Artykuł metodologiczny

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/62431

⸱

19 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Mycology Research Center, Chiba University, 2Marine Works Japan Ltd.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemiczne utrwalanie zostało użyte do obserwacji ultrastruktury komórek i tkanek. Jednak metoda ta nie zachowuje odpowiednio ultrastruktury komórek; Zwykle obserwuje się artefakty i ekstrakcję zawartości komórek. Szybkie zamrażanie jest lepszą alternatywą dla zachowania struktury komórkowej. Zamrażanie kanapkowe żywych drożdży lub bakterii, a następnie substytucja przez zamrożenie zostało wykorzystane do obserwacji wyjątkowej naturalnej ultrastruktury komórek. Ostatnio zamrażanie kanapkowe komórek hodowlanych lub tkanek ludzkich utrwalonych aldehydem glutarowym zostało również wykorzystane do ujawnienia ultrastruktury komórek i tkanek.

Te badania były do tej pory przeprowadzane za pomocą ręcznie robionego urządzenia do zamrażania kanapek, a zastosowania do badań w innych laboratoriach były ograniczone. Niedawno wyprodukowano nowe urządzenie do zamrażania kanapek, które jest już dostępne na rynku. W niniejszej pracy pokazano, jak wykorzystać urządzenie do zamrażania kanapkowego do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, komórek hodowlanych, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazano również przygotowanie próbek do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu oraz procedury zamrażania-substytucji, zatapiania żywicy, przycinania bloków, cięcia ultracienkich odcinków, odzyskiwania skrawków, barwienia i pokrywania siatek foliami nośnymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia elektronowa to potężne narzędzie do badania ultrastruktury komórek. Utrwalanie chemiczne za pomocą konwencjonalnych procedur odwadniania zostało wykorzystane do obserwacji ultrastruktury komórek i tkanek. Jednak metoda ta nie zachowuje odpowiednio ultrastruktury komórek, a zwykle obserwuje się artefakty i ekstrakcję zawartości komórek. Szybkie zamrażanie i substytucja komórek i tkanek przez zamrożenie są lepszą alternatywą dla zachowania struktury komórkowej.

Trzy główne metody zostały zastosowane do szybkiego zamrażania komórek1: 1) zamrażanie wgłębne odbywa się poprzez zanurzanie próbek w schłodzonym kriogenie, takim jak propan, i było używane od wczesnych lat 50-tych2; 2) Zamrażanie zimnych bloków metalowych odbywa się poprzez szybkie uderzanie komórek i tkanek o metalowy blok chłodzony ciekłym azotem lub ciekłym helem3,4; oraz 3) Zamrażanie wysokociśnieniowe odbywa się poprzez zamrażanie komórek i tkanek ciekłym azotem pod wysokim ciśnieniem5,6,7.

Zamrażanie kanapkowe to rodzaj zamrażania metodą zanurzania, która polega na umieszczeniu cienkich materiałów biologicznych między dwoma miedzianymi dyskami i szybkim zamrożeniu ich poprzez zanurzenie w ciekłym propanie8,9,10. W tej metodzie bardzo cienkie próbki (o grubości kilku mikrometrów) są szybko schładzane kriogenem przy użyciu metalu, który ma dobrą przewodność cieplną z obu stron. W ten sposób metoda ta skutecznie usuwa ciepło z próbek, umożliwiając stabilne zamrażanie komórek bez uszkodzenia kryształków lodu. Zamrożenie kanapkowe, a następnie podstawienie żywych komórek drożdży i bakterii przez zamrożenie, ujawnia naturalną ultrastrukturę komórek10,11,12,13,14,15,16.

Ostatnio ta metoda okazała się przydatna do zachowania przejrzystych obrazów komórek mikroorganizmów utrwalonych aldehydem glutarowym17,18,19,20,21,22,23,24, hodowla komórek25,26,27, oraz ludzkie komórki i tkanki1,28. Chociaż badania te zostały przeprowadzone przy użyciu ręcznie robionego urządzenia do zamrażania kanapek29, a zastosowania do innych badań w innych laboratoriach zostały ograniczone, wyprodukowano nowe urządzenie do zamrażania kanapek (SFD)28 i jest już dostępne na rynku.

Niniejszy artykuł pokazuje, jak używać SFD do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazano również przygotowanie próbek do ultracienkiego przekroju po szybkim zamrożeniu, a także procedury zamrażania i substytucji, zatapiania żywicy, przycinania bloków, cięcia ultracienkich odcinków, odzyskiwania skrawków, barwienia i pokrywania siatek foliami nośnymi.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Protokół badania dla próbek ludzkich został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Biomedycznych Wyższej Szkoły Medycznej Uniwersytetu Chiba (3085). Tetrtlenek osmu jest niebezpieczną substancją chemiczną; Należy obchodzić się z nim w rękawicach w okapie. Rysunek 1 przedstawia urządzenie do zamrażania kanapek i niezbędne narzędzia28. Rysunek 2 pokazuje materiały niezbędne do przeprowadzenia eksperymentów z zamrażaniem kanapek. Szklane fiolki są napełniane acetonem zawierającym tetratlenek osmu i przechowywane w temperaturze -80°C do momentu użycia (Rysunek 2B). Miedziane krążki mają średnicę 3 mm, nie mają otworów, mają literę po jednej stronie i są dostępne w handlu (Rysunek 2C).

1. Szybkie zamrażanie zawiesin komórkowych w celu zamrożenia-substytucji

UWAGA: Cała procedura jest pokazana w Rysunek 3.

  1. Komórek
    1. Użyj zawiesin komórkowych bakterii, drożdży (Rysunek 2A), komórek hodowlanych i izolowanych komórek do zamrażania kanapek.
      UWAGA: Można używać zarówno żywych, jak i utrwalonych w aldehydzie glutarowym komórek28.
  2. Przygotowanie ciekłego propanu
    UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy używać rękawic kriogenicznych i okularów ochronnych. Ponieważ propan jest wybuchowy, należy uważać, aby nie używać ognia w tym samym pomieszczeniu, a okna powinny być otwarte.
    1. Napełnij pojemnik z ciekłym azotem SFD ciekłym azotem (Rysunek 4A). Napełnij pojemnik na płynny propan ciekłym propanem, wprowadzając gaz propan za pomocą drobnej dyszy (Rysunek 4B, C). Przyspiesz krzepnięcie propanu za pomocą chłodzonego metalowego pręta (Rysunek 1 i Rysunek 4D,E).
  3. Przygotowanie krążków miedzianych
    1. Umieść miedziane krążki na szkle szkiełkowym stroną bez liter do góry (Rysunek 2D) i traktuj wyładowaniem jarzeniowym o napięciu 10 Pa, 400 woltów, 1 mA przez 30 s (Rysunek 4F,G), aby powierzchnia dysku była hydrofilowa za pomocą aparatu do rozpylania jonów30.
  4. Przekładanie i zamrażanie wgłębne zawiesiny komórek
    1. Przenieś zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml (Rysunek 5A) i wiruj przy 2,900 × g przez 10 s w temperaturze pokojowej (Rysunek 5B,C). Usunąć supernatant i zawiesić osad w celu uzyskania gęstej zawiesiny (patrz omówienie).
    2. Umieść niewielką ilość zawiesiny komórek (~0,02 μL) na miedzianym krążku (Rysunek 5D-F), przykryj go innym miedzianym krążkiem (Rysunek 5G) i podnieś krążki pęsetą (Rysunek 5H).
      UWAGA: Aby zmierzyć ~0,02 μl zawiesiny komórek, obserwuj 0,1 μl kropli zawiesiny pod mikroskopem stereoskopowym i podziel je na kropelki, które stanowią 1/5 tej objętości.
    3. Zrób studzienkę w środku stałego propanu za pomocą cienkiego metalowego pręta (Rysunek 5I). Umieść pęsetę w SFD i szybko ją zamroź, naciskając przycisk wstrzykiwania aparatu (Rysunek 5J,K).
      UWAGA: Należy uważać, aby nie wysuszyć próbek i nie położyć dwóch krążków całkowicie jeden na drugim (w przeciwnym razie ich odłączenie stanie się bardzo trudne w następnym kroku).
  5. Przekładanie i zamrażanie wgłębne tkanek zwierzęcych i ludzkich
    1. Użyj tkanek zwierzęcych i ludzkich (~0,5 mm x 0,5 mm x 1,5 mm) utrwalonych w 2,5% buforze fosforanowym aldehydu glutarowego-0,1 M (pH 7,4) (Rysunek 6A,B). Pokrój je na odcinki o grubości od 0,1 do 0,2 mm za pomocą żyletki pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 6C,D).
      1. Umieść małą kroplę (~0,02 μL) roztworu aldehydu glutarowego na miedzianym krążku (Rysunek 6E, F). Następnie za pomocą pęsety umieść kawałek tkanki w aldehydzie glutarowym na miedzianym krążku ( Rysunek 6G, H) i przykryj go innym miedzianym krążkiem ( Rysunek 6I-K).
      2. Szybko zamrozić krążki z tkankami w topiącym się propanu SFD, jak opisano w sekcji 1.4 (Rysunek 5J,K).
        UWAGA: Ponieważ aldehyd glutarowy jest niebezpieczną substancją chemiczną, należy obchodzić się z nim w rękawiczkach pod wyciągiem. Chusteczki nie powinny być myte po umieszczeniu na miedzianym krążku, ale trzymane w roztworze aldehydu glutarowego, ponieważ aldehyd glutarowy ma działanie zapobiegające zamarzaniu1.
  6. Zamrażanie i substytucja acetonem osmu
    1. Przenieś dyski do ciekłego azotu w kąpieli roboczej (Rysunek 7A,B). Używając pęsety schłodzonej ciekłym azotem, odłącz dyski od siebie, aby odsłonić próbkę (Rysunek 7C-E).
    2. Umieść krążki z komórkami w szklanej fiolce (Rysunek 7F) wypełnionej 1 ml acetonu zawierającego 2% tetratlenku osmu (Rysunek 2B), która została umieszczona w ciekłym azocie i zestalona (Rysunek 4H).
    3. Przenieś dyski do głębokiej zamrażarki i przechowuj je w temperaturze -80°C przez 2-4 dni w celu zamrożenia komórek (Rysunek 3). Namocz zużytą pęsetę w wodzie o temperaturze pokojowej, aby je ogrzać (Rysunek 7G) w celu zamrożenia następujących próbek.
      UWAGA: Pęseta do obchodzenia się z próbką powinna być ciepła (temperatura pokojowa), ponieważ zimna pęseta może zamrozić próbkę przed szybkim zamrożeniem, prowadząc do tworzenia się kryształków lodu.
  7. Podgrzewanie i osadzanie próbki
    1. Stopniowo doprowadzaj próbki do temperatury pokojowej (2 godziny w temperaturze -20°C, 2 godziny w temperaturze 4°C i 15 minut w temperaturze pokojowej, Rysunek 3 i Rysunek 8A) i przenieś krążki do plastikowych probówek o pojemności 2 ml wypełnionych 1 ml acetonu (Rysunek 3 i Rysunek 8B,C).
    2. Przygotuj żywicę epoksydową, mieszając odczynniki w jednorazowym plastikowym pojemniku za pomocą mieszadła (Rysunek 8D-F).
    3. Aceton w kroku 1.7.1 wymieniać kolejno na 30% żywicy (w acetonie), 60% żywicy i 90% żywicy w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę każde. Następnie wymień 90% żywicę na 100% żywicę w temperaturze 37°C przez noc. Na koniec zanurz próbki w 100% żywicy (Rysunek 8G-J) w formie do zatapiania krzemu i polimeryzuj je w temperaturze 60 ° C przez 24 godziny (Rysunek 3).
      UWAGA: Próbki powinny pozostać przymocowane do miedzianych krążków przez cały czas trwania procedury (aby ułatwić cięcie). Nie zaleca się stosowania aparatu obrotowego lub wytrząsającego podczas procesu zatapiania, ponieważ w niewielkim stopniu przyczyniają się one do przenikania żywicy do komórki. Co więcej, wibracje z aparatu czasami powodują odklejanie się próbek od miedzianych dysków. Inkubacja w temperaturze 37°C przez noc przyspieszyłaby przenikanie żywicy do ogniwa pod wpływem energii cieplnej (żywica nie polimeryzowałaby się, ponieważ nie zawiera żadnego akceleratora).
  8. Przycinanie bloków próbek
    1. Wyjmij spolimeryzowane bloki z silikonowych form do zatapiania (Rysunek 9A). Napisz numer próbki na bloku (Rysunek 9B).
    2. Usuń miedziane krążki z bloku za pomocą żyletki (Rysunek 9C,D) i przytnij próbki osadzone na powierzchni bloku do 0,7 mm x 0,7 mm za pomocą ultradźwiękowego ostrza do przycinania (Rysunek 9E) i żyletki (Rysunek 9F-H) pod mikroskopem stereoskopowym31.
    3. Umieść blok w uchwycie na próbki ultramikrotomu (Rysunek 9I) i gładko wytnij powierzchnię bloku za pomocą diamentowego noża do przycinania (Rysunek 9J,K).
  9. Cięcie ultracienkich odcinków
    1. Usuń blok z ultramikrotomu (Rysunek 10A)31, umieść go w mikroskopie stereoskopowym i przytnij go dalej do 0,2 mm x 0,3 mm za pomocą żyletki (Rysunek 10B,C).
    2. Nałóż neopren na kratki, aby były przyczepne (Rysunek 10D). Umieść blok z powrotem na ultramikrotomie, przykryj ultramikrotom plastikową osłoną (Rysunek 10E)31 i wytnij odcinki o grubości 50-70 nm (Rysunek 10F-H).
    3. Odzyskaj sekcje za pomocą pętli (Rysunek 10I), zamontuj je na miedzianych kratkach o siatce 300 lub 400 potraktowanych neoprenem i wysusz je (Rysunek 10J).
  10. Barwienie przekrojów i obserwacja pod mikroskopem elektronowym
    1. Ustaw siatki z sekcjami w rowku połówki rurki silikonowej (Rysunek 11A)31, i namocz w roztworze octanu uranylu i cytrynianu ołowiu przez 3 minuty każdy w celu barwienia (Rysunek 11B-E)32.
    2. W przypadku próbek drożdży i grzybów umieść siatki na bibule filtracyjnej (4 mm x 4 mm), podnieś je pęsetą i przykryj plazmowo polimeryzowaną folią naftalenową 33 na powierzchni wody (Rysunek 11F,G). Włóż siatki do mikroskopu elektronowego i obserwuj pod napięciem 100 kV (Rysunek 11H,I).

2. Szybkie zamrażanie wirusów i makrocząsteczek

  1. Przygotowanie ciekłego etanu
    UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy używać rękawic kriogenicznych i okularów ochronnych. Ponieważ etan jest materiałem wybuchowym, należy uważać, aby nie palić ognia w tym samym pomieszczeniu, a okna powinny być otwarte. Etan jest używany, ponieważ odparowuje w mikroskopie elektronowym, podczas gdy propan nie.
    1. Napełnij pojemnik z ciekłym azotem SFD ciekłym azotem. Napełnij pojemnik ciekłym etanem ciekłym etanem, wprowadzając etan przez cienką dyszę.
  2. Przygotowanie i szybkie zamrażanie mikrosiatek i próbek
    1. Spraw, aby obie powierzchnie mikrosieci były hydrofilowe, traktując je wyładowaniem jarzeniowym (10 Pa, 400 V, 1 mA) za pomocą aparatu do rozpylania jonowego30.
    2. Umieść mikrosiatkę w SFD i nałóż 2 μl wirusa lub zawiesiny wielkocząsteczkowej (1 mg białka/ml) na mikrosiatki. Usunąć nadmiar płynu za pomocą bibuły filtracyjnej i szybko zamrozić mikrosiatkę, naciskając przycisk wstrzykiwania aparatu.
  3. Umieszczenie zamrożonej mikrosieci w uchwycie do kriotransferu i obserwacja pod mikroskopem elektronowym
    1. Przenieś zamrożone mikrosiatki w ciekłym azocie, umieść je wcześniej w uchwycie do kriotransferu schłodzonym temperaturą ciekłego azotu i obserwuj pod mikroskopem elektronowym w niskiej temperaturze34.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywe komórki mikroorganizmów w zawiesinie zostały zebrane przez wirowanie, umieszczone między dwoma miedzianymi dyskami, szybko zamrożone za pomocą SFD, podstawione przez zamrożenie, zatopione w żywicy epoksydowej, ultracienko przecięte, barwione i obserwowane pod mikroskopem elektronowym, postępując zgodnie z procedurami opisanymi powyżej. Rysunek 12 pokazuje ultracienkie przekroje Escherichia coli (bakterie, Rysunek 12A,B)16 i Saccharomyces cerevisiae (drożdże, Rysunek 12C)15. Zwróć uwagę, że obrazy są bardzo wyraźne i pokazują naturalną morfologię.

Zawiesiny komórek hodowanych i izolowanych komórek zwierzęcych utrwalone aldehydem glutarowym zostały zebrane i szybko zamrożone za pomocą SFD, podstawione przez zamrożenie i obserwowane pod mikroskopem elektronowym, postępując zgodnie z procedurami opisanymi powyżej. Rysunek 13 pokazuje ultracienkie odcinki hodowanych komórek (Rysunek 13A-C)1,28 i wyizolowane komórki z jamy brzusznej myszy (Rysunek 13D)28. Rysunek 14 przedstawia ultracienkie fragmenty ludzkiej skóry (Rycina 14A-D) i kożuchy (Rysunek 14E)1. Zwróć uwagę, że obrazy są również bardzo wyraźne i pokazują naturalną morfologię. Rysunek 15 pokazuje cząsteczki rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B szybko zamrożone za pomocą SFD i obserwowane przez mikroskopię krioelektronową34. Podobnie jak w przypadku innych komórek, obrazy są bardzo wyraźne i pokazują naturalną morfologię.

figure-results-1
Rysunek 1: Urządzenie do zamrażania kanapek28 i niezbędne narzędzia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Materiały niezbędne do przeprowadzenia eksperymentów z zamrażaniem kanapek. (A) Próbka: Mikrofotografia świetlna drożdży Saccharomyces cerevisiae. Podziałka = 10 μm. (B) Fiolki szklane (10 ml) zawierające 1 ml acetonu z 2% tetratlenkiem osmu. (C) Miedziane dyski pokazujące powierzchnię bez litery (po lewej) oraz powierzchnię z literą (po prawej). Podziałka = 3 mm. Skaningowa mikroskopia elektronowa. (D) Krążki miedziane bez liter do góry umieszczone były na szkiełku podstawowym z obustronną taśmą klejącą (*). Podziałka = 3 mm. (E) Maszynka do golenia obosieczna i maszynka do golenia z łamaną maszynką do krojenia tkanek zwierzęcych i ludzkich, maszynka do golenia z jedną krawędzią do przycinania bloków oraz rozdrobniona deska do krojenia tkanek zwierzęcych i ludzkich. (F) Pęseta z ekstrudowaną pianką polistyrenową chroniąca palce przed zimnem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przygotowanie próbek zawiesin komórkowych metodą zamrażania kanapkowego. Skróty: r.t. = temperatura pokojowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przygotowanie ciekłego propanu, miedzianych krążków i utrwalacza. (A) Ciekły azot (strzałka) został wlany do pojemnika z ciekłym azotem urządzenia do zamrażania kanapek. (B) Gaz propan został wprowadzony do pojemnika z ciekłym propanem przez cienką dyszę. (C) Ciekły propan (strzałka). (D) Metalowy pręt (strzałka) był używany do chłodzenia ciekłego propanu w celu przyspieszenia krzepnięcia ciekłego propanu. (E) Zestalony propan (strzałka). (F) Napylacz jonowy (strzałka) do nadawania dyskom miedzianym hydrofilowości z wyładowaniem jarzeniowym. (G) Wyładowanie jarzeniowe. (H) Szklane fiolki umieszczone w ciekłym azocie w łaźni roboczej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Szybkie zamrażanie zawiesiny komórek (drożdży) za pomocą urządzenia do zamrażania kanapek. (A) Przeniesienie kultury drożdży do probówki wirówkowej. b) Mikrowirówka. (C) Osad Saccharomyces cerevisiae w probówce wirówkowej (strzałka). (D) Przeniesienie próbki za pomocą mikropipety z probówki wirówkowej. (E) Umieszczenie próbki na miedzianym dysku. (F) Mała kropla próbki na miedzianym dysku (strzałka). (G) Przykrycie próbki innym miedzianym dyskiem. (H) Zebranie dwóch krążków pęsetą. (I) Wykonanie studni w stałym propanu za pomocą cienkiego metalowego pręta. (J) Zamrażanie próbki metodą wgłębną poprzez naciśnięcie przycisku wstrzykiwania. (K) Zamrożenie zostało zakończone. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Przygotowanie próbki tkanek ludzkich (skóry). (A, B) Ludzka tkanka skórna utrwalona w aldehydzie glutarowym na szalce Petriego. Podziałka = 5 mm. (C, D) Tkanki (strzałka) zostały pokrojone za pomocą dwóch obosiecznych brzytwy na rozdrobnionej desce. (E, F) Małą kroplę roztworu aldehydu glutarowego (strzałkę) umieszczono na miedzianym krążku. (G, H) Kawałek tkanki skórnej umieszczono na miedzianym krążku za pomocą pęsety. (I) Drugi dysk został użyty do pokrycia miedzianego dysku tkanką skórną. (J) Umieszczone w kanapce krążki były zbierane pęsetą. (K) Uduszone dyski delikatnie przytrzymywano pęsetą. Zwróć uwagę na zachowaną przerwę między końcówkami pęsety (strzałka), aby uniknąć zmiażdżenia tkanek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Przeniesienie próbki do ciekłego azotu i odłączenie dysków. (A) Przeniesienie krążków (strzałka) do ciekłego azotu w kąpieli roboczej. (B) Dyski w ciekłym azocie (strzałka). (C) Pęsety umieszczono w ciekłym azocie w celu ich schłodzenia w kąpieli roboczej. (D, E) Odłączanie miedzianych krążków (strzałek) za pomocą pęsety. (F) Przeniesienie dysku (strzałki) do szklanej fiolki za pomocą pęsety. (G) Podgrzanie pęsety w wodzie w celu zamrożenia następnego próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Podgrzewanie i osadzanie próbki. (A) Próbki w szklanych fiolkach w temperaturze pokojowej. (B) Przeniesienie krążków (strzałka) do plastikowej probówki o pojemności 2 ml za pomocą pęsety. (C) Miedziane krążki (strzała) w acetonie w plastykowej tubie. (D) Mierzenie żywic za pomocą rurki iniekcyjnej (strzałka). (E) Przeniesienie żywicy do jednorazowego kubka (strzałka). (F) Mieszanie żywicy za pomocą mieszadła. (G) Niewielką ilość żywicy umieszczono w otworach silikonowej formy do zatapiania. (H) Nadmiar żywicy w kratkach usunięto za pomocą bibuły filtracyjnej. (I, J) Miedziane krążki z próbkami umieszczono w dnie otworów formy do zatapiania próbką stroną do góry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Przycinanie bloku próbki. (A) Wyjmowanie spolimeryzowanych bloków z form do zatapiania. (B) Numer próbki został zapisany na bloku. (C, D) Miedziany dysk został usunięty z bloku za pomocą brzytwy. Podziałka dla (D) = 1 mm. (E-G) Próbka została przycięta za pomocą ultradźwiękowego ostrza tnącego i żyletki. Podziałka dla (G) = 1 mm. (H) Wysokie powiększenie (G). Pojedyncza jasna plama to komórka. Komórki zostały osadzone w pojedynczej warstwie10. Podziałka = 10 μm. (I-K) Powierzchnia bloku została wycięta na gładko za pomocą diamentowego noża do przycinania. Podziałka skali dla (K) = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Cięcie ultracienkich przekrojów. (A) Blok próbki został usunięty z mikrotomu31. (B, C) Okaz został następnie przycięty żyletką. Podziałka dla (C) = 0,5 mm. (D) Neopren został nałożony na siatki, aby się przykleiły. (E) Ultramikrotom został pokryty tworzywem sztucznym, aby uniknąć przepływu powietrza podczas ultracienkiego cięcia. (F) Diamentowa łódź z nożem była napełniona wodą. (G, H) Ultracienkie sekcje zostały przycięte do grubości 70 nm. Podziałka dla (H) = 1 mm. (I, J) Skrawki zostały pobrane za pomocą pętli, a następnie wysuszone. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11: Barwienie sekcji. (A) Kratki zostały umieszczone w rowku połówki silikonowej rurki. (B) Byli moczeni w octanie uranylu w celu barwienia. (C) Zużyty octan uranylu zebrano na samouszczelniającej się folii woskowej. (D) Kratki zostały przemyte strumieniem wody, a następnie (E) namoczone w cytrynianu ołowiu. (F) Polimeryzowaną plazmowo folię naftalenową unosiła się na wodzie i (G) używała do pokrycia siatki umieszczonej na bibule filtracyjnej o wymiarach 4 mm x 4 mm. (H) Siatkę umieszczono w uchwycie na próbki i (I) obserwowano w mikroskopie elektronowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rysunek 12: Ultracienkie skrawki Escherichia coli (bakterie, A, B) i Saccharomyces cerevisiae (drożdże, C). (A) Należy zauważyć, że próbki są osadzone gęsto i jednorodnie i nie wykazują żadnych deformacji. (B, C) Struktury błonowe wykazują wyraźną i gładką morfologię, a rybosomy są na tyle przejrzyste, że każdą cząstkę można wyliczyć16. (C) Jądro drożdży i wakuole wykazują prawdziwy kształt koła, co może być ich naturalną morfologią. Macierz mitochondriów wykazuje wygląd gęsty od elektronów, co może być cechą żywych komórek, które są utrwalane przez szybkie zamrażanie. Podziałka = 1 μm. Skróty: CW = ściana komórkowa; ER = retikulum endoplazmatyczne; NM = błona jądrowa; NP = pory jądrowe; OM = membrana zewnętrzna; PM = błony plazmatyczne; R = rybosomy; N = jądro; M = mitochondria. (B) jest reprodukowany z Yamada et al.16 za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-13
Rysunek 13: Ultracienkie przekroje. (A-C) Hodowane komórki K562. (D) Wyizolowana komórka tuczna od myszy. (A) Należy zauważyć, że próbki są osadzone gęsto i jednorodnie i nie wykazują żadnych deformacji. Pasek skali = 20 μm. (BD) Przy dużym powiększeniu wyraźnie obserwuje się jądro, jąderko, błonę jądrową, pory jądrowe, retikulum endoplazmatyczne, mitochondria, rybosomy i granulki. Podziałka = 2 μm (B), 500 nm (C), 2 μm (D). Skróty: N = jądro; Nu = jąderko; NM = błona jądrowa, NP = pory jądrowe; ER = retikulum endoplazmatyczne; M = mitochondria; R = rybosomy; G = granulki; D = dzielące się komórki. (A) jest reprodukowany z Yamaguchi et al.1 za zgodą. (B-D) są reprodukowane z Yamaguchi et al.28 za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-14
Rysunek 14: Ultracienkie przekroje. (A-D) ludzka skóra i (E) kożuszek skórny. (A-E) Należy pamiętać, że obrazy tkanek i komórek są wyraźne i naturalne oraz wykazują dobry kontrast, chociaż skrawki są bardzo cienkie (50 nm). Macierz mitochondriów wykazuje gęsty wygląd, który jest podobny do gęstych matryc mitochondrialnych szybko zamrożonych żywych komórek (D). Podziałka = 10 μm (A, E), 200 nm (BD). Skróty: D = desmosomy; ER = retikulum endoplazmatyczne; K = keratynocyty; KF = włókna keratynowe; M = mitochondria; N = jądro; NM = błona jądrowa; P = płytki krwi; R = rybosomy; W = białe krwinki. Przedruk z Yamaguchi et al.28 za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-15
Rysunek 15: Cząstki rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) szybko zamrożone ciekłym etanem za pomocą urządzenia do zamrażania kanapek i obserwowane za pomocą mikroskopii krioelektronowej. Kuliste puste cząstki to cząstki rdzenia HBV. Podziałka = 100 nm. Skróty: HBV = wirus zapalenia wątroby typu B; I = lód. Przedruk z Yamaguchi et al.28 za zgodą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższa dyskusja opiera się na ponad 120 eksperymentach z zamrażaniem i zamrażaniem kanapek na ponad 1000 próbkach oraz na ponad 70 eksperymentach z mikroskopią krioelektronową na ponad 75 próbkach przeprowadzonych w ciągu 36 lat.

Wskaźnik sukcesu dobrego zamrażania przez zamrażanie kanapek
Wskaźnik sukcesu w osiągnięciu dobrego zamrażania zależy od próbek. Komórki drożdży Saccharomyces cerevisiae (drożdże) hodowane w pożywce YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% dekstrozy) dały prawie 100% sukces w dobrym zamrażaniu bez tworzenia się kryształków lodu 10,11,15,35,36. Inne gatunki drożdży, w tym Shizosaccharomyces 37,38,39, Cryptococcus 14,40,41,42,43,44,45, Exophiala 13,41,46,47,48, 49, Fusarium 50,51,52, Aureobasidium53, Candida54,55, Fellomyces56, Aspergillus57 i Trichosporon, również wykazały dobre zamrażanie. Bakterie, w tym Mycobacterium58,59 i E. coli16, również wykazały dobre mrożenie. Hodowane komórki i izolowane komórki zwierzęce wykazywały dobre zamrażanie zarówno dla komórek żywych, jak i utrwalonych aldehydem glutarowym 1,25,26,27,60. Tkanki zwierzęce i ludzkie utrwalone aldehydem glutarowym pokrojone na grubość od 0,1 do 0,2 mm również wykazywały dobre zamrożenie w większości przypadków 1,28.

Warunki dobrego zamrażania
Używaj tylko komórek w odpowiednim etapie wzrostu i stanie. Komórki w hodowli powinny znajdować się w fazie wykładniczej. Nałóż bardzo małe ilości zawiesin komórkowych skoncentrowanych próbek (dla S. cerevisiae, ~0,02 μl 3-5 × 109 komórek/ml) na miedziany krążek. Plastry tkanek zwierzęcych lub ludzkich utrwalone aldehydem glutarowym powinny być również bardzo małe (najlepiej 0,3 mm x 0,3 mm x 0,1 mm). Ponieważ cięcie plastrów chusteczek o grubości 0,1 mm jest trudne, pokrój wiele tkanek i wybierz cienkie i półprzezroczyste plasterki. Pracuj szybko, ale ostrożnie i nie pozwól, aby próbki wyschły. Podnosząc ułożone w stos miedziane krążki za pomocą pęsety, nie należy naciskać dysków zbyt mocno, aby uniknąć zmiażdżenia komórek i tkanek. Załadunek próbki jest najważniejszym krokiem do udanego zamrażania, a wymagane warunki są takie same, jak warunki dobrego zamrażania w przypadku zamrażania pod wysokim ciśnieniem. Czytelnicy powinni zapoznać się ze znakomitą recenzją McDonald61.

Inne zastosowania
W pracy przedstawiono mikrofotografie elektronowe bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek zwierzęcych, tkanek ludzkich i cząstek wirusa. Zaobserwowaliśmy dobre zamarzanie alg morskich związanych aldehydem glutarowym. Jednak struktury komórkowe żywych słodkowodnych zielonych alg zostały zniszczone przez tworzenie się kryształków lodu. Mieszanie komórek z 20% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) zapewniło, że ultrastruktura była dobrze zachowana bez uszkodzeń kryształów lodu. Zastosowanie 20% BSA było również korzystne dla zachowania ultrastruktury komórek łodygi grzyba. Eksperymenty nad zamrażaniem komórek i tkanek roślinnych poprzez zastosowanie 20% BSA są w toku. Chociaż nie podjęto próby skaningowej mikroskopii elektronowej próbek podstawionych metodą zamrażania i zamrażania, wcześniej opisywano obserwację dobrze zachowanych struktur komórkowych9.

Uwagi dotyczące metody zamrażania kanapek
Ultrastrukturę komórek zbliżoną do natywnej najlepiej obserwuje się poprzez szybkie zamrażanie i zamrażanie żywych komórek. Tworzenia się kryształków lodu za pomocą SFD można uniknąć, ograniczając grubość komórek do ≤30μm1. Utrwalanie tkanek za pomocą aldehydu glutarowego często zapewnia lepsze zachowanie struktury komórkowej w celu obserwacji komórek hodowanych w zawiesinie, ponieważ wiązanie aldehydu glutarowego usztywnia strukturę komórkową i zapobiega możliwym zmianom ultrastrukturalnym podczas pobierania i wirowania żywych komórek1. Utrwalanie aldehydu glutarowego pozwala również na zwiększenie głębokości zamrażania nawet do 0,2 mm1, podobnie jak w przypadku metody zamrażania wysokociśnieniowego (HPF). Dlatego maszynę HPF można zastąpić maszyną SFD do głębokiego zamrażania tkanek zwierzęcych i ludzkich.

