Artykuł metodologiczny

Rozważania dotyczące gromadzenia, przetwarzania i przechowywania w badaniach biomarkerów moczu

DOI:

10.3791/62453

⸱

21 października 2021

 , 
1Department of Pediatrics, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu dostarczenie informacji na temat pobierania, przetwarzania i przechowywania próbek moczu do badań biomarkerów infekcji dróg moczowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka białek moczowych, które są obiecujące jako nowe markery infekcji dróg moczowych. Identyfikacja nowego biomarkera, który ma większą dokładność predykcyjną w porównaniu z obecnymi metodami diagnostycznymi, może znacznie poprawić zdolność leczenia pacjentów z infekcjami dróg moczowych. Jednak pobieranie, przetwarzanie i przechowywanie próbek może potencjalnie wpłynąć na wyniki badań nad biomarkerami. Zrozumienie wpływu każdego z tych etapów na badania biomarkerów jest niezbędne do informowania o przyszłych, wysokiej jakości badaniach w tej dziedzinie, a także do krytycznego przeglądu innych badań w tej dziedzinie. W niniejszym artykule dokonano przeglądu literatury dotyczącej skutków każdego etapu przetwarzania próbki moczu i opisano wpływ różnych schorzeń na białka moczu. Protokół będzie koncentrował się na technikach pobierania, czasie i temperaturze przechowywania, technikach przetwarzania, stosowaniu odczynników i długoterminowym zamrażaniu stabilności biomarkerów. Skupi się na białkach, ale pokrótce omówi inne materiały, które można wykorzystać w badaniach nad biomarkerami. W ten sposób protokół ten będzie stanowił przewodnik dla przyszłych badaczy, który pomoże w projektowaniu badań biomarkerów moczu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje dróg moczowych (UTI) są jedną z najczęstszych infekcji bakteryjnych zarówno u dzieci, jak i u dorosłych1. Podczas gdy diagnoza ZUM w niektórych populacjach może być nieskomplikowana, w innych, takich jak osoby z pęcherzami neuropatycznymi2. Możliwość dokładnego diagnozowania ZUM pomoże usprawnić działania związane z zarządzaniem antybiotykami poprzez zmniejszenie stosowania niepotrzebnych antybiotyków i potencjalnie pomoże we wcześniejszej diagnozie ZUM, zmniejszając w ten sposób ryzyko zachorowalności. Biorąc pod uwagę rozpowszechnienie infekcji dróg moczowych, istnieje duże zainteresowanie poprawą zarządzania tą powszechną infekcją.

W literaturze pojawia się coraz więcej nowych biomarkerów, które są obiecujące pod względem zdolności do diagnozowania UTI3,4,5,6,7. Istnieje jednak kilka czynników związanych z przetwarzaniem próbek moczu, które mogą zmienić wyniki. Czynniki te obejmują metody zbierania, temperaturę i czas krótko- i długoterminowego przechowywania, techniki przetwarzania, użycie odczynników oraz cykle zamrażania i rozmrażania8. Zrozumienie, w jaki sposób zmiany w każdym z nich mogą wpływać na odczyty biomarkerów, jest niezbędne zarówno do krytycznej interpretacji badań w literaturze, jak i do zaprojektowania wysokiej jakości badań skoncentrowanych na biomarkerach moczu.

Tutaj znajduje się opisowy przegląd literatury na temat wpływu każdego czynnika, w tym technik zbierania, krótko- i długoterminowej temperatury i czasu przechowywania, użycia odczynników oraz wpływu cykli zamrażania i rozmrażania, na białka, które mogą być użyteczne jako biomarkery moczu i dostarczają zaleceń dotyczących optymalnego przetwarzania na podstawie tego przeglądu literatury. Protokół ten skupi się na biomarkerach białkowych mierzonych za pomocą western blot lub ELISA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach. Upewnij się, że zgoda została uzyskana od instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB) przed pobraniem i wykorzystaniem próbek biologicznych do badań.

