Artykuł metodologiczny

Osiągnięcie efektywnego przesiewania fragmentów w zakładzie XChem w Diamond Light Source

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62414

⸱

29 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus, 3Structural Genomics Consortium, University of Oxford, 4Centre for Medicines Discovery, University of Oxford, 5Oxford Protein Informatics Group, Department of Statistics, Oxford University, 6Department of Biochemistry, University of Johannesburg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje cały proces XChem do badania fragmentów na bazie kryształów, począwszy od złożenia wniosku o dostęp i wszystkich kolejnych kroków do rozpowszechniania danych.

Streszczenie

W odkrywaniu leków na podstawie fragmentów, setki, a często tysiące związków mniejszych niż ~300 Da są testowane na interesującym białku w celu zidentyfikowania jednostek chemicznych, które mogą zostać rozwinięte w silnych kandydatów na leki. Ponieważ związki są małe, interakcje są słabe, a zatem metoda przesiewowa musi być bardzo czuła; Co więcej, informacje strukturalne wydają się być kluczowe dla opracowania tych trafień w związki podobne do ołowiu. W związku z tym krystalografia białek zawsze była techniką o najwyższym standardzie, ale historycznie zbyt trudna, aby znaleźć powszechne zastosowanie jako podstawowe badanie przesiewowe.

Początkowe eksperymenty XChem zostały zademonstrowane w 2014 roku, a następnie przetestowane z partnerami akademickimi i przemysłowymi w celu walidacji procesu. Od tego czasu duży wysiłek badawczy i znaczny czas badania usprawniły przygotowanie próbek, opracowały bibliotekę fragmentów z możliwością szybkiego śledzenia, zautomatyzowały i poprawiły zdolność linii badawczej I04-1 do bezobsługowego gromadzenia danych oraz wdrożyły nowe narzędzia do zarządzania danymi, analizy i identyfikacji trafień.

XChem jest teraz obiektem do badań przesiewowych fragmentów krystalograficznych na dużą skalę, wspierającym cały proces osadzania kryształów i dostępnym dla użytkowników akademickich i przemysłowych na całym świecie. Od 2016 r. aktywnie rozwijany jest recenzowany program dla użytkowników akademickich, aby uwzględnić projekty o jak najszerszym zakresie naukowym, w tym projekty dobrze zweryfikowane i eksploracyjne. Dostęp akademicki jest przyznawany poprzez dwa razy w roku zaproszenia do składania recenzowanych wniosków, a prace własne są organizowane przez grupę Diamond's Industrial Liaison group. Ten przepływ pracy został już rutynowo zastosowany do ponad stu celów z różnych obszarów terapeutycznych i skutecznie identyfikuje słabe spoiwa (1%-30% współczynnika trafień), które zarówno służą jako wysokiej jakości punkty wyjścia do projektowania mieszanek, jak i dostarczają obszernych informacji strukturalnych na temat miejsc wiązania. Odporność procesu została wykazana poprzez kontynuację badań przesiewowych celów SARS-CoV-2 podczas pandemii COVID-19, w tym 3-tygodniowy okres oczekiwania na główną proteazę.

Wprowadzenie

Odkrywanie leków na podstawie fragmentów (FBDD) jest szeroko stosowaną strategią odkrywania wiodących źródeł, a od czasu jej powstania 25 lat temu, dostarczyła cztery leki do użytku klinicznego, a ponad 40 cząsteczek zostało zaawansowanych do badań klinicznych1,2,3. Fragmenty to małe jednostki chemiczne, zwykle o masie cząsteczkowej 300 Da lub mniejszej. Są one wybierane ze względu na ich niską złożoność chemiczną, co stanowi dobry punkt wyjścia do opracowania wysoce wydajnych inhibitorów ligandów o doskonałych właściwościach fizykochemicznych. Ich rozmiar oznacza, że próbkują one krajobraz wiązań białek dokładniej niż biblioteki większych związków podobnych do leków lub ołowiu, a tym samym ujawniają również gorące punkty i domniemane miejsca allosteryczne. W połączeniu z informacjami strukturalnymi, fragmenty dostarczają szczegółowej mapy potencjalnych interakcji molekularnych między białkiem a ligandem. Niemniej jednak niezawodne wykrywanie i walidacja tych jednostek, które mają tendencję do słabego wiązania się z białkiem docelowym, wymaga szeregu solidnych i czułych biofizycznych metod przesiewowych, takich jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) lub izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC)4,5.

Krystalografia rentgenowska jest istotną częścią zestawu narzędzi FBDD: jest wystarczająco czuła, aby zidentyfikować słabe spoiwa i bezpośrednio dostarcza informacji strukturalnych o interakcjach na poziomie molekularnym. Jest komplementarny z innymi badaniami przesiewowymi biofizyki i zwykle jest niezbędny do postępu uderzeń fragmentów w związki ołowiu; wymaga wysokiej jakości systemów kryształowych, co oznacza, że krystalizacja jest wysoce powtarzalna, a kryształy idealnie ulegają dyfrakcji z rozdzielczością lepszą niż 2,8 A.

Historycznie rzecz biorąc, bardzo trudno było używać krystalografii jako podstawowego ekranu fragmentów6,7,8, czy to w środowisku akademickim, czy w przemyśle. W przeciwieństwie do tego, synchrotrony osiągnęły ulepszenia o rząd wielkości w robotyce, automation9,10,11 i technologii detektorów12,13, i połączone z równie przyspieszoną mocą obliczeniową i algorytmami przetwarzania danych14,15,16, kompletne zestawy danych dyfrakcyjnych mogą być mierzone w ciągu kilku sekund, a duża liczba z nich jest całkowicie bezobsługowa, jak to zapoczątkowano w LillyCAT7 i późniejszych MASSIF17,18 (Europejski Ośrodek Promieniowania Synchrotronowego (ESRF)). To skłoniło synchrotrony do opracowania wysoce usprawnionych platform, aby ekranowanie fragmentów opartych na kryształach jako główny ekran było dostępne dla szerokiej społeczności użytkowników (XChem w Diamond; CrystalDirect w EMBL/ESRF19; BESSY w: Helmholtz-Zentrum Berlin20; FragMax w MaxIV21).

Ten artykuł dokumentuje protokoły, które tworzą platformę XChem do badania fragmentów za pomocą krystalografii rentgenowskiej, od przygotowania próbki do końcowych wyników strukturalnych uderzeń modelowanych w 3D. Pipeline (Rysunek 1) wymagał opracowania nowych podejść do identyfikacji kryształów22, soaking23 i harvesting24, a także oprogramowania do zarządzania danymi25 oraz algorytmicznego podejścia do identyfikacji fragmentów26, które jest obecnie szeroko stosowane w społeczności. Technologia pozyskiwania kryształów jest obecnie sprzedawana przez jednego z dostawców (patrz Tabela Materiałów), a otwarta dostępność narzędzi pozwoliła innym synchrotronom na dostosowanie ich do tworzenia równoważnych platform21. Trwające projekty dotyczą analizy danych, uzupełniania modeli i rozpowszechniania danych za pośrednictwem platformy Fragalysis27. Laboratorium przygotowania próbek sąsiaduje z linią badawczą I04-1, co upraszcza logistykę przesyłania setek zamrożonych próbek na linię badawczą, a dedykowany czas trwania badania na I04-1 umożliwia szybkie przekazywanie informacji zwrotnych na temat promieniowania rentgenowskiego, które kieruje kampanią.

XChem jest integralną częścią programu użytkowników Diamond, z dwoma połączeniami rocznie (początek kwietnia i października). Proces recenzowania został dopracowany w porozumieniu z ekspertami w dziedzinie odkrywania leków ze środowisk akademickich i przemysłowych. Wraz z mocnymi dowodami naukowymi, proces propozycji28 wymaga od wnioskodawców samooceny nie tylko gotowości systemu kryształowego, ale także ich wiedzy specjalistycznej w zakresie biochemicznych i ortogonalnych metod biofizycznych oraz zdolności do postępów w badaniach przesiewowych poprzez chemię kontrolną. Tryby dostępu również ewoluowały, aby dostosować się do multidyscyplinarnej społeczności użytkowników:

Poziom 1 (pojedynczy projekt) jest przeznaczony dla projektów na etapie eksploracyjnym i narzędzi walidacji trafień (narzędzia biofizyczne lub biochemiczne) oraz strategie kontynuacji nie muszą być stosowane. Jeśli projekt zostanie zaakceptowany, zostanie mu przyznana zmniejszona liczba zmian w czasie wiązki, wystarczająca do weryfikacji koncepcji.