Ponieważ tkanki utrwalone aldehydem glutarowym mogą być przechowywane przez ponad 2 lata28, zamrażanie kanapek można przeprowadzić zgodnie z wygodą użytkownika. Mocowanie tkanek za pomocą aldehydu glutarowego ułatwia również sekcjonowanie tkanek, ponieważ tkanki stają się sztywniejsze wraz z utrwalaniem. W przeciwieństwie do maszyny HPF, SFD może być używany do szybkiego zamrażania wirusów do mikroskopii krioelektronowej oraz do bakterii i komórek eukariotycznych. Co więcej, w porównaniu z maszyną HPF, SFD jest mały, przenośny, tańszy i może być nabyty przez więcej laboratoriów. Mamy nadzieję, że te cechy SFD pomogą większej liczbie laboratoriów osiągnąć ich cele badawcze28.

Cechy naturalnej morfologii komórek
Struktury komórkowe są w swoim naturalnym stanie, jeśli wykazują następujący wygląd: Struktury błonowe błony zewnętrznej (ryc. 12A, B), błony plazmatycznej (ryc. 12B,C; Rysunek 13A-D; i Rysunek 14E), otoczka jądrowa (Rysunek 12C, Rysunek 13B-D i Rysunek 14D-E), mitochondria (Rysunek 12C, Rysunek 13C i Rysunek 14D) i wakuole (Rysunek 12C) wykazują gładkie kontury. Jądro i wakuole są prawie okrągłe (ryc. 12C). Rybosomy wykazują wyraźny wygląd gęsty elektronu o średnicy ~20 nm (Rysunek 12B,C; Rysunek 13C; i rysunek 14D). Cytoplazma jest przezroczysta jak elektron (ryc. 12B,C; Rysunek 13C; i rysunek 14D).

Wpływ wiązania aldehydu glutarowego na morfologię komórek
Wiązanie aldehydu glutarowego przeprowadzono dla tkanek zwierzęcych lub ludzkich przed zamrożeniem kanapkowym w celu uzyskania ultrastruktury wolnej od kryształków lodu. Mikrofotografie uzyskane tą metodą pokazują wyjątkowo wyraźne obrazy podobne do tych uzyskanych w wyniku szybkiego zamrożenia żywych tkanek (ryc. 14)1. Badania na komórkach drożdży, mikroorganizmach głębinowych i hodowanych komórkach pokazują, że deformacja ultrastruktury jest głównie spowodowana wiązaniem i odwadnianiem tetratlenku osmu przez etanol w temperaturze pokojowej 1,17,18,28. Small poinformował również, że chociaż wiązanie aldehydu glutarowego nie niszczy organizacji aktyny w hodowanych fibroblastach, wiązanie i odwadnianie tetratlenku osmu przez aceton lub etanol w temperaturze pokojowej niszczy organizację aktyny62.

W związku z tym należy przeprowadzić szczegółowe badania nad wpływem wiązania aldehydu glutarowego na morfologię komórek. Ohno opracował metodę kriofiksacji in vivo , w której żywe tkanki są szybko zamrażane bez zatrzymywania dopływu krwi63. Tkanki poddano likupyzacji i zatopiono w żywicy epoksydowej, obserwowano ultracienkie skrawki. Obrazy z mikroskopu elektronowego wykazały najbardziej zbliżoną do natywnej ultrastrukturę żywych tkanek w porównaniu z tymi uzyskanymi przez konwencjonalne odwodnienie chemiczne i szybkie zamrażanie świeżych, nieutrwalonych tkanek. W związku z tym interesujące może być porównanie ultrastruktury uzyskanej przez substytucję przez utrwalanie i zamrażanie aldehydu glutarowego (obecna metoda) oraz ultrastruktury uzyskanej przez substytucję in vivo metodą kriofiksacji i zamrażania w celu zbadania efektów wiązania aldehydu glutarowego.

Troska o środowisko i zwiększona wydajność eksperymentów
Do zastąpienia żywicy używamy plastikowych tubek o pojemności 2 ml. Jeden ml rozcieńczonej żywicy wystarcza na każdy etap podstawiania. Zużyte plastikowe rurki można wyrzucić po każdym doświadczeniu. Może to zaoszczędzić czas i wysiłek związany z myciem szklanych fiolek, gdy są one używane do zastępowania żywicy. Dodatkowo roztwór octanu uranylu może być wielokrotnie stosowany do barwienia przekrojów32. Po zabarwieniu skrawków roztwór octanu uranylu można zapisać i ponownie wykorzystać. Ponieważ octan uranylu jest substancją radioaktywną, jego ponowne użycie pomaga uniknąć wytwarzania odpadów i przyczynia się do ochrony środowiska.

Folia naftalenowa polimeryzowana plazmowo
Polimeryzowana plazmowo folia naftalenowa to trójwymiarowo spolimeryzowana folia węglowa wykonana z gazowego naftalenu przez polimeryzację plazmową pod wyładowaniem jarzeniowym33. Folia jest odporna na bombardowanie elektronami i chemikaliami, bardzo czysta, przezroczysta na elektrony, ma płaską powierzchnię i amorficzną strukturę. Tak więc polimeryzowana plazmowo folia naftalenowa, która jest dostępna na rynku, jest doskonała i jest zalecana jako folia nośna.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Urządzenie do zamrażania kanapekMarine works Japan, Ltd, Yokosuka, JaponiaMW-SFD-01z metalowym prętem, cienkim metalowym prętem, pęsetą i kąpielą roboczą
Fiolki-Fiolki scyntylacyjne do utrwalacza
Aceton-tetratlenek
osmuNisshin EM Co. Ltd., Tokio30040,1 g
ZamrażarkaSanyo Co. Ltd., OsakaMDF-C8V1
Dysk miedzianyNisshin EM Co. Ltd.,Tokio-Zapoznajsię z tym
artykułem Szkłoprzesuwne-Dwustronna
taśma klejąca-Jednosieczna
żyletkaNisshin EM Co. Ltd.,Tokio-Pióro, FAS-10
Żyletka obosiecznaNisshin EM Co. Ltd.,Tokyo-Feather, FA-10
Rozdrobniona deskaNisshin EM Co. Ltd., Tokio428
PęsetaNisshin EM Co. Ltd.,Tokio-Kilka par
Pęsety z pianką polistyrenową-Jednapara
Gaz-Kriogeniczny
aparat do rozpylania jonówHitachi wysokie technologie, TokyoHitachi E102
Mikropipeta-Do1 mL, 200 μ L oraz 2 μ L
MikrowirówkaTomy digital biology Co. Ltd., TokyoCapsulefuge, PMC-060
StereomicroscopeNikon Co. Ltd., Tokio i wsp.-Oświetlenie LED SMZ 645
do stereomikroskopuNikon Co. Ltd., Tokio i wsp.SM-LW 61 Ji
Jednorazowy plastikowy pojemnik-50ml i 200 ml
Etangazowy-Kriogeniczne
2 ml probówki Eppendorfa-Dozatapiania
Jednorazowe plastikowe strzykawki-1ml, 5 ml, 10 ml i 20 ml
Mieszadło
magnetyczne-Żywica epoksydowaNisshin EM Co. Ltd., Tokyo340Quetol 812 zestaw
silikonowa forma do zatapianiaNisshin EM Co. Ltd., Tokio4217o średnicy 7 mm, głębokości 13 mm
Incubater-For37 & deg; C oraz 60 ° C
Etap przycinaniaSunmag Co. Ltd., Tokio-Wyposażony w mechanizm przechylania, Patrz ten artykuł
Oświetlenie LED do przycinania stageSunmag Co. Ltd., Tokio-Zapoznaj się z tym dokumentem
Ultradźwiękowe ostrze do przycinaniaNisshin EM Co. Ltd., Tokio5240EM-240, Zapoznaj się z tym artykułem
UltramikrotomLeica Microsystems, WiedeńUltracut S
SiatkiNisshin EM Co. Ltd., Tokio2633, 2634300 oczek, 400 oczek
0,5% Roztwór neoprenu WNisshin EM Co. Ltd., Tokio605
Perfect LoopNisshin EM Co. Ltd., Tokio2351Do pobierania sekcji
Pół rurki do barwienia sekcjiNisshin EM Co. Ltd., Tokio463Zapoznaj się z tym pape
Super Support FilmNisshin EM Co. Ltd, Tokio647
Filtr strzykawkowyToyo Roshi Kaisha, Ltd., TokioDISMIC-03CPOctan celulozy, 0,45 μ m
Transmisyjny mikroskop elektronowyJEOL Co. Ltd., TokioJEM-1400
szklane 10 ml Aldehyd glutarowy Nisshin EM Co. Ltd., Tokio 3052 Ciekły azot- propan

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamaguchi, M., et al. Good ultrastructural preservation of human tissues and cultured cells by glutaraldehyde fixation, sandwich freezing, and freeze-substitution. Cytologia. 85 (1), 15-26 (2020).
  2. Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Technique. 3 (2), 177-210 (1986).
  3. Van Harreveld, A., Crowell, J. Electron microscopy after rapid freezing on a metal surface and substitution fixation. The Anatomical Record. 149, 381-385 (1964).
  4. Aoki, N., Ito, M., Ejiri, S., Ozawa, H. Ultrastructure of human skin by a rapid freezing technique: structural preservation and antigenicity. Journal of Investigative Dermatology. 102 (3), 354-361 (1994).
  5. Moor, H. Theory and practice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. Berlin, Heidelberg. 175-191 (1987).
  6. McDonald, K. L., Morphew, M., Vertkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: Equipment-and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
  7. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161 (3), 359-371 (2008).
  8. Costello, M. J. Ultra-rapid freezing of the biological samples. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 361-370 (1980).
  9. Baba, M., Osumi, M. Transmission and scanning electron microscopic examination of intracellular organelles in freeze-substituted Kloeckera and Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Journal of Electron Microscopy Technique. 5 (3), 249-261 (1987).
  10. Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 261-266 (2009).
  11. Yamaguchi, M., et al. Electron microscopy of hepatitis B virus core antigen expressing yeast cells by freeze-substitution fixation. European Journal of Cell Biology. 47 (1), 138-143 (1988).
  12. Baba, M., Takeshige, K., Baba, N., Ohsumi, Y. Ultrastructural analysis of the autophagic process in yeast: detection of autophagosomes and their characterization. Journal of Cell Biology. 124 (6), 903-913 (1994).
  13. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study. Experimental Cell Research. 279 (1), 71-79 (2002).
  14. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 296 (2), 257-265 (2009).
  15. Yamaguchi, M., et al. Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy. Journal of Electron Microscopy. 60 (5), 321-335 (2011).
  16. Yamada, H., et al. Structome analysis of Escherichia coli cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density. Microscopy. 66 (4), 283-294 (2017).
  17. Yamaguchi, M., Ohkusu, M., Sameshima, M., Kawamoto, S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Japanese Journal of Medical Mycology. 46 (3), 187-192 (2005).
  18. Yamaguchi, M., et al. Improved preservation of fine structure of deep-sea microorganisms by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Journal of Electron Microscopy. 60 (4), 283-287 (2011).
  19. Yamaguchi, M., et al. Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea. Journal of Electron Microscopy. 61 (6), 423-431 (2012).
  20. Yamada, H., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Pre-fixation of virulent Mycobacterium tuberculosis with glutaraldehyde preserves exquisite ultrastructure on transmission electron microscopy through cryofixation and freeze-substitution with osmium-acetone at ultralow temperature. Journal of Microbiological Methods. 96, 50-55 (2014).
  21. Yamaguchi, M. An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms. JSM Mycotoxins. 65 (2), 81-99 (2015).
  22. Yamaguchi, M., et al. High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea. Microscopy. 65 (4), 363-369 (2016).
  23. Yamaguchi, M., Yamada, H., Uematsu, K., Horinouchi, Y., Chibana, H. Electron microscopy and structome analysis of unique amorphous bacteria from the deep sea. Cytologia. 83 (3), 337-342 (2018).
  24. Yamaguchi, M., Yamada, H., Chibana, H. Deep-sea bacteria harboring bacterial endosymbionts in a cytoplasm?: 3D electron microscopy by serial ultrathin sectioning of freeze-substituted specimen. Cytologia. 85 (3), 209-211 (2020).
  25. Yamaguchi, M., Takahashi-Nakaguchi, A., Aida, Y., Sato-Okamoto, M., Chibana, H. Convenient method for better preservation of fine structures of cultured macrophages and engulfed yeast cells by freeze-substitution fixation. Microscopy. 66 (3), 209-211 (2017).
  26. Aoki, S., et al. Shift in energy metabolism caused by glucocorticoids enhances the effect of cytotoxic anticancer drugs against acute lymphoblastic leukemia cells. Oncotarget. 8 (55), 94271-94285 (2017).
  27. Hirao, T., et al. Altered intracellular signaling by imatinib increases the anticancer effects of tyrosine kinase inhibitors in chronic myelogenous leukemia cells. Cancer Science. 109 (1), 121-131 (2018).
  28. Yamaguchi, M., et al. Sandwich freezing device for rapid freezing of viruses, bacteria, yeast, cultured cells, and animal and human tissues in electron microscopy. Microscopy. 70 (2), 215-223 (2021).
  29. Yamaguchi, M. Troubleshooting in specimen preparation of microorganisms. Kenbikyo. 42, In Japanese 26-28 (2007).
  30. Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy. Microscopy. 65 (55), 444-450 (2016).
  31. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56235(2018).
  32. Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. Repeated use of uranyl acetate solution for section staining in transmission electron microscopy. Plant Morphology. 17 (1), 57-59 (2005).
  33. Yamaguchi, M., Tanaka, A., Suzuki, T. A support film of plasma-polymerized naphthalene for electron microscopy: method of preparation and application. Journal of Electron Microscopy. 41 (1), 7-13 (1992).
  34. Yamaguchi, M., et al. Cryo-electron microscopy of hepatitis B virus core particles produced by transformed yeast: comparison with negative staining and ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 37 (6), 337-341 (1988).
  35. Yamaguchi, M., et al. Dynamics of hepatitis B virus core antigen in a transformed yeast cell: analysis with an inducible system. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 386-393 (1994).
  36. Yamaguchi, M., Miyatsu, T., Mizokami, H., Matsuoka, L., Takeo, K. Translocation of hepatitis B virus core particles through nuclear pores in transformed yeast cells. Journal of Electron Microscopy. 45 (4), 321-324 (1996).
  37. Sipiczki, M., Takeo, K., Yamaguchi, M., Yoshida, S., Miklos, I. Environmentally controlled dimorphic cycle in fission yeast. Microbiology. 144, Pt 5 1319-1330 (1998).
  38. Sipiczki, M., et al. Role of cell shape in determination of the division plane in Schizosaccharomyces pombe: random orientation of septa in spherical cells. Journal of Bacteriology. 182 (6), 1693-1701 (2000).
  39. Encz, iK., Yamaguchi, M., Sipiczki, M. Morphology transition genes in the dimorphic fission yeast Schizosaccharomyces japonicus. Antonie van Leeuwenhoek. 92 (2), 143-154 (2007).
  40. Kopecka, M., et al. Microtubules and actin cytoskeleton in Cryptococcus neoformans compared with ascomycetous budding and fission yeasts. European Journal of Cell Biology. 80 (4), 303-311 (2001).
  41. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Kita, S., Aikawa, E., Takeo, K. Electron microscopy of pathogenic yeasts Cryptococcus neoformans and Exophiala dermatitidis by high-pressure freezing. Journal of Electron Microscopy. 51 (1), 21-27 (2002).
  42. Ikeda, R., et al. Contribution of the mannan backbone of cryptococcal glucuroxylomannan and a glycolytic enzyme of Staphylococcus aureus to contact-mediated killing of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology. 189 (13), 4815-4826 (2007).
  43. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. Journal of Electron Microscopy. 59 (2), 165-172 (2010).
  44. Kozubowski, L., et al. Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast Cryptococcus neoformans. MBio. 4 (5), 00614(2013).
  45. Stepanova, A. A., Yamaguchi, M., Chibana, H., Vasilyeva, N. V. Ultrastructural aspects of cell components migration during budding in the yeast Cryptococcus leurentii. Problems in Medical Mycology. 18 (3), 24-29 (2016).
  46. Ohkusu, M., et al. Cellular and nuclear characteristics of Exophiala dermatitidis. Studies in Mycology. 43 (43), 143-150 (1999).
  47. Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy. FEMS Microbiology Letters. 219 (1), 17-21 (2003).
  48. Yamaguchi, M., et al. The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells. European Journal of Cell Biology. 82 (10), 531-538 (2003).
  49. Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning. Journal of Electron Microscopy. 52 (2), 133-143 (2003).
  50. Takaya, N., et al. Cytochrome P450nor, a novel class of mitochondrial cytochrome P450 involved in nitrate respiration in the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Biochemistry and Biophysics. 372 (2), 340-346 (1999).
  51. Zhou, Z., et al. Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 1892-1896 (2002).
  52. Takasaki, K., et al. Fungal ammonia fermentation, a novel metabolic mechanism that couples the dissimilatory and assimilatory pathways of both nitrate and ethanol. Role of acetyl CoA synthetase in anaerobic ATP synthesis. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 12414-12420 (2004).
  53. Kopecka, M., et al. Analysis of microtubules and F-actin structures in hyphae and conidia development in opportunistic human pathogenic black yeast Aureobasidium pullulans. Microbiology. 149, Pt 4 865-876 (2003).
  54. Ueno, K., Namiki, Y., Mitani, H., Yamaguchi, M., Chibana, H. Differential cell wall remodeling of two chitin synthase deletants Δchs3A and Δchs3B in the pathogenic yeast Candida glabrata. FEMS Yeast Research. 11 (5), 398-407 (2011).
  55. Ikezaki, S., et al. Mild heat stress affects on the cell wall structure in Candida albicans biofilm. Medical Mycology Journal. 60 (2), 29-37 (2019).
  56. Gabriel, M., et al. The cytoskeleton in the unique cell reproduction by conidiogenesis of the long-neck yeast Fellomyces (Sterigmatomyces) fuzhouensis. Protoplasma. 229 (1), 33-44 (2006).
  57. Yoshimi, A., et al. Functional analysis of the α-1,3-glucan synthase genes agsA and agsB in Aspergillus nidulans: agsB is the major α-1,3-glucan synthase in this fungus. PLoS One. 8 (1), 54893(2013).
  58. Yamada, H., Mitarai, S., Chikamatsu, K., Mizuno, K., Yamaguchi, M. Novel freeze-substitution electron microscopy provides new aspects of virulent Mycobacterium tuberculosis with visualization of the outer membrane and satisfying biosafety requirements. Journal of Microbiological Methods. 80 (1), 14-18 (2010).
  59. Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS One. 10 (1), 0117109(2015).
  60. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Scientfic Reports. 9 (1), 18699(2019).
  61. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251 (2), 429-448 (2014).
  62. Small, J. V. Organization of actin in the leading edge of cultured cells: influence of osmium tetroxide and dehydration on the ultrastructure of actin meshworks. Journal of Cell Biology. 91 (3), Pt 1 695-705 (1981).
  63. Ohno, S., Terada, N., Fujii, Y., Ueda, H., Takayama, I. Dynamic structure of glomerular capillary loop as revealed by an in vivo cryotechnique. Virchows Archiv. 427 (5), 519-527 (1996).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mro na substytucjautrwalanie glutaraldehydemci cie ultracienkich przekroj wzatapianie w ywicydyski miedzianekriomikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły