Artykuł metodologiczny

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

DOI:

10.3791/62429

⸱

31 marca 2021

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych składa się z wewnętrznej (cytoplazmatycznej) i zewnętrznej błony (OM), oddzielonych cienką warstwą peptydoglikanu. Podczas wzrostu błona zewnętrzna może błyszczeć, tworząc kuliste pęcherzyki błony zewnętrznej (OMV). Te OMV są zaangażowane w wiele funkcji komórkowych, w tym dostarczanie ładunku do komórek gospodarza i komunikację z komórkami bakteryjnymi. Ostatnio zaczęto badać potencjał terapeutyczny OMV, w tym ich zastosowanie jako szczepionek i nośników leków. Chociaż OMV pochodzą z OM, od dawna zdawano sobie sprawę, że ładunek lipidów i białek OMV różni się, często znacząco, od ładunku OM. Niedawno odkryto dowody na to, że bakterie mogą uwalniać wiele typów OMV i istnieją dowody na to, że rozmiar może wpływać na mechanizm ich wchłaniania przez komórki gospodarza. Badania w tej dziedzinie są jednak ograniczone ze względu na trudności w skutecznym oddzieleniu OMV o niejednorodnych rozmiarach. W tym celu tradycyjnie stosuje się wirowanie w gradionym spadku gęstości (DGC); Jednak ta technika jest czasochłonna i trudna do skalowania. Z drugiej strony, chromatografia wykluczająca ze względu na rozmiar (SEC) jest mniej kłopotliwa i nadaje się do niezbędnego przyszłego zwiększenia skali w celu terapeutycznego zastosowania OMV. W tym miejscu opisujemy podejście SEC, które umożliwia powtarzalne oddzielanie pęcherzyków o niejednorodnych rozmiarach, wykorzystując jako przypadek testowy OMV wytwarzane przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans, których średnica waha się od mniej niż 150 nm do ponad 350 nm. Pokazujemy separację "dużych" (350 nm) OMV i "małych" (<150 nm) OMV, weryfikowaną za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Zalecamy techniki oparte na SEC zamiast technik opartych na DGC do oddzielania pęcherzyków o niejednorodnych rozmiarach ze względu na łatwość użycia, odtwarzalność (w tym między użytkownikami) i możliwość zwiększenia skali.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie Gram-ujemne uwalniają pęcherzyki pochodzące z ich zewnętrznej błony, tak zwane pęcherzyki błony zewnętrznej (OMB), podczas całego wzrostu. Te OMV odgrywają ważną rolę w komunikacji międzykomórkowej, zarówno między bakteriami a gospodarzem, jak i między komórkami bakteryjnymi, przenosząc szereg ważnych biomolekuł, w tym DNA/RNA, białka, lipidy i peptydoglikany1,2. W szczególności rola OMV w patogenezie bakteryjnej została szeroko zbadana ze względu na ich wzbogacenie w niektóre czynniki wirulencji i toksyny3,4,5,6,7,8,9,10,11.

OMV mają rozmiary od 20 do 450 nm, w zależności od bakterii rodzicielskiej i etapu wzrostu, przy czym kilka typów bakterii uwalnia OMV o niejednorodnych rozmiarach8,12,13,14, które różnią się również składem białka i mechanizmem wnikania do komórek gospodarza12. H. pylori uwalniał OMV o średnicy od 20 do 450 nm, przy czym mniejsze OMV zawierały bardziej jednorodny skład białkowy niż większe OMV. Co ważne, zaobserwowano, że obie populacje OMV są internalizowane przez komórki gospodarza za pomocą różnych mechanizmów12. Ponadto wykazaliśmy, że Aggregatibacter actinomycetemcomitans uwalnia populację małych (<150 nm) OMV wraz z populacją dużych (>350 nm) OMV, przy czym OMV zawierają znaczną ilość wydzielanej toksyny białkowej, leukotoksyny (LtxA)15. Chociaż rola heterogeniczności OMV w procesach komórkowych jest wyraźnie ważna, trudności techniczne w oddzielaniu i analizowaniu różnych populacji pęcherzyków ograniczyły te badania.

Oprócz ich znaczenia w patogenezie bakterii, OMV zostały zaproponowane do wykorzystania w wielu zastosowaniach biotechnologicznych, w tym jako szczepionki i pojazdy dostarczające leki16,17,18,19,20. Do ich translacyjnego zastosowania w takich podejściach wymagane jest czyste i monodyspersyjne przygotowanie pęcherzyków. W związku z tym konieczne są skuteczne i wydajne metody separacji.

Najczęściej, wirowanie gradientu gęstości (DGC) jest używane do oddzielania niejednorodnych populacji pęcherzyków od resztek komórkowych, w tym wici i wydzielanych białek21; metoda została również opisana jako podejście do separacji subpopulacji OMV o niejednorodnych rozmiarach12,13,14. Jednak DGC jest czasochłonny, nieefektywny i bardzo zmienny między użytkownikami22 i dlatego nie jest idealny do skalowania. Natomiast chromatografia wykluczania wielkości (SEC) reprezentuje skalowalne, wydajne i spójne podejście do oczyszczania OMVs21,23,24. Odkryliśmy, że długa (50 cm), grawitacyjna kolumna SEC, wypełniona żelowym medium filtracyjnym, jest wystarczająca do skutecznego oczyszczania i oddzielania subpopulacji OMV. W szczególności zastosowaliśmy to podejście do rozdzielenia OMV A. actinomycetemcomitans na "duże" i "małe" subpopulacje, a także do usunięcia zanieczyszczenia białkami i DNA. Oczyszczanie zakończono w czasie krótszym niż 4 godziny, a także dokonano całkowitego oddzielenia subpopulacji OMV i usunięcia szczątków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie

  1. Aby przygotować bufor płuczący ELISA, dodaj 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl i 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1 l wody dejonizowanej (DI). Dodać 500 μl polisorbatu-20. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą HCl lub NaOH.
  2. Aby przygotować bufor blokujący, dodaj 3,94 g zasady Tris, 8,77 g NaCl i 10 g BSA. Dodać 500 μl polisorbatu-20 do 1 l wody demineralizowanej. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą HCl lub NaOH.
  3. Aby przygotować bufor elucyjny (PBS), dodać 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 do 1 l wody DI. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl lub NaOH.
    UWAGA: W razie potrzeby można przygotować 10-krotny roztwór tego buforu i rozcieńczyć go wodą DI.

2. Przygotowanie próbki OMV

  1. Hoduj komórki A. actinomycetemcomitans do późnej fazy wykładniczej (gęstość optyczna przy 600 nm 0,7). Granulować komórki przez dwukrotne odwirowanie w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,45 μm.
  2. Stężyć wolny od bakterii supernatant za pomocą filtrów odcinających o masie cząsteczkowej 50 kDa. Ultraodwirować stężony roztwór o stężeniu 105 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
  3. Zawiesić osad w PBS i ponownie odwirować (105 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 min.) Zawiesić osad w 2 ml PBS.

3. Pakowanie kolumny S-1000

  1. Wymieszać podstawową butelkę z żelowym medium filtracyjnym ze szklanym prętem mieszającym i wlać do szklanej butelki objętość niezbędną do napełnienia kolumny plus około 50% nadmiaru (około 135 ml). Pozostaw te kulki na miejscu, aż opadną, a następnie zdekantuj nadmiar płynu. Ponownie zawiesić kulki w buforze elucyjnym, tak aby końcowy roztwór składał się w około 70% (objętościowo) żelu, 30% buforu. Odgazuj roztwór w próżni.
  2. Zamontuj szklaną kolumnę pionowo za pomocą stojaka pierścieniowego i napełnij buforem elucyjnym, aby zwilżyć ścianki kolumny. Opróżnij bufor, aż w kolumnie pozostanie tylko około 1 cm buforu.
  3. Nie tworząc bąbelków, ostrożnie wbij koraliki do kolumny, wypełniając kolumnę do góry. Kontynuuj opróżnianie nadmiaru bufora przez cały ten proces. Pamiętaj, aby nie pozwolić, aby koraliki całkowicie opadły przed dodaniem dodatkowych koralików na górze kolumny. Kolumna powinna być upakowana na wysokość około 2 cm poniżej dna zbiornika kolumny.

4. Ładowanie próbki i zbieranie frakcji

  1. Odgazowanie buforu elucyjnego w próżni. Przemyć kolumnę dwiema objętościami kolumny (180 ml) buforu elucyjnego.
  2. Poczekaj, aż pozostały bufor całkowicie wejdzie do kolumny. Gdy bufor dotrze do górnej części warstwy żelu, ostrożnie odpipetować 2 ml próbki zawierającej OMV (o stężeniu lipidów około 100 - 200 nmol/L) na powierzchnię kulek, uważając, aby nie naruszyć żadnego z kulek w górnej części kolumny. Pozwól, aby próbka całkowicie weszła do żelu, to znaczy, gdy żadna ciecz nie pozostaje nad warstwą żelu.
  3. Ostrożnie i powoli dodawać bufor elucyjny na wierzch kolumny żelowej. Nie należy naruszać wierzchniej warstwy żelu, ponieważ spowoduje to rozcieńczenie próbki.
  4. Umieść pojedynczą probówkę o pojemności 50 ml pod kolumną i otwórz kolumnę. Zebrać pierwsze 20 ml eluentu. Dodać dodatkowy bufor elucyjny na górę kolumny, ostrożnie, w razie potrzeby, aby upewnić się, że kolumna nigdy nie jest sucha.
  5. Umieść serię probówek o pojemności 1,5 ml pod kolumną. Uruchomić kolumnę i zebrać serię próbek o pojemności 1 ml w każdej probówce. W miarę pobierania próbek, w razie potrzeby należy kontynuować dodawanie buforu elucyjnego do górnej części kolumny. Powtarzaj, aż zostanie zebranych 96 frakcji. Zatrzymaj kolumnę.
    UWAGA: Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania lub 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania do czasu dalszej analizy.
  6. Aby oczyścić kolumnę, przepuść przez nią jedną objętość kolumny (90 ml) 0,1 M NaOH. Przepuścić przez kolumnę dwie objętości (180 ml) buforu elucyjnego.

5. Przykładowa analiza

  1. Aby zmierzyć stężenie lipidów w każdej frakcji, należy odpipetować 50 μl każdej frakcji do pojedynczego dołka na 96-dołkowej płytce. Do każdej studzienki dodaj 2,5 μl barwnika lipofilowego. Inkubować przez 15 s. Zmierzyć intensywność fluorescencji na czytniku płytkowym o długości fali wzbudzenia 515 nm i długości fali emisji 640 nm. Aby obliczyć frakcję wszystkich lipidów w każdej próbce, zsumuj wszystkie intensywności emisji i podziel każdą poszczególną intensywność przez sumę.
  2. Aby zmierzyć stężenie określonego białka, należy odpipetować 100 μl każdej frakcji do pojedynczego dołka płytki immunologicznej ELISA. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 3 godziny.
    1. Zdekantować próbki. Dodać 200 μl buforu płuczącego ELISA do każdej studzienki i zdekantować. Powtórz cztery razy, w sumie pięć prań.
    2. Dodać 200 μl buforu blokującego do każdego dołka i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C. Zdekantować.
    3. Inkubować płytki ze 100 μl buforu blokującego i przeciwciałem pierwszorzędowym (1:10 000 dla przeciwciała oczyszczonego; 1:10 dla przeciwciała nieoczyszczonego) przez noc w temperaturze 4 °C. Dekantować.
    4. Dodać 200 μl buforu płuczącego ELISA do każdej studzienki i zdekantować. Powtórz cztery razy, w sumie pięć prań.
    5. Dodać 100 μl buforu płuczącego ELISA oraz przeciwciało drugorzędowe (1:30 000) do każdego dołka. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.
    6. Dodać 200 μl buforu płuczącego ELISA do każdej studzienki i zdekantować. Powtórz cztery razy, w sumie pięć prań.
    7. Dodać 100 μl jednoetapowego roztworu 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) i inkubować przez 15-30 minut lub do momentu uzyskania niebieskiego koloru. Zatrzymać reakcję TMB za pomocą 50 μl roztworu zatrzymującego.
    8. Na czytniku płytkowym odczytaj absorbancję każdej studzienki przy długości fali 450 nm.
  3. Aby zmierzyć całkowite stężenie białka, należy zapisać absorbancję każdej frakcji przy długości fali 280 nm (A280) za pomocą spektrofotometru UV-vis.

Schemat protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat procedury SEC. Kolumnę wypełnia się ostrożnie odgazowanym żelowym medium filtracyjnym, aby uniknąć pęcherzyków i nieciągłości, a następnie przemywać dwiema objętościami buforu elucyjnego w kolumnie. Następnie próbkę ostrożnie pipetuje się na wierzch żelu, nie przerywając wypełniania żelu. Kolumnę otwiera się i pracuje tak długo, aż próbka całkowicie dostanie się do żelu. W tym momencie bufor umieszcza się na górze kolumny i zbiera się pierwsze 20 ml eluatu. Następnie pobiera się serię frakcji o pojemności 1 ml. Frakcje te są następnie umieszczane na 96-dołkowej płytce lub 96-dołkowej płytce immunologicznej w celu analizy zawartości lipidów i białek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne wyniki tej metody. OMV wytworzone przez szczep JP2 A. actinomycetemcomitans zostały najpierw oczyszczone z supernatantu hodowli za pomocą ultrawirowania15. Wcześniej odkryliśmy, że ten szczep wytwarza dwie populacje OMV, jedną o średnicy około 300 nm, a drugą o średnicy około 100 nm15. Aby oddzielić te populacje OMV, oczyściliśmy próbkę przy użyciu protokołu SEC opisanego powyżej. Każda frakcja była a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiliśmy protokół prostego, szybkiego i powtarzalnego oddzielania subpopulacji bakteryjnych OMV. Chociaż technika ta jest stosunkowo prosta, istnieją pewne kroki, które należy wykonać bardzo ostrożnie, aby zapewnić skuteczną separację w kolumnie. Po pierwsze, ważne jest, aby żel był ładowany do kolumny ostrożnie i powoli, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Zaobserwowaliśmy, że pozostawienie żelu w temperaturze pokojowej na kilka godzin przed załadowaniem kolumny pozwala żelowi zrównoważyć się i minim...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez National Science Foundation (1554417) i National Institutes of Health (DE027769).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-stopniowe filtry Ultra TMB-ELISAThermo Scientific34028
Amicon 50 kDaMillipore SigmaUFC905024
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP9704-100
Płytki immunologiczne ELISAThermo Scientific442404
FM 4-64Thermo ScientificT133201,5 x 50 cm
Szklany czytnik płytek Econo-ColumnBioRad7371552
Infinite 200 Pro Tecan
Chlorek potasu (KCl)Amresco (VWR)0395-500G
Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny (KH2PO4)Amresco (VWR)0781-500G
Sephacryl S-1000 SuperfineGE Healthcare17-0476-01
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ChemicalS271-3
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (Na2HPO4)Amresco (VWR)0404-500G
Tris BaseVWR0497-1KG
Tween(R) 20Acros Organics23336-2500

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
  3. Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
  4. Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414(2018).
  5. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
  6. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
  7. Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
  8. Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
  9. Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
  10. Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
  11. Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
  12. Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466(2018).
  13. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209(2019).
  14. Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
  15. Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414(2018).
  16. Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
  17. Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
  18. Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
  19. Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
  20. Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
  21. Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).
  22. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  23. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297(2017).
  24. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  25. Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
  26. Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
  27. Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
  28. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).
  29. Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

P cherzyki b ony zewn trznejheterogeniczno p cherzyk w bakteryjnychdynamiczne rozpraszanie wiat awirowanie w gradiencie g sto ciseparacja p cherzyk wanaliza ELISAilo ciowe oznaczanie bia ekpomiar lipid wledzenie cz stek

Powiązane artykuły