Narzędzia do oceny w czasie rzeczywistym modelu zakażenia Pseudomonas aeruginosa

Podsumowanie

Syntetyczne podłoże do mukowiscydozy (SCFM2) może być używane w połączeniu zarówno z konfokalną laserową mikroskopią skaningową, jak i aktywowanym fluorescencją sortowaniem komórek, aby obserwować agregaty bakteryjne w wysokiej rozdzielczości. W tym artykule szczegółowo opisano metody oceny zagregowanych populacji podczas leczenia przeciwdrobnoustrojowego jako platformę dla przyszłych badań.

Streszczenie

Pseudomonas aeruginosa (Pa) jest jednym z najczęstszych patogenów oportunistycznych związanych z mukowiscydozą (CF). Po ustaleniu kolonizacji Pa duża część infekujących bakterii tworzy biofilmy w plwocinie dróg oddechowych. Wykazano, że biofilmy Pa wyizolowane z plwociny mukowiscydozy rosną w małych, gęstych agregatach ~10-1,000 komórek, które są zorganizowane przestrzennie i wykazują klinicznie istotne fenotypy, takie jak tolerancja na środki przeciwdrobnoustrojowe. Jednym z największych wyzwań związanych z badaniem, w jaki sposób agregaty Pa reagują na zmieniające się środowisko plwociny, jest brak istotnych pod względem odżywczym i solidnych systemów, które sprzyjają tworzeniu się agregatów. Za pomocą syntetycznego podłoża z plwociny CF (SCFM2) można obserwować historię życia agregatów Pa za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) i analizy obrazu w rozdzielczości pojedynczej komórki. Ten system in vitro umożliwia obserwację tysięcy agregatów o różnej wielkości w czasie rzeczywistym, w trzech wymiarach i w skali mikronów. Na poziomie indywidualnym i populacyjnym możliwość grupowania agregatów według fenotypu i położenia ułatwia obserwację agregatów na różnych etapach rozwoju i ich reakcję na zmiany w mikrośrodowisku, takie jak antybiotykoterapia, w celu precyzyjnego różnicowania.

Wprowadzenie

Pseudomonas aeruginosa (Pa) to patogen oportunistyczny, który wywołuje przewlekłe infekcje u osób z niedoborami odporności. W przypadku osób cierpiących na genetyczną chorobę, jaką jest mukowiscydoza (CF), infekcje te mogą trwać przez całe życie. Mukowiscydoza prowadzi do gromadzenia się w drogach oddechowych gętej, bogatej w składniki odżywcze wydzieliny, która z czasem zostaje skolonizowana przez różne patogeny drobnoustrojowe. Pa jest jednym z najczęstszych patogenów występujących w przebiegu mukowiscydozy, kolonizując drogi oddechowe we wczesnym dzieciństwie i wywołując trudne do leczenia infekcje¹. Mimo usprawnienia schematów terapeutycznych w ostatnich latach, Pa nadal stanowi istotny problem kliniczny i jest uważana za wiodącą przyczynę śmiertelności u osób z mukowiscydozą^2,3. Ten fenotyp trwałości oraz rosnąca tolerancja na antybiotyki sprawiły, że Pa znalazła się w grupie patogenów zidentyfikowanych zarówno przez Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC), jak i Światową Organizację Zdrowia (WHO) jako priorytety badawcze w opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych – patogeny ESKAPE⁴.

Podobnie jak w przypadku innych patogenów ESKAPE, nabyta oporność na antybiotyki jest powszechna u Pa, jednak istnieje również wiele właściwości wewnętrznych, które przyczyniają się do tolerancji Pa na środki przeciwdrobnoustrojowe. Wśród nich znajduje się zdolność Pa do tworzenia agregatów – bardzo gęstych skupisk od ~10 do 1 000 komórek, które można zaobserwować w wielu infekcjach, w tym w plwocinie pacjentów z CF^5,6. Podobnie jak Pa badane w innych systemach biofilmowych, agregaty Pa wykazują fenotypy istotne klinicznie, takie jak zwiększona oporność na antybiotyki i aktywacja komunikacji międzykomórkowej (quorum sensing (QS)). Na przykład wykazano, że agregaty Pa wykorzystują zachowania regulowane przez QS do walki z innymi mikroorganizmami, a także do tolerowania leczenia przeciwdrobnoustrojowego, np. poprzez produkcję piocyjaniny⁷. Możliwość badania takich zachowań oferuje przełomowy wgląd w ekosystemy bakteryjne w środowisku zbliżonym do tego, w którym występują one w ludzkim organizmie.

