Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

4.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62410

⸱

2 kwietnia 2021

 , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-Sen University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Streszczenie

Retinopatia indukowana tlenem (OIR) jest szeroko stosowana do badania nieprawidłowego wzrostu naczyń krwionośnych w chorobach niedokrwiennych siatkówki, w tym retinopatii wcześniaków (ROP), proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR) i niedrożności żył siatkówki (RVO). Większość badań OIR obserwuje neowaskularyzację siatkówki w określonych punktach czasowych; jednak dynamiczny wzrost naczyń krwionośnych u żywych myszy w czasie, który jest niezbędny do zrozumienia chorób naczyń związanych z OIR, był niedostatecznie zbadany. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół indukcji mysiego modelu OIR, podkreślając potencjalne pułapki i zapewniając ulepszoną metodę szybkiego ilościowego określania obszarów obliteracji naczyń krwionośnych (VO) i neowaskularyzacji (NV) za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Co ważniejsze, monitorowaliśmy odrastanie naczyń krwionośnych u żywych myszy od P15 do P25, wykonując angiografię dna oka fluoresceiny (FFA) w mysim modelu OIR. Zastosowanie FFA do mysiego modelu OIR pozwala nam obserwować proces przebudowy podczas odrastania naczyń.

Wprowadzenie

Neowaskularyzacja siatkówki (RNV), która jest definiowana jako stan, w którym nowe patologiczne naczynia pochodzą z istniejących żył siatkówki, zwykle rozciąga się wzdłuż wewnętrznej powierzchni siatkówki i rozrasta się do ciała szklistego (lub przestrzeni podsiatkówkowej w pewnych warunkach)1. Jest to cecha charakterystyczna i wspólna wielu retinopatii niedokrwiennych, w tym retinopatii wcześniaków (ROP), niedrożności żył siatkówki (RVO) i proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej (PDR)2.

Liczne obserwacje kliniczne i eksperymentalne wykazały, że główną przyczyną neowaskularyzacji siatkówki jest niedokrwienie3,4. W ROP noworodki są narażone na działanie tlenu na wysokim poziomie w zamkniętych inkubatorach w celu zwiększenia przeżywalności, co jest również ważnym czynnikiem hamującym wzrost naczyń krwionośnych. Po zakończeniu leczenia siatkówki noworodków doświadczają względnego okresu niedotlenienia5. Inne sytuacje obserwuje się w niedrożności centralnych lub rozgałęzionych żył siatkówki w RVO, obserwuje się również uszkodzenie naczyń włosowatych siatkówki, które jest spowodowane mikroangiopatią w PDR2. Niedotlenienie dodatkowo zwiększa ekspresję czynników angiogennych, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), poprzez szlak sygnałowy czynnika 1α indukowanego hipoksją (HIF-1α), który z kolei kieruje komórkami śródbłonka naczyniowego do wzrostu w obszarze niedotlenienia i tworzenia nowych naczyń6,7.

ROP to rodzaj retinopatii proliferacyjnej naczyń krwionośnych u wcześniaków i główna przyczyna ślepoty dziecięcej8,9, która charakteryzuje się niedotlenieniem siatkówki, neowaskularyzacją siatkówki i przerostem włóknistym10,11,12. W latach pięćdziesiątych XX wieku naukowcy odkryli, że wysokie stężenie tlenu może znacznie poprawić objawy oddechowe u wcześniaków13,14. W związku z tym w tamtym czasie tlenoterapia była coraz częściej stosowana u wcześniaków15. Jednak równolegle z powszechnym stosowaniem tlenoterapii u wcześniaków, częstość występowania ROP wzrastała z roku na rok. Od tego czasu naukowcy powiązali tlen z ROP, badając różne modele zwierzęce, aby zrozumieć patogenezę ROP i RNV16.

U człowieka większość rozwoju unaczynienia siatkówki jest zakończona przed urodzeniem, podczas gdy u gryzoni unaczynienie siatkówki rozwija się po urodzeniu, dostarczając dostępnego systemu modelowego do badania angiogenezy w unaczynieniu siatkówki2. Wraz z ciągłym postępem badań, modele retinopatii indukowanej tlenem (OIR) stały się głównymi modelami naśladowania patologicznej angiogenezy wynikającej z niedokrwienia. W badaniu modelu OIR nie ma konkretnych gatunków zwierząt, a model został opracowany dla różnych gatunków zwierząt, w tym kitten17, rat18, mouse19, beagle puppy20 i zebrafish21. Wszystkie modele mają ten sam mechanizm, dzięki któremu są narażone na hiperoksję podczas wczesnego rozwoju siatkówki, a następnie wracają do środowiska normoksycznego. Smith i wsp. zaobserwowali, że wystawienie młodych myszy na hiperoksję z P7 przez 5 dni wywołało ekstremalną formę regresji naczyń w centralnej siatkówce i sprowadzenie ich z powrotem do powietrza w pomieszczeniu w P12 stopniowo wywołało kępki neowaskularne, które rosły w kierunku ciała szklistego19. Był to ustandaryzowany model myszy OIR, zwany również modelem Smitha. Connor i in. jeszcze bardziej zoptymalizowali protokół i w 2009 roku opracowali uniwersalną metodę ilościowego określania obszaru VO (obliteracja naczyń krwionośnych) i NV (neowaskularyzacja), co zwiększyło akceptację i wykorzystanie modelu22. Model myszy OIR jest obecnie nadal najczęściej używanym modelem ze względu na jego niewielkie rozmiary, szybką reprodukcję, wyraźne tło genetyczne, dobrą powtarzalność i wysoki wskaźnik sukcesu.

