Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje izolację komórek mysiej zastawki aortalnej za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy. Izolowane komórki zastawki myszy są ważne dla wykonywania różnych testów, takich jak test zwapnienia in vitro, oraz dla badania szlaków molekularnych prowadzących do mineralizacji zastawki aortalnej.

Streszczenie

Zwapnienie komórek zastawki aortalnej jest cechą charakterystyczną zwężenia zastawki aortalnej i jest związane ze zwłóknieniem guzka zastawki. Komórki śródmiąższowe zastawki (VIC) odgrywają ważną rolę w procesie zwapnienia w zwężeniu zastawki aortalnej poprzez aktywację ich programu odróżnicowania do komórek podobnych do osteoblastów. Mysie VIC są dobrym narzędziem in vitro do wyjaśnienia szlaków sygnałowych napędzających mineralizację komórki zastawki aortalnej. Opisana tu metoda, z powodzeniem stosowana przez tych autorów, wyjaśnia, w jaki sposób uzyskać świeżo wyizolowane komórki. Przeprowadzono dwuetapową procedurę kolagenazy z dawkami 1 mg/ml i 4,5 mg/ml. Pierwszym krokiem jest usunięcie warstwy komórek śródbłonka i uniknięcie jakiegokolwiek zanieczyszczenia. Druga inkubacja kolagenazy ma na celu ułatwienie migracji VIC z tkanki na płytkę. Ponadto omówiono procedurę barwienia immunofluorescencyjnego w celu charakterystyki fenotypu izolowanych komórek zastawki myszy. Ponadto test zwapnienia przeprowadzono in vitro przy użyciu procedury pomiaru odczynnika wapniowego i barwienia czerwienią alizarynową. Wykorzystanie hodowli pierwotnej komórek zastawki myszy jest niezbędne do testowania nowych celów farmakologicznych w celu zahamowania mineralizacji komórek in vitro.

Wprowadzenie

Zwapniała choroba zastawki aortalnej (CAVD) jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą zastawkową serca w populacjach zachodnich, dotykającą prawie 2,5% osób starszych powyżej 65 roku życia¹. CAVD dotyka ponad sześć milionów Amerykanów i jest związana ze zmianami we właściwościach mechanicznych ulotek, które upośledzają normalny przepływ krwi^1,2. Obecnie nie ma leczenia farmakologicznego, które zatrzymałoby postęp choroby lub aktywowało regresję mineralną. Jedyną skuteczną terapią w leczeniu CAVD jest chirurgiczna wymiana zastawki aortalnej lub przezcewnikowa wymiana zastawki aortalnej³. Dlatego konieczne jest zbadanie mechanizmów molekularnych prowadzących do mineralizacji zastawki w celu zidentyfikowania nowych celów farmakologicznych. Rzeczywiście, nieleczone zwężenie zastawki aortalnej ma kilka niekorzystnych konsekwencji, takich jak dysfunkcja lewej komory i niewydolność serca⁴.

Zastawka aortalna składa się z trzech warstw znanych jako fibrosa, spongiosa i ventricularis, które zawierają VIC jako dominujący typ komórek⁵. Włóknienie i komora są pokryte warstwą komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (VEC)⁵. VEC regulują przepuszczalność komórek zapalnych, a także sygnałów parakrynnych. Zwiększone naprężenia mechaniczne mogą wpływać na integralność VEC i zaburzać homeostazę zastawki aortalnej, prowadząc do inwazji komórek zapalnych⁶. Analizy skaningowej mikroskopii elektronowej wykazały przerwanie śródbłonka w ludzkiej zwapniałej zastawce aortalnej⁷.

Analizy histologiczne zwapniałej tkanki ujawniają obecność osteoblastów i osteoklastów. Ponadto zaobserwowano osteogenne różnicowanie VIC zarówno in vitro, jak i w tkance zastawki ludzkiej⁸. Proces ten jest głównie koordynowany przez czynnik transkrypcyjny związany z Runt 2 (Runx2) i białka morfogenetyczne kości (BMPs)^8,9.

Protokół

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Icahn School of Medicine w Mount Sinai institutional core and use committee.

