Method Article

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa Analiza ilościowa rozmieszczenia konidów Aspergillus fumigatus w całości optycznie oczyszczonym płucu myszy

DOI:

10.3791/62436

⸱

September 18th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów Aspergillus fumigatus (o wielkości 3 μm) w drogach oddechowych myszy. Metoda może być również stosowana do analizy rozkładu mikrocząstek i aglomeratów nanocząstek w drogach oddechowych w różnych modelach stanów patologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus conidia to patogeny przenoszone drogą powietrzną, które mogą przenikać do ludzkich dróg oddechowych. Osoby immunokompetentne bez alergii wykazują odporność i tolerancję immunologiczną, natomiast u pacjentów z obniżoną odpornością konidia mogą kolonizować drogi oddechowe i powodować ciężkie inwazyjne choroby układu oddechowego. Różne komórki w różnych przedziałach dróg oddechowych biorą udział w odpowiedzi immunologicznej, która zapobiega inwazji grzybów; Jednak czasoprzestrzenne aspekty eliminacji patogenów nadal nie są w pełni zrozumiałe. Trójwymiarowe (3D) obrazowanie optycznie oczyszczonych całych narządów, w szczególności płuc myszy eksperymentalnych, umożliwia wykrywanie fluorescencyjnie znakowanych patogenów w drogach oddechowych w różnych punktach czasowych po zakażeniu. W niniejszym badaniu opisano układ eksperymentalny do przeprowadzenia analizy ilościowej rozmieszczenia konidiów A. fumigatus w drogach oddechowych. Za pomocą fluorescencyjnej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) prześledziliśmy lokalizację fluorescencyjnie znakowanych konidiów w gałęziach oskrzeli i przedziale pęcherzykowym 6 godzin po zastosowaniu jamy ustnej i gardła myszom. Opisane tutaj podejście było wcześniej stosowane do wykrywania dokładnej lokalizacji patogenu i identyfikacji komórek oddziałujących z patogenem w różnych fazach odpowiedzi immunologicznej. Układ doświadczalny można wykorzystać do oszacowania kinetyki eliminacji patogenu w różnych warunkach patologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Codziennie ludzie wdychają patogeny unoszące się w powietrzu, w tym zarodniki oportunistycznych grzybów Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), które mogą przenikać do dróg oddechowych1. Drogi oddechowe ssaków to system dróg oddechowych różnych pokoleń, które charakteryzują się odmienną budową ścian dróg oddechowych2,3,4. Ściany tchawicy i oskrzeli składają się z kilku typów komórek, wśród których znajdują się komórki rzęskowe, które zapewniają klirens śluzowo-rzęskowy5. W pęcherzykach płucnych nie ma kom....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody dotyczące zwierząt laboratoryjnych zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Instytucie Chemii Bioorganicznej im. Szemiakina i Owczinnikowa Rosyjskiej Akademii Nauk (numer protokołu 226/2017).

1. Aplikacja konidiaów A. fumigatus

  1. Aby otrzymać znakowane fluorescencyjnie konidia A. fumigatus, utrwal 5 × 108 konidiów, dodając 1 ml 3% paraformaldehydu do granulki konidiów. Inkubować w probówce o pojemności 50 ml przez 2 godziny na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć konidia 20 ml soli fizjologicznej z b....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z powyższym protokołem, uzyskano obraz 3D pokazujący drogi oddechowe i konidia A. fumigatus w płacie płucnym myszy (Rysunek 1A). Streptawidyna (która była używana do wizualizacji dróg oddechowych) oznaczała oskrzela i oskrzeliki 15. Dodatkowo, duże naczynia, które można łatwo odróżnić od dróg oddechowych po ich morfologii, oraz opłucna są uwidocznione w kanale dróg oddechowych (Rysunek 1A-C). Stworzenie powierzchni dróg odde.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie 3D całego narządu pozwala na uzyskanie danych bez preparacji próbki, co ma ogromne znaczenie dla badania przestrzennych aspektów anatomicznego rozmieszczenia patogenu w organizmie. Istnieje kilka technik i modyfikacji optycznego oczyszczania tkanek, które pomagają przezwyciężyć rozpraszanie światła laserowego i umożliwiają obrazowanie całego narządu 15,16,18,19. Jedno z niestandardo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów w tej pracy.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Prof. Svenowi Krappmannowi (Szpital Uniwersytecki w Erlangen i FUA Erlangen-Nürnberg, Niemcy) za dostarczenie szczepu konidiów Aspergillus fumigatus AfS150. Autorzy dziękują Biuru Prasowemu MIPT. V.B. dziękuje Ministerstwu Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej (#075-00337-20-03, projekt FSMG-2020-0003). Prace nad obrazowaniem i kwantyfikacją konidiów A. fumigatus były wspierane przez RSF nr 19-75-00082. Prace dotyczące obrazowania dróg oddechowych były wspierane przez RFBR nr 20-04-60311.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus konidiaATCC46645Szczep AfS150, pochodna ATCC 46645
Alkohol benzylowyPanreac141081.161198,0-100 %
Benzoesan benzyluAcrosAC10586-001099+%
C57Bl/6 myszyPushchino Animal Centrum Hodowlane (Rosja)Samiec. 12 - 30 tygodni.
CewnikVenisystemsG715-A0118G
Obrazowanie komórek komora ze szklanym dnemEppendorf307420284 lub 8-dołkowa komora ze szklanym dnem
WirówkaEppendorf5804RMożna użyć dowolnej wirówki 1000 g
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZEISSZEISS LSM780
DimetylosulfotlenekSigma-Aldrich276855≥ 99,9%
Pakiet do przetwarzania obrazu FIDŻIDarmowe oprogramowanieFIJI
KleszczB. Braun AesculapBD557RKleszcz zębaty
B. Braun AesculapBD321RKleszcz z cienką końcówką
Bochem1727Gładki
Butelka szklanaDURAN242101304Z mieloną pokrywką
Edytor graficzny PhotoshopAdobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPad SoftwareGraphPadPrism 8
Imaris Microscopy Imaging SoftwareOxford InstrumentsDostępna jest bezpłatna wersja próbna https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
ObiektywZEISS420640-9800-000  Plan-apochromatyczny, 10 i razy; (NA = 0,3)
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060Π
PipetaProLine722020od 5 do 50 sztuk L
Mleko w proszkuRothT145.2
Mieszalnik próbekDynalMXIC1
NożyczkiB. BraunBC257RBlunt
ShakerApexlabGS-2050-300 obr./min
SkalpelBochem12646
Nić jedwabnaB. Braun3 USP
Streptawidyna, Alexa Fluor 488 koniugatThermoFisherS11223
ProbówkaSPL Lifesciences5005050 mL
Tris (hydroksymetyloaminometan)HelikonH-1702-0,5  Pan 121.14; Numer CAS: 77-86-1
Triton X-100Amresco Am-O694-0.1
Oprogramowanie mikroskopuZEN ZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
  2. Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Re....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Laser MicroscopyAspergillus Fumigatus ConidiaOptical ClearingMouse Lung ImagingQuantitative AnalysisAirway DistributionThree Dimensional ImagingSpectral UnmixingAirway MaskingImmune Response

Related Articles