U myszy unaczynienie siatkówki zaczyna się po urodzeniu wraz z wrastaniem naczyń od głowy nerwu wzrokowego do wewnętrznej siatkówki w kierunku ora serrata. Podczas normalnego rozwoju siatkówki pierwsze naczynia siatkówki wyrastają z głowy nerwu wzrokowego około porodu, tworząc rozszerzającą się sieć (splot pierwotny), która dociera do obwodu około 7 dnia po urodzeniu (P7)23. Następnie naczynia zaczynają wrastać w siatkówkę, tworząc głęboką warstwę, penetrując siatkówkę i tworząc sieć laminarną wokół wewnętrznej warstwy jądrowej (INL), jak w human24. Pod koniec trzeciego tygodnia po porodzie (P21) głębszy rozwój splotu jest prawie zakończony. W przypadku mysiego modelu OIR niedrożność naczyń zawsze pojawia się w centralnej siatkówce z powodu szybkiej degeneracji dużej liczby niedojrzałych sieci naczyniowych w obszarze centralnym podczas ekspozycji na hiperoksję. Tak więc wzrost patologicznej neowaskularyzacji występuje również w środkowej siatkówki obwodowej, która jest granicą obszaru nieperfuzyjnego i obszaru naczyniowego. Jednak ludzkie naczynia siatkówkowe prawie uformowały się przed urodzeniem. Jeśli chodzi o wcześniaki, siatkówka obwodowa nie jest całkowicie unaczyniona pod wpływem hiperoksji25,26. Tak więc okluzja naczyń krwionośnych i neowaskularyzacja pojawiają się głównie w siatkówce obwodowej27,28. Pomimo tych różnic, mysi model OIR dokładnie podsumowuje patologiczne zdarzenia, które występują podczas neowaskularyzacji wywołanej niedokrwieniem.

Indukcję modelu OIR można podzielić na dwie fazy29: w fazie 1 (faza hiperoksji) rozwój naczyń krwionośnych siatkówki jest zatrzymany lub opóźniony z powodu niedrożności i regresji naczyń krwionośnych w wyniku spadku VEGF i apoptozy komórek śródbłonka24,30; w fazie 2 (faza niedotlenienia) dopływ tlenu do siatkówki stanie się niewystarczający w warunkach powietrza w pomieszczeniu29, który jest niezbędny dla rozwoju neuronów i homeostazy19,31. Ta sytuacja niedokrwienna zwykle prowadzi do nieuregulowanej, nieprawidłowej neowaskularyzacji.

Obecnie powszechnie stosowaną metodą modelowania jest naprzemienne narażenie na wysoki / niski poziom tlenu: matki i ich młode są wystawione na działanie 75% tlenu przez 5 dni w P7, a następnie 5 dni w powietrzu w pomieszczeniu, aż P17 wykaże porównywalne wyniki22, co jest punktem końcowym indukcji modelu myszy OIR. (Rysunek 1). Oprócz symulacji ROP, ta patologiczna neowaskularyzacja za pośrednictwem niedokrwienia może być również wykorzystywana do badania innych chorób niedokrwiennych siatkówki. Główne pomiary tego modelu obejmują ilościowe określenie obszaru VO i NV, które są analizowane z płaskich mocowań siatkówki za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego lub perfuzji FITC-dekstranu. Każda mysz może być przebadana tylko raz ze względu na śmiertelną operację. Obecnie istnieje kilka metod obserwacji dynamicznych zmian unaczynienia siatkówki w sposób ciągły podczas procesu regresji naczyniowej i patologicznej angiogenezy32. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół indukcji modelu OIR, analizę płaskich mocowań siatkówki, a także przebieg pracy angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) na myszach, co byłoby pomocne w uzyskaniu bardziej wszechstronnego zrozumienia dynamicznych zmian naczyniowych podczas dwóch faz mysiego modelu OIR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury związane z użyciem myszy zostały zatwierdzone przez komisję etyki eksperymentów na zwierzętach Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Chiny (autoryzowany numer: 2020-082), oraz zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Centrum Okulistycznego Zhongshan oraz Oświadczenia Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącej wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

1. Indukcja mysiego modelu OIR

  1. Użyj myszy z niższym wskaźnikiem wrodzonych wad rozwojowych oczu, np. myszy C57BL / 6J, i połącz je w pary w stosunku samiec / samica = 1: 2. Pozwól, aby młode urodziły się tego samego dnia i zacznij indukować model OIR w P7. Zapisuj masę ciała szczeniąt myszy dokładnie przed modelowaniem.
    UWAGA: Zanotuj dzień urodzenia jako P0. Regularnie rejestruj wagę każdej myszy. Masa ciała nowonarodzonych szczeniąt jest bardzo ważna podczas indukcji OIR, ponieważ wrażliwość myszy w różnych stanach na tlen jest różna. Wykluczyć młode o masie większej niż 5 g w P7, aby zapewnić porównywalne wyniki.
  2. Zapewnij odpowiednie środowisko życia dla matek karmiących i ich szczeniąt, takie jak ustawienie temperatury na 23 °C ± 2 °C, kontrolowanie wilgotności na poziomie 40%-65%, naprzemienne 12 godzin światła i 12 godzin ciemności każdego dnia, dodanie trochę waty do klatki do gniazdowania, zapewnienie odpowiedniej wysterylizowanej żywności i wody, i trzymanie ich w indywidualnie wentylowanych klatkach (IVC).
  3. Monitoruj poziom wilgotności i temperatury wewnątrz komory. Kontroluj wilgotność w zakresie od 40% do 65% i utrzymuj temperaturę na poziomie 23 °C ± 2 °C.
  4. Sprawdź dopływ tlenu za pomocą czujników tlenu, utrzymuj stały poziom tlenu na poziomie 75% i kontroluj natężenie przepływu tlenu na poziomie 0,5-0,75 l/min. Umieść 50 g wapna sodowanego na dnie komory, aby wchłonąć nadmiar CO2 i utrzymać wartości CO2 poniżej 3%22.
  5. Monitoruj zachowania matek karmiących, takie jak budowanie gniazda, gryzienie szczeniąt i odmawianie laktacji przynajmniej raz dziennie. Wyeliminuj matki karmiące z kiepskim macierzyństwem.
  6. Umieść młode P7 (samca i samicę) oraz ich karmiące matki w komorze tlenowej, w której poziom tlenu wynosi 75% przez 5 dni do P12. Unikaj niepotrzebnego otwierania komory w okresie indukcji modelu. Upewnij się, że są dodatkowe matki zastępcze do wymiany, na wypadek, gdyby matki karmiące zmarły z powodu urazu płuc podczas hiperoksji.
    UWAGA: Aby zapewnić porównywalność eksperymentu, ogranicz liczbę do 6-8 młodych dla każdej matki. Zwróć uwagę na potencjalny problem toksyczności tlenu, który powoduje śmierć niektórych matek karmiących. Objawy hiperoksycznego uszkodzenia płuc u matek karmiących obejmują między innymi wahania częstości oddechów, zmniejszoną aktywność i zmniejszone karmienie. Gdy wystąpi powyższe zjawisko, należy jak najszybciej poddać matkę karmiącej eutanazji 1% pentobarbitalem sodu (50 mg/kg). Przygotuj kilka matek zastępczych, np. 129S1/SvImJ do wymiany i używaj ich tylko w razie potrzeby. Nie zaleca się rutynowego zastępowania matek karmiących, ponieważ doprowadzi to do częstego otwierania komory tlenowej, co spowoduje niestabilny poziom tlenu i agresję matki.
  7. Przyprowadź młode i ich matki karmiące z powrotem do powietrza w pomieszczeniu w temperaturze P12 i monitoruj wagę wszystkich szczeniąt w sposób ciągły aż do P17. Pogrupuj młode na podstawie wagi, aby upewnić się, że każda grupa doświadczalna ma podobny rozkład masy.

2. Przygotowanie całych wierzchowców siatkówki i barwienie immunofluorescencyjne

  1. Zapisz masę ciała szczeniąt. Uśmierc młode przez przedawkowanie środka znieczulającego (1% pentobarbital sodu 50 mg/kg) lub wdychanie CO2 . W razie potrzeby można zastosować inne metody eutanazji, takie jak zwichnięcie szyjki macicy i torakotomia obustronna.
  2. Użyj zakrzywionych nożyczek, aby zwolnić połączenie między gałkami ocznymi a tkanką oczodołu. Następnie umieść zakrzywione kleszcze w tylnej części gałki ocznej, zaciśnij nerw wzrokowy i szybko wyjmij oko z orbity. Umyj gałki oczne we wstępnie schłodzonym 1x buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS), aby usunąć włosy i krew z powierzchni gałek ocznych.
  3. Umieść oczyszczone gałki oczne w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml wypełnionej 4% paraformaldehydem (PFA) i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 12-15 obrotów na minutę (rpm) (początkowe utrwalenie).
    UWAGA: Wiadomo, że paraformaldehyd jest alergizujący, ogólnie toksyczny i wyjątkowo cytotoksyczny. Ściśle przestrzegaj instrukcji bezpieczeństwa i unikaj wdychania i kontaktu ze skórą.
  4. Użyj naczynia hodowlanego i umieść kroplę 1x PBS w centralnej części i wykonaj następujące czynności pod mikroskopem preparacyjnym i umieść jedną gałkę oczną w tej kropli. Przytrzymaj gałkę oczną za pomocą kleszczy i ostrożnie nakłuj rogówkę na rąbku rogówki za pomocą igły do strzykawki o pojemności 1 ml. Włóż końcówkę nożyczek do tego otworu i ostrożnie odetnij rogówkę wzdłuż rąbka rogówki. Uważaj, aby nie przeciąć siatkówki.
  5. Usuń tęczówkę i obiektyw za pomocą kleszczy. Następnie umieść pozostałą muszlę oczną w 4% PFA i ponownie utrwalaj przez kolejne 45 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min (utrwalenie wtórne).
  6. Użyj naczynia hodowlanego i wlej kroplę 1x PBS do środkowej części. Umieść stałą gałkę oczną w tej kropli. Przytrzymaj gałkę oczną za pomocą kleszczy. Delikatnie oddziel warstwy siatkówki i twardówki za pomocą dwóch kleszczyków. Umieść końcówkę nożyczek między warstwami siatkówki i twardówki i przetnij twardówkę w kierunku nerwu wzrokowego. Oderwij twardówkę od siatkówki i uzyskaj miseczkę siatkówki.
    UWAGA: Przytrzymaj tylną miseczkę za nerw wzrokowy za pomocą kleszczy, a następnie użyj zakrzywionego końca innego kleszcza, aby docisnąć twardówkę w głowie nerwu wzrokowego i delikatnie masuj siatkówkę ruchem zamaszystym do przodu jako alternatywę dla uwolnienia siatkówki.
  7. Użyj kleszczy, aby zwolnić połączenie między promieniowymi naczyniami hialoidalnymi a siatkówką obwodową, zaciśnij korzeń naczyń szklistych, który znajduje się blisko głowy nerwu wzrokowego, i ostrożnie odetnij naczynia hialoidalne.
  8. Użyj pipety o pojemności 2 ml z odciętą końcówką, aby przenieść kubek siatkówki. Umieść miseczkę siatkówki w jednym dołku na 48-dołkowej płytce i myj ją przez 3 x 5 minut z 1x PBS w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min.
  9. Inkubować miseczkę siatkówki w mieszanym roztworze 1% Triton X-100 (w PBS) i 5% normalnej surowicy osła (w PBS) przez noc w temperaturze 4 °C.
    1. Alternatywnie można zablokować i przepuszczalnie siatkówki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Zmienić surowicę blokującą w zależności od źródła przeciwciała drugorzędowego.
  10. W przypadku znakowania naczyń krwionośnych siatkówki za pomocą izolektyny B4, inkubuj siatkówkę w studzience 48-dołkowej z 0,1% normalnej surowicy osła (400 μl) i izollektyny B4-594 (1:400) przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min.
    UWAGA: W przypadku znakowania naczyń krwionośnych innymi markerami, takimi jak CD31, lub znakowania innych komórek, należy użyć specyficznych przeciwciał pierwszorzędowych do ich znakowania.
  11. Inkubować siatkówkę z 1:100-1:500 specyficznymi przeciwciałami pierwszorzędowymi (w 400 μl 0,1% normalnej surowicy osła) w temperaturze 4 °C na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min przez 48 godzin. (opcjonalnie)
  12. Po powrocie do temperatury pokojowej przemyj siatkówkę 0,1% PBST (0,1% TritonX-100 w PBS) przez 3 x 20 min na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min.
  13. Inkubować siatkówkę z przeciwciałami drugorzędowymi w proporcji 1:1000 (w 400 μl 0,1% normalnej surowicy osła) przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min. (Opcjonalnie)
    1. Alternatywnie inkubuj siatkówkę z przeciwciałami drugorzędowymi o wysokim powinowactwie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  14. Inkubuj siatkówkę z DAPI (1:1,000) w temperaturze pokojowej przez 20-25 minut, aby oznaczyć jądro.
    UWAGA: Przetestuj optymalne proporcje rozcieńczenia dla wszystkich przeciwciał użytych w krokach 10-11 i 13-14 w eksperymencie.
  15. Myć siatkówkę przez 3 x 30 min 0,1% PBST na wytrząsarce z prędkością 12-15 obr./min w temperaturze pokojowej.
  16. Przenieś miseczkę siatkówki na czysty szkiełko z otworem skierowanym do góry. Przetnij siatkówkę promieniowo w pozycjach godziny 3, 6, 9 i 12 od obwodu do środka, odcinając około 1-1,5 mm od głowy nerwu wzrokowego.
  17. Dodaj kilka kropli 1x PBS, aby trzykrotnie przepłukać siatkówkę. Użyj papieru układanego powietrzem, aby wysuszyć i spłaszczyć siatkówkę. Dodać kroplę podłoża montażowego (patrz Tabela materiałów) na środek szkiełka nakrywkowego i przestań dodawać je, aż średnica kropli zwiększy się do połowy szkiełka nakrywkowego. Szybko odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść je na wierzchu rozpostartej siatkówki. Unikaj tworzenia się bąbelków.
  18. Zrób zdjęcia płaskich mocowań siatkówki lub przechowuj i chroń szkiełka przed światłem w temperaturze 4 °C.

3. Analiza i kwantyfikacja płaskich mocowań siatkówki

UWAGA: W mysim modelu OIR, badacze często rejestrują obszar okluzji naczyniowej centralnej siatkówki i patologicznej neowaskularyzacji obwodowej siatkówki podczas P12-P25. Wcześniejsze badania wykazały, że centralny obszar jałowy siatkówki osiąga maksimum w P12 i stopniowo kurczy się od P13 do P17; w tym samym czasie siatkówka myszy OIR osiąga szczyt obszaru neowaskularyzacji około P1722,29. Od P17 naczynia nowotworowe stopniowo się cofają, a naczynia funkcjonalne odrastają w obszar jałowy. Unaczynienie siatkówki w zasadzie wraca do normy przy P2533.

  1. Zrób zdjęcia płaskich mocowań siatkówki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) z soczewką obiektywową 10x. Najpierw wybierz kanał DAPI i ustaw głowę nerwu wzrokowego w środku pola widzenia. Następnie dostosuj inne kanały i skup się na powierzchownym unaczynieniu siatkówki. Sprawdź Kafelki w programie fotograficznym (patrz Spis materiałów) i ustaw liczbę zdjęć, które mają zostać zszyte. Kliknij Rozpocznij eksperyment, aby uchwycić całą siatkówkę.
  2. Użyj programu do przetwarzania obrazu (patrz tabela materiałów), aby określić ilościowo obszar obliteracji naczyń krwionośnych (VO) i neowaskularyzacji (NV) po barwieniu immunofluorescencyjnym.
    1. Najpierw kliknij narzędzie Magiczna różdżka i ustaw odpowiednią tolerancję zgodnie z różnicą jasności, a następnie przesuń kursor na tło i kliknij myszą. Następnie wybierz opcję Wybierz odwrotność, aby uzyskać podstawowy zarys siatkówki. Użyj narzędzia Lasso, aby dokładniej obrysować szczegóły siatkówki. Korzystając z funkcji Histogram, zapisz wartość piksela całej siatkówki i zapisz ją lub wygeneruj tabelę w programie bazy danych.
    2. Podziel obraz siatkówki na cztery ćwiartki. W każdej ćwiartce użyj narzędzia Lasso, aby narysować obszar VO ( Rysunek 2A-C) i użyj narzędzia Magiczna różdżka, aby wybrać obszar NV ( Rysunek 2D-F). Na podstawie informacji o pikselach na histogramie oblicz stosunek pikseli VO i NV do całej siatkówki, czyli procent obszaru VO lub NV w stosunku do całej siatkówki.
      UWAGA: Istnieje również w pełni zautomatyzowany potok o otwartym kodzie źródłowym do kwantyfikacji obszarów VO i NV na obrazach OIR przy użyciu sieci neuronowych głębokiego uczenia (http://oirseg.org/), który zapewnia badaczom niezawodny i oszczędzający czas sposób, a także ujednolica standard kwantyfikacji34.
  3. Zapisuj informacje o pikselach w tabeli arkusza kalkulacyjnego, co jest wygodne do późniejszej analizy.

4. Obrazowanie in vivo z angiografią dna oka z fluoresceiną (FFA)

UWAGA: Dla myszy OIR, zarówno perfuzja FITC, jak i barwienie immunofluorescencyjne mogą być użyte tylko raz z powodu śmierci zwierząt doświadczalnych. W porównaniu z tym, jedną z zalet FFA jest obserwacja dynamicznych zmian naczyń siatkówkowych myszy podczas rozwoju i stanu patologicznego in vivo35,36.