1. Przygotowanie przed izolacją komórek zaworu od dorosłych myszy

1. Oczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne pokazane w Rysunek 1A, używając 70% v/v etanolu, a następnie autoklawując je w autoklawie przez 30 minut. Wyczyść miejsce pracy chirurgicznej 70% etanolem.
2. Dodać 500 μl penicyliny-streptomycyny do 50 ml 10 mm HEPES. Przygotować porcję 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Utrzymuj roztwory na lodzie.
3. Przygotuj roztwory kolagenazy o stężeniu 1 mg/ml i 4,5 mg/ml i użyj 5 ml każdego roztworu w probówkach o pojemności 15 ml do wykonania całej procedury. Aby przygotować 5 ml kolagenazy 1 mg/ml, zmieszaj 5 mg kolagenazy z 2,5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM, wolna od płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i 2,5 ml 10 ml 10 mM HEPES uzupełnionych antybiotykami (1% penicylina-streptomycyna z kroku 1.2). Przefiltruj roztwory przez filtr 0,22 μm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
   UWAGA: Roztwory należy przechowywać na lodzie, aby chronić enzymy.
4. Przed użyciem podgrzać roztwór DMEM do temperatury 37 °C, wykonując wszystkie czynności opisane poniżej. Przygotować kompletną pożywkę, uzupełniając DMEM 1% penicyliny-streptomycyny, 1% pirogronianu sodu, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 1 ml odczynnika do eliminacji mykoplazmy (patrz tabela materiałów) i 10% FBS.

2. Izolacja komórek zaworu

1. Aby uzyskać 10⁶ komórek do eksperymentu, użyj pięciu 8-tygodniowych myszy (minimum trzy). Umieść mysz w komorze indukcyjnej wraz z małym kawałkiem bibuły nasączonej 1 ml izofluranu, ale nie dopuszczaj do kontaktu z tkanką. Aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone; Sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania palców u stóp, a następnie poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Stosować izofluran w celu złagodzenia bólu przed zwichnięciem szyjki macicy, ponieważ procedura opisana poniżej jest nieuleczalna.
2. Umieść mysz na platformie preparacyjnej i przymocuj łapy kaniulami, aby utrzymać ją na miejscu. Oczyść klatkę piersiową i brzuch etanolem; Otwórz brzuch i klatkę piersiową nożyczkami. Małymi nożyczkami chirurgicznymi przeciąć między lewym przedsionkiem a lewą komorą, aby wykrwawić mysz. Perfuzję serca za pomocą 10 ml zimnego 1x PBS, aby usunąć krew z serca.
3. Przetnij serce i zachowaj 3 mm od aorty wstępującej, jak pokazano na rysunku Rysunek 1B. Wypreparuj zastawkę aortalną pod mikroskopem stereoskopowym. Przetnij serce poziomo na środku komór (Rysunek 1C). Przetnij lewą komorę w kierunku aorty i ostrożnie wypreparuj zastawkę aortalną (Rysunek 1D-F). Umieść zawory razem w małym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.
4. Umyj izolowane zastawki w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 75 mm z 5 ml zimnego HEPES (10 mM) uzupełnionego antybiotykami (1% penicyliny-streptomycyny) w celu usunięcia krwi (Rysunek 2). Przygotuj dwie probówki kolagenazy o pojemności 15 ml 1 mg/ml i 4,5 mg/ml zgodnie z powyższym opisem w kroku 1.3.
   UWAGA: Po rozbiorze manipuluj izolowanymi zaworami w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
5. Inkubować zastawki w kolagenazie typu I (1 mg/ml) przez 30 minut w temperaturze 37 °C z ciągłym wytrząsaniem (Rysunek 2). Odwirować probówkę przez 5 minut przy 150 × g, przemyć osad raz 2 ml HEPES (10 mM) i wirować przez 30 s z dużą prędkością. Wlej zawartość tej probówki do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm i ostrożnie przenieś fragmenty tkanki za pomocą cienkiej pęsety do nowej probówki.
   UWAGA: Na tym etapie VIC nadal nie są oddzielone od tkanki, a osad zawiera kawałki tkanki. Aby uniknąć zanieczyszczenia komórkami śródbłonka, nie należy odwirowywać po wirowaniu w kroku 2.5.
6. Inkubować osad w probówce o pojemności 15 ml z 5 ml kolagenazy typu I (4,5 mg/ml) w temperaturze 37 °C w ciągłym mieszaniu przez 35 minut. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml w celu rozdzielenia komórek i odwirować przy 150 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml kompletnego DMEM. Wirować przy 150 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, aby oczyścić komórki.
   UWAGA: Osad nadal będzie zawierał fragmenty tkanek.
8. Ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki i umieścić komórki w jednym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w minimalnej ilości pożywki, aby ułatwić ich przyłączenie do szalki hodowlanej. Pozostaw komórki w spokoju w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla.
9. Po 3 dniach sprawdź komórki pod mikroskopem, aby zweryfikować dobry wzrost w pobliżu resztek tkanki. Gdy 1,000 komórek będzie widocznych pod mikroskopem, ostrożnie usuń resztki tkanki za pomocą autoklawowanej pęsety i zmień pożywkę.
   UWAGA: Płyta nie powinna być naruszona; Jeśli wymagana liczba komórek nie zostanie zaobserwowana, umieść naczynie do hodowli komórkowych z powrotem w inkubatorze na kolejne 2 dni.
10. Gdy komórki zlewają się w 70% (2,5 × 10⁵), trypsynizuj, a następnie przenieś je do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 75 mm.

3. Analiza tożsamości i morfologii komórek

UWAGA: Barwienie immunofluorescencyjne zostało użyte do zbadania morfologii komórek i zanieczyszczenia komórek śródbłonka.

1. Wyczyść okap 70% v/v/ etanolem. Umieść sterylne szkiełka nakrywkowe (22 mm x 22 mm) na płytkach 6-dołkowych.
   UWAGA: Aby wysterylizować szkiełka nakrywkowe, umyj je 70% etanolem i trzymaj w kapturze przez noc w świetle ultrafioletowym.
2. Wysiej 100 000 komórek na dołek na płytce 6-dołkowej. Po 24 godzinach umyj komórki dwukrotnie w 1x PBS i utrwal je w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 minut. Ponownie umyj komórki dwukrotnie za pomocą 1x PBS.
   UWAGA: W tym momencie komórki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C do rozpoczęcia procedury barwienia.
3. Aby zweryfikować czystość VIC, użyj aktyny alfa-mięśni gładkich (αSMA), wimentyny i klastra różnicowania 31 (CD31) w celu wykrycia zanieczyszczenia VEC.
4. Przygotować podwielokrotność buforu blokującego, mieszając 500 μl normalnej surowicy (tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe), 9,5 ml 1x PBS i 30 μl Triton X-100. Inkubować komórki w 2 ml buforu blokującego przez 1 godzinę.
5. Przygotować bufor do rozcieńczania przeciwciał zawierający 30 μl Triton X-100, 10 ml 1x PBS i 0,1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
6. Weź puste pudełko na końcówki, napełnij połowę pudełka wodą, aby stworzyć wilgotną komorę. Przykryj uchwyt końcówki wilgotną chusteczką, a następnie arkuszem parafilmu.
7. Pobrać 1 μl pierwszorzędowego przeciwciała i wymieszać je ze 100 μl buforu rozcieńczającego przygotowanego w kroku 3.5. Umieścić 50 μl rozcieńczonego przeciwciała na parafilmie. Wyjmij szkiełka nakrywkowe z dołków, odwróć je i umieść na kroplach przeciwciała; Inkubować komórki przez noc z przeciwciałem.
8. Dodaj 1 ml PBS do płytki 6-dołkowej. Ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z parafilmu, odwróć je i umieść w studzience. Myć komórki ciągłym delikatnym mieszaniem przez 5 minut. Zastąp PBS nowym PBS; Umyj komórki 3 razy.
9. Inkubować komórki z rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) przez 1 godzinę. Dodać 1 μl przeciwciała drugorzędowego do 500 μl buforu do rozcieńczania przeciwciał (przygotowanego w kroku 3.5). Przykryj talerz folią aluminiową. Umyj komórki 3 razy 1 ml 1x PBS z ciągłym mieszaniem.
10. Na szkiełka nakrywkowe należy zamontować 50 μl pożywki montującej 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) i obserwować komórki pod mikroskopem w celu analizy morfologii komórek i zanieczyszczenia VEC.

4. Test zwapnienia in vitro

1. Wyczyść okap 70% etanolem, ogrzej podłoże DMEM do 37 °C.
2. Wysiewać 100 000 komórek/kondycję na 6-dołkowe płytki w kompletnym DMEM i hodować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
3. Przygotować pożywkę wapniącą, mieszając 2 mM NaH₂PO₄, ^10-7 M insuliny i 50 μg/ml kwasu askorbinowego w DMEM z 5% FBS. Na 93 ml DMEM dodać 5 ml FBS, 1 ml antybiotyków (stężenie końcowe 1%), 1 ml pirogronianu sodu (100 mM), 27,5 mg NaH₂PO_4, 5,8 μl insuliny i 5 mg kwasu askorbinowego.
   UWAGA: Przed użyciem przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm.
4. Po upływie 24 godzin zastąpić pożywkę sklarowaną przez pożywkę wapniejącą. Inkubować komórki przez 7 dni w temperaturze 37 °C. W 3^dniu należy zastąpić je świeżą pożywką wapniącą i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, aby zakończyć 7-dniowe leczenie.
5. Po 7 dniach usuń pożywkę i przemyj komórki dwukrotnie 2 ml 1x PBS. Inkubować komórki w 1 ml 0,6 N kwasu solnego (HCl) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Zebrać HCl do probówki o pojemności 1,5 ml i odparować w wyparce obrotowej. Ponownie zawiesić zawartość wszystkich probówek w 60 μl HCl.
   UWAGA: Procedura suszenia jest ważna, aby stężyć roztwór i uzyskać taką samą objętość dla każdego stanu.
6. Użyj 96-dołkowej płytki do pomiaru stężenia wapnia za pomocą odczynnika Arsenazo III, dostępnego w gotowym do użycia zestawie (więcej szczegółów w Tabeli Materiałów).
7. Przygotować roztwór wzorcowy wapnia o stężeniu 10 mg/dl. Odważyć 10 mg wodorotlenku wapnia (Ca(OH)₂) i rozpuścić w 100 ml wody destylowanej.
8. Na klarownej 96-dołkowej płytce odpipetować 2 μl roztworu próby ślepej (HCl, 0,6 N), roztwór wzorcowy, próbkę na studzienkę (10 mg/dl) i próbki. Przeprowadzić doświadczenie w trzech egzemplarzach, aby sprawdzić zmienność pipetowania. Dodać 200 μl odczynnika dla każdego warunku.
   UWAGA: Próbki powyżej 15 mg/dl należy rozcieńczyć solą fizjologiczną w stosunku 1:1, ponownie oznaczyć, a wynik pomnożyć przez dwa.
9. Inkubować reakcję przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Reakcja jest stabilna przez 60 min.
10. Odczytać i zapisać absorbancję płytki przy długości fali 650 nm. Aby obliczyć ilość wapnia w próbkach, należy użyć następującego wzoru:
    Wapń (mg/ml) = (absorbancja próbki/absorbancja wzorca) × Stężenie wzorca

Wyniki

Ponieważ mysie zastawki aortalne mają zazwyczaj średnicę 1 mm, co najmniej trzy zastawki muszą być połączone, aby zebrać milion żywych komórek do różnych procedur eksperymentalnych. Poszczególne etapy procesu izolacji VIC są pokazane w Rysunek 1 i Rysunek 2. Ponieważ trudno jest ręcznie zeskrobać tkankę zastawki, lepiej jest użyć naprężeń ścinających powstałych w wyniku wirowania w celu usunięcia VEC. Rzeczywiście, wyniki barwienia immunofluorescencyjnego CD31 w...

Dyskusja

W artykule przedstawiono szczegółowy protokół izolacji komórek zastawki myszy dla hodowli pierwotnej. Trzy zastawki aortalne od 8-tygodniowych myszy połączono w celu uzyskania odpowiedniej liczby komórek. Ponadto protokół ten opisuje charakterystykę fenotypu VIC i test mineralizacji in vitro. Metoda została zaadaptowana z wcześniej opisanego protokołu z Mathieu et ^al.7.

Podczas izolacji zastawek aortalnych należy zachować ostrożność, aby uniknąć wszelk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nożyczki do krawędzi tnącej 3 mm	FST	15000-00
Anty-alfa mięśnie gładkie Przeciwciało aktynowe	abcam
Anty-myszy, Alexa Fluor 488 sprzężony	Sygnalizacja komórkowa	4412
Zestaw odczynników Arsenazo-III	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	Zestaw do pomiaru stężenia wapnia
Nożyczki Bonn	FST	14184-09
Wodorotlenek wapnia	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Kolagenaza typu I  (125 jednostek/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Bardzo drobne kleszczyki do graefe	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Kleszcze drobnoziarniste	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M roztwór	KOMÓRKI MACIERZYSTE TECHNOLOGIE
L-Glutamina 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Odczynnik do eliminacji Mykoplazmy
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecylina streptomycyna 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Pirogronian sodu 100 mM	Thermofisher Scientific
Kleszczyki o standardowym wzorze	Nożyczki chirurgiczne FST	11000-12
- Sharp-Blunt	FST	14008-14
Trypsyna 0,05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam