Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dżdżownica, Lumbricus Terrestris: nowatorski model unaczynień in vivo z mikroiniekcją

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62449

⸱

1 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bioinnovation PhD Program, Tulane University, 2Biology Department, Virginia Commonwealth University, 3Mechanical Engineering Department, Montgomery College, 4Biomedical Engineering Department, Tulane University, 5US Food and Drug Administration

W tym artykule

Podsumowanie

Dżdżownice to nowy model bezkręgowców in vivo do badań naczyniowych. Prezentujemy techniki i sprzęt, które pozwalają na sprawną operację i mikroiniekcje w układ krwionośny dżdżownic. Opisano protokoły chirurgiczne, techniki mikroiniekcji oraz procedurę wytwarzania mikropipet na zamówienie.

Streszczenie

Chociaż kręgowce są niezbędne do badań biomedycznych, często są one ograniczane przez takie czynniki, jak koszty, długa wewnętrzna ocena i względy etyczne. Przedstawiamy dżdżownicę jako alternatywnego, taniego bezkręgowca mającego zastosowanie w niektórych wstępnych badaniach naczyniowych. Ze względu na chirurgiczną dostępność naczyń grzbietowych, naczyń brzusznych i pięciu par pseudoserc dżdżownic, dżdżownice są łatwo dostępne, oferują niskie koszty utrzymania i wymagają podawania tylko małych dawek danego związku. Model dżdżownic zapewnia prosty, zamknięty układ krążenia naczyniowego o strukturze hemoglobiny podobnej do ludzkiej krwi. Zapewniony jest protokół znieczulania dżdżownic i wykonywania nacięć chirurgicznych w celu odsłonięcia odpowiednich naczyń krwionośnych. Mikropipety do podawania związków chemicznych są formowane przez podgrzewanie i ciągnięcie szkła za pomocą ściągacza do pipet oraz użycie systemu ukosowania w celu utworzenia końcówki cienkiej igły w skali mikronowej. Końcówki są następnie używane z mikropozycjonerem i mikrowstrzykiwaczem do wstrzykiwania dowolnych związków do układu naczyniowego dżdżownicy, w sposób powtarzalny, z dostępnością dużych rozmiarów próbek i małych objętości związku. Podano szczegółowe informacje na temat zawiłości procedury wstrzykiwania. Mały rozmiar naczynia dżdżownic jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku naczynia brzusznego; Jednak opanowanie prezentowanych technik zapewnia wysoką powtarzalność jako rozwiązanie niskokosztowe, co sprawia, że badania na bardzo dużych próbach są praktyczne.

Wprowadzenie

Dżdżownica była używana jako ważny bioindykator i test biologiczny dla poprzednich zastosowań naukowych1,2,3,4,5,6; Jest to idealny organizm do oceny zagrożeń biologicznych związanych z odpadami niebezpiecznymi i toksycznymi w środowisku lądowym dla in situ i badania bioakumulacji, takie jak biocydy (insektycydy) w glebie i niekorzystne skutki ekotoksykologiczne7,8,9,10. Dodatkowo, dzięki bioprospekcji, dżdżownica jest alternatywnym źródłem cząsteczek fibrynolitycznych, przeciwzakrzepowych, przeciwbakteryjnych i przeciwnowotworowych11,12; do tego stopnia, że w 1991 roku zespół wyekstrahował i oczyścił lumbricynę ze skóry dżdżownic i umieścił ją na guzach sutka myszy SHN, co doprowadziło do zahamowania wzrostu guza13. Dżdżownica jest również pedagogicznie użytecznym modelem zwierzęcym, ponieważ może być wykorzystana do wystawienia uczniów na operację i zrozumienia anatomii okazu; Od badania krążenia krwi po elektrofizjologię14,15.

W naszych własnych badaniach zbadaliśmy reakcję naczyń żywych dżdżownic na ultradźwięki o wysokim natężeniu18. Odkryliśmy, że pęknięcie naczynia krwionośnego u robaka nastąpiło w warunkach podobnych do tych, które kojarzyliśmy z uszkodzeniem pęknięć w ludzkich mikronaczyniach. Nasza bieżąca praca polega na wstrzykiwaniu mikropęcherzyków do układu krwionośnego dżdżownic. Mikropęcherzyki składają się z ciężkiego gazu otoczonego otoczką lipidową, albuminową lub polimerową, środki te mogą być stosowane jako środki kontrastowe obrazu, a także jako nośniki do celowanego dostarczania leków.

Ten nowatorski protokół jest istotny dla każdego badania, które skorzystałoby z dożylnego (IV) wstrzyknięcia związku, który mógłby wykorzystywać naturalne bioindykatory dżdżownicy. Podejście opiera się na mikroiniekcji dożylnej do jednego z kilku możliwych punktów wejścia, w tym do dowolnego z pięciu par pseudoserc dżdżownicy, naczynia grzbietowego i naczynia brzusznego. Zabieg polega na skomplikowanym nacięciu chirurgicznym w celu odsłonięcia naczyń, a następnie wstrzyknięciu kontrolowanym przez mikropozycjoner. Osiąga się to za pomocą niestandardowych mikropipet skonstruowanych specjalnie do mikroiniekcji naczyniowych dżdżownic. Te mikropipety umożliwiają precyzyjne celowanie w naczynia o średnicy brzusznej nawet 90 μm.

Ten protokół ma na celu ulepszenie wcześniejszych technik mikropipetowania, w tym badania z 1948 roku dotyczącego ekstrakcji krwi i moczu dżdżownic16. Jak widać na rysunku S1, przygotowanie do tej ekstrakcji może być trudne i, jak stwierdził autor, może zająć do jednej godziny lub dłużej. Podobna metoda została opracowana w 1970 roku, ale autor doświadczył wielu złamanych końcówek podczas wstrzykiwania płynów do gigantycznych włókien dżdżownicy17. W obecnej metodzie opisanej poniżej ekstrakcja krwi jest kwestią sekund do minut i ma znaczenie zarówno dla wstrzykiwania związków, jak i ekstrakcji płynów z dżdżownic. W tym konkretnym przypadku wstrzyknęliśmy środki kontrastowe, mikropęcherzyki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie mikropipet: ciągnięcie szkła i końcówka do ukosowania

  1. Wyciąganie mikropipet
    1. Włącz ściągacz do mikropipet i wybierz program, aby wprowadzić określone parametry mikroiniekcji dżdżownic.
    2. Ustaw parametry na Ciśnienie=500, Ciągnięcie=75, Czas=250, Ciepło=336 i Prędkość=70. Wyniki mogą się różnić w zależności od ściągacza; Dlatego eksperymentuj z parametrami, aby uzyskać pożądaną końcówkę (rozmiar, ostrość, kształt itp.).
    3. Należy przeprowadzić test RAMP w celu określenia wartości cieplnej mikropipet przed ich wyciągnięciem, ponieważ niewykonanie tego może doprowadzić do przepalenia żarnika korytowego lub pęknięcia szkła.
    4. Jeśli ciśnienie powietrza wymaga zmiany, naciśnij przycisk kasowania, wybierz brak (0), gdy pojawi się monit o skasowanie wszystkich wartości, a następnie wybierz zmień ciśnienie (2). Ten proces może się różnić w zależności od ściągacza; Dlatego należy zapoznać się z instrukcją obsługi przyrządu, aby zmienić ustawienia ciśnienia.
    5. Otwórz pokrywę ściągacza do mikropipet i załaduj do niego mikropipetę. Użyte szkło do mikropipet to szkło borokrzemianowe z pipetą z żarnikiem: 10 cm długości, średnica zewnętrzna: 1,5 mm i średnica wewnętrzna: 0,86 mm.
    6. Wsuń pipetę do rowka w kształcie litery V od prawej strony wzdłuż szczeliny pipety, aż koniec pipety zrówna się z końcem uchwytu na pipetę. Aby upewnić się, że pipeta może przemieszczać się po żarniku na przeciwną stronę, popchnij pipetę tak daleko, jak to możliwe, upewniając się, że spoczywa na szczelinie pipety.
    7. Aby zablokować pipetę, dokręć pokrętło po prawej stronie i przesuń zablokowany system wraz z pipetą, aż dotrze do drugiej strony ściągacza przez filament. Na koniec przymocuj lewą stronę pipety do ściągacza. Pipeta powinna znajdować się w środku filamentu; Zapoznaj się z instrukcją, aby uzyskać instrukcje dotyczące prawidłowego ustawiania pipety.
    8. Po załadowaniu pipety zamknij ściągacz, naciśnij przycisk ciągnięcia i poczekaj, aż pipeta zostanie pociągnięta, zanim wyjmiesz dwie powstałe pipety.
    9. Odkręć pokrętła, aby wyjąć pipety i uważaj, aby nie zatrzasnąć pipet podczas wyjmowania ze szczeliny.
    10. Umieść wyciągnięte mikropipety na uchwycie do mikropipet lub innym wsporniku, aby utrzymać mikropipetę na miejscu i umożliwić łatwe obracanie bez pękania wyciągniętych mikropipet. Opracowaliśmy własny uchwyt do mikropipet, który można stworzyć w warsztacie mechanicznym lub nawet wydrukować w 3D.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    11. Umieść uchwyt mikropipety pod mikroskopem i użyj programu kamery lub podobnego oprogramowania, aby zrobić zdjęcie wyciągniętych mikropipet i zarejestrować średnicę końcówki przy 10-krotnym powiększeniu ~1000 mm i ~50 mm od końcówki.
    12. Przed zrobieniem zdjęcia upewnij się, że ustawienia aparatu są zgodne z ustawieniami mikroskopu (10x), aby pomiar był dokładny, szczególnie w przypadku pomiarów po obrazowaniu. Ustawienie 10x znajduje się na poziomej wstążce paska narzędzi znajdującej się w górnej części ekranu.
    13. Aby wyświetlić i zrobić zdjęcie mikropipety, wybierz kamerę w oprogramowaniu aparatu znajdującym się w lewym górnym rogu i naciśnij przycisk Snap po ustawieniu ostrości na końcówce, aby uzyskać dokładny odczyt. Przycisk Przyciągaj znajduje się na poziomym pasku narzędzi po lewej stronie strony pod zakładką aparatu.
    14. Wykonaj pomiary wyciągniętych mikropipet, aby określić, czy osiągnięto pożądany rozmiar końcówki i konsystencję. Wyciągnięcie do 5 pipet wystarczy, aby określić, czy ściągacz i jego parametry konsekwentnie zapewniają pożądany rozmiar. Jeśli żądany rozmiar końcówki nie został osiągnięty lub jeśli rozmiary nadal różnią się w zależności od pipety, badacz może być zmuszony do eksperymentowania z różnymi ustawieniami, aż do osiągnięcia pożądanego rozmiaru końcówki, lub może być konieczne ustalenie położenia filamentu i pipety, co może wymagać odwołania się do instrukcji obsługi ściągacza do pipet.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  2. Ustawianie ukosu mikropipety i korzystanie z miernika impedancji elektrody
    1. Do ukosowania wyciągniętych mikropipet należy użyć ukosowarki do mikropipet z miernikiem impedancji elektrod i mikroskopem stereoskopowym 40x.
      UWAGA: Można użyć innych ukosowarek; Nawet wewnętrzni kosokrawcy są uwodzeni, a ponadto można uzyskać różne konfiguracje z różnymi mikroskopami do badania procesu ukosowania, w tym zamontowanie kamery na mikroskopie.
    2. Zamontuj cokół/płytę szlifierską z drobną płytką między dwoma czarnymi uchwytami.
    3. Umieść dolną płytę tak, aby magnesy były skierowane od płyty.
    4. Skręć ze sobą trzy części: (1) górny pierścień ustalający, (2) drobną płytkę szlifierską i (3) dolny pierścień ustalający (magnetyczny). Zidentyfikuj powierzchnię ścierną płyty szlifierskiej; W przypadku cienkiej płyty ma kolor fioletowy i powinien być skierowany do góry, aby szkło stykało się z kwarcową płaską optyką.
    5. Umieść pięć kropli oleju w cokole ukosowania lub tyle, ile jest potrzebnych, na kwarcowej płaszczyźnie optycznej przyrządu do ukosowania i umieść zmontowaną płytkę na górze. Ten olej może trwać cały dzień, ale jeśli płyta szarpie lub nie obraca się, kiedy powinna, może być konieczne ponowne naoliwienie kwarcowego płaskownika optycznego.
    6. Zakręć płytką ręcznie kilka razy, aby rozprowadzić olej, a następnie można włączyć instrument.
    7. Aby ustawić miernik impedancji, dodaj sól fizjologiczną (0.9% NaCl) na, który jest przewodem odniesienia, i umieść na płytce do fazowania. Namocz wstążkę, aby utworzyć obwód za pomocą mikropipety i przykryj płytkę cienką warstwą roztworu soli fizjologicznej.
    8. Przymocuj segment przewodu do końca przewodu przymocowanego do miernika impedancji.
    9. Przestaw przełącznik "on" na mierniku impedancji i pozostaw w trybie "czuwania", aż będzie gotowy do rozpoczęcia ukosowania. Ponieważ tworzymy duży otwór, ustaw miernik impedancji elektrody na x0,1, gdy będzie gotowy do ukosowania.
  3. Ładowanie mikropipety i ukosowanie
    1. Załaduj mikropipetę na zacisk pipety, który znajduje się na manipulatorze i dokręć pokrętło, aby utrzymać ją na miejscu podczas ukosowania.
    2. Przez tylny koniec mikropipety napełnij całą pipetę solą fizjologiczną i włóż ołowi do mikropipety, upewniając się, że w mikropipecie nie ma pęcherzyków powietrza. Zauważono, że obecność pęcherzyków powietrza w mikropipecie powoduje zmienność pomiarów.
    3. Włącz miernik impedancji, przełączając się z trybu "czuwania" na "x0,1". Rezystancja powinna początkowo wynosić 100 MΩ, a gdy końcówka mikropipety dotknie soli fizjologicznej, powinien wyświetlić inny odczyt.
    4. Aby ukosować właściwy rozmiar otworu końcówki, przed opuszczeniem mikropipety należy ustawić kąt na manipulatorze na 35°, aby uzyskać równomierne ukosowanie. Kąt 30° jest również wystarczający, ale pomiędzy tymi dwoma 35° ma mniejsze odchylenie standardowe, dzięki czemu jest bardziej spójny w ukosowaniu, a końcówka mniej pęka.
    5. Za pomocą manipulatora umieść końcówkę mikropipety w odległości około dwóch trzecich od środka obrotu płyty mielącej.
    6. Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej opuść mikropipetę blisko płytki, tak aby końcówka mikropipety zbliżyła się do roztworu soli fizjologicznej. Jeśli żadna kamera nie jest dostępna, ważne jest, aby spojrzeć w dół mikroskopu, aby zobaczyć ukosowanie końcówki.
    7. Gdy końcówka mikropipety zetknie się z solą fizjologiczną, odczyt miernika impedancji powinien spaść ze 100 MΩ do wartości w zakresie od 80 do 20 MΩ. Wartość ta będzie się różnić ze względu na wyciągnięty otwór szklany.
    8. W tym momencie przełącz się z pokrętła regulacji zgrubnej na pokrętło regulacji precyzyjnej, aby wolniej opuszczać pipetę, aby uniknąć złamania końcówki na płytce. Ważne jest, aby na tym etapie ukosowania jednocześnie monitorować miernik impedancji i końcówkę.
    9. Podczas ukosowania obserwuj, jak zmienia się rozmiar końcówki i używaj oświetlenia, aby stworzyć dobry punkt obserwacyjny podczas ukosowania.
      UWAGA: Końcówka stanie się bardzo błyszcząca, gdy nastąpi fazowanie, a otwór końcówki stanie się większy. Na tym etapie konieczne jest użycie pokrętła precyzyjnej regulacji na manipulatorze, aby obniżyć lub podnieść mikropipetę. Po zdjęciu mikropipety z płytki, przyniesienie jej z powrotem do płytki może spowodować pęknięcie końcówki.
    10. Powoli opuszczaj końcówkę, aż dotrze do płytki ukosującej i powoli ukosuj, aż zostanie osiągnięta rezystancja około 20 MΩ. Opanowanie tego procesu będzie silną krzywą uczenia się i będzie wymagało praktyki, aby konsekwentnie ukosować końcówkę.
    11. Po osiągnięciu rezystancji 20 MΩ należy zdjąć mikropipetę z ukosownika.
    12. Wyjmij końcówkę z mikropipety i wyjmij mikropipetę z ukosownika. Pozostawiona na ukosowcu mikropipeta może pęknąć lub utworzyć większy otwór na jej końcu; Dlatego ważne jest, aby monitorować miernik i końcówkę podczas ukosowania.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    13. Umieść skośną mikropipetę na uchwycie mikropipety i użyj obiektywu 10x w oprogramowaniu mikroskopu, aby zmierzyć rozmiar otworu końcówki. Wielkość próbki wynosząca 10 końcówek jest wystarczająca do sprawdzenia spójności we wszystkich fazowanych końcówkach.
    14. Przed zrobieniem zdjęcia upewnij się, że ustawienie mikroskopu (10x) jest zgodne z ustawieniami aparatu. Wartości odstające mogą zostać wyrzucone po pomiarach otwarcia końcówki.
    15. Aby wyłączyć ukosowanie, należy przekręcić przełącznik w położenie "off" zarówno na silniku paska napędowego, jak i na mierniku impedancji.
    16. Odkręć cokół/płytę szlifierską, aby zdjąć górny pierścień ustalający. Nie podnoś cokołu/płyty szlifierskiej, gdy są one ze sobą połączone, ponieważ może pęknąć z powodu wytworzonej podciśnienia.
    17. Po podniesieniu górnego pierścienia ustalającego nasadki za pomocą, zsuń drobną płytkę szlifierską i podnieś ostatnią nasadkę magnetyczną, aby ją zdjąć. Usuń nadmiar oleju z kwarcowej powierzchni optycznej chusteczkami laboratoryjnymi.
    18. Wyczyść wszystkie trzy elementy wodą dejonizowaną (DI) i osusz, aby uniknąć tworzenia się kryształów soli. Po długim okresie użytkowania obrotowa podstawa magnetyczna może ulec szarpaniu. W takim przypadku spryskaj pasek napędowy niewielką ilością wody DI, aby usunąć skrystalizowaną sól.
    19. Zetrzyj nadmiar oleju z tyłu płyty szlifierskiej, a także z kwarcowej płaskiej powierzchni optycznej.
    20. Użyj wody DI na platformie ukosowacza, aby usunąć nadmiar soli fizjologicznej, która może znajdować się na instrumencie, aby uniknąć krystalizacji.
    21. Użyj wody DI do umycia skośnych końcówek. Jeśli końcówki nie zostaną umyte, ulegną krystalizacji, ale można je później łatwo zmyć wodą DI.
    22. Połóż glinę w talerzu i użyj szkła nakrywkowego, aby zapobiec zanieczyszczeniu mikropipet.
    23. Zrób wgłębienia w glinie, aby przytrzymać mikropipety. Gotowe do użycia, skośne końcówki są teraz gotowe do zasypania interesującym związkiem i wstrzyknięcia do układu naczyniowego dżdżownicy. W tym przykładzie protokołu użyto środków kontrastowych, mikropęcherzyków, jako związku zainteresowania.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Kalibracja mikrowtryskiwaczy ze ściętymi końcówkami

  1. Przygotuj płytę pokrytą hydrofobem.
    1. Dzień wcześniej pokryj dwie płytki powłoką hydrofobową na powierzchni, aby utwardziły się przez noc. Ta substancja chemiczna powinna pochodzić z materiałów kupionych w sklepie lub z wewnętrznych materiałów laboratoryjnych, jeśli są dostępne, a utwardzenie wymaga co najmniej 12 godzin.
    2. Powlekanie to szybki, dwuetapowy proces. Spryskaj lakierem bazowym, a następnie spryskaj lakierem nawierzchniowym.
    3. W kapturze lub na otwartej przestrzeni spryskaj lakier bazowy na talerz po energicznym potrząśnięciu puszką z powłoką bazową, gdy kulki mieszające grzechoczą przez minutę.
    4. Spryskaj płytkę lakierem bazowym około 6-12 cali od powierzchni, wykonując przejścia podczas powlekania płytki. Przełęcze składają się z przejść światła od prawej do lewej, a następnie w górę i w dół. Kontynuuj potrząsanie, gdy płyta jest powlekana, i uważaj, aby nie spryskiwać nadmiernie, ponieważ zmniejszy to wydajność produktu.
    5. Odczekaj 1-2 minuty przed nałożeniem kolejnej warstwy lakieru bazowego. Chociaż nie jest to konieczne, w razie potrzeby można nałożyć dodatkową powłokę.
    6. Poczekaj 30 minut, aż warstwa bazowa wyschnie.
    7. Powtórz kroki 2.1.3 - 2.1.5 dla warstwy wierzchniej.
    8. Po utwardzeniu płytki przez noc lub przez co najmniej 12 godzin, jest ona gotowa do napełnienia olejem mineralnym. Napełnij talerz olejem mineralnym mniej więcej do połowy.
    9. Umieść płytkę z olejem mineralnym na stoliku mikrowtryskiwacza.
  2. Załaduj skośne końcówki na mikrowtryskiwacz.
    1. Podłącz mikrowtryskiwacz bezpośrednio do laboratoryjnego strumienia sprężonego powietrza. W tym systemie można użyć butli ze sprężonym azotem i regulatora ciśnienia, ale należy pamiętać, że inne systemy mikrowtryskiwaczy mogą wymagać innego interfejsu.
    2. Otwórz sprężone powietrze i otwórz regulator przewodu powietrza niskiego ciśnienia na 70 PSI i włącz mikrowtryskiwacz. Nie przekraczaj 80 PSI, ponieważ system nie jest w stanie obsłużyć powyżej 80 PSI.
    3. Napełnij końcówki wodą za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z metalową igłą w piaście. Jeśli wewnętrzna średnica pipety jest inna, potrzebna będzie metalowa igła o innej grubości, aby ją pomieścić.
    4. Po zalaniu wodą załadować mikropipetę na uchwyt igły mikromanipulatora joysticka. Można stosować różne mikroiniektory i mikromanipulatory.
  3. Tworzenie pęcherzyków wody w celu kalibracji objętości dozowania za pomocą mikropipety ze skosem.
    UWAGA: Przed podaniem jakiegokolwiek związku do układu krwionośnego dżdżownicy, mikrowstrzykiwacz musi zostać skalibrowany w celu określenia prawidłowej objętości wstrzyknięcia.
    1. Ustaw parametry na mikrowtryskiwaczu na ciśnienie 4 PSI i czas na 0,5 sekundy. Przekroczenie tych parametrów spowoduje zniekształcenie wielkości naczynia, co jest niekorzystne, chyba że celem badacza jest badanie rozszerzalności naczynia.
    2. Opuść końcówkę pipety, aż znajdzie się blisko dna płytki, ale należy uważać, aby nie złamać końcówki na dnie płytki. Im niżej końcówka znajduje się w oleju mineralnym, tym bardziej lepka będzie na końcówce, co może prowadzić do pęknięcia.
    3. Zacznij od krawędzi płytki, aby w pełni wykorzystać płytkę podczas kalibracji.
    4. Po ustawieniu się na swoim miejscu naciśnij pedał, aby dozować pęcherzyk wody do oleju.
    5. Bańka może pozostać przyklejona do końcówki. Aby temu zaradzić, należy szybko odciągnąć płytkę w kierunku przeciwnym do pęcherzyka, aby oddzielić ją od końcówki pipety.
    6. Za pomocą oprogramowania aparatu zmierz rozmiar bąbelka i oblicz objętość. Jeśli żadne oprogramowanie aparatu nie jest dostępne, można użyć alternatywnego oprogramowania.
    7. Utwórz 10 pęcherzyków i zmierz średnią średnicę pęcherzyków, aby określić prawidłową objętość, jaką mikropipeta dozuje do układu krwionośnego dżdżownic.
      UWAGA: Jeśli badacz jest zainteresowany dozowaniem różnych objętości, można manipulować parametrami ciśnienia i czasu; Powtórzyć kroki 2.3.1 - 2.3.7.