  1. Zważ szczenięta przed znieczuleniem.
  2. Znieczulenie szczeniąt przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,3% pentobarbitalu sodu w dawce 30-50 mg/kg.
    UWAGA: W przypadku myszy w ciągu 1 miesiąca należy zwrócić uwagę na dawki środka znieczulającego. Stosuj niższe stężenia i dawki środka znieczulającego, aby zmniejszyć śmierć myszy spowodowaną znieczuleniem. Po znieczuleniu szczeniąt użyj małej poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Hipotermia nie tylko wpływa na funkcje fizjologiczne szczeniąt, ale także prowadzi do zmian w krystalinie i przyspiesza rozwój zaćmy.
  3. Użyj 20 μl kropli do oczu z rozszerzaniem źrenic (0,5% tropikamidu + 0,5% chlorowodorku fenylefryny) dla każdego szczeniaka i odczekaj 5 minut, aby osiągnąć długotrwałe rozszerzenie źrenicy (Rysunek 3A,B).
  4. Przynieś znieczulone szczenięta przed urządzenie do obrazowania (patrz Tabela materiałów). Trzymaj szczenięta na małej poduszce grzewczej, umieszczaj szczenięta w stabilnej pozycji i regularnie używaj sztucznych łez, aby utrzymać wilgoć w rogówce. Kliknij tryb obrazowania dna oka w podczerwieni (IR), aby ustawić głowę nerwu wzrokowego na środku ekranu.
    UWAGA: Obserwując jedno oko szczeniąt, nie zapomnij chronić drugiego oka. Stosuj krople do oczu z hypromelozą, aby zapobiec wybielaniu rogówki z powodu suchości.
  5. Po dootrzewnowym wstrzyknięciu 0,15 ml 0,5% roztworu soli sodowej fluoresceiny, należy natychmiast kliknąć przycisk FA i przycisk Wstrzyknięcie na panelu dotykowym urządzenia do obrazowania, aby rozpocząć odmierzanie czasu. Zapisz obrazy po 3 minutach, gdy krążenie krwi w siatkówce wejdzie w fazę żylną i obserwuj siatkówkę nie mniej niż 6-8 minut.
    UWAGA: Po dootrzewnowym wstrzyknięciu roztworu soli sodowej fluoresceiny, skóra, błona śluzowa i mocz szczeniąt wykazują wyraźny żółtawozielony kolor. Większość fluoresceiny jest wydalana przez młode w ciągu jednego dnia. Wstrzykiwanie fluoresceiny sodowej dootrzewnowo co drugi dzień przez sześć razy nie powoduje znaczących skutków ubocznych37.
  6. Przesuń głowę nerwu wzrokowego do środka obszaru akwizycji obrazu i zrób pierwsze zdjęcie centralnej siatkówki. Następnie przesuń soczewkę urządzenia do obrazowania poziomo na nosową stronę oka, aż głowa nerwu wzrokowego znajdzie się w środku jednej strony obszaru akwizycji obrazu i wykonaj drugi obraz. Kontynuuj wykonywanie zdjęć siatkówki skroniowej, górnej i dolnej, odpowiednio za pomocą tej metody (Rysunek 3C).
    UWAGA: Wykonaj zdjęcia w "pięciu orientacjach" w ciągu 12 minut, gdy następuje faza regresji. Pozycja głowy nerwu wzrokowego na dolnym obrazie nie może spaść na linię boczną ze względu na ograniczoną regulację kąta soczewki.
  7. Zapisz obrazy i użyj programu do przetwarzania obrazu do zszywania.

5. Przetwarzanie obrazu angiografii dna oka metodą fluoresceiny (FFA)

  1. Otwórz program do przetwarzania obrazów i kliknij Nowy w pliku, aby utworzyć nowe płótno z czarnym tłem (Rysunek 4A).
  2. Otwórz najpierw obraz centralnej siatkówki w warstwie tła. Kliknij Plik i dodaj drugi obraz. Dostosuj krycie drugiego obrazu do 60%, przesuń i zmień rozmiar drugiego obrazu, aż te same części obu obrazów będą się na siebie nakładać. Kliknij przycisk Przełącz między trybami swobodnej transformacji i wypaczania i w razie potrzeby dokonaj subtelnych korekt naczyń. Następnie zmniejsz krycie drugiego obrazu z powrotem do 100% (Rysunek 4A,B).
  3. Wybierz dwa obrazy w tym samym czasie i kliknij Warstwy automatycznego mieszania. Zaznacz opcję Panorama jako metodę mieszania, a także zaznacz następujące dwa zdania. Kliknij OK i zakończ zszywanie pierwszych dwóch obrazów (Rysunek 4C,D).
  4. Weź pierwsze dwa zszyte obrazy jako całość, dodaj trzeci obraz i kontynuuj mieszanie. Powtórz powyższe metody, aby zakończyć zszywanie pięciu obrazów (Rysunek 4E).
  5. Użyj narzędzia Kadrowanie, aby przyciąć obrazy FFA w różnych punktach czasowych do jednolitego rozmiaru i obserwować dynamiczne zmiany unaczynienia siatkówki od P15 do P25 zarówno u szczeniąt normalnych, jak i OIR.