1. Kolekcja

  1. Pobrać próbkę moczu w sterylnym kubku na próbkę. Zdecyduj o rodzaju próbki moczu, a także o konkretnych kryteriach włączenia i wyłączenia, w oparciu o konkretny projekt badania. W przypadku badań ZUM należy zastosować metodę czystego złapania lub cewnikowania, aby uniknąć zanieczyszczenia krocza.
  2. Aby uzyskać czystą próbkę moczu, poinstruuj uczestników, aby wytarli obszar okołocewkowy chusteczką, odprowadzili niewielką ilość moczu do toalety, a następnie oddali mocz do kubka na próbkę.
  3. Poinstruuj kobiety, aby używały palców do rozchylania warg sromowych, a mężczyzn, aby cofnęli napletek (jeśli dotyczy) przed oddaniem moczu, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  4. Zapisz czas odbioru.
  5. Zbierz odpowiednie dane kliniczne od każdego uczestnika, zgodnie z wymaganiami indywidualnego projektu badania i pytania badawczego.
  6. Rozważ wykonanie analizy moczu lub prętowego wskaźnika poziomu moczu na każdej próbce przed przetworzeniem i przechowywaniem, jeśli dane te nie są wiarygodnie dostępne w elektronicznej dokumentacji medycznej.

2. Przetwarzanie i przechowywanie próbek

  1. Próbki należy natychmiast przetworzyć. Jeżeli nie jest to możliwe, należy przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez okres do 24 godzin.
  2. Jeżeli próbki nie mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C lub muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C dłużej niż 24 godziny, należy dodać do próbek 0,2 M kwasu borowego lub 10 mM NaN3 do próbek. Sprawdź, czy takie odczynniki są kompatybilne z planowanymi dalszymi zastosowaniami.
  3. Zapisać czas przebywania próbek w temperaturze 4 °C.
  4. Odwirować próbki przy 1000-1500 x g przez 10-20 minut. Wirowanie nie musi odbywać się w temperaturze 4 °C.
  5. Zebrać sklarowany osad i rozdzielić go na osobne probówki do mikrowirówek.
  6. Oznacz probówki wieloma przezroczystymi identyfikatorami (takimi jak data i identyfikacja próbki (ID)). Rozważ użycie komputerowo generowanych kodów kreskowych zaprojektowanych specjalnie do przechowywania próbek biologicznych w temperaturze -80 °C. Jeśli nie jest dostępny, upewnij się, że wstrzykiwacz używany do oznaczania próbek jest wodoodporny.
  7. Oznacz każde pudełko zamrażarki tak, aby każda lokalizacja miała określony kod. W tym celu ponumeruj każdą kolumnę inną literą, a każdy wiersz liczbą. Pozwoli to na tworzenie map lub innych przewodników w celu łatwej lokalizacji próbki.
  8. Natychmiast zamrozić próbki w temperaturze -80 °C. Zanotować czas zamrażania.
  9. W dniu pomiaru próbki należy rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby zminimalizować niepotrzebne przechowywanie w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
  10. Zapisać czasy i liczbę dodatkowych cykli zamrażania i rozmrażania dla każdej podwielokrotności.

3. Analiza

  1. W przypadku korzystania z dostępnych na rynku testów ELISA należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Uruchom przykłady w dwóch egzemplarzach.
  3. Należy określić oczekiwane stężenie białka będącego przedmiotem zainteresowania, aby upewnić się, że poziomy białka w próbkach mieszczą się w zakresie zestawu. Jeżeli oczekiwany poziom białka przekracza górną normę, należy rozcieńczyć próbki.
  4. Po uzyskaniu danych z czytnika płytek (ELISA) lub western blot należy określić stężenie każdego biomarkera w próbce ręcznie (niezalecane) lub za pomocą dowolnego oprogramowania.
  5. Przeanalizuj wyniki. Analiza danych zależy od indywidualnego projektu badania.
  6. Rozważ dostosowanie wartości biomarkerów, aby uwzględnić stężenie w moczu.
    UWAGA: Tradycyjnie, badacze biomarkerów stosowali kreatyninę w moczu jako metodę normalizacji, szczególnie u uczestników z prawidłową czynnością nerek, w celu wyjaśnienia stężenia moczu. Jednak inni zgłaszają, że normalizacja nie ma wpływu na wyniki4. Aby pokonać tę przeszkodę, niektórzy badacze zgłaszają zarówno znormalizowane, jak i nieznormalizowane wyniki.
  7. Zaleca się raportowanie zakresów czasu od pobrania do zamrożenia, a także czasu czasu w temperaturze 4 °C przed przetworzeniem w opublikowanych manuskryptach, aby umożliwić interpretację wyników w kontekście przetwarzania próbki (Rysunek 1)

4. Wpływ różnych warunków przechowywania na lipokalinę związaną z żelatynazą neutrofilową (NGAL).

  1. Uzupełnij świeży mocz 2 ng/ml rekombinowanego NGAL.
  2. Podwielokrotność moczu i poddanie go różnym warunkom przetwarzania i przechowywania.
    1. Odwirować mocz w temperaturze 1000-1500 x g przez 10-20 minut. Wirowanie nie musi odbywać się w temperaturze 4 °C. Przechowywać w różnych warunkach (20 °C, 4 °C, -20 °C) przez 24 godziny, 48 godzin lub 72 godziny.
    2. Przechowywać podwielokrotność próbki w temperaturze -80 °C dla porównania.
  3. Po utrzymaniu próbek w różnych warunkach, jak wspomniano w kroku 4.2.1, należy zmierzyć poziomy NGAL w próbkach za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELISA, który zawiera kontrole zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirowanie miało niewielki wpływ na poziom NGAL. Próbki odwirowane przechowywane w temperaturze -80 °C miały niższy poziom NGAL niż próbki nieodwirowane (2,17 ng/ml ± 0,32 ng/ml, 2,77 ng/ml ± 0,21 ng/ml). Cykle zamrażania miały również wpływ na poziomy NGAL po trzecim cyklu zamrażania i rozmrażania. (Rysunek 2). Spośród badanych warunków (wirowanie, cykle zamrażania i rozmrażania oraz temperatura przechowywania) temperatura przechowywania miała największy wpływ na poziomy NGAL. Przechowywanie w tempera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie uzyskania spójnych i odtwarzalnych wyników nie ogranicza się do sukcesu poszczególnych badań, ale umożliwi również lepsze porównanie wyników w literaturze9. Różnice między badaniami na kluczowych etapach procedury mogą wprowadzać nieodwracalne odchylenia, które mogą wpływać na sygnały biomarkerów i ich interpretację, co może być odpowiedzialne za rozbieżności między kilkoma badaniami10. Wskazuje to na potrzebę ustanowienia bardziej ustandaryzowanego podejścia do p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie uzyskano żadnych zewnętrznych funduszy na tę pracę. Do pozyskania danych w tej pracy wykorzystano fundusze instytucjonalne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas borowySigma-AldrichB6768Należy wziąć pod uwagę w przypadku próbek, które nie mogą być szybko przetworzone i zamrożone
ZamrażarkiFisher Scientific03-395-464
Probówki do mikrowirówekThomas scientific1149X93
Zestaw NGAL ELISAR& D SystemsDLCN20Służy do tworzenia reprezentatywnych wyników
Pipeta i końcówkiW zależności od wielkości pipety i objętości płynu.
Azydek soduSigma-AldrichS2002Należy wziąć pod uwagę w przypadku próbek, które nie mogą być szybko przetworzone i zamrożone
Kubeczki do zbierania moczuThermo Scientific3122B03ORGSterylne kubki nie są wymagane, chyba że są potrzebne do innych badań

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: Incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, 1 SUPPL. 1 5-13 (2002).
  2. Forster, C. S., Pohl, H. Diagnosis of urinary tract infection in the neuropathic bladder: Changing the paradigm to include the microbiome. Topics in Spinal Cord Injury Rehabilitation. 25 (3), (2019).
  3. Gadalla, A. A. H., et al. Identification of clinical and urine biomarkers for uncomplicated urinary tract infection using machine learning algorithms. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  4. Shaikh, N., et al. Biomarkers that differentiate false positive urinalyses from true urinary tract infection. Pediatric Nephrology. 35 (2), 321-329 (2020).
  5. Renata, Y., Jassar, H., Katz, R., Hochberg, A., Nir, R. -R., Klein-Kremer, A. Urinary concentration of cytokines in children with acute pyelonephritis. European journal of Pediatrics. 172 (6), 769-774 (2013).
  6. Forster, C. S., Haffey, W. D., Bennett, M., Greis, K. D., Devarajan, P. Identification of urinary CD44 and Prosaposin as specific biomarkers of urinary tract infections in children with neurogenic bladders. Biomarker Insights. 14, (2019).
  7. Bitsori, M., et al. Urine IL-8 concentrations in infectious and non-infectious urinary tract conditions. Pediatric Nephrology. 26 (11), Berlin, Germany. 2003-2007 (2011).
  8. Schuh, M. P., et al. Long-term Stability of urinary biomarkers of acute kidney injury in children. American Journal of Kidney Diseases. 67 (1), 56-61 (2016).
  9. Hepburn, S., et al. An analysis of the impact of pre-analytical factors on the urine proteome: Sample processing time, temperature, and proteolysis. Proteomics - Clinical Applications. 9 (5-6), 507-521 (2015).
  10. Han, W. K., Wagener, G., Zhu, Y., Wang, S., Lee, H. T. Urinary biomarkers in the early detection of acute kidney injury after cardiac surgery. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 4 (5), 873-882 (2009).
  11. Schaub, S., et al. Urine protein profiling with surface-enhanced laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Kidney International. 65 (1), 323-332 (2004).
  12. Thongboonkerd, V. Practical points in urinary proteomics. Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).
  13. Grenier, F. C., et al. Evaluation of the ARCHITECT urine NGAL assay: Assay performance, specimen handling requirements and biological variability. Clinical Biochemistry. 43 (6), 615-620 (2010).
  14. Liu, K. D., et al. Storage time and urine biomarker levels in the ASSESS-AKI study. PLoS ONE. 11 (10), 1-9 (2016).
  15. Parikh, C. R., et al. Urine stability studies for novel biomarkers of acute kidney injury. American Journal of Kidney Diseases. 63 (4), 567-572 (2014).
  16. Van De Vrie, M., Deegens, J. K., Van Der Vlag, J., Hilbrands, L. B. Effect of long-term storage of urine samples on measurement of kidney injury molecule 1 (KIM-1) and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). American Journal of Kidney Diseases. 63 (4), 573-576 (2014).
  17. Hubel, A., Aksan, A., Skubitz, A. P. N., Wendt, C., Zhong, X. State of the art in preservation of fluid biospecimens. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 237-244 (2011).
  18. Havanapan, P. O., Thongboonkerd, V. Are protease inhibitors required for gel-based proteomics of kidney and urine. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3109-3117 (2009).
  19. Thongboonkerd, V., Saetun, P. Bacterial overgrowth affects urinary proteome analysis: Recommendation for centrifugation, temperature, duration, and the use of preservatives during sample collection. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4173-4181 (2007).
  20. Saetun, P., Semangoen, T., Thongboonkerd, V. Characterizations of urinary sediments precipitated after freezing and their effects on urinary protein and chemical analyses. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 296 (6), 1346-1354 (2009).
  21. Project, H. K. Standard Protocol for Urine Collection and Storage. , (2021).
  22. Nickolas, T. L., et al. Diagnostic and prognostic stratification in the emergency department using urinary biomarkers of nephron damage: a multicenter prospective cohort study. Journal of the American College of Cardiology. 59 (3), 246-255 (2012).
  23. Forster, C. S., Loechtenfeldt, A. M., Shah, S. S., Goldstein, S. Urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin in girls with recurrent urinary tract infections. Pediatric Nephrology. , 1-8 (2020).
  24. Forster, C. S., et al. Predictive ability of NGAL in identifying urinary tract infection in children with neurogenic bladders. Pediatric Nephrology. 33 (8), Berlin, Germany. 1365-1374 (2018).
  25. Forster, C., et al. Urinary NGAL deficiency in children with recurrent urinary tract infections. Journal of Pediatric Urology. 32, 1077-1080 (2017).
  26. Gupta, S., Preece, J., Haynes, A., Becknell, B., Ching, C. Differentiating asymptomatic bacteriuria from urinary tract infection in the pediatric neurogenic bladder population: NGAL as a promising biomarker. Topics in Spinal Cord Injury Rehabilitation. 25 (3), 214-221 (2019).
  27. Shaikh, N., et al. Host and bacterial markers that differ in children with cystitis and pyelonephritis. Journal of Pediatrics. 209, 146-153 (2019).
  28. Harpole, M., Davis, J., Espina, V. Current state of the art for enhancing urine biomarker discovery. Expert Review of Proteomics. 13 (6), 609-626 (2016).
  29. Jung, C. E., et al. Benchmarking urine storage and collection conditions for evaluating the female urinary microbiome. Scientific Reports. 9 (1), 13409(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biomarkery moczowepobieranie pr bek moczustabilno biomarker wbia kowe markery moczoweprzetwarzanie pr bekprzechowywanie pr bekzaka enia dr g moczowychstabilno bia ektechniki pobierania pr bek
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły