Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Shannon M. Collins; Justin B. Nice; En Hyung Chang; Angela C. Brown

doi:10.3791/62429

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62429

⸱

31 marca 2021

Shannon M. Collins¹ , Justin B. Nice¹ , En Hyung Chang¹ , Angela C. Brown¹

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University

W tym artykule

Podsumowanie

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Streszczenie

Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych składa się z wewnętrznej (cytoplazmatycznej) i zewnętrznej błony (OM), oddzielonych cienką warstwą peptydoglikanu. Podczas wzrostu błona zewnętrzna może błyszczeć, tworząc kuliste pęcherzyki błony zewnętrznej (OMV). Te OMV są zaangażowane w wiele funkcji komórkowych, w tym dostarczanie ładunku do komórek gospodarza i komunikację z komórkami bakteryjnymi. Ostatnio zaczęto badać potencjał terapeutyczny OMV, w tym ich zastosowanie jako szczepionek i nośników leków. Chociaż OMV pochodzą z OM, od dawna zdawano sobie sprawę, że ładunek lipidów i białek OMV różni się, często znacząco, od ładunku OM. Niedawno odkryto dowody na to, że bakterie mogą uwalniać wiele typów OMV i istnieją dowody na to, że rozmiar może wpływać na mechanizm ich wchłaniania przez komórki gospodarza. Badania w tej dziedzinie są jednak ograniczone ze względu na trudności w skutecznym oddzieleniu OMV o niejednorodnych rozmiarach. W tym celu tradycyjnie stosuje się wirowanie w gradionym spadku gęstości (DGC); Jednak ta technika jest czasochłonna i trudna do skalowania. Z drugiej strony, chromatografia wykluczająca ze względu na rozmiar (SEC) jest mniej kłopotliwa i nadaje się do niezbędnego przyszłego zwiększenia skali w celu terapeutycznego zastosowania OMV. W tym miejscu opisujemy podejście SEC, które umożliwia powtarzalne oddzielanie pęcherzyków o niejednorodnych rozmiarach, wykorzystując jako przypadek testowy OMV wytwarzane przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans, których średnica waha się od mniej niż 150 nm do ponad 350 nm. Pokazujemy separację "dużych" (350 nm) OMV i "małych" (<150 nm) OMV, weryfikowaną za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Zalecamy techniki oparte na SEC zamiast technik opartych na DGC do oddzielania pęcherzyków o niejednorodnych rozmiarach ze względu na łatwość użycia, odtwarzalność (w tym między użytkownikami) i możliwość zwiększenia skali.

Wprowadzenie

Bakterie Gram-ujemne uwalniają pęcherzyki pochodzące z ich zewnętrznej błony, tak zwane pęcherzyki błony zewnętrznej (OMB), podczas całego wzrostu. Te OMV odgrywają ważną rolę w komunikacji międzykomórkowej, zarówno między bakteriami a gospodarzem, jak i między komórkami bakteryjnymi, przenosząc szereg ważnych biomolekuł, w tym DNA/RNA, białka, lipidy i peptydoglikany¹^,². W szczególności rola OMV w patogenezie bakteryjnej została szeroko zbadana ze względu na ich wzbogacenie w niektóre czynniki wirulencji i toksyny³^,⁴^,⁵