6. Analiza statystyczna

  1. Wartości bieżące jako średnia ± odchylenie standardowe (s.d.).
  2. Użyj testu t-Studenta, aby porównać dwie niezależne próby. Użyj jednokierunkowej ANOVA, aby porównać wiele zestawów danych i połączyć z testem Dunnetta lub Tukeya, który jest powszechnie używanym testem wielokrotnego porównania.
  3. W przypadku danych o rozkładzie nienormalnym należy użyć testu U Manna-Whitneya lub testu Kruskala Wallisa. Rozważ istotne różnice statystyczne, gdy P < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W mysim modelu OIR najważniejszym i podstawowym wynikiem jest ilościowe określenie obszaru VO i NV. Po przebywaniu w środowisku hiperoksycznym przez 5 dni od P7, w centralnej części siatkówki szczeniąt zaobserwowano największy obszar braku perfuzji. Pod wpływem stymulacji hipoksją przez kolejne 5 dni stopniowo powstawały nowotwory naczyniowe siatkówki, które fluorescowały intensywniej niż otaczające je naczynia prawidłowe. Po P17 sygnał fluorescencyjny patologicznej neowaskularyzacji szybko zanikał w miarę przebudowy sia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Na podatność myszy na OIR wpływa wiele czynników. Nie można porównywać szczeniąt o różnym pochodzeniu genetycznym i szczepach. U myszy albinosów BALB/c naczynia szybko odrastają w obszar VO ze znacznie zmniejszonymi kępkami neowaskularnymi38, co powoduje pewne trudności w badaniach. U myszy C57BL / 6 występuje zwiększone uszkodzenie fotoreceptorów w porównaniu ze szczepem myszy BALB / cJ39,40. To samo dotyczy różnych typów myszy transgenic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom z naszego laboratorium i Laboratorium Okulistycznego Centrum Okulistycznego Zhongshan za ich pomoc techniczną. Dziękujemy również prof. Chunqiao Liu za wsparcie eksperymentalne. Prace te były wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC: 81670872; Pekin, Chiny), Fundacja Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong w Chinach (grant nr 2019A1515011347) oraz projekt budowy szpitala wysokiego szczebla z Państwowego Kluczowego Laboratorium Okulistyki w Centrum Okulistycznym Zhongshan (grant nr 303020103; Guangzhou, prowincja Guangdong, Chiny).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml sterylna strzykawkaSolarbioYA0550Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki i iniekcji dootrzewnowej
1 i razy; Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Transgen Biotech  FG701-01Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki
2 ml Probówka do mikrowirówekCorningMCT-200-CDo przygotowania płaskich mocowań siatkówki
48 Well Clear Płytki wielodołkowe z powłoką TCCorning3548Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki
Samoprzylepne szkiełka mikroskopoweRóżneDo przygotowania płaskich mocowań siatkówki
Adobe Photoshop CC 2019Adobe Inc.Do analizy obrazu
Gazowy dwutlenek węglaRóżneNa ofiarę
Szkiełko okładkoweRóżneDo przygotowania płaskich mocowań siatkówki
Kleszcze zakrzywioneWorld Precision Instruments14127Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki
Roztwór do barwienia DAPIAbcamab228549Do etykietowania jądra na płaskich mocowaniach siatkówki
Mikroskop preparacyjnyOlmpusSZ61Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki
Fluoresceina sodowaSigma-AldrichF6377Do obrazowania in vivo
Mikroskop fluorescencyjny  ZeissAxioImager.Z2Do akwizycji obrazów fluorescencyjnych płaskich mocowań siatkówki
Fluoromount-G Podłoże montażoweSouthernBiotech  0100-01Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki
HydroksypropylometylocelulozaMaya89161Do obrazowania in vivo
Przeciwciało izoloktyny B4 594InvitrogenI21413Do oznaczania unaczynienia siatkówki na płaskich mocowaniach siatkówki
Myszy C57 / BL6JGemPharmatech z prowincji Jiangsu Doindukcji modelu OIR
Mikropreparowanie nożyczki-ostrze prosteWorld Precision Instruments503242Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki
Kleszcze proste nr 4World Precision Instruments  501978-6Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki
Normalna surowica osłaAbcamab7475Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki
Czujnik O2RóżneDo monitorowania poziomu O2
OxyCyclerBiospherixA84XOVDo indukcji modelu OIR
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP6148-1KGDo utrwalania tkanek
Pentobarbital soduRóżneDo znieczulenia
Wapno sodowaneRóżneDo pochłaniania nadmiaru CO2 w komorze tlenowej
SPECTRALIS HRA+OCTHeidelbergHC00500002Do obrazowania in vivo
SPSS Statistics 22.0IBMDo analizy statystycznej
Wytrząsarka do defilacji TansferenceKylin-BellZD-2008Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki
Naczynie do hodowli tkankowych (niskie nasadki)Corning3261-20EADo przygotowania płaskich mocowań
siatkówki Pipety transferoweRóżneDo przygotowania płaskich mocowań siatkówki
Triton X-100Sigma-Aldrich  SLBW6818Do przygotowania płaskich mocowań siatkówki
RóżneDo obrazowania in vivo
Oprogramowanie do obrazowania ZENZEISSDo akwizycji i eksportu obrazów