Jednym z największych wyzwań w badaniu odpowiedzi agregatów Pa na zmieniające się środowisko plwociny jest brak odpornych systemów o odpowiedniej wartości odżywczej, które sprzyjałyby tworzeniu się agregatów. Wiele informacji na temat Pa odkryto przy użyciu systemów in vitro, w których komórki rosną planktonicznie lub tworzą charakterystyczną, przytwierdzoną do powierzchni strukturę typu „grzyba”, której nie zaobserwowano in vivo⁸. Chociaż klasyczne modele wzrostu biofilmu, takie jak komory przepływowe czy stały agar, dostarczyły szerokiej i cennej wiedzy na temat zachowań bakteryjnych i mechanizmów tolerancji na antybiotyki, wyniki te nie zawsze przekładają się na warunki in vivo. Wiele modeli in vitro ma ograniczoną zdolność do odwzorowania środowiska wzrostu w miejscu infekcji u ludzi, co wymusza prowadzenie kosztownych badań in vivo. Z kolei wiele modeli in vivo nie zapewnia elastyczności i rozdzielczości, jakie oferują techniki in vitro.

Syntetyczna plwocina z mukowiscydozą (SCFM2) została opracowana w celu zapewnienia środowiska dla wzrostu Pa podobnego do tego, jakie występuje podczas przewlekłej infekcji w płucach osób z mukowiscydozą (CF). SCFM2 zawiera źródła odżywcze zidentyfikowane w wydrukowanej plwocinie CF, a także mucynę, lipidy i DNA. Wzrost Pa w SCFM2 wymaga zestawu genów niemal identycznego z tym, który jest niezbędny do wzrostu w rzeczywistej plwocinie, i wspiera naturalne tworzenie się agregatów Pa^9,10. Po inokulacji komórki planktoniczne tworzą agregaty, które zwiększają swoją wielkość poprzez ekspansję. Pojedyncze komórki (nazywane migrantami) uwalniają się z agregatów, migrują do niezasiedlonych obszarów i tworzą nowe agregaty¹⁰. Taki cykl życiowy można obserwować za pomocą CLSM i analizy obrazu z rozdzielczością pojedynczej komórki. Agregaty Pa tworzone w SCFM2 mają rozmiary zbliżone do tych obserwowanych w płucach z mukowiscydozą¹⁰. Model ten umożliwia obserwację wielu agregatów o różnej wielkości w czasie rzeczywistym i w trzech wymiarach w skali mikronowej. Mikroskopia poklatkowa pozwala na śledzenie tysięcy (~50 000) agregatów w jednym eksperymencie. Zastosowanie oprogramowania do analizy obrazu umożliwia kwantyfikację fenotypów agregatów z mikrofotografii, w tym objętości agregatów, powierzchni oraz ich pozycji w trzech wymiarach z dokładnością do 0,1 μm, zarówno na poziomie pojedynczego agregatu, jak i całej populacji. Możliwość grupowania agregatów według fenotypu i pozycji pozwala na precyzyjne rozróżnienie agregatów na różnych etapach rozwoju, a także na badanie ich odpowiedzi na zmieniające się mikrośrodowisko^6,11.

Zastosowanie SCFM2 do badania Pa agregaty w testach o małej objętości i wysokiej przepustowości czynią go elastycznym i kosztowo efektywnym modelem. Jako zdefiniowane medium, SCFM2 zapewnia jednolitość i powtarzalność w wielu platformach, stanowiąc odpowiednią pod względem żywieniowym i fizycznym metodę badania Pa agregaty in vitro⁹Zastosowania obejmują wykorzystanie tej metody w połączeniu z CLSM w celu obserwacji organizacji przestrzennej i tolerancji na antybiotyki z wysoką rozdzielczością (jak opisano w niniejszym artykule metodycznym). Możliwość przeprowadzania eksperymentów dostarczających danych w czasie rzeczywistym w skali mikronowej pozwala na badanie oddziaływań wewnątrzgatunkowych i międzygatunkowych w sposób, w jaki mogą one występować. in vivoNa przykład SCFM2 był wcześniej wykorzystywany do badania dynamiki przestrzennej komunikacji międzykomórkowej w populacjach agregatów za pomocą sieci systemów wykorzystujących Pa do regulacji wielu genów przyczyniających się do wirulencji i patogenezy⁶.

Rysunek 1: Graficzne przedstawienie głównych etapów eksperymentalnych. (A) Medium SCFM2 zostaje zaszczepione komórkami Pa, którym pozwala się na tworzenie agregatów w naczyniu hodowlanym z dna szklanego. (B) Agregaty są przenoszone do mikroskopu konfokalnego, a następnie dodaje się antybiotyk. Przedstawiono trzy powtórzenia techniczne (komory 1-3) oraz studzienkę kontrolną (4) z zaszczepionym SCFM2 bez zastosowania antybiotyku. Agregaty są obrazowane za pomocą CLSM przez okres 18 h. (C) Po wstępnym obrazowaniu przez 18 h agregaty są traktowane jodkiem propidium w celu wizualizacji martwych komórek i obrazowane przy użyciu CLSM (D) Agregaty o pożądanym fenotypie są oddzielane od SCFM2 za pomocą FACS. Skróty: SCFM2 = syntetyczne medium imitujące plwocinę w mukowiscydozie; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokalna skaningowa mikroskopia laserowa; FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W niniejszej pracy zademonstrowano użyteczność SCFM2 do badania wpływu leczenia antybiotykami na agregaty Pa w czasie rzeczywistym, a następnie zastosowano metodę sortowania komórek w celu izolacji populacji agregatów o odmiennych fenotypach do dalszych analiz (Rysunek 1).

Protokół

1. Przygotowanie syntetycznego medium mukowiskozy (SCFM2)

UWAGA: Przygotowanie SCFM2 składa się z trzech głównych etapów przedstawionych poniżej (Rysunek 2). Pełne szczegóły i bibliografię można znaleźć w źródłach^9,10,12.