Poziom 2 (pojedynczy projekt) jest przeznaczony dla dobrze zweryfikowanych projektów i wymaga dalszych narzędzi i strategii kontynuacji. Jeśli projekt zostanie zaakceptowany, zostanie mu przydzielony czas badawczy wystarczający na przeprowadzenie pełnej kampanii przesiewowej. Pojedyncze projekty (Tier 1 lub Tier 2) muszą zostać ukończone w ciągu 6 miesięcy okresu rozliczeniowego (od kwietnia do września lub od października do marca).

Grupa Alokacji Bloków (BAG) jest przeznaczona dla konsorcjów grup i projektów, gdzie w ramach BAG istnieje solidny proces wyboru celów i priorytetyzacji, wraz z jasnym procesem kontynuacji. BAG muszą mieć co najmniej jednego w pełni przeszkolonego eksperta (superużytkownika) przeszkolonego przez XChem, który koordynuje ich działania z personelem Diamond i szkoli członków BAG. Przydzielona liczba przesunięć w czasie trwania projektu jest określana przez liczbę solidnych naukowo projektów w BAG i jest ponownie oceniana dla każdego okresu alokacji na podstawie raportu BAG. Dostęp jest dostępny przez 2 lata.

Eksperyment XChem jest podzielony na trzy etapy, z punktem decyzyjnym dla każdego z nich: test tolerancji rozpuszczalnika, wstępne badanie przesiewowe i główny ekran (Rysunek 2). Test tolerancji rozpuszczalnika pomaga określić parametry namaczania, ilość rozpuszczalnika (DMSO, glikolu etylenowego lub innych krioprotektantów, jeśli to konieczne), którą system kryształowy może tolerować i jak długo. Stężenia rozpuszczalników zwykle wahają się od 5% do 30% w co najmniej dwóch punktach czasowych. Dane dyfrakcyjne są zbierane i porównywane z dyfrakcją podstawową układu kryształowego; To określi parametry namaczania na następny etap. W przypadku badania wstępnego 100-150 związków jest moczonych w warunkach określonych w teście rozpuszczalnikowym, a jego celem jest potwierdzenie, że kryształy mogą tolerować związki w tych warunkach. W razie potrzeby krioprotektant jest następnie dodawany do kropli już zawierających fragmenty. Kryterium sukcesu jest to, że 80% lub więcej kryształów przetrwa wystarczająco dobrze, aby uzyskać dane dyfrakcyjne o dobrej i stałej jakości; Jeśli to się nie powiedzie, warunki namaczania są zwykle zmieniane poprzez zmianę czasu namaczania lub stężenia rozpuszczalnika. Po pomyślnym przeprowadzeniu wstępnego badania przesiewowego, pozostałe związki wybrane do eksperymentu można skonfigurować przy użyciu parametrów końcowych.

Biblioteka DSI (zobacz Tabelę Materiałów) została celowo zaprojektowana, aby umożliwić szybki postęp za pomocą opanowanej chemii29 i była koniem pociągowym placówki. Jest dostępny dla użytkowników w stężeniu 500 mM w DMSO. Użytkownicy akademiccy mają również dostęp do innych bibliotek dostarczanych przez współpracowników (łącznie ponad 2 000 związków) w stężeniach 100-500 mM w DMSO (pełną listę można znaleźć na stronie internetowej28). Znaczna część całej kolekcji jest również dostępna w postaci glikolu etylenowego, dla systemów krystalicznych, które nie tolerują DMSO. Użytkownicy mogą również przynosić własne biblioteki, pod warunkiem, że znajdują się one na płytach kompatybilnych z systemem obsługi cieczy akustycznej (patrz tabela materiałów).

Dla wszystkich trzech etapów eksperymentu (charakterystyka rozpuszczalnika, wstępne badanie przesiewowe lub pełny ekran), następujące procedury przygotowania próbki są identyczne (Rysunek 3): wybór miejsca dozowania związku poprzez obrazowanie i celowanie w krople krystalizacji za pomocą TeXRank22; dozowanie do kropli za pomocą systemu dozowania płynów akustycznych zarówno dla rozpuszczalnika, jak i związków23; efektywne zbieranie kryształów za pomocą Crystal shifter24; oraz wgrywanie przykładowych informacji do bazy danych linii badawczej (ISPyB). Obecnym interfejsem do projektowania i wykonywania eksperymentów jest aplikacja oparta na Excelu (SoakDB), która generuje niezbędne pliki wejściowe dla różnych urządzeń platformy oraz śledzi i rejestruje wszystkie wyniki w bazie danych SQLite. Skanery kodów kreskowych są używane na różnych etapach procesu, aby pomóc w śledzeniu próbek, a dane te są dodawane do bazy danych.

Dane dyfrakcyjne są zbierane w trybie nienadzorowanym za pomocą dedykowanego czasu wiązki na linii I04-1. Dostępne są dwa tryby centrowania, a mianowicie optyczny i oparty na promieniowaniu rentgenowskim17. W przypadku kryształów w kształcie igieł i prętów zaleca się centrowanie promieniowania rentgenowskiego, podczas gdy bardziej masywne kryształy na ogół obsługują tryb optyczny, który jest szybszy, a zatem pozwala na zebranie większej liczby próbek w wyznaczonym czasie wiązki. W zależności od rozdzielczości kryształów (ustalonej przed wejściem na platformę) zbieranie danych może wynosić 60 s lub 15 s całkowitej ekspozycji. Zbieranie danych na etapie badania rozpuszczalnikiem zazwyczaj informuje o tym, która kombinacja najlepiej sprawdzi się w połączeniu z wydajnością linii badawczej I04-1.

Duża ilość analizy danych jest zarządzana przez XChemExplorer (XCE)25, który może być również użyty do uruchomienia kroku identyfikacji trafienia za pomocą PanDDA26. XCE to narzędzie do zarządzania danymi i przepływu pracy, które obsługuje wielkoskalową analizę struktur białkowo-ligandowych (Rysunek 4); odczytuje wszystkie wyniki automatycznego przetwarzania z danych zebranych w Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 i STARANISO31) i automatycznie wybiera jeden z wyników na podstawie jakości danych i podobieństwa do modelu referencyjnego. Ważne jest, aby model był reprezentatywny dla układu kryształów używanego do badań przesiewowych XChem i musiał zawierać wszystkie wody lub inne cząsteczki rozpuszczalników, a także wszystkie kofaktory, ligandy i alternatywne konformacje widoczne w kryształach nasączonych wyłącznie rozpuszczalnikiem. Jakość tego modelu referencyjnego będzie miała bezpośredni wpływ na ilość pracy wymaganej na etapie budowania i udoskonalania modelu. PanDDA służy do analizy wszystkich danych i identyfikacji miejsc wiązania. Wyrównuje struktury do struktury odniesienia, oblicza mapy statystyczne, identyfikuje zdarzenia i oblicza mapy zdarzeń 26,32. W paradygmacie PanDDA nie jest ani konieczne, ani pożądane budowanie pełnego modelu krystalograficznego; To, co musi być modelowane, to tylko widok białka, w którym fragment jest związany (model stanu związanego), więc należy skupić się tylko na budowaniu liganda i otaczających go reszt/cząsteczek rozpuszczalnika zgodnie z mapą zdarzeń32.

Protokół

1. Składanie propozycji projektów

  1. Treść propozycji: ponieważ program XChem jest nadmiernie subskrybowany, dokładne i kompletne informacje zawarte we wniosku mają kluczowe znaczenie dla przejścia recenzji.
    1. Przekonaj się! Przedstaw znaczenie celu i umieść go w szerszym kontekście.
      1. Przedstaw strategię po kampanii przesiewowej fragmentów: ortogonalne metody walidacji trafień i sposobu ich rozwijania. W razie potrzeby uporządkuj współpracę.
      2. Ze względu na intensywną część laboratoryjną i analizę danych, zdecydowanie zaleca się wcześniejsze przydzielenie doświadczonego krystalografa.
      3. Solidny system kryształowy jest kluczem do wyeliminowania różnic technicznych, a użytkownicy powinni zająć się tymi istotnymi punktami.
        1. Upewnij się, że warunki krystalizacji dają powtarzalne krople z kryształami o podobnej jakości dyfrakcyjnej w płytkach odpowiednich do stosowania na platformie o objętości zbiornika 30 μl (lub mniejszej) i wielkości kropli między 200-500 nL. Idealnie byłoby, gdyby ponad 50% kropli na płytce zawierało kryształy o rozmiarze co najmniej 35 μm33.
        2. Zapewnić stałą jakość dyfrakcji kryształów (2,6 A lub lepsza).
        3. Sprawdź przydatność systemu krystalicznego do badania przesiewowego fragmentów, w tym upakowania kryształów i dostępności znanych miejsc. Wcześniejsze dowody na istnienie cząsteczki związanej w tych miejscach są często uspokajające.

2. Przygotowanie do wizyty

  1. Przekazywanie protokołów krystalizacji do krystalizacji na miejscu.
    1. Dostarczyć 2 x 50 ml roztworu w zbiorniku, gotowego do użycia.
    2. Dostarczyć roztwór białkowy o stężeniu niezbędnym do krystalizacji, gotowy do użycia w porcjach 30-50 μl.
    3. Dostarczyć 10 ml roztworu buforowego białka.
    4. Dostarczyć materiał siewny (nawet jeśli nie jest on wymagany w protokole krystalizacji).
      UWAGA: Wysiewanie sprzyja odtwarzalności krystalizacji i przyspiesza czas zarodkowania33.
    5. Wypełnij formularz informacyjny o krystalizacji dostępny na stronie XChem 28.
    6. Podaj informacje o przechowywaniu w formularzu wysyłkowym dostępnym na stronie XChem28.
  2. Zainstaluj NoMachine i skonfiguruj zdalny pulpit do Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html).
  3. Wygeneruj i przenieś dobry model referencyjny w porozumieniu z ekspertem krystalografem lub personelem wsparcia XChem.

3. Eksperyment z badaniem przesiewowym fragmentów

  1. Definiowanie miejsca dozowania związku.
    1. Obrazowanie płytek krystalizacyjnych.
      1. Wyobrazić sobie wszystkie płytki kryształowe (patrz Tabela materiałów) wymagane do eksperymentu w obrazownikach płyt kryształowych (patrz Tabela materiałów). Korzystając z oprogramowania imager, wygeneruj nazwę (nazwy) tablicy w katalogu odpowiednim dla typu płyty w następującym formacie: Propozycja Number_Plate numer.
      2. Wydrukuj kody kreskowe (kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę tabliczki i wybierz z menu), umieść je po przeciwnej stronie tabliczki niż litery rzędu, włóż tabliczkę (tablice) do portu ładowania z kodem kreskowym skierowanym odwrotnie od użytkownika.
      3. Użyj oprogramowania sterującego imagerem, zeskanuj port ładowania, kliknij prawym przyciskiem myszy płyty, a następnie wybierz Płyty pamięciowe.
      4. Po zakończeniu obrazowania wyjmij płytki z imagera.
    2. Wybór lokalizacji kryształów i związku
      UWAGA: Obrazy kropelek krystalizacji są przetwarzane w potoku Luigi przy użyciu algorytmu Ranker opartego na tekstach TexRank w celu uszeregowania kropel według prawdopodobnej obecności kryształów22. Zajmuje to około 10 minut, a obrazy będą wtedy dostępne w TexRank.
      1. Otwórz TeXRank na komputerze i wybierz kryształową tackę z listy w prawym dolnym rogu lub wpisując kod kreskowy w polu w lewym górnym rogu.
      2. Wybierz odpowiedni format imagera i widok pojedynczego dołka. Poruszaj się po obrazach kropli, a gdy pojawi się kryształ, który nadaje się do użycia w eksperymencie, kliknij prawym przyciskiem myszy od kryształu, ale wewnątrz kropli - celem jest wycelowanie w miejsce w kropli, aby dodać rozpuszczalnik / związki, więc nie chcesz bezpośrednio uderzać w kryształ23.
      3. Kontynuuj przez całą płytę, a po zakończeniu wybierz przycisk Echo 1 Target; zapisz w katalogu kryształowych celów pod odpowiednią wizytą. Nie zmieniaj nazwy pliku.
      4. Powtórz te czynności dla wszystkich dodatkowych płytek.
  2. Dozowanie mieszanek
    1. Generowanie plików do dozowania mieszanek
      1. W SoakDB wprowadź wybór biblioteki lub informacje o rozpuszczalniku w tabeli biblioteki/rozpuszczalnika.
      2. Wprowadź objętość dropu i załaduj się na liście docelowych kryształów.
      3. Wygeneruj wymagane partie.
      4. Wprowadź parametry namaczania. Kliknij Oblicz, a następnie przycisk Eksport oczekujący. W przypadku rozpuszczalnika dodaj do tabeli różne stężenia. W ten sposób generowane są pliki do wykorzystania w dozowniku akustycznym.
      5. Jeśli używasz krioprotektantu, wprowadź stężenie i utwórz pliki w ten sam sposób.
    2. Dozowanie roztworów za pomocą dozownika akustycznego (patrz tabela materiałów)
      1. Wziąć płytkę źródłową (związki lub rozpuszczalnik/krioprotektant) i obracać płytkę w wirówce przez 2 minuty przy 1 000 x g.
      2. W przypadku dozowania rozpuszczalnika lub krioprotektantu należy odpipetować 30 μl do odpowiedniego dołka na płytce 384PP; przykryć folią z mikrouszczelką, a następnie odwirować jak powyżej.
      3. Otwórz oprogramowanie, wybierz opcję Nowa i wybierz odpowiednią płytkę studzienki źródłowej (384PP, 384LDV lub 1536LDV) oraz klasę cieczy (DMSO, CP, BP lub GP). Upewnij się, że jako blachę docelową wybrano właściwy typ blachy. Następnie zaznacz pole Niestandardowe i kontynuuj.
      4. Wybierz opcję Importuj i wybierz odpowiedni plik wsadowy. Wykonaj kroki importowania zgodnie z monitem oprogramowania.
      5. Skorzystaj z map płytek, aby sprawdzić roztwór do dozowania i lokalizacje docelowe.
      6. Uruchom protokół, postępując zgodnie z wyświetlanymi monitami. Roztwór (roztwory) z płytki źródłowej zostanie dozowany do wybranych kryształowych kropli.
      7. Przechowywać płytkę w inkubatorze przez wymagany czas.
        UWAGA: Parametry te są określane na etapie charakteryzowania rozpuszczalnika, temperatura będzie wynosić 4 °C lub 20 °C w zależności od temperatury wzrostu kryształów, a czasy wynoszą zwykle od 1 h do 3 h.
  3. Zbieranie kryształów za pomocą półautomatycznego urządzenia do zbierania kryształów (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Jeśli wymagana jest krioprotekcja, powtórz krok 3.2.2 w celu dodania roztworów krioprotektantu do kropli kryształów przed pobraniem próbek.
    1. Przygotowanie do zbioru
      1. Przygotuj pliki wymagane do zbierania w SoakDB. Gdy zostaniesz o to poproszony, potwierdź, że namaczanie zostało zakończone, a partie zakończone.
      2. Zeskanuj liczbę krążków wymaganych do przeprowadzenia eksperymentu pod prawidłowym numerem propozycji.
      3. Wybierz tacę z pętlami o odpowiedniej wielkości dla kryształów (35 μm, 75 μm lub 150 μm). Co ważne, należy wybrać rozmiar pętli, który jak najbardziej odpowiada rozmiarowi kryształu, aby umożliwić automatyczne centrowanie na linii badawczej, poprawić jakość danych poprzez zmniejszenie tła i wyeliminować potrzebę stosowania krioprotektantu.
      4. Otwórz odpowiednie oprogramowanie i otwórz kartę przepływu pracy.
      5. Zeskanuj krążki do oprogramowania i przewiń z powrotem na górę listy, podświetlając pierwszy krążek.
      6. Umieść krążki w piance dewara i ostudź je ciekłym azotem.
      7. Wybierz opcję Importuj plik z SoakDB i wybierz partię do zbioru; sprawdź, czy partia jest przypisana do posiadacza po lewej stronie. Pojawi się lista robocza.
      8. Weź kryształową płytkę, usuń uszczelkę i włóż lewy uchwyt; przesuń tabliczkę do pozycji parkowania.
    2. Zbieranie kryształów
      1. Usiądź wygodnie i naciśnij przycisk Rozpocznij przepływ pracy (ekran jest ekranem dotykowym), aby przejść do pierwszej wybranej pozycji studni.
      2. Jeśli kryształ przetrwał, zamontuj kryształ w pętli i zanurz go w ciekłym azocie, umieszczając go na pozycji 1 w pierwszym krążku na liście.
      3. Wybierz odpowiedni opis kryształu z interfejsu (normalny, stopiony, pęknięty, galaretowaty lub kolorowy).
      4. Jeśli kropla jest nasączeniem związku, zapisz opis stanu związku (klarowny, krystaliczny, wytrącony, złe dozowanie lub separacja faz).
      5. Jeśli kryształ został pomyślnie zamontowany, wybierz opcję Zamontowany, w przeciwnym razie wybierz opcję Niepowodzenie.
      6. Płyta zostanie przeniesiona do następnej wybranej studni. Wypełnij kolejno wszystkie pozycje krążka (nie zostawiaj przerwy, jeśli kryształ uległ awarii). Kontynuuj do końca przepływu pracy.
      7. Na końcu przepływu pracy załaduj dodatkowe partie i kontynuuj napełnianie krążków w kolejności. Nie ma potrzeby rozpoczynania nowego krążka dla nowej partii.
    3. Śledzenie wyników zbioru za pomocą kodów kreskowych
      1. Po zebraniu wszystkich kryształów zanieś krążki do skanera kodów kreskowych, umieszczaj pojedynczo w uchwycie, aby zeskanować krążek i przypiąć kody kreskowe.
      2. Po zakończeniu załóż pokrywki na krążki i przechowuj w zbiorniku na ciekły azot Dewar.
      3. Załaduj plik wyjściowy do interfejsu SoakDB.
    4. Zapisywanie przykładowych informacji do ISPyB34,35,36
      1. Przekazywanie przykładowych danych do ISPyB
        1. W SoakDB zaktualizuj linię badawczą, odwiedź stronę Update for ISPyB i kliknij Export aby utworzyć plik do wgrania do ISPyB.
        2. Otwórz kit. Zaloguj się i przejdź do następującego katalogu: dls/labxchem/data/year/lbXXXX-1/processing/lab36/ispyb.
        3. Uruchom skrypt csv2ispyb (csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv)
          UWAGA: Próbki są teraz ładowane do ISPyB.
      2. Rejestruj lokalizację krążka i strategię zbierania danych.
        1. Zapisz szczegóły i lokalizację krążków
          UWAGA: Ważne jest, aby zapisać szczegóły i lokalizację krążków, aby można je było zlokalizować i załadować na linię badawczą.
          1. W SoakDB otwórz drugą kartę oznaczoną Pucks.
          2. Wypełnij dane w polach u góry. W szczególności lokalizacja krążków (dewar i laski do przechowywania), parametry zbierania danych, w tym oczekiwana rozdzielczość i numer propozycji.
          3. Kliknij przycisk Zapisz, a w tabeli pojawi się lista wszystkich krążków. Skopiuj ostatnio wypełnione krążki.
          4. Otwórz arkusz kalkulacyjny kolejki XChem (skrót na pulpicie) i wklej informacje. Podaj wszelkie dodatkowe istotne informacje.

4. Zbieranie danych

UWAGA: Dane są zbierane w trybie nienadzorowanym i zarządzane przez zespół XChem/linii badawczej.

  1. Przypominanie błędnie wyśrodkowanych próbek.
    UWAGA: Są one wymagane, gdy wystąpiły problemy z gromadzeniem danych dla niektórych próbek, najprawdopodobniej spowodowane nieprawidłowym wyśrodkowaniem pinów.
    1. Spójrz na widok zmieniacza próbek w ISPyB, wybierz Uszereguj według AP, aby ocenić próbki według automatycznie przetworzonej rozdzielczości z gradacją kolorów od zielonego do czerwonego.
    2. Kliknij próbki, aby sprawdzić, czy nie ma ich czerwonych lub żółtych próbek.
      UWAGA: Spowoduje to wyświetlenie zbierania danych.
    3. Sprawdź migawki kryształu, aby zobaczyć, czy kryształ jest wyśrodkowany.
    4. Zanotuj wszystkie te, które nie zostały wyśrodkowane i wyślij do lokalnego kontaktu, który przypomni sobie brakujące próbki.

5. Analiza danych

  1. Pobieranie i analizowanie wyników automatycznego przetwarzania Diamonda za pomocą XChemExplorer (XCE)25.
    1. W terminalu przejdź do podfolderu Przetwarzanie: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing lub dla XChem BAGs: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing/project/processing/.
    2. Użyj aliasu xce, aby otworzyć XChemExplorer.
    3. Wybierz przycisk Aktualizuj tabele ze źródła danych.
    4. Na karcie Przegląd znajduje się podsumowanie danych eksperymentalnych. Dodaj dodatkowe kategorie za pomocą opcji Wybierz kolumny do pokazania w menu Źródło danych.
    5. Na karcie Ustawienia wybierz katalog zbierania danych (/dls/i04-1/data/year/visit/).
    6. Otwórz kartę Zestawy danych, wybierz element docelowy z menu rozwijanego Wybierz element docelowy, wybierz pozycję Get Nowe wyniki z automatycznego przetwarzania z menu rozwijanego Zestawy danych, a następnie kliknij pozycję Uruchom.
      UWAGA: XCE będzie teraz analizować wizytę zbierania danych w celu automatycznego przetwarzania wyników. Może to zająć trochę czasu przy pierwszym uruchomieniu, w zależności od liczby analizowanych zestawów danych/katalogów.
    7. Sprawdź spójność i jakość danych, sprawdzając rozdzielczość, grupę przestrzeni i Rmerge. Wyklucz dane o rozdzielczości niższej niż 2,8 A.
      UWAGA: Domyślnie wybór zestawu danych jest oparty na wyniku obliczonym na podstawie I/sigI, kompletności i liczby unikalnych odbić, ale inne wyniki przetwarzania można wybrać do use25.
    8. Aby wybrać inny wynik przetwarzania dla poszczególnych zestawów danych, jeśli wolisz, kliknij Identyfikator próbki i wybierz żądany program/uruchomienie. Aby zmienić potok przetwarzania dla wszystkich zestawów danych, wybierz opcję Edytuj preferencje z menu Preferencje i zmień Mechanizm wyboru zestawu danych.
    9. W razie potrzeby ponownie przetwórz dane za pomocą ISPyB37.
    10. Jeśli żadne przetworzone dane dla próbki nie są akceptowalne, oznacz je jako Nie udało się wykluczyć z dalszej analizy.
    11. Po zakończeniu kliknij pozycję Aktualizuj tabele ze źródła danych, aby dodać dane do kolejnych tabel.
  2. Obliczanie początkowych map za pomocą DIMPLE38.
    1. Otwórz kartę Mapy, wybierz model referencyjny z menu rozwijanego i wybierz żądane zestawy danych, a następnie uruchom DIMPLE na wybranych plikach MTZ.
    2. XCE uruchamia wiele zadań DIMPLE jednocześnie w klastrze w Diamond. Znajdź stan tych zadań w kolumnie Dimple Status i odśwież je przy użyciu przycisku Aktualizuj tabele ze źródła danych lub polecenia qstat w systemie Linux.
    3. Po zakończeniu sprawdź, czy wartości Dimple Rcryst, Dimple Rfree i Space Group są akceptowalne. W razie potrzeby (wysokie Rfree/niewłaściwa grupa spacji/duża różnica w objętości komórki elementarnej) zmień wyniki automatycznego przetwarzania zgodnie z wcześniejszym opisem i powtórz generowanie mapy dla tych zestawów danych.
  3. Generowanie ograniczeń ligandów za pomocą Grade39, AceDRG40 lub phenix.eLBOW41.
    1. Wybierz żądany program (Preferencje, Edytuj preferencje, Program do generowania umocowań), a następnie wybierz zestawy danych w zakładce Mapy, a następnie uruchom Utwórz plik CIF/PDB/PNG z WYBRANYCH związków z listy rozwijanej Mapy i ograniczenia.
    2. Odśwież stan tych zadań znalezionych w kolumnie Stan złożony przy użyciu przycisku Aktualizuj tabele ze źródła danych.
  4. Budowanie modelu stanu podstawowego (Pre-run)
    UWAGA: Termin model stanu podstawowego reprezentuje strukturę białka w jego postaci wolnej od ligandów, jak zaobserwowano w 100 zestawach danych (liczba ta jest wybierana arbitralnie). Ponieważ model stanu podstawowego jest używany jako odniesienie do budowania stanu związanego z ligandem, kluczowe znaczenie ma zbudowanie dokładnego modelu stanu podstawowego, obejmującego wszystkie cząsteczki rozpuszczalnika i wody, przed analizą całej kampanii przesiewowej fragmentów. W tym kroku sto pierwszych zestawów danych o najwyższej rozdzielczości oznaczonych przez PanDDA jako pozbawione interesujących zdarzeń (a zatem prawdopodobnie wolne od ligandów) jest używanych do generowania mapy średniej stanu podstawowego, podczas gdy zestaw danych o najniższymwolnym R jest wybierany do udoskonalenia. Mapa średniej stanu podstawowego nie jest mapą krystalograficzną, jednak ważne jest, aby używać tej mapy tylko do budowy modelu stanu podstawowego.
    1. Otwórz kartę PanDDAs i w razie potrzeby zaktualizuj tabele ze źródła danych.
    2. Zdefiniuj katalog wyjściowy (/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas).
    3. Wybierz opcję Uruchom wstępnie dla modelu stanu podłoża i kliknij Uruchom.
      UWAGA: Zestawy danych z wysokimi Rfree i nieoczekiwanymi grupami przestrzeni powinny być automatycznie wykluczane z analizy.
    4. Aby ręcznie wykluczyć zestawy danych z wysokimi Rfree i nieoczekiwanymi grupami spacji, wybierz opcję Ignoruj całkowicie.
    5. Sprawdź stan zadania przed uruchomieniem za pomocą qstat w oknie terminala.
    6. Po zakończeniu wybierz opcję Zbuduj model stanu gruntu i kliknij Uruchom.
      UWAGA: Spowoduje to otwarcie Coot z mapą średniej PanDDA i modelem referencyjnym/mapami 2Fo-Fc/Fo-Fc z zestawu danych najlepszej jakości do ponownego modelowania i udoskonalania przy użyciu Coot. Niezwykle ważne jest, aby do modelowania używana była wyłącznie mapa średniej PanDDA.
  5. Identyfikowanie trafień za pomocą klasy PanDDA26
    1. Analiza PanDDA
      UWAGA: Uruchomienie w klastrze może zająć trochę czasu, jeśli istnieje wiele zestawów danych, komórka elementarna jest duża, a w jednostce asymetrycznej znajduje się wiele kopii białka.
      1. Powtórz wcześniej opisane kroki dla opcji Analizuj wyniki automatycznego przetwarzania DLS i Wstępne obliczenia mapy. Do obliczeń mapy należy użyć modelu stanu podstawowego jako odniesienia: Odśwież listę plików referencyjnych > Ustaw nowe odniesienie i wygeneruj umocowania ligandów zgodnie z potrzebami dla nowych danych (kroki 6.1-6.3).
      2. Na karcie PanDDAs upewnij się, że katalog wyjściowy jest ustawiony jak poprzednio, a następnie uruchom pandda.analyse z menu rozwijanego Identyfikacja trafienia.
      3. Sprawdź stan zadania w terminalu Linux za pomocą polecenia qstat.
    2. PanDDA inspect - sprawdzanie/budowanie zdarzeń powiązań
      1. Na karcie PanDDAs w XCE uruchom pandda.inspect z menu rozwijanego Identyfikacja trafień, aby otworzyć Coot42 z panelem sterowania PanDDA.
        UWAGA: Panel sterowania pandda.inspect zapewnia podsumowanie statystyk PanDDA i umożliwia użytkownikom nawigację po powiązanych zdarzeniach/witrynach. Generowany jest również plik HTML podsumowania wyników, który można zaktualizować podczas inspekcji, wybierając pozycję Aktualizuj HTML.
      2. Aby zamodelować ligand, kliknij Scal ligand z modelem i Zapisz model przed przejściem do innego zdarzenia, aby uniknąć utraty jakichkolwiek zmian w modelu stanu ograniczonego.
        UWAGA: Tylko modele, które zostały zaktualizowane i zapisane, zostaną wyeksportowane w celu udoskonalenia na późniejszym etapie.
      3. Użyj pola Komentarz do zdarzenia, aby dodać adnotację do zdarzenia powiązania, oraz pola Rejestruj informacje o witrynie, aby dodać adnotacje do witryn powiązania.
      4. Mapy średniej obciążenia i 2mFo-DFc (z DIMPLE) do porównania z mapą i modelem zdarzeń.
        1. Gdy wszystkie żywe ligandy zostaną wymodelowane, połączone i zapisane na podstawie mapy zdarzeń, zamknij pandda.inspect.
    3. Eksport i uściślanie PanDDA
      UWAGA: Po inspekcji PanDDA modele są eksportowane z powrotem do katalogu projektu i uruchamiana jest wstępna runda udoskonalania. Obecnie dostępne są dwa potoki, które umożliwiają to w zakładce PANDDA w XCE.
      1. Eksport NOWYCH/WSZYSTKICH/WYBRANYCH MODELI PANDDA generuje zestaw modeli powiązanych i niepowiązanych w celu doprecyzowania oraz generuje parametry ograniczenia zajętości dla klasy Refmac43.
        UWAGA: Model zespołowy zostanie użyty do udoskonalenia, ale tylko model stanu ograniczonego zostanie zaktualizowany w Coot i zdeponowany w PDB. Ten potok najlepiej nadaje się do zestawów danych z fragmentami o niskim zajętości i znaczącymi zmianami w modelu białkowym.
      2. Uściślanie modeli w stanie ograniczonym NEW/ALL za pomocą BUSTER uściśla stan ograniczony tylko za pomocą Buster44.
        UWAGA: Najlepiej sprawdza się to w przypadku ligandów/zestawów danych o wysokim obłożeniu przy minimalnych zmianach w modelu białka.
  6. Doprecyzowanie działań (wszystkie zestawy danych wybrane do doprecyzowania będą teraz widoczne na karcie Zawężenie). Wybierz opcję Open COOT - BUSTER Refinement lub Open COOT - REFMAC Refinement z menu rozwijanego Refinement, aby otworzyć Coot za pomocą panelu sterowania XCE Refinement.
    1. Wybierz status próbek do rafinacji z listy rozwijanej Wybierz próbki (zwykle 3 - w uściśleniu) i kliknij GO.
      UWAGA: Panel sterowania XCE zawiera podsumowanie liczby zestawów danych dla tej kategorii i umożliwia nawigację między zestawami danych, udostępniając jednocześnie podsumowanie statystyk uściślania.
    2. Dodawanie adnotacji do ufności liganda w panelu sterowania XCE: 0 - brak liganda - Fragment nie został powiązany; 1 - Niska pewność siebie - Fragment prawdopodobnie związał się, ale nie jest szczególnie przekonujący; 2 - Prawidłowy ligand, słaba gęstość - Użytkownik jest pewien, że fragment się związał, ale jest mało zajęty / występują pewne problemy z mapami; 3 - Wyraźna gęstość, nieoczekiwany ligand - Mapy wyraźnie wskazują wiązanie ligandów, które nie korelują z podaną strukturą chemiczną; 4 - Wysoki poziom ufności - Ligand jest jednoznacznie związany.
    3. Na tym etapie wprowadź wszelkie niezbędne zmiany w modelu i rozpocznij dalsze udoskonalanie za pomocą przycisku Uściślij.
    4. Użyj przycisku Pokaż listę zadań do wykonania MolProbity, aby uzyskać dostęp do analizy MolProbity45 uruchomionej we wszystkich cyklach udoskonalania.
    5. W razie potrzeby dodaj parametry zagęszczenia, np. dla anizotropowych czynników temperatury, danych bliźniaczych lub uściślenia zajętości, wybierając przycisk Parametry zagęszczenia.
      UWAGA: Statystyki przetwarzania danych są również dostępne w XCE w zakładce Uściślanie, a jeśli udoskonalanie jest wykonywane za pomocą potoku Buster, dostarczane są raporty Buster, w tym MOGUL analysis46.
    6. Zmienianie stanu zestawu danych w miarę jego udoskonalania można zmieniać zarówno w oknie głównym XCE na karcie Zawężenie, jak i w panelu sterowania Coot XCE. Po upewnieniu się, że model jest dokładny wokół liganda i nadaje się do udostępnienia do dalszej analizy, zmień stan na CompChem Ready. Gdy udoskonalanie zostanie zakończone, a model będzie gotowy do przesłania do pliku PDB, zmień stan na Gotowe do osadzania.

6. Deponowanie danych

UWAGA: Wszystkie zestawy danych z ekranu fragmentów oraz model stanu podstawowego użyty do wygenerowania map zdarzeń PanDDA mogą być zdeponowane w PDB za pomocą depozycji grupowych.

  1. Przekonwertuj wszystkie mapy zdarzeń PanDDA na format MTZ, uruchamiając Mapa zdarzeń ->SF z menu Identyfikacja trafienia.
  2. Podaj dodatkowe metadane, takie jak autorzy i metody, wybierając pozycję Osadzanie > Edytuj informacje. Wypełnij wszystkie wymagane pozycje i kliknij Zapisz w bazie danych, a następnie zapisz te informacje w celu osadzenia modelu stanu podstawowego. Należy to zrobić po zmianie stanu modelu na Gotowy do osadzania.
  3. Na karcie Osadzanie wybierz przycisk Przygotuj mmcif, aby wygenerować pliki mmcif współczynnika konstrukcji dla wszystkich zestawów danych Deposition Ready. Po zakończeniu tego procesu w oknie terminala pojawi się następujący komunikat: Zakończono przygotowywanie plików mmcif do depozycji wwPDB.
  4. Wybierz przycisk Kopiuj mmcif, aby skopiować wszystkie te pliki do jednego spakowanego archiwum tar w katalogu osadzania grup wizyty.
  5. Przejdź do https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; zaloguj się za pomocą nazwy użytkownika: grouptester i hasła: !2016rcsbpdb. Utwórz sesję i przekaż plik ligand-bound.tar.bz2 z katalogu osadzania grupy.
  6. Po pomyślnym przesłaniu struktur związanych z ligandem, wysyłana jest wiadomość e-mail z kodami PDB. Wybierz opcję Aktualizuj bazę danych za pomocą kodów PDB z menu Deposition; skopiuj i wklej informacje z tej wiadomości e-mail do wyskakującego okienka, a następnie kliknij Aktualizuj bazę danych, aby dodać identyfikatory PDB.
  7. W celu zdeponowania modelu stanu podstawowego używanego przez PanDDA, wybierz odpowiedni katalog PanDDA w XCE i uruchom apo->mmcif z menu Identyfikacja trafień.
    UWAGA: XCE arbitralnie wybierze strukturę o wysokiej rozdzielczości z niskim Rfree jako model dla pakietu osadzania, a następnie skompiluje wszystkie pliki mmcif współczynnika struktury w jeden plik.
  8. Na karcie Deposition (Osadzanie) wybierz przycisk Add to Database (Dodaj do bazy danych) znajdujący się poniżej sekcji Group Deposition of Ground-State Model (Osadzanie grupowe modelu stanu podstawowego).
  9. Wprowadź metadane modelu stanu podstawowego (ponownie wybierając opcję Osadzanie > Edytuj informacje), załaduj poprzedni plik i zapisz w bazie danych.
  10. Przygotuj plik mmcif stanu podstawowego, uruchamiając polecenie Przygotuj mmcif w sekcji Group Deposition of Ground-State Model (Grupowe osadzanie modelu stanu podstawowego), a po zakończeniu skopiuj plik mmcif do katalogu osadzania grupowego, wybierając przycisk Kopiuj mmcif z tej samej sekcji.
  11. Tak jak poprzednio, przejdź do https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; zaloguj się za pomocą nazwy użytkownika: grouptester i hasła: !2016rcsbpdb. Utwórz sesję i prześlij plik ground_state_structures.tar.bz2 z katalogu osadzania grupy.

Wyniki

Procedura XChem służąca do przesiewania fragmentów za pomocą krystalografii rentgenowskiej została znacznie zoptymalizowana, co umożliwiło jej szerokie przyjęcie przez społeczność naukową (Rysunek 5). Proces ten został zwalidowany w ponad 150 kampaniach przesiewowych, w których odsetek trafień (hit rate) wahał się od 1% do 30%47,48,49,50,51,52 oraz przez wielu stałych użytkowników. Systemy krystaliczne, które nie są odpowiednie (niska rozdzielczość, niespójna krystalizacja lub jakość dyfrakcji) lub nie tolerują DMSO ani glikolu etylenowego, są eliminowane na wczesnym etapie procesu, co pozwala oszczędzić czas, wysiłek i zasoby. Udane kampanie dostarczają trójwymiarowej mapy potencjalnych miejsc oddziaływań na białku docelowym; typowym wynikiem jest przesiew XChem głównej proteazy SARS-CoV-2 (Rysunek 6). Zazwyczaj trafienia fragmentowe znajdują się w: (a) znanych miejscach zainteresowania, takich jak centra aktywne enzymów i kieszenie pomocnicze48; (b) domniemanych miejscach allosterycznych, na przykład w oddziaływaniach białko-białko53; (c) na granicach upakowania kryształów, co zazwyczaj uznaje się za wyniki fałszywie dodatnie (Rysunek 6). Takie dane strukturalne stanowią zazwyczaj podstawę do łączenia (merging), wiązania (linking) lub rozbudowy (growing) trafień fragmentowych w małe cząsteczki o charakterystyce związków wiodących1,3.

figure-results-1
Rycina 1: Proces XChem. Schematyczna reprezentacja platformy, od propozycji projektu, przez przygotowanie próbek, zbieranie danych, aż po identyfikację trafień. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Strategia przesiewania. Schemat blokowy przedstawia cel każdego etapu, wymagania eksperymentalne oraz punkty decyzyjne. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat przygotowania próbek. Przedstawiono kluczowe etapy przygotowania próbek, przy czym informacje z każdego kroku są zapisywane w bazie danych SQLite. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza danych z wykorzystaniem XCE. Krytyczne kroki analizy danych przedstawiono na schemacie przepływu pracy wraz z odpowiednimi pakietami oprogramowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Ewolucja programu użytkownika XChem: Wykres przedstawia rozwój i konsolidację programu użytkownika od 2015 do 2019 roku, wraz z utworzeniem BAG w 2019 roku, a także odporność platformy w czasie pandemii COVID-19 w 2020 roku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki przesiewania fragmentów XChem. Dimer głównej proteazy (Mpro) SARS-CoV2 przedstawiono w formie powierzchni, gdzie trafienia w centrum aktywnym zaznaczono na żółto, domniemane trafienia allosteryczne na magenta, a artefakty powierzchniowe/upakowania krystalicznego na zielono. Rysunek wykonano przy użyciu programu Chimera oraz wpisów PDB dla Mpro z depozycji grupowej G_1002156. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Proces opisany w tym dokumencie został gruntownie przetestowany przez społeczność użytkowników, a zdolność adaptacji opisanych tutaj protokołów jest kluczem do obsługi szerokiej gamy projektów zwykle spotykanych na platformie. Konieczne jest jednak spełnienie kilku warunków wstępnych systemu kryształowego.

W przypadku każdej kampanii przesiewowej fragmentów przeprowadzanej z wykorzystaniem krystalografii rentgenowskiej kluczowe znaczenie ma powtarzalny i solidny system krystaliczny. Ponieważ standardowy protokół XChem polega na dodawaniu fragmentu bezpośrednio do kropli kryształu, optymalizacja powinna skupić się na liczbie kropli zawierających kryształy wysokiej jakości, a nie na całkowitej liczbie kryształów. Jeśli krople zawierają wiele kryształów, są one skutecznie zbędne, chociaż mogą złagodzić proces zbioru. Co więcej, przeniesienie protokołu krystalizacji z instytutu macierzystego do obiektów na miejscu może być wyzwaniem. Na ogół najlepiej osiąga się to za pomocą zasiewu kryształów w celu promowania powtarzalnego zarodkowania54, a zatem dobrą praktyką jest, aby użytkownicy dostarczali zapasy nasion wraz z roztworami białkowymi i krystalizacyjnymi.

Aby zapewnić dobrą rozpuszczalność i nośnik związku, w rozpuszczalnikach organicznych, w szczególności DMSO i glikolu etylenowy, zapewniono wysokie stężenia nasączania, które mają na celu napędzanie wiązania słabych fragmentów. Dostarczenie dwóch różnych rozpuszczalników daje użytkownikom alternatywę dla kryształów, które w ogóle nie tolerują DMSO lub gdy blokują one wiązanie fragmentów w miejscu zainteresowania. Użytkownicy mogą dostarczać alternatywne biblioteki w buforze wodnym: związki będą dobrze dozować, pod warunkiem, że zostaną całkowicie rozpuszczone i sformatowane w płytkach kompatybilnych z robotem dozującym ciecze.

W przypadku projektów, w przypadku których nie jest możliwe znalezienie odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego, który zarówno rozpuściłby bibliotekę, jak i byłby tolerowany przez system krystaliczny, alternatywną procedurą jest użycie wysuszonych związków, jak ustalono w BESSY55.

W społeczności od dawna pojawia się pytanie o możliwość wchłaniania związków chemicznych do kryształów hodowanych w warunkach krystalizacji zawierających wysokie stężenia soli. W praktyce obserwuje się większe wytrącanie się związków i szybkie tworzenie się kryształów soli na etapie zbioru, co jest redukowane przez zastosowanie wilgotnego środowiska wokół obszaru zbioru. Ogólnie rzecz biorąc, kampanie przesiewowe w układach krystalicznych w warunkach wysokiej krystalizacji soli dają porównywalny wskaźnik trafień do warunków o niskiej zawartości soli.

Początkowe etapy procesu XChem (badanie tolerancji rozpuszczalników i wstępne badanie) to stosunkowo małe i szybkie eksperymenty, ale pozwalają na jasną decyzję o rozpoczęciu lub odrzuceniu projektu. Najbardziej bolesne jest to, że alternatywne systemy kryształów będą musiały zostać znalezione, jeśli żaden rozpuszczalnik nie jest tolerowany lub wstępne badanie przesiewowe skutkuje bardzo niskim wskaźnikiem trafień. W przeciwieństwie do tego, jeśli się powiedzie, wyniki bezpośrednio informują o warunkach namaczania, które należy wykorzystać w eksperymencie przesiewowym, oraz o najlepszej strategii zbierania danych. Ponieważ jakość danych, a zwłaszcza rozdzielczość, będzie miała wpływ na jakość gęstości elektronów do identyfikacji i analizy trafień, celem jest nasiąkanie w najwyższym możliwym stężeniu związku, które nie ma szkodliwego wpływu na jakość dyfrakcji (przy czym większość zbiorów danych (~80%) ulega dyfrakcji z rozdzielczością 2,8 A lub lepszą).

Proces analizy danych jest usprawniony w XChemExplorer, który opiera się na oprogramowaniu PanDDA do wykrywania słabych spoiw i umożliwia użytkownikom szybką wizualizację i przegląd wyników kampanii przesiewowej. XChemExplorer importuje wyniki przetwarzania danych z pakietów dostępnych w Diamond (DIALS16, autoPROC30, STARANISO31 i Xia214) z limitami rozdzielczości określonymi przez standardową metodę dla każdego pakietu (tj. CC1/2 = 0,3). Domyślnie wybór zestawu danych opiera się na wyniku obliczonym na podstawie I/sigI, kompletności i liczby unikalnych odbić, ale konkretne wyniki przetwarzania można wybrać do użycia zarówno globalnie, jak i dla poszczególnych próbek25. Dane są również wykluczane z analizy przez PanDDA w oparciu o kryteria, takie jak rozdzielczość,brak R i różnica w objętości komórki elementarnej między danymi referencyjnymi i docelowymi (wartości domyślne to odpowiednio 3,5 A, 0,4 i 12%), tak że słabo dyfrakcyjne, źle wyśrodkowane lub błędnie indeksowane kryształy nie wpływają na analizę.

Algorytm PanDDA wykorzystuje znaczną liczbę zestawów danych zebranych podczas kampanii fragmentów w celu wykrycia ligandów częściowego zajęcia, które nie są widoczne na standardowych mapach krystalograficznych. Początkowo PanDDA wykorzystuje dane zebrane podczas testów tolerancji rozpuszczalników i etapów wstępnego badania przesiewowego w celu przygotowania mapy średniej gęstości, która jest następnie wykorzystywana do stworzenia modelu stanu podstawowego. Ponieważ model ten będzie używany we wszystkich kolejnych etapach analizy, ważne jest, aby dokładnie reprezentował niezligandowane białko w warunkach stosowanych do badania przesiewowego fragmentów. Następnie PanDDA wykorzystuje analizę statystyczną do identyfikacji związanych ligandów, generując mapę zdarzeń dla stanu związanego kryształu. Mapa zdarzeń jest generowana przez odjęcie niezwiązanej frakcji kryształu od zestawu danych częściowego zajętości i przedstawia, co można by zaobserwować, gdyby ligand był związany przy pełnym zajęciu. Nawet fragmenty, które wydają się wyraźne na konwencjonalnych mapach 2mFo-DF c , mogą być błędnie modelowane, jeśli nie zapozna się z mapami zdarzeń32. Chociaż PanDDA jest potężną metodą identyfikacji zestawów danych, które różnią się od średnich map (co zwykle wskazuje na wiązanie fragmentów), a metryki, takie jak RSCC, RSZD, współczynnik B i RMSD podczas udoskonalania, są dostarczane z korzyścią dla użytkownika, użytkownik jest ostatecznie odpowiedzialny za podjęcie decyzji, czy obserwowana gęstość dokładnie przedstawia oczekiwany ligand i najbardziej odpowiednią konformację.

Po analizie i udoskonaleniu danych wszyscy użytkownicy mogą jednocześnie deponować wiele struktur w Banku Danych Białkowych (PDB) za pomocą XChemExplorer. Dla każdego ekranu fragmentu wykonywane są dwa grupowe zeznania. Pierwsza depozycja zawiera wszystkie modele związane z fragmentami, ze współczynnikami do obliczania map zdarzeń PanDDA zawartych w plikach MMCIF. Drugie osadzanie dostarcza towarzyszącego modelu stanu podstawowego, wraz ze zmierzonymi współczynnikami struktury wszystkich zestawów danych eksperymentu: dane te mogą być wykorzystane do odtworzenia analizy PanDDA i do opracowania przyszłych algorytmów. Jeśli chodzi o struktury trafień, gdy zajętość fragmentów jest niska, wyrafinowanie jest lepiej prowadzone, jeśli modele są złożeniem struktur stanu podstawowego związanych z ligandem i mylących32; Niemniej jednak praktyka polega na deponowaniu tylko frakcji w stanie ograniczonym, ponieważ pełne modele złożone są na ogół złożone i trudne do interpretacji. W związku z tym niektóre wskaźniki jakości ponownie obliczone przez WPB (w szczególności R/Rfree) są czasami nieznacznie zawyżone. Możliwe jest również dostarczanie wszystkich surowych danych za pomocą platform takich jak Zenodo56, chociaż nie jest to obecnie obsługiwane przez potok XChem.

Ogólnie rzecz biorąc, od czasu uruchomienia w 2016 r. ligandy fragmentaryczne można było zidentyfikować w ponad 95% celów przy użyciu tej procedury. Doświadczenia z wielu projektów wspieranych przez XChem zostały przekształcone w najlepsze praktyki w zakresie przygotowania kryształów33, podczas gdy biblioteka fragmentów została rozwinięta, która wdrożyła koncepcję wspomagania progresji fragmentów29, pomagając również w ustanowieniu praktyki publicznego udostępniania kompozycji bibliotecznych. Platforma pokazała, jak ważna jest dobrze utrzymana infrastruktura i udokumentowane procesy, szczegółowo opisane tutaj, a także umożliwiła ocenę innych bibliotek fragmentów57,58, porównanie bibliotek48 oraz dostarczenie informacji na temat projektu wspólnej biblioteki EUOpenscreen-DRIVE59,60.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca stanowi duży wspólny wysiłek pomiędzy Diamentowym Źródłem Światła i Konsorcjum Genomicznym Struktury. Autorzy chcieliby podziękować różnym grupom wsparcia Diamond i grupie MX za ich wkład w automatyzację linii badawczej i04-1 oraz za zapewnienie usprawnionych potoków gromadzenia i automatycznego przetwarzania danych, które są powszechnie uruchamiane na wszystkich liniach badawczych MX. Chcieliby również podziękować grupie SGC PX za ich wytrwałość, ponieważ byli pierwszymi użytkownikami, którzy przetestowali konfigurację, oraz firmie Evotec za to, że jest pierwszym poważnym użytkownikiem przemysłowym. Prace te były wspierane przez iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansowany z programu Horyzont 2020 Komisji Europejskiej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Biblioteka DSIBiblioteka fragmentówEnamineDSI-896
Seria Echo 550 i 650Akustyczny system dozowaniaBeckman-Coulter
Mikropłytki EchoBeckman-Coulter001-12380; 001-8768; 001-6025Mikropłytki 1536-dołkowe i 384-dołkowe
ShifterOxford Lab TechnologyUrządzenie do pobierania
mikropłytek wirówka z odchylanym wirnikiemSigmamodel 11121wirówka mikropłytkowa
3-kroplowe płytki krystalizacyjneSwissci3W96T-UVPPłytki krystalizacyjne
Formulatrix imager płytek i oprogramowanie RockmakerFormulatrixUrządzenie do obrazowania płytek krystalizacyjnych

Bibliografia

  1. Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: The impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
  2. Jacquemard, C., Kellenberger, E. A bright future for fragment-based drug discovery: what does it hold. Expert Opinion on Drug Discovery. 14 (5), 413-416 (2019).
  3. Jahnke, W., et al. Fragment-to-lead medicinal chemistry publications in 2019. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (24), 15494-15507 (2019).
  4. Li, Q. Application of fragment-based drug discovery to versatile targets. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 180(2020).
  5. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (23), Basel, Switzerland. 4309(2019).
  6. Patel, D., Bauman, J. D., Arnold, E. Advantages of crystallographic fragment screening: functional and mechanistic insights from a powerful platform for efficient drug discovery. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 92-100 (2014).
  7. Wasserman, S., et al. Automated synchrotron crystallography for drug discovery: the LRL-CAT beamline at the APS. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 67 (1), 46-47 (2011).
  8. Hartshorn, M. J. Fragment-based lead discovery using X-ray crystallography. Journal of Medicinal Chemistry. 48 (2), 403-413 (2005).
  9. Arzt, S., et al. Automation of macromolecular crystallography beamlines. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 89 (2), 124-152 (2005).
  10. Beteva, A. High-throughput sample handling and data collection at synchrotrons: Embedding the ESRF into the high-throughput gene-to-structure pipeline. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 62, Pt 10 1162-1169 (2006).
  11. Papp, G., et al. FlexED8: The first member of a fast and flexible sample-changer family for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 10 841-851 (2017).
  12. Casanas, A., et al. EIGER detector: Application in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 72, Pt 9 1036-1048 (2016).
  13. Henrich, B., et al. PILATUS: A single photon counting pixel detector for X-ray applications. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 607 (1), 247-249 (2009).
  14. Winter, G., Lobley, C. M. C., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 69, Pt 7 1260-1273 (2013).
  15. Winter, G., McAuley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
  16. Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 74, Pt 2 85-97 (2018).
  17. Bowler, M. W. MASSIF-1: A beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  18. Von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) - A beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27, Pt 3 844-851 (2020).
  19. Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68, Pt 10 1393-1399 (2012).
  20. Helmholtz Zentrum Berlin. , Available from: https://www.helmholtzberlin.de/forschung/oe/np/gmx/fragment-screening/index_en.html (2021).
  21. Lima, G. M. A., et al. FragMAX: the fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 76 (8), 771-777 (2020).
  22. Ng, J. T., Dekker, C., Kroemer, M., Osborne, M., Von Delft, F. Using textons to rank crystallization droplets by the likely presence of crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 70, Pt 10 2702-2718 (2014).
  23. Collins, P. M., et al. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 246-255 (2017).
  24. Wright, N. D., et al. The low-cost Shifter microscope stage transforms the speed and robustness of protein crystal harvesting. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 77, Pt 1 62-74 (2021).
  25. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 267-278 (2017).
  26. Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123(2017).
  27. Fragalysis. , Available from: https://fragalysis.diamond.ac.uk (2021).
  28. Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Fragment-Screening.html (2021).
  29. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
  30. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, Pt 4 293-302 (2011).
  31. Vonrhein, C., et al. Advances in automated data analysis and processing within autoPROC , combined with improved characterisation, mitigation and visualisation of the anisotropy of diffraction limits using STARANISO. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 74 (1), 360(2018).
  32. Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 265-266 (2017).
  33. Collins, P. M., et al. Achieving a good crystal system for crystallographic x-ray fragment screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
  34. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  35. Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., McAuley, K. E. SynchWeb: a modern interface for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 48, Pt 3 927-932 (2015).
  36. Ginn, H. M., et al. SynchLink: an iOS app for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 47, Pt 5 1781-1783 (2014).
  37. Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Data-Analysis/Reprocessing-in-ISPyB.html (2021).
  38. Wojdyr, M., Keegan, R., Winter, G., Ashton, A. DIMPLE - a pipeline for the rapid generation of difference maps from protein crystals with putatively bound ligands. Acta Crystallographica. Section A, Foundations of Crystallography. 69, 299(2013).
  39. Global Phasing Limited. , Available from: http://www.globalphasing.com (2021).
  40. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 112-122 (2017).
  41. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 65, Pt 10 1074-1080 (2009).
  42. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  43. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  44. Bricogne, G., et al. Buster version 2.10.3. Global Phasing Ltd. , Cambridge, United Kingdom. (2017).
  45. Chen, V. B., et al. MolProbity: All-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 1 12-21 (2010).
  46. Bruno, I. J., et al. Retrieval of crystallographically-derived molecular geometry information. Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 44 (6), 2133-2144 (2004).
  47. Delbart, F., et al. An allosteric binding site of the α7 nicotinic acetylcholine receptor revealed in a humanized acetylcholine-binding protein. TheJournal of Biological Chemistry. 293, 2534-2545 (2018).
  48. Douangamath, A., et al. Crystallographic and electrophilic fragment screening of the SARS-CoV-2 main protease. Nature Communications. 11 (1), 5047(2020).
  49. Guo, J., et al. In crystallo-screening for discovery of human norovirus 3C-like protease inhibitors. Journal of Structural Biology: X. 4, 100031(2020).
  50. Keedy, D. A., et al. An expanded allosteric network in PTP1B by multitemperature crystallography, fragment screening, and covalent tethering. eLife. 7, 36307(2018).
  51. McIntyre, P. J., et al. Characterization of three druggable hot-spots in the aurora-a/tpx2 interaction using biochemical, biophysical, and fragment-based approaches. ACS Chemical Biology. 12 (11), 2906-2914 (2017).
  52. Thomas, S. E., et al. Structure-guided fragmentbased drug discovery at the synchrotron: Screening binding sites and correlations with hotspot mapping. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 377 (2147), 20180422(2019).
  53. Nichols, C., et al. Mining the PDB for tractable cases where x-ray crystallography combined with fragment screens can be used to systematically design protein-protein inhibitors: Two test cases illustrated by IL1β-IL1R and p38α-TAB1 complexes. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (14), 7559-7568 (2020).
  54. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).
  55. Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally diverse compound libraries for crystallographic fragment screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
  56. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org (2021).
  57. Foley, D. J., et al. Synthesis and demonstration of the biological relevance of sp(3) -rich scaffolds distantly related to natural product frameworks. Chemistry. 23 (60), Weinheim an der Bergstrasse. Germany. 15227-15232 (2017).
  58. Kidd, S. L., et al. Demonstration of the utility of DOS-derived fragment libraries for rapid hit derivatisation in a multidirectional fashion. Chemical Science. 11 (39), 10792-10801 (2020).
  59. EU-openscreen ERIC. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/ (2021).
  60. Schuller, M., et al. Fragment binding to the Nsp3 macrodomain of SARS-CoV-2 identified through crystallographic screening and computational docking. bioRxiv. 393405, (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Krystalografia rentgenowskakrystalografia bia ekprojektowanie lek w oparte na fragmentachpozyskiwanie kryszta wzbieranie danychidentyfikacja hit wdopasowanie ligand wbiologia strukturalnaodkrywanie lek w

Powiązane artykuły