Rozważania dotyczące gromadzenia, przetwarzania i przechowywania w badaniach biomarkerów moczu

Summary

Ten protokół ma na celu dostarczenie informacji na temat pobierania, przetwarzania i przechowywania próbek moczu do badań biomarkerów infekcji dróg moczowych.

Abstract

Istnieje kilka białek moczowych, które są obiecujące jako nowe markery infekcji dróg moczowych. Identyfikacja nowego biomarkera, który ma większą dokładność predykcyjną w porównaniu z obecnymi metodami diagnostycznymi, może znacznie poprawić zdolność leczenia pacjentów z infekcjami dróg moczowych. Jednak pobieranie, przetwarzanie i przechowywanie próbek może potencjalnie wpłynąć na wyniki badań nad biomarkerami. Zrozumienie wpływu każdego z tych etapów na badania biomarkerów jest niezbędne do informowania o przyszłych, wysokiej jakości badaniach w tej dziedzinie, a także do krytycznego przeglądu innych badań w tej dziedzinie. W niniejszym artykule dokonano przeglądu literatury dotyczącej skutków każdego etapu przetwarzania próbki moczu i opisano wpływ różnych schorzeń na białka moczu. Protokół będzie koncentrował się na technikach pobierania, czasie i temperaturze przechowywania, technikach przetwarzania, stosowaniu odczynników i długoterminowym zamrażaniu stabilności biomarkerów. Skupi się na białkach, ale pokrótce omówi inne materiały, które można wykorzystać w badaniach nad biomarkerami. W ten sposób protokół ten będzie stanowił przewodnik dla przyszłych badaczy, który pomoże w projektowaniu badań biomarkerów moczu.

Introduction

Infekcje dróg moczowych (UTI) są jedną z najczęstszych infekcji bakteryjnych zarówno u dzieci, jak i u dorosłych¹. Podczas gdy diagnoza ZUM w niektórych populacjach może być nieskomplikowana, w innych, takich jak osoby z pęcherzami neuropatycznymi². Możliwość dokładnego diagnozowania ZUM pomoże usprawnić działania związane z zarządzaniem antybiotykami poprzez zmniejszenie stosowania niepotrzebnych antybiotyków i potencjalnie pomoże we wcześniejszej diagnozie ZUM, zmniejszając w ten sposób ryzyko zachorowalności. Biorąc pod uwagę rozpowszechnienie infekcji dróg moczowych, istnieje duże zainteresowanie poprawą zarządzania tą powszechną infekcją.

W literaturze pojawia się coraz więcej nowych biomarkerów, które są obiecujące pod względem zdolności do diagnozowania UTI^3,4,5,6,7. Istnieje jednak kilka czynników związanych z przetwarzaniem próbek moczu, które mogą zmienić wyniki. Czynniki te obejmują metody zbierania, temperaturę i czas krótko- i długoterminowego przechowywania, techniki przetwarzania, użycie odczynników oraz cykle zamrażania i rozmrażania⁸. Zrozumienie, w jaki sposób zmiany w każdym z nich mogą wpływać na odczyty biomarkerów, jest niezbędne zarówno do krytycznej interpretacji badań w literaturze, jak i do zaprojektowania wysokiej jakości badań skoncentrowanych na biomarkerach moczu.

Tutaj znajduje się opisowy przegląd literatury na temat wpływu każdego czynnika, w tym technik zbierania, krótko- i długoterminowej temperatury i czasu przechowywania, użycia odczynników oraz wpływu cykli zamrażania i rozmrażania, na białka, które mogą być użyteczne jako biomarkery moczu i dostarczają zaleceń dotyczących optymalnego przetwarzania na podstawie tego przeglądu literatury. Protokół ten skupi się na biomarkerach białkowych mierzonych za pomocą western blot lub ELISA.

Protocol

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach. Upewnij się, że zgoda została uzyskana od instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB) przed pobraniem i wykorzystaniem próbek biologicznych do badań.

1. Kolekcja

1. Pobrać próbkę moczu w sterylnym kubku na próbkę. Zdecyduj o rodzaju próbki moczu, a także o konkretnych kryteriach włączenia i wyłączenia, w oparciu o konkretny projekt badania. W przypadku badań ZUM należy zastosować metodę czystego złapania lub cewnikowania, aby uniknąć zanieczyszczenia krocza.
2. Aby uzyskać czystą próbkę moczu, poinstruuj uczestników, aby wytarli obszar okołocewkowy chusteczką, odprowadzili niewielką ilość moczu do toalety, a następnie oddali mocz do kubka na próbkę.
3. Poinstruuj kobiety, aby używały palców do rozchylania warg sromowych, a mężczyzn, aby cofnęli napletek (jeśli dotyczy) przed oddaniem moczu, aby uniknąć zanieczyszczenia.
4. Zapisz czas odbioru.
5. Zbierz odpowiednie dane kliniczne od każdego uczestnika, zgodnie z wymaganiami indywidualnego projektu badania i pytania badawczego.
6. Rozważ wykonanie analizy moczu lub prętowego wskaźnika poziomu moczu na każdej próbce przed przetworzeniem i przechowywaniem, jeśli dane te nie są wiarygodnie dostępne w elektronicznej dokumentacji medycznej.

2. Przetwarzanie i przechowywanie próbek

1. Próbki należy natychmiast przetworzyć. Jeżeli nie jest to możliwe, należy przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez okres do 24 godzin.
2. Jeżeli próbki nie mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C dłużej niż 24 godziny, należy dodać do próbek 0,2 M kwasu borowego lub 10 mM NaN₃ do próbek. Sprawdź, czy takie odczynniki są kompatybilne z planowanymi dalszymi zastosowaniami.
3. Zapisać czas przebywania próbek w temperaturze 4 °C.
4. Odwirować próbki przy 1000-1500 x g przez 10-20 minut. Wirowanie nie musi odbywać się w temperaturze 4 °C.
5. Zebrać sklarowany osad i rozdzielić go na osobne probówki do mikrowirówek.
6. Oznacz probówki wieloma przezroczystymi identyfikatorami (takimi jak data i identyfikacja próbki (ID)). Rozważ użycie komputerowo generowanych kodów kreskowych zaprojektowanych specjalnie do przechowywania próbek biologicznych w temperaturze -80 °C. Jeśli nie jest dostępny, upewnij się, że wstrzykiwacz używany do oznaczania próbek jest wodoodporny.
7. Oznacz każde pudełko zamrażarki tak, aby każda lokalizacja miała określony kod. W tym celu ponumeruj każdą kolumnę inną literą, a każdy wiersz liczbą. Pozwoli to na tworzenie map lub innych przewodników w celu łatwej lokalizacji próbki.
8. Natychmiast zamrozić próbki w temperaturze -80 °C. Zanotować czas zamrażania.
9. W dniu pomiaru próbki należy rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby zminimalizować niepotrzebne przechowywanie w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
10. Zapisać czasy i liczbę dodatkowych cykli zamrażania i rozmrażania dla każdej podwielokrotności.

3. Analiza

1. W przypadku korzystania z dostępnych na rynku testów ELISA należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Uruchom przykłady w dwóch egzemplarzach.
3. Należy określić oczekiwane stężenie białka będącego przedmiotem zainteresowania, aby upewnić się, że poziomy białka w próbkach mieszczą się w zakresie zestawu. Jeżeli oczekiwany poziom białka przekracza górną normę, należy rozcieńczyć próbki.
4. Po uzyskaniu danych z czytnika płytek (ELISA) lub western blot należy określić stężenie każdego biomarkera w próbce ręcznie (niezalecane) lub za pomocą dowolnego oprogramowania.
5. Przeanalizuj wyniki. Analiza danych zależy od indywidualnego projektu badania.
6. Rozważ dostosowanie wartości biomarkerów, aby uwzględnić stężenie w moczu.
   UWAGA: Tradycyjnie, badacze biomarkerów stosowali kreatyninę w moczu jako metodę normalizacji, szczególnie u uczestników z prawidłową czynnością nerek, w celu wyjaśnienia stężenia moczu. Jednak inni zgłaszają, że normalizacja nie ma wpływu na wyniki⁴. Aby pokonać tę przeszkodę, niektórzy badacze zgłaszają zarówno znormalizowane, jak i nieznormalizowane wyniki.
7. Zaleca się raportowanie zakresów czasu od pobrania do zamrożenia, a także czasu czasu w temperaturze 4 °C przed przetworzeniem w opublikowanych manuskryptach, aby umożliwić interpretację wyników w kontekście przetwarzania próbki (Rysunek 1)

4. Wpływ różnych warunków przechowywania na lipokalinę związaną z żelatynazą neutrofilową (NGAL).

1. Uzupełnij świeży mocz 2 ng/ml rekombinowanego NGAL.
2. Podwielokrotność moczu i poddanie go różnym warunkom przetwarzania i przechowywania.
   1. Odwirować mocz w temperaturze 1000-1500 x g przez 10-20 minut. Wirowanie nie musi odbywać się w temperaturze 4 °C. Przechowywać w różnych warunkach (20 °C, 4 °C, -20 °C) przez 24 godziny, 48 godzin lub 72 godziny.
   2. Przechowywać podwielokrotność próbki w temperaturze -80 °C dla porównania.
3. Po utrzymaniu próbek w różnych warunkach, jak wspomniano w kroku 4.2.1, należy zmierzyć poziomy NGAL w próbkach za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELISA, który zawiera kontrole zgodnie z instrukcjami producenta.

Results

Wirowanie miało niewielki wpływ na poziom NGAL. Próbki odwirowane przechowywane w temperaturze -80 °C miały niższy poziom NGAL niż próbki nieodwirowane (2,17 ng/ml ± 0,32 ng/ml, 2,77 ng/ml ± 0,21 ng/ml). Cykle zamrażania miały również wpływ na poziomy NGAL po trzecim cyklu zamrażania i rozmrażania. (Rysunek 2). Spośród badanych warunków (wirowanie, cykle zamrażania i rozmrażania oraz temperatura przechowywania) temperatura przechowywania miała największy wpływ na poziomy NGAL. Przechowywanie w tempera...

Discussion

Znaczenie uzyskania spójnych i odtwarzalnych wyników nie ogranicza się do sukcesu poszczególnych badań, ale umożliwi również lepsze porównanie wyników w literaturze⁹. Różnice między badaniami na kluczowych etapach procedury mogą wprowadzać nieodwracalne odchylenia, które mogą wpływać na sygnały biomarkerów i ich interpretację, co może być odpowiedzialne za rozbieżności między kilkoma badaniami¹⁰. Wskazuje to na potrzebę ustanowienia bardziej ustandaryzowanego podejścia do p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kwas borowy	Sigma-Aldrich	B6768	Należy wziąć pod uwagę w przypadku próbek, które nie mogą być szybko przetworzone i zamrożone
Zamrażarki	Fisher Scientific	03-395-464
Probówki do mikrowirówek	Thomas scientific	1149X93
Zestaw NGAL ELISA	R& D Systems	DLCN20	Służy do tworzenia reprezentatywnych wyników
Pipeta i końcówki	W zależności od wielkości pipety i objętości płynu.
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002	Należy wziąć pod uwagę w przypadku próbek, które nie mogą być szybko przetworzone i zamrożone
Kubeczki do zbierania moczu	Thermo Scientific	3122B03ORG	Sterylne kubki nie są wymagane, chyba że są potrzebne do innych badań