Rysunek 2: Przygotowanie i inokulacja medium SCFM2.(A) Baza buforowana jest przygotowywana przy użyciu soli i aminokwasów wymienionych w Tabeli 1 i Tabeli 2. Bazę buforowaną można przechowywać w temperaturze 4 °C do 30 dni, jednak musi być ona chroniona przed wystawieniem na działanie światła. (B) Mucynę i DNA dodaje się do alikwoty bazy buforowanej i rozpuszcza w roztworze przez noc w temperaturze 4 °C. (C) Lipidy oraz dodatkowe zapasy dodaje się do roztworu inkubowanego przez noc i inkubuje w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm przez 20 min. Następnie SCFM2 jest inokulowane przemytymi komórkami w fazie logarytmicznej przy OD₆₀₀ = 0,05. Skróty: SCFM2 = syntetyczne medium imitujące plwocinę w mukowiscydozie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Sterylizacja mucyny wieprzowej
   1. Przygotować sterylną mucynę o końcowym stężeniu 5 mg/mL w SCFM2. Na przykład, dla objętości 5 mL SCFM2, odważyć 25 mg mucyny typu II do sterylnej płytki Petriego i umieścić w sterylizatorze ultrafioletowym (UV) na 4 h, delikatnie mieszając co godzinę.
   2. Po 4 h przenieść mucynę poddaną działaniu UV do autoklawowanych probówek 1,7 mL w warunkach sterylnych i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   3. Aby potwierdzić całkowitą sterylizację, rozpuścić próbkę mucyny w sterylnym płynie, takim jak woda lub pożywka Luria Bertani (LB), i obserwować pod mikroskopem.
      UWAGA: Sterylizowaną mucynę można przechowywać w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy.
2. Przygotowanie bazy buforowanej
   1. Przygotować roztwory zapasowe soli i aminokwasów, dodając odpowiednie ilości wagowo do wody dejonizowanej, zgodnie z listą w Tabeli 1. Wszystkie roztwory zapasowe wysterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,22 μm, owinąć folią w celu ochrony przed degradacją pod wpływem światła i przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego miesiąca.
   2. Przygotować bazę buforowaną, łącząc 190 mL wody dejonizowanej z roztworami zapasowymi aminokwasów i soli w objętościach wymienionych w Tabeli 1. Dostosować pH roztworu do wartości 6,8 i uzupełnić do końcowej objętości 250 mL. Wysterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C do 30 dni.
   3. Wieczorem w dniu poprzedzającym eksperyment, odmierzyć pożądaną ilość bazy buforowanej do szklanej kolby hodowlanej, a następnie dodać mucynę (5 mg/mL zgodnie z opisem w kroku 1.1.1) oraz oczyszczone DNA z nasienia łososia (0,6 mg/mL). Delikatnie wymieszać, owinąć folią i pozostawić w temperaturze 4 °C przez noc, aby mucyna i DNA mogły się rozpuścić.
      UWAGA: Alikwoty DNA z nasienia łososia należy rozmrażać na lodzie, wymieszać w wortexie, a następnie dodać do bazy buforowanej i mucyny. Roztwory zapasowe tryptofanu, asparaginy i tyrozyny muszą być przygotowane w roztworach NaOH (stężenia znajdują się w Tabeli 1) zamiast w wodzie dejonizowanej. Bazę buforowaną i wszystkie roztwory zapasowe należy trzymać owinięte folią, aby chronić je przed ekspozycją na światło. Większość roztworów zapasowych jest stabilna do miesiąca. Roztworów, które zmieniły kolor, nie należy używać i należy je wymienić przed użyciem.
3. Dodawanie dodatkowych roztworów zapasowych
   1. W dniu eksperymentu dodać roztwory zapasowe wymienione w Tabeli 2 do bazy buforowanej zawierającej mucynę i DNA.
      UWAGA: Świeży roztwór FeSO₄ przygotować w dniu eksperymentu, natomiast wszystkie pozostałe roztwory zapasowe można przygotować wcześniej i przechowywać przez 30 dni w temperaturze 4 °C. 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC) zawiera chloroform. Należy obchodzić się z nią ostrożnie i nie używać w pobliżu otwartego ognia. Po dodaniu DOPC inkubować SCFM2 w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (250 rpm) przez co najmniej 20 min (dla kultury 5 mL). Ten czas inkubacji pozwala na odparowanie chloroformu zawartego w DOPC. Kolba nie powinna być szczelnie zamknięta; zamiast tego należy luźno przykryć otwór kolby folią.

2. Ocena tolerancji na środki przeciwdrobnoustrojowe w agregatach bakteryjnych w czasie rzeczywistym

1. Przygotowanie kultur nocnych
   1. Wieczorem, dzień przed eksperymentem, zaszczep 5 mL pożywki LB kilkoma koloniami Pa PAO1-pMRP9-1¹³ z płytki z agarem LB zawierającej antybiotyk (karbenicylina 300 μg/mL). Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu 250 rpm.
      UWAGA: Kultury nocne należy hodować z dodatkiem antybiotyków niezbędnych do selekcji wymaganych plazmidów (w tym przypadku plazmidu ekspresyjnego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), pMRP9-1). Należy pamiętać, że komórki Pa muszą zostać przemyte przed zaszczepieniem do SCFM2. Pożywkę LB w kulturach nocnych można zastąpić innymi bogatymi pożywkami laboratoryjnymi. Wszystkie izolaty bakteryjne powinny być obsługiwane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi BSL-2 przez cały czas trwania protokołu.
2. Zaszczepianie SCFM2
   1. W dniu eksperymentu rozcieńcz kultury nocne Pa w stosunku 1:10 (kultura: pożywka płynna), zaszczepiając 500 μL do 5 mL świeżej pożywki LB. Hoduj komórki do fazy logarytmicznej (60-90 min) w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu 250 rpm.
   2. Odwiruj kultury w fazie logarytmicznej przy 10,000 × g przez 5 min. Przemyj komórki, usuwając supernatant i resuspensując osad w 3 mL filtrowanej, sterylnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS, pH 7.0). Powtórz czynność dwukrotnie, a następnie zresuspenduj osad w końcowej objętości 1 mL PBS.
   3. Zmierz absorbancję przemytych komórek za pomocą spektrofotometru przy 600 nm (OD₆₀₀) i oblicz objętość kultury wymaganą do uzyskania początkowej wartości OD₆₀₀ wynoszącej 0,05 w 5 mL SCFM2. Zaszczep Pa do SCFM2 i delikatnie wymieszaj na wortexie, aby równomiernie rozdzielić komórki. Pipetuj 1 mL zaszczepionego SCFM2 do każdej komory 4-dołkowej szklanej płytki optycznej i inkubuj statycznie przez 4 h w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Czas podwojenia kultur Pa zależy od szczepu oraz dostępności tlenu. W SCFM2, w opisanych tutaj warunkach, czas podwojenia Pa wynosi ~1,4 h¹⁰.

