwojowych oczu, np. myszy C57BL / 6J, i połącz je w pary w stosunku samiec / s....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W mysim modelu OIR najważniejszym i podstawowym wynikiem jest ilościowe określenie obszaru VO i NV. Po przebywaniu w środowisku hiperoksycznym przez 5 dni od P7, w centralnej części siatkówki szczeniąt zaobserwowano największy obszar braku perfuzji. Pod wpływem stymulacji hipoksją przez kolejne 5 dni stopniowo powstawały nowotwory naczyniowe siatkówki, które fluorescowały intensywniej niż otaczające je naczynia prawidłowe. Po P17 sygnał fluorescencyjny patologicznej neowaskularyzacji szybko zanikał w miarę przebudowy sia.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Na podatność myszy na OIR wpływa wiele czynników. Nie można porównywać szczeniąt o różnym pochodzeniu genetycznym i szczepach. U myszy albinosów BALB/c naczynia szybko odrastają w obszar VO ze znacznie zmniejszonymi kępkami neowaskularnymi38, co powoduje pewne trudności w badaniach. U myszy C57BL / 6 występuje zwiększone uszkodzenie fotoreceptorów w porównaniu ze szczepem myszy BALB / cJ39,40. To samo dotyczy różnych typów myszy transgenic.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy wszystkim członkom z naszego laboratorium i Laboratorium Okulistycznego Centrum Okulistycznego Zhongshan za ich pomoc techniczną. Dziękujemy również prof. Chunqiao Liu za wsparcie eksperymentalne. Prace te były wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC: 81670872; Pekin, Chiny), Fundacja Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong w Chinach (grant nr 2019A1515011347) oraz projekt budowy szpitala wysokiego szczebla z Państwowego Kluczowego Laboratorium Okulistyki w Centrum Okulistycznym Zhongshan (grant nr 303020103; Guangzhou, prowincja Guangdong, Chiny).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 ml sterylna strzykawka | Solarbio | YA0550 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki i iniekcji dootrzewnowej |
| 1 i razy; Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| 2 ml Probówka do mikrowirówek | Corning | MCT-200-C | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| 48 Well Clear Płytki wielodołkowe z powłoką TC | Corning | 3548 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| Samoprzylepne szkiełka mikroskopowe | Różne | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki | |
| Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | Do analizy obrazu | |
| Gazowy dwutlenek węgla | Różne | Na ofiarę | |
| Szkiełko okładkowe | Różne | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki | |
| Kleszcze zakrzywione | World Precision Instruments | 14127 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| Roztwór do barwienia DAPI | Abcam | ab228549 | Do etykietowania jądra na płaskich mocowaniach siatkówki |
| Mikroskop preparacyjny | Olmpus | SZ61 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| Fluoresceina sodowa | Sigma-Aldrich | F6377 | Do obrazowania in vivo |
| Mikroskop fluorescencyjny | Zeiss | AxioImager.Z2 | Do akwizycji obrazów fluorescencyjnych płaskich mocowań siatkówki |
| Fluoromount-G Podłoże montażowe | SouthernBiotech | 0100-01 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| Hydroksypropylometyloceluloza | Maya | 89161 | Do obrazowania in vivo |
| Przeciwciało izoloktyny B4 594 | Invitrogen | I21413 | Do oznaczania unaczynienia siatkówki na płaskich mocowaniach siatkówki |
| Myszy C57 / BL6J | GemPharmatech z prowincji Jiangsu Do | indukcji modelu OIR | |
| Mikropreparowanie nożyczki-ostrze proste | World Precision Instruments | 503242 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| Kleszcze proste nr 4 | World Precision Instruments | 501978-6 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| Normalna surowica osła | Abcam | ab7475 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| Czujnik O2 | Różne | Do monitorowania poziomu O2 | |
| OxyCycler | Biospherix | A84XOV | Do indukcji modelu OIR |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Do utrwalania tkanek |
| Pentobarbital sodu | Różne | Do znieczulenia | |
| Wapno sodowane | Różne | Do pochłaniania nadmiaru CO2 w komorze tlenowej | |
| SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | Do obrazowania in vivo |
| SPSS Statistics 22.0 | IBM | Do analizy statystycznej | |
| Wytrząsarka do defilacji Tansference | Kylin-Bell | ZD-2008 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| Naczynie do hodowli tkankowych (niskie nasadki) | Corning | 3261-20EA | Do przygotowania płaskich mocowań |
| siatkówki Pipety transferowe | Różne | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki |
| Różne | Do obrazowania in vivo | ||
| Oprogramowanie do obrazowania ZEN | ZEISS | Do akwizycji i eksportu obrazów |
Bibliografia
- Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (20....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