Bibliografia

  1. Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Shimizu, K., Kobayashi, Y., Muraoka, K. Midperipheral fundus involvement in diabetic retinopathy. Ophthalmology. 88 (7), 601-612 (1981).
  4. Ashton, N. Retinal vascularization in health and disease: Proctor Award Lecture of the Association for Research in Ophthalmology. American Journal of Ophthalmology. 44 (4), Pt 2 7-17 (1957).
  5. Hellström, A., Smith, L. E., Dammann, O. Retinopathy of prematurity. Lancet. 382 (9902), 1445-1457 (2013).
  6. Xu, Y., et al. Melatonin attenuated retinal neovascularization and neuroglial dysfunction by inhibition of HIF-1α-VEGF pathway in oxygen-induced retinopathy mice. Journal of Pineal Research. 64 (4), 12473(2018).
  7. Cavallaro, G., et al. The pathophysiology of retinopathy of prematurity: an update of previous and recent knowledge. Acta Ophthalmologica. 92 (1), 2-20 (2014).
  8. Gilbert, C., Rahi, J., Eckstein, M., O'Sullivan, J., Foster, A. Retinopathy of prematurity in middle-income countries. Lancet. 350 (9070), 12-14 (1997).
  9. Chen, J., Smith, L. E. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10 (2), 133-140 (2007).
  10. Fielder, A., Blencowe, H., O'Connor, A., Gilbert, C. Impact of retinopathy of prematurity on ocular structures and visual functions. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 100 (2), 179-184 (2015).
  11. Moshfeghi, D. M. Presumed transient reactive astrocytic hyperplasia in immature retina. Retina. 26, 7 Suppl 69-73 (2006).
  12. Kandasamy, Y., Hartley, L., Rudd, D., Smith, R. The association between systemic vascular endothelial growth factor and retinopathy of prematurity in premature infants: a systematic review. British Journal of Ophthalmology. 101 (1), 21-24 (2017).
  13. Shah, P. K., et al. Retinopathy of prematurity: Past, present and future. World Journal of Clinical Pediatrics. 5 (1), 35-46 (2016).
  14. Kinsey, V. E. Retrolental fibroplasia; cooperative study of retrolental fibroplasia and the use of oxygen. AMA Archives of Ophthalmology. 56 (4), 481-543 (1956).
  15. Tin, W., Gupta, S. Optimum oxygen therapy in preterm babies. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 92 (2), 143-147 (2007).
  16. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  17. Ashton, N., Ward, B., Serpell, G. Effect of oxygen on developing retinal vessels with particular reference to the problem of retrolental fibroplasia. The British Journal of Ophthalmology. 38 (7), 397-432 (1954).
  18. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  19. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  20. McLeod, D. S., Brownstein, R., Lutty, G. A. Vaso-obliteration in the canine model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (2), 300-311 (1996).
  21. Cao, R., Jensen, L. D., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), 2748(2008).
  22. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  23. Fruttiger, M. Development of the mouse retinal vasculature: angiogenesis versus vasculogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 522-527 (2002).
  24. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  25. Rivera, J. C., et al. Ischemic retinopathies: oxidative stress and inflammation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 3940241(2017).
  26. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  27. Flynn, J. T., et al. Retinopathy of prematurity. Diagnosis, severity, and natural history. Ophthalmology. 94 (6), 620-629 (1987).
  28. Aguilar, E., et al. Chapter 6. Ocular models of angiogenesis. Methods in Enzymology. 444, 115-158 (2008).
  29. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  30. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Retinal vascular development and oxygen-induced retinopathy: a role for adenosine. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (1), 95-111 (2003).
  31. Vähätupa, M., et al. Oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  32. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  33. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  34. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), (2017).
  35. McLeod, D. S., D'Anna, S. A., Lutty, G. A. Clinical and histopathologic features of canine oxygen-induced proliferative retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (10), 1918-1932 (1998).
  36. Penn, J. S., Johnson, B. D. Fluorescein angiography as a means of assessing retinal vascular pathology in oxygen-exposed newborn rats. Current Eye Research. 12 (6), 561-570 (1993).
  37. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  38. Zeilbeck, L. F., Müller, B., Knobloch, V., Tamm, E. R., Ohlmann, A. Differential angiogenic properties of lithium chloride in vitro and in vivo. PLoS One. 9 (4), 95546(2014).
  39. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  40. Zhang, Q., Zhang, Z. M. Oxygen-induced retinopathy in mice with retinal photoreceptor cell degeneration. Life Sciences. 102 (1), 28-35 (2014).
  41. Okamoto, N., et al. Transgenic mice with increased expression of vascular endothelial growth factor in the retina: a new model of intraretinal and subretinal neovascularization. The American Journal of Pathology. 151 (1), 281-291 (1997).
  42. Ohlmann, A., et al. Norrin promotes vascular regrowth after oxygen-induced retinal vessel loss and suppresses retinopathy in mice. The Journal of Neuroscience. 30 (1), 183-193 (2010).
  43. Fang, L., Barber, A. J., Shenberger, J. S. Regulation of fibroblast growth factor 2 expression in oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (1), 207-215 (2014).
  44. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  45. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. The American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  46. Vanhaesebrouck, S., et al. Association between retinal neovascularization and serial weight measurements in murine and human newborns. European Journal of Ophthalmology. 23 (5), 678-682 (2013).
  47. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. The American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  48. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (9), 1205-1211 (2009).
  49. Huang, S., et al. Comparison of dextran perfusion and GSI-B4 isolectin staining in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye Science. 30 (2), 70-74 (2015).
  50. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  51. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wzrost naczy siatk wkineowaskularyzacja siatk wkipreparat ca ej siatk wkibarwienie immunofluorescencyjnefluoresceinowa angiografia dna okapreparat p aski siatk wkiznakowanie izolektyn B4mikroskopia konfokalnaobliteracja naczyniowa
Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.