3. Wizualizacja agregatów podczas leczenia antybiotykami za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM)

UWAGA: Ta sekcja opisuje zastosowanie konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego oraz oprogramowania do przechwytywania obrazów w celu obrazowania agregatów Pa w SCFM2. Celem jest obserwacja i charakterystyka pozostałej (tolerancyjnej) biomasy bakteryjnej po zastosowaniu antybiotyków. Przedstawione kroki można z powodzeniem przeprowadzić na innych mikroskopach konfokalnych, choć w celu uzyskania szczegółowych wytycznych należy zapoznać się z instrukcją obsługi urządzenia.

1. Obraz Pa hodowle przy użyciu komory grzewczej lub podgrzewanej mikropłytki zamontowanej na stoliku mikroskopu w celu utrzymania temperatury otoczenia wynoszącej 37 °CRozpocznij Inkubacja moduł co najmniej 2 h przed rozpoczęciem eksperymentu, aby cała aparatura osiągnęła pożądaną temperaturę i ograniczyć dalszą rozszerzalność oraz przemieszczanie się elementów podczas gromadzenia danych.
2. Po 4 h przenieś hodowle w medium SCFM2 zawierające Pa komórki na podgrzewany stolik mikroskopu. Wyznaczyć 3 z 4 studzienek jako powtórzenia techniczne dla obróbki antybiotykiem, a 4.^th a także kontrolę bezlekową, zawierającą jedynie Pa komórki w pożywce SCFM2, bez antybiotyku. Zidentyfikować agregaty za pomocą mikroskopii w polu jasnym w obrębie Zlokalizuj tabelę przed jakąkolwiek eksytacją reporterów fluorescencyjnych. Zdefiniuj obszar obrazowania w każdej studzience i zapisz jego pozycję (współrzędne x-y-z) przy użyciu Stanowiska moduł w oprogramowaniu do obrazowania.
3. Użyj obiektywu imersyjnego 63x w celu wizualizacji Pa kultury zawierające plazmid ekspresyjny GFP pMRP9-1 w pożywce SCFM2 przy długości fali wzbudzenia 488 nm i długości fali emisji 509 nm. Wykonać obrazy, korzystając z opcji z-stack w ramach Akwizycja moduł at 1 μm odstępy (łącznie 60 przekrojów). Należy użyć Uśrednianie linii moduł do redukcji fluorescencji tła w kanale GFP w całkowitej objętości 60 μm obrazy z-stack (1,093,5 mm³). Wykonać obrazy kontrolne niezaszczepionego podłoża SCFM2, stosując identyczne ustawienia, aby określić fluorescencję tła do analizy obrazów.
   UWAGA: Obrazy są pozyskiwane poprzez generowanie macierzy 512 pikseli x 512 pikseli (0.26 μm Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 0.26 μm pikseli) 8-bitowe obrazy z-stack, które są 60 μm od podstawy szkiełka nakrywki.
4. Użyj opcji szeregów czasowych (time series) w oprogramowaniu do obrazowania, aby zarejestrować 60 przekrojów dla każdej pozycji (studzienki) w odstępach 15-minutowych przez okres 18 h. Wykorzystaj funkcję precyzyjnego ustawiania ostrości (definite focus strategy) w oprogramowaniu, aby zapisać płaszczyznę ogniskowania dla każdej pozycji, do której system będzie powracał w każdym punkcie czasowym podczas całego eksperymentu.
5. Po całkowitym czasie inkubacji wynoszącym 4,5 h należy wykonać obrazowanie każdej pozycji przy użyciu powyższych ustawień, aby określić biomasę agregatów w każdej z czterech studni przed dodaniem antybiotyku.
6. Po 6 h całkowitej inkubacji do każdej powtórki należy dodać antybiotyk w stężeniu dwukrotnie niższym niż minimalne stężenie hamujące (MIC). Należy go pipetować bezpośrednio i delikatnie do środka studzienki, tuż poniżej granicy faz powietrze-ciecz. Wszystkie kultury należy utrzymać w podgrzewanej komorze konfokalnej.
   UWAGA: W tym przypadku siarczan kolistyny w stężeniu 140 μg/mL został użyty.
7. Rozpocznij obrazowanie po zastosowaniu antybiotykoterapii, klikając w Rozpocznij eksperyment opcja w programie do obrazowania.
   UWAGA: Stosowana stężenie antybiotyku zależy od rodzaju antybiotyku, a Pa izolację oraz to, czy użytkownik chce zbadać efekty uśmiercania czy tolerancji. W tym eksperymencie stosuje się pojedynczą dawkę. W razie potrzeby można dodać kolejne dawki bez zakłócania kultur.

4. Barwienie agregatów Pa jodkiem propidium

UWAGA: Jodek propidyny (PI) jest powszechnie stosowany jako odczynnik barwiący do identyfikacji nieżywotnych (martwych) komórek bakteryjnych w hodowli. W niniejszym przypadku służy on do identyfikacji agregatów wrażliwych na leczenie antybiotykami zastosowane w sekcji 3. W całym tym protokole ekspresja i detekcja GFP w komórkach Pa służą jako główny wskaźnik żywotności komórek. Ten ostatni krok umożliwia ponowne wykorzystanie obrazowania konfokalnego do określenia przestrzennego rozmieszczenia żywych i martwych agregatów względem siebie. Dodatkowo agregaty są klasyfikowane jako żywe lub martwe w celu dalszego sortowania komórek w sekcji 5.

1. Po 18 h dodać PI do każdej studni czterokomorowej szalki z dnem optycznym zawierającej hodowle w pożywce SCFM2. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi objętości PI i czasu inkubacji (np. ~2 μL na mL hodowli, ~20-30 min).

5. Izolowanie żywych komórek z agregatów przy użyciu metody FACS

UWAGA: FACS stanowi potężną platformę do sortowania i izolowania grup komórek na podstawie fenotypu znakowanego fluorescencyjnie. W tym przypadku FACS jest wykorzystywany do izolowania żywych (tolerujących antybiotyki) agregatów od agregatów nieżywotnych.

1. Po barwieniu jodkiem propidialnym należy wyjąć hodowle z inkubatora i przenieść je do urządzenia FACS w izolowanym termicznie pojemniku w celu utrzymania 37 °C.
2. Przenieś 1 ml aliquotów SCFM2 zawierających agregaty Pa przy najniższym przepływie.
   UWAGA: Każda alikwota będzie zawierać około 15 000 agregatów.
3. Aby wykryć GFP, naświetl komórki laserem o długości fali 488 nm i zarejestruj wysokość sygnału fluorescencji przy 530/30 nm. Barwienie PI zwizualizuj poprzez wzbudzenie laserem o długości fali 561 nm i zarejestruj wysokość sygnału fluorescencji przy 610/20 nm. Sortowanie przeprowadź przy użyciu dyszy 70 $\mu$m.
   UWAGA: Posortowane agregaty można łączyć na wiele sposobów, w zależności od zastosowania przez użytkownika. W tym przypadku do sortowania żywych komórek wykorzystano metodę FACS. Pa agregaty do dalszego sekwencjonowania RNA. Alternatywne zastosowania omówiono poniżej.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Mikroskopia poklatkowa generuje ogromne ilości danych. 18-godzinny eksperyment służący do obserwacji agregatów Pa w SCFM2 pozwala zidentyfikować w czasie ok. 50 000 agregatów, które mogą zostać poddane charakterystyce pod kątem objętości oraz rozmieszczenia przestrzennego. Należy użyć oprogramowania do analizy obrazu w celu ilościowego określenia dynamiki agregatów w SCFM2:

1. W przypadku badań nad agregatami w SCFM2, określ ilość fluorescencji tła GFP, tworząc histogram liczników w kanale GFP dla niezaszczepionego SCFM2 oraz SCFM2 szczepionego szczepem Pa PAO1 zawierającym pMRP9-1. Aby upewnić się, że wykryte woksele GFP korelują z biomasą Pa, zdefiniuj woksel GFP+ jako wartość ≥1,5x wartości licznika tła GFP.
   UWAGA: Fluorescencja tła jest definiowana jako średnia z najwyższych wartości wokseli w trzech losowo wybranych pozycjach. Liczniki tła są, jako standardowa miara, odejmowane od wszystkich pikseli na obrazach eksperymentalnych przez oprogramowanie do analizy obrazu.
2. Po odjęciu tła w module Surpass, wygeneruj izopowierzchnie dla wszystkich pozostałych wokseli.
3. Aby wykryć poszczególne agregaty, włącz opcję Split Objects i zdefiniuj agregaty jako obiekty o objętości ≥5 μm³. Użyj modułu Vantage w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby obliczyć objętość, współrzędne x-y-z oraz sumę wokseli GFP dla każdego poszczególnego obiektu. Wyeksportuj te dane do zewnętrznej platformy statystycznej.
   UWAGA: Niektóre oprogramowania do analizy obrazu umożliwiają jednoczesny eksport wielu ilościowych fenotypów, co pozwala na obliczenie korelacji.
4. Przefiltruj dane wyeksportowane z modułu Vantage według rozmiaru, aby upewnić się, że nie pozostały obiekty o objętości <0,5 µm³ (biomasa rozproszona). Dla każdego poszczególnego obiektu na obrazie oblicz odległość od niego w odniesieniu do innych obiektów (agregatów), korzystając z modułu Vantage oprogramowania do analizy obrazu lub ręcznie za pomocą następującego równania:
   d = sqrt((x₂− x₁)² + (y₂− y₁)² + (z₂− z₁)²) (1)
5. Użyj obliczeń SUM i AVERAGE, aby wyznaczyć całkowitą biomasę i średnią objętość agregatów. Alternatywnie wyeksportuj dane do innych platform statystycznych lub skryptów, np. do analizy rozkładu agregatów w biomasie, jak omówiono w reprezentatywnych wynikach (skrypt nieopublikowany, opracowany we współpracy z laboratorium Whiteleya w Georgia Institute of Technology).

Wyniki

Niniejsza praca szczegółowo opisuje metody obserwacji agregatów Pa w wysokiej rozdzielczości i w środowisku zbliżonym do warunków chronicznej infekcji płuc w CF^9,10,12. SCFM2 stanowi układ in vitro, który sprzyja naturalnej agregacji komórek Pa do rozmiarów zbliżonych do tych obserwowanych podczas rzeczywistej infekcji¹⁰. Możliwość dostosowania SCFM2 jako zdefiniowanej pożywki p...

Dyskusja

W ramach tych prac wprowadzono metodologie, które można łączyć w celu badania zagregowanych populacji bakterii w obecności i bez leczenia antybiotykami. CLSM o wysokiej rozdzielczości umożliwia wizualizację zmian w biomasie kruszywa i orientacji strukturalnej kruszyw w czasie rzeczywistym po wystawieniu na działanie antybiotyków. Ponadto można określić ilościowo cechy fizyczne i strukturalne biomasy, która pozostaje po leczeniu antybiotykami, w celu skorelowania tych obserwacji z przyszłymi badaniami ekspresji genów z wy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aminokwasy
Alanina	Acros Organics	56-41-7
Arginina HCl	MP	1119-34-2
Asparagina	Acros Organics	56-84-8	Przygotowany w 0,5 M NaOH
Cystyna HCl	Alfa Aesar	L06328
Kwas glutaminowy HCl	Acros Organics	138-15-8
Glycine	Acros Organics	56-40-6
Histydyna HCl H2O	Alfa	Aesar A17627
Izoleucyna	Acros Organics	73-32-5
Leucyna	Alfa Aesar	A12311
Lizyna HCl	Alfa Aesar	J62099
Metionina	Acros Organics	63-68-3
Ornityna HCl	Alfa	Aesar A12111
Fenyloalanina	Acros Organics	63-91-2
Prolina	Alfa	Aesar A10199
Seryna	Alfa Aesar	A11179
Treonina	Acros Organics	72-19-5
Tryptofan	Acros Organics	73-22-3	Przygotowany w 0,2 m NaOH
Tyrozyna	Alfa	Aesar A11141	Przygotowany w 1,0 m NaOH
Walina	Acros Organics	72-18-4
Antybiotyk
Karbenicylina	Alfa Aesar	J6194903
Dzień Zapasów
CaCl2 * 2H2O	Fisher Chemical	C79-500
Dekstroza (D-glukoza)	Fisher Chemical	50-99-7
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)	Fisher (Avanti Polar Lipids)	4235-95-4	wstrząsnąć 15-20 min w temperaturze 37 stopni; C do odparowania chloroformu
FeSO4 * 7H2O	Acros Organics	7782-63-0	ten zapas wynosi 1 mg / ml, MUSI zrobić świeży
kwas L-mlekowy	Alfa Aesar	L13242	pH zapas do 7 z NaOH
MgCl2 * 6H2O	Acros Organics	7791-18-6
N-acetyloglukozamina	TCI	A0092
Preparaty
Mucyna wieprzowa	Sigma	M1778-100G	Sterylizacja UV
DNA nasienia łososia	Invitrogen	15632-011
Barwnik
Jodek propidyny	Alfa Aesar	J66764MC
Sole
K2SO4	Alfa Aesar	A13975
KCl	Alfa Aesar	J64189	dodaj ciało stałe bezpośrednio do buforowanej podstawy
KNO3	Acros Organics	7757-79-1
MOPS	Alfa Aesar	A12914	dodaj ciało stałe bezpośrednio do buforowanej bazy
NaCl	Fisher Chemical	S271-500	dodaj ciało stałe bezpośrednio do buforowanej bazy
Na2HPO4	RPI	S23100-500.0
NaH2PO4	RPI	S23120-500.0
NH4Cl	Acros Organics	12125-02-9	dodawać ciało stałe bezpośrednio do buforowanej bazy
Materiały eksploatacyjne
Probówki stożkowe (15 ml)	Olympus plastics	28-101
Probówki stożkowe (50 mL)	Olympus plastics	28-106
Probówki hodowlane z nasadką przepływu powietrza	Olympus plastics	21-129
35 mm czterokomorowe naczynie ze szklanym dnem	CellVis	NC0600518
Rosół Luria Bertani (LB)	Genessee Scientific	11-118
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Odczynniki Fisher	BP2944100
Końcówki do pipet (p200)	Olympus plastics	23-150RL
Końcówki do pipet (p1000)	Olympus plastics	23-165RL
Pipety serologiczne (5 ml)	Olympus plastics	12-102
Pipety serologiczne (25 ml)	Olympus plastics	12-106
Pipety serologiczne (50 ml)	Olympus plastics	12-107
Woda ultraczysta (bez RNaz/DNaz); woda nanoczysta	Genessee Scientific	18-194	Nanoczysta woda używana do przygotowania roztworów w Tabeli 1
Strzykawki (10  ml)Strzykawki	794412 BD
0,22 mm PES	Tworzywa sztuczne Olympus	25-244
PS kuweta semi-mico	Olympus plastics	91-408
Oprogramowanie
Biorender			Aby przygotować figury
FacsDiva6.1.3	Becton Dickinson, San Jose, CA
Imaris	Bitplane		wersja 9.6
Zen Black
Sprzęt
FacsAriallu	Becton Dickinson, San Jose, CA
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy LSM 880	Zeiss

stałe (50 ml)Filtr strzykawkowy 309653