Ten artykuł opisuje izolację komórek mysiej zastawki aortalnej za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy. Izolowane komórki zastawki myszy są ważne dla wykonywania różnych testów, takich jak test zwapnienia in vitro, oraz dla badania szlaków molekularnych prowadzących do mineralizacji zastawki aortalnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zwapnienie komórek zastawki aortalnej jest cechą charakterystyczną zwężenia zastawki aortalnej i jest związane ze zwłóknieniem guzka zastawki. Komórki śródmiąższowe zastawki (VIC) odgrywają ważną rolę w procesie zwapnienia w zwężeniu zastawki aortalnej poprzez aktywację ich programu odróżnicowania do komórek podobnych do osteoblastów. Mysie VIC są dobrym narzędziem in vitro do wyjaśnienia szlaków sygnałowych napędzających mineralizację komórki zastawki aortalnej. Opisana tu metoda, z powodzeniem stosowana przez tych autorów, wyjaśnia, w jaki sposób uzyskać świeżo wyizolowane komórki. Przeprowadzono dwuetapową procedurę kolagenazy z dawkami 1 mg/ml i 4,5 mg/ml. Pierwszym krokiem jest usunięcie warstwy komórek śródbłonka i uniknięcie jakiegokolwiek zanieczyszczenia. Druga inkubacja kolagenazy ma na celu ułatwienie migracji VIC z tkanki na płytkę. Ponadto omówiono procedurę barwienia immunofluorescencyjnego w celu charakterystyki fenotypu izolowanych komórek zastawki myszy. Ponadto test zwapnienia przeprowadzono in vitro przy użyciu procedury pomiaru odczynnika wapniowego i barwienia czerwienią alizarynową. Wykorzystanie hodowli pierwotnej komórek zastawki myszy jest niezbędne do testowania nowych celów farmakologicznych w celu zahamowania mineralizacji komórek in vitro.
Wprowadzenie
Zwapniała choroba zastawki aortalnej (CAVD) jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą zastawkową serca w populacjach zachodnich, dotykającą prawie 2,5% osób starszych powyżej 65 roku życia1. CAVD dotyka ponad sześć milionów Amerykanów i jest związana ze zmianami we właściwościach mechanicznych ulotek, które upośledzają normalny przepływ krwi1,2. Obecnie nie ma leczenia farmakologicznego, które zatrzymałoby postęp choroby lub aktywowało regresję mineralną. Jedyną skuteczną terapią w leczeniu CAVD jest chirurgiczna wymiana zastawki aortalnej lub przezcewnikowa wymiana zastawki aortalnej
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Icahn School of Medicine w Mount Sinai institutional core and use committee.
1. Przygotowanie przed izolacją komórek zaworu od dorosłych myszy
- Oczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne pokazane w Rysunek 1A, używając 70% v/v etanolu, a następnie autoklawując je w autoklawie przez 30 minut. Wyczyść miejsce pracy chirurgicznej 70% etanolem.
- Dodać 500 μl penicyliny-streptomycyny do 50 ml 10 mm HEPES. Przygotować porcję 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Utrzymuj roztwory na ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ponieważ zastawki aortalne myszy mają zazwyczaj średnicę 1 mm, w celu zebrania miliona żywych komórek do różnych procedur eksperymentalnych należy połączyć materiał z co najmniej trzech zastawek. Poszczególne etapy procesu izolacji VIC przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2. Ze względu na trudność w mechanicznym zeskrobywaniu tkanki zastawkowej, zaleca się wykorzystanie naprężeń ścinających powstałych podczas wirowania w wortexie w celu usunięcia VEC. Rzeczywiśc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule przedstawiono szczegółowy protokół izolacji komórek zastawki myszy dla hodowli pierwotnej. Trzy zastawki aortalne od 8-tygodniowych myszy połączono w celu uzyskania odpowiedniej liczby komórek. Ponadto protokół ten opisuje charakterystykę fenotypu VIC i test mineralizacji in vitro. Metoda została zaadaptowana z wcześniej opisanego protokołu z Mathieu et al.7.
Podczas izolacji zastawek aortalnych należy zachować ostrożność, aby uniknąć wszelk.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nożyczki do krawędzi tnącej 3 mm | FST | 15000-00 | |
| Anty-alfa mięśnie gładkie Przeciwciało aktynowe | abcam | ||
| Anty-myszy, Alexa Fluor 488 sprzężony | Sygnalizacja komórkowa | 4412 | |
| Zestaw odczynników Arsenazo-III | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | Zestaw do pomiaru stężenia wapnia |
| Nożyczki Bonn | FST | 14184-09 | |
| Wodorotlenek wapnia | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Kolagenaza typu I (125 jednostek/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Bardzo drobne kleszczyki do graefe | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Kleszcze drobnoziarniste | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M roztwór | KOMÓRKI MACIERZYSTE TECHNOLOGIE | ||
| L-Glutamina 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Odczynnik do eliminacji Mykoplazmy |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecylina streptomycyna 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Pirogronian sodu 100 mM | Thermofisher Scientific | ||
| Kleszczyki o standardowym wzorze | Nożyczki chirurgiczne FST | 11000-12 | |
| - Sharp-Blunt | FST | 14008-14 | |
| Trypsyna 0,05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
Bibliografia
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the Amer....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