3. Przygotowanie do operacji dżdżownic w celu odsłonięcia określonego układu naczyniowego dżdżownic

  1. Przygotowanie i pomiary dżdżownic
    1. Przed zabiegiem przygotuj 10% roztwór etanolu, który znieczuli dżdżownice.
    2. Trzymaj dżdżownice w zlewce o pojemności 100 ml z glebą między eksperymentami.
    3. Przechowuj tylko 5 - 10 dżdżownic na raz w zlewce, aby zapobiec wysychaniu dżdżownic z powodu nagłych zmian z lodówki na blat, od 4 °C do 25 °C.
    4. Umieść dżdżownice w 10% etanolu na 30 minut. Jeśli dżdżownica nadal się porusza po 30 minutach, pozostaw ją w roztworze etanolu na dodatkowe 5 minut.
      UWAGA: Czasami dżdżownica potrzebuje więcej czasu ze względu na swój rozmiar; Dlatego czas w etanolu może wymagać dostosowania do wielkości dżdżownic, ale nie dłużej niż godzinę. Ponad godzina zaszkodzi dżdżownicy.
    5. Opłucz dżdżownicę pod wodą z kranu, aby usunąć wytwarzany przez nią szlam i etanol.
    6. Połóż dżdżownicę na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar wody.
    7. Po znieczuleniu dżdżownicy zapisz wagę każdej dżdżownicy (g), szerokość (mm), długość (mm) i szerokość naczynia (μm). Weź wagę i wymiary dżdżownicy przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć i bez rozciągania dżdżownicy.
    8. Gdy naczynie zostanie chirurgicznie odsłonięte pod mikroskopem, użyj oprogramowania kamery, aby zmierzyć szerokość naczynia. Jeśli nie jest dostępne żadne oprogramowanie aparatu, wystarczy mikrolinijka ze stali nierdzewnej, chociaż nie jest ona tak dokładna jak pomiar za pomocą oprogramowania cyfrowego.
      UWAGA: W zależności od interesującego Cię naczynia, przejdź do kroku 3.2 (naczynie brzuszne), 3.3 (naczynie grzbietowe), 3.4 (widok serca z góry) lub 3.5 (widok serc z boku).
  2. Odsłanianie układu naczyniowego dżdżownic, naczynia brzusznego (metoda 1)
    1. Użyj gumowej podkładki podczas zabiegu chirurgicznego, aby przygwoździć dżdżownicę, odsłaniając w ten sposób naczynie interesujące badacza. Ciemna część skóry powinna być skierowana w dół.
    2. Aby chirurgicznie otworzyć dżdżownicę, umieść ją na jej grzbietowej stronie, ciemniejszej części dżdżownicy, gdzie na skórze wykonuje się małe boczne nacięcie o długości około 1 mm za pomocą ostrza. To małe nacięcie pozwala nożyczkom chirurgicznym wejść w celu utworzenia długiego nacięcia.
    3. Przypnij skórę dżdżownic w odległości 33 mm od siebie, tworząc otwór o średnicy 27 mm, aby odsłonić naczynie, używając tylko czterech szpilek, aby prawidłowo odsłonić naczynie. Szpilki można dodawać lub przesuwać, po przypięciu dżdżownicy, aby pomóc manipulować skórą dżdżownicy.
    4. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie, aby dotrzeć do drugiej szpilki z boku ciała. Popychając się w kierunku skóry, zapobiega uszkodzeniom wnętrza dżdżownicy, takim jak przecięcie układu krwionośnego lub jelit.
    5. Po wykonaniu nacięcia przypnij lub ponownie przypnij miejsce, w którym wykonano pierwsze nacięcie, a następnie na końcu cięcia.
    6. Za pomocą obu narzędzi chirurgicznych (uchwytów chirurgicznych) przesuń skórę, aby odsłonić wnętrze dżdżownicy.
    7. Przygnij skórę na dole, gdy skóra jest przesuwana, a przesuwając się w górę dżdżownicy, kontynuuj ostrożne oddzielanie skóry od narządów. Na górze umieść ostatnią szpilkę.
    8. Jeśli naczynie nie jest odsłonięte, pociągnij za przeciwne strony skóry dżdżownicy, aby oddzielić elastyczną tkankę dżdżownicy, aby odsłonić naczynie brzuszne i dalej oddzielić skórę.
      UWAGA: To szarpnięcie usunie część tkanki, która utrzymuje narządy wewnątrz dżdżownicy. Zachowaj ostrożność na tym etapie, ponieważ może to nieumyślnie pęknąć naczynia dżdżownicy. Naczynie brzuszne powinno być teraz odsłonięte, a rdzeń nerwowy może funkcjonować jako marker naczynia, ponieważ rdzeń nerwowy biegnie wzdłuż skóry tuż obok i równolegle do naczynia brzusznego. Jeśli naczynie brzuszne znajduje się blisko jelita, pociągnięcie za skórę może jeszcze bardziej odsłonić naczynie. Jeśli nie, odepchnij jelito na bok, ale może to spowodować bałagan w miejscu pracy.
  3. Odsłonięcie układu naczyniowego dżdżownic, naczynie grzbietowe (metoda 2)
    UWAGA: Kroki odsłaniania naczynia grzbietowego są podobne do odsłonięcia naczynia brzusznego.
    1. Powtórz kroki 3.2.1 - 3.2.3 z kroku 3.2. W przypadku tych kroków ciemna część skóry powinna być skierowana do góry.
    2. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć w kierunku środka dżdżownicy na przeciwną stronę.
    3. Od środka dżdżownicy wykonaj nacięcie w kierunku przedniej części dżdżownicy, głowy. Pchanie w górę w kierunku skóry zapobiega uszkodzeniom wnętrza dżdżownicy, takim jak przecięcie naczynia lub jelita.
    4. Po wykonaniu cięcia ukośnego przypnij lub ponownie przypnij miejsce pierwszego nacięcia, a następnie na końcu wykonanego cięcia.
    5. Powtórz kroki 3.2.6 - 3.2.9 w kroku 3.2.
      UWAGA: Naczynie grzbietowe powinno być teraz odsłonięte.
  4. Odsłonięcie układu naczyniowego dżdżownic, widok serca z góry (metoda 3)
    1. Podczas zabiegu chirurgicznego użyj gumowej podkładki, aby przygwoździć dżdżownicę, odsłaniając w ten sposób naczynie interesujące badacza.
    2. Aby chirurgicznie odsłonić dżdżownicę, umieść ją na jej brzusznej stronie, jasnej części dżdżownicy. Ciemna część skóry powinna być skierowana do góry.
    3. Użyj czterech szpilek, aby przytrzymać skórę dżdżownicy i stworzyć okno, aby odsłonić serca zainteresowania. Dodatkowa szpilka, w sumie pięć, może być użyta do przytrzymania dżdżownicy w pobliżu czubka jej głowy, przedniego końca.
    4. Rozpocznij przypinanie dżdżownicy od dołu do góry, zaczynając od prawej strony, a następnie przesuwając się na lewą stronę. Przypnij dżdżownicę, umieszczając dwie szpilki na górze w pobliżu czubka głowy, przedniego końca i dwie w pobliżu łechtaczki.
    5. Za pomocą ostrza wykonaj małe nacięcie około 1 mm z boku dżdżownicy.
    6. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć w kierunku środka dżdżownicy po przeciwnej stronie.
    7. Od środka dżdżownicy wykonaj cięcie w kierunku przodu dżdżownicy, aż dotrze do ujścia dżdżownicy, przedniego końca.
      UWAGA: Ważne jest, aby nożyczki były uniesione przy skórze, aby uniknąć przecięcia naczyń krwionośnych; Ostrze nożyczek jest widoczne, gdy przechodzisz przez skórę. Upewnij się, że cięcie jest wykonane na przednim końcu dżdżownicy, ponieważ zapewni to lepszą widoczność serc.
    8. Po przypięciu ponownie przypnij dżdżownicę, jeśli skóra zwija się w dżdżownicę.
    9. Wykonaj szarpnięcie, aby odpowiednio oddzielić tkankę dżdżownicy, aby prawidłowo odsłonić serca.
    10. Jeśli serca nie są odsłonięte, poruszaj białymi pęcherzykami nasiennymi, ponieważ serca czasami chowają się pod tymi pęcherzykami.
      UWAGA: Narażenie serca może się różnić od dżdżownicy do dżdżownicy, wszystkie 10 serc może być widocznych lub tylko połowa i tak dalej. W tym momencie badacz musi określić, czy przesunąć narządy i tkanki, aby zlokalizować serca dżdżownicy.
  5. Odsłonięcie układu naczyniowego dżdżownic, widok z boku serca (metoda 4)
    1. Podczas zabiegu chirurgicznego użyj gumowej podkładki, aby przygwoździć dżdżownicę, odsłaniając w ten sposób naczynie interesujące badacza.
    2. Aby chirurgicznie odsłonić dżdżownicę, połóż ją na boku. Ponieważ dżdżownica jest na boku, zarówno jasna, jak i ciemna strona dżdżownicy powinna być widoczna
      3. .
    3. Powtórz kroki 3.4.3 - 3.4.9 od kroku 3.4.
    4. Jeśli serca nie są odsłonięte, poruszaj białymi pęcherzykami nasiennymi, ponieważ serca czasami chowają się pod tymi pęcherzykami.
      UWAGA: Narażenie serca może się różnić od dżdżownicy do dżdżownicy, wszystkie pięć serc może być widocznych lub mniej. W tym momencie badacz musi określić, czy przesunąć narządy i tkanki, aby zlokalizować serca dżdżownicy.

4. Podawanie związków do naczyń krwionośnych dżdżownic

  1. Przygotowanie dżdżownicy do podawania związków
    UWAGA: W przypadku tych konkretnych kroków wstrzyknęliśmy środki kontrastowe, mikropęcherzyki, do układu naczyniowego dżdżownic jako związek będący przedmiotem zainteresowania.
    1. Przed mikroiniekcją umieść dżdżownicę na etapie mikroiniekcji i użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć wszelkie płyny wokół naczynia, odsłaniając w ten sposób naczynia krwionośne do wstrzyknięcia.
      UWAGA: Nie należy wywierać silnego nacisku, ponieważ spowoduje to krwawienie z naczynia.
    2. Ustawić interesujące nas naczynia krwionośne do mikropipety, ponieważ ważne jest, aby naczynie brzuszne było wyrównane do wstrzyknięcia. Jeśli serca są przedmiotem zainteresowania, muszą być prostopadłe do mikropipety.
    3. Skoncentruj mikroskop na interesującym Cię układzie naczyniowym i zacznij opuszczać mikropipetę do układu naczyniowego. Przed przesunięciem któregokolwiek z manipulatorów joysticka upewnij się, że wszystkie są ustawione na 0 mm, aby zapewnić najlepszą mobilność.
    4. Gdy końcówka mikropipety styka się z naczyniem na dżdżownice, upewnij się, że kąt między naczyniem a mikropipetą jest mniejszy niż 15°.
    5. Gdy mikropipeta zacznie wywierać nacisk na naczynie, krew odsunie się od końcówki z powodu nacisku na naczynia krwionośne. Jest to dobry wskaźnik prawidłowego umiejscowienia wstrzyknięcia.
    6. Aby zapewnić pomyślne wstrzyknięcie, należy przesunąć mikropipetę do przodu za pomocą joysticka, aby zetknąć się z układem naczyniowym.
      UWAGA: Ważne jest, aby nie przebić naczynia. Zwróć uwagę, że końcówka powinna przesuwać naczynia krwionośne w kierunku grzbietowym i brzusznym w kierunku, w którym porusza się mikropipeta, a następnie należy użyć grubego pokrętła do przesunięcia końcówki mikropipety do przodu, aby umożliwić pełną penetrację naczynia. Jeśli płytka jest ruchoma, można ją wykorzystać do przesuwania i przebijania naczynia do mikropipety zamiast korzystania z mikrokontrolerów lub wszystkich jednocześnie. Naczynie nie zostanie przebite od razu, ale odrzut naczynia jest wskaźnikiem prawidłowej penetracji mikropipety. Gdy końcówka wniknie w naczynie, naczynie powinno być proste i wyrównane z mikropipetą. Jeśli tak nie jest, powoli wycofaj mikropipetę za pomocą precyzyjnego regulatora.
    7. Naciśnij pedał, aby wstrzyknąć naczynia krwionośne dżdżownicy. Rozcieńczenie krwi jest kolejnym wskaźnikiem prawidłowej penetracji po naciśnięciu pedału.
    8. Powoli schować mikropipetę i odciągnąć ją od siebie.
      UWAGA: Alternatywnie, złamanie końcówki, gdy mikropipeta jest nadal w naczyniu, jest skuteczną metodą uniknięcia utraty krwi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poniższe reprezentatywne wyniki opierają się na zestawie określonych parametrów, które obejmują ustawienia wykorzystane do wyciągania pipety szklanej, rozmiar otworu pipety uformowany pod danym kątem ścięcia oraz ciśnienie i czas mikroiniekcji. Na Rysunku 1 przedstawiono schemat przepływu obrazujący cały proces od początku do końca.

W zależności od wybranych parametrów wyciągarki do pipet, z procesu wyciągania powstanie końcówka o następującym kształcie (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż dżdżownica zawiera 10% etanolu, szczególnie jeśli dżdżownica jest w starszym wieku, mogą wystąpić niepożądane skutki w przypadku czasu ekspozycji dłuższego niż 30 minut; Jelita zaczną się pogarszać, a kiedy dżdżownica zostanie chirurgicznie otwarta, jej jelita wewnętrzne rozprzestrzeniają się. Dlatego zachęca się do stosowania dżdżownic młodych i w średnim wieku. Podczas procesu przecinania skóry dżdżownicy konieczne jest, aby nie wykonywać pełnego cięcia nożycami, co oznacza, że badacz musi ciąć tylko do połowy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez NSF-FDA Scholar-in-Residence Fellowship (NSF-FDA SIR, #1641221), US Food and Drug Administration Office Chief Scientist Challenge Grant (FDA OCS), National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (NSF IGERT, #1144646) i wspierana przez Office of Science and Engineering Laboratories (OSEL) przy Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klej tkankowy 3M Vetbond3M Vetbond084-1469SBKlej weterynaryjny do butelek 3 ml - płynny band-aide
40x Mikroskop stereoskopowySutter Instrument Co.BV-10-DNie jest potrzebny, można dodać inne lunety
500 Large WormsWindsor Wholesale Bait500 Large
Beveler Olej stojącySutter Instrument Co.008
OstrzaTed Pella, Inc121-2
Szkło borokrzemianowe z włóknemSutter Instrument Co.BF150-86-10
KameraAmScopeMU500
KameraAmScopeMU1803-CK8MP USB3.0 Mikroskop Aparat cyfrowy
Elektroda Miernik impedancjiSutter Instrument Co.BV-10-C
EtanolSigma AldrichE7023-1L
Czysty etanol FilamentSutter Instrument Co.FT315Brynna żarnika
Płyta szlifierskaSutter Instrument Co.104DFine Plate
Sól fizjologiczna klasy szpitalnejBaxter Healthcare Corporation2F71240,9% Joystick do nawadniania chlorkiem sodu
MikromanipulatorNarishigeMN-151
KimWipes Kimtech ScienceKimberly-Clark Professional34155
Leafgro LeafGro5892521,5 stopy sześciennej
Metalowa igła piastyHamilton91024Luer Lock Metalowa igła
Klipsy do mikronaczyńWPI501779-G
MikrowtryskiwaczTriTech ResearchMINJ-D
Micropiette Puller Model P-97Sutter Instrument Co.P-97
Ukosowanie mikropipetSutter Instrument Co.Mikroskop BV-10-B
AmScopeSM-8TPW2-144S3.5X-225X Simul-Focal Przegubowy
uchwyt igłyTriTech ResearchMINJ-4
NeverWetRust-OleumNeverWet
Pyrex GlassCorning08747AFisher Producent
Nierdzewna mikrolinijkaTed Pella, Inc13635Mikrolinijka zamontowana na uchwycie, skala 10 mm, z liniami w odstępach co 0,01 mm
Uchwyty chirurgiczneTed Pella, Inc53073Kleszcze, Hemostat
Nożyczki chirurgiczneTed Pella, Inc1320Nożyczki do cienkiej tęczówki, proste
U.S.P. Smar do oleju mineralnego Środek przeczyszczającyŁabędźOlej
do mikroskopu mineralny

Bibliografia

  1. Stevenson, J. The Oligochaeta. , Claredon Press. Oxford. 685(1930).
  2. Reynolds, J. W., Reynolds, W. M. Earthworms in medicine. American Journal of Nursing. 72 (7), 1273(1972).
  3. Gates, G. E. The earthworms of Rangoon. Journal of the Burma Research Society. 25, 196-221 (1926).
  4. Carr, L. G. K. Interesting animal foods, medicines, and omens of the eastern Indians, with comparisons to ancient European practices. Journal of the Washington Academy of Sciences. 41 (7), 229-235 (1951).
  5. Price, S. F. Kentucky folk-lore. The Journal of American Folklore. 14 (52), 30-38 (1901).
  6. Elmer, J., Palmer, A. F., Cabrales, P. Oxygen delivery during extreme anemia with ultra-pure earthworm hemoglobin. Life Sciences. 91 (17-18), 852-859 (2012).
  7. Eyambe, G. S., Goven, A. J., Fitzpatrick, L. C., Venables, B. J., Cooper, E. L. A non-invasive technique for sequential collection of earthworm (Lumbricus terrestris) leukocytes during subchronic immunotoxicity studies. Laboratory Animals. 25 (1), 61-67 (1991).
  8. Basley, K., Goulson, D. Effects of chronic exposure to clothianidin on the earthworm Lumbricus terrestris. PeerJ. 5, 3177(2017).
  9. Mvumi, B. M., Gwenzi, W., Mhandu, M. G. Ecotoxicological effects of citrus processing waste on earthworms. Lumbricus terrestris L. Industrial Crops and Products. 110, 123-129 (2017).
  10. Furst, A. My saga with earthworms. Food and Chemical Toxicology. 40 (6), 789-791 (2002).
  11. Cooper, E. L., Hrzenjak, T. M., Grdisa, M. Alternative sources of fibrinolytic, anticoagulative, antimicrobial and anticancer molecules. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 17 (3), 237-244 (2004).
  12. Cooper, E. L., Hirabayashi, K., Balamurugan, M. Dilong: food for thought and medicine. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 2 (4), 242-248 (2012).
  13. Nagasawa, H., et al. Inhibition by lombricine from earthworm (Lumbricus terrestris) of the growth of spontaneous mammary tumours in SHN mice. Anticancer Research. 11 (3), 1061-1064 (1991).
  14. Shannon, K. M., Gage, G. J., Jankovic, A., Wilson, W. J., Marzullo, T. C. Portable conduction velocity experiments using earthworms for the college and high school neuroscience teaching laboratory. Advances in Physiology Education. 38 (1), 62-70 (2014).
  15. National Research Council. A framework for K-12 science education: Practices, crosscutting concepts, and core ideas. , National Academies Press. (2012).
  16. Ramsay, J. The Osmotic Relations of the Earthworm. Journal of Experimental Biology. 26 (1), 46-56 (1949).
  17. Mulloney, B. Structure of the Giant Fibers of Earthworms. Science. 168 (3934), 994-996 (1970).
  18. Kim, Y., Nabili, M., Acharya, P., Lopez, A., Myers, M. R. Microvessel rupture induced by high-intensity therapeutic ultrasound - a study of parameter sensitivity in a simple in vivo model. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5 (1), 5(2017).
  19. Wahab, R. A., et al. Mechanical bioeffects of pulsed high intensity focused ultrasound on a simple neural model. Medical Physics. 39 (1), 4274-4283 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Model dżdżownicyukład naczyniowy bezkręgowcówtechnika mikrowstrzykiwanianaczyniowy układ krążenianaczynie grzbietowenaczynie brzusznepseudosercawstrzykiwanie mikropipetąstruktura hemoglobiny

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.