Method Article

Struktura obliczeniowa oparta na ruchu kulek do trójwymiarowej analizy niejednorodności materiału biofilmu

DOI:

10.3791/62454

⸱

June 22nd, 2021

 , 
1Sol Sherry Thrombosis Research Center, Lewis Katz School of Medicine, Temple University, 2Department of Mathematics, Temple University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę analizy i ilościowego określania wzorca ruchu kulek karboksylowych o wielkości 1 μm przez heterogeniczne biofilmy bakteryjne. Porównanie wzorców ruchowych może być wykorzystane do ilościowego określenia różnic we właściwościach materiałowych biofilmów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnice we właściwościach materiałowych biofilmów bakteryjnych zaobserwowano w biofilmach różnych gatunków bakterii, w obrębie tego samego gatunku w różnych warunkach wzrostu i po potraktowaniu cząsteczkami modyfikującymi matrycę. Aby lepiej określić ilościowo właściwości materiałowe biofilmów 3D, opracowano eksperymentalny i obliczeniowy przepływ pracy, który zastosowano w celu zbadania różnic między biofilmami Enterococcus faecalis, serotypem Salmonella enterica Typhimurium i Escherichia coli, a także roli kędziorów amyloidowych w potwierdzaniu sztywności biofilmów Enterobacteriaceae. Dynamika czasoprzestrzenna kulek karboksylowych o wielkości 1 μm w biofilmach była śledzona w biofilmach 3D o wielkości 20 μm w ciągu 20 minut. Stosy obrazów 4D zostały przetworzone za pomocą wtyczki Mosaic w ImageJ w celu wytworzenia danych 3D trajektorii ruchu koralików. Te dane trajektorii zostały przeanalizowane za pomocą nowo opracowanego zestawu narzędzi Bead Evaluator, w którym dane dotyczące ruchu, w tym długość życia trajektorii, prędkości ściegów, gęstości komórek wzdłuż trajektorii oraz informacje o obwiedni, były obliczane i przechowywane w plikach csv. W tym artykule przedstawiono przebieg pracy od konfiguracji eksperymentalnej i rejestracji obrazu do obliczenia i analizy trajektorii ściegu. Struktura biofilmów zawierających curli skutkowała bardziej stabilnymi interakcjami perełkowymi i mniejszym ruchem kulek niż w biofilmach z mutacjami kulek i enterokokami. Ruch kulek nie wydawał się silnie zależny od gęstości komórek podczas pomiaru prędkości kulki i objętości pola granicznego trajektorii, co potwierdza hipotezę, że inne właściwości materiałowe biofilmów kontrolują dynamikę kulek. Technika ta ma szerokie zastosowanie do ilościowego oznaczania różnic w biofilmach o różnym składzie matrycy, a także biofilmów przed i po zabiegach modyfikujących matrycę.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilmy bakteryjne są wszechobecne jako część ludzkiej mikroflory i nieustannie wchodzą w interakcje z cząsteczkami. Cząsteczki te mają różną wielkość od antybiotyków 1 nm i bakterii 1-3 mm do większych cząstek błonnika w przewodzie pokarmowym. Skład jedno- lub wielogatunkowych biofilmów wpływa na właściwości materiału, a tym samym na wzorzec ruchu cząstek przez biofilmy1,2,3,4,5. Jednym z przykładów są bakteryjne amyloidy, które mają zachowaną, fibrylarną strukturę krzyżową warstwy beta6. Kędzierzawy amyloidu ulega ekspresji przez bakterie jelitowe, takie jak Escherichia coli i serotyp Salmonella enterica Typhimurium, a geny wykryto w wielu innych typach bakterii7. Curli8,9 ma wpływ na różne właściwości materiałowe biofilmów. Curli bezpośrednio oddziałuje z innymi składnikami macierzy, takimi jak zewnątrzkomórkowe DNA (eDNA) i celuloza10,11. Curli otacza komórki i wpływa na sztywność błony komórkowej12 oraz ogólne właściwości lepkosprężyste biofilmu13. Curli pośredniczy w zwiększonej wytrzymałości na rozciąganie poprzez wiązanie się z fibronektyną, co powoduje wzrost silnego przylegania do powierzchni szkła14. Nadchodzące bakteriofagi wiążą się z kędzierzawkami i ograniczają inwazję fagów do biofilmów15.

Podczas korzystania z wielotestowych powlekanych szkiełek do analizy grubych na około 20 μm Enterococcus faecalis, E. coli i S. Biofilmy Typhimurium przy użyciu mikroskopii konfokalnej, wyraźne różnice między E. coli, S. Można było zaobserwować Typhimurium10,16 i biofilmy E. faecalis (aktualne badanie). Podczas gdy biofilmy z gatunku Enterobacteriaceae miały wysoki poziom sztywności, a obszary o niskiej gęstości komórkowej były łatwe do zobrazowania, uzyskanie wyraźnych obrazów biofilmów E. faecalis o wysokiej rozdzielczości przy użyciu uśredniania linii i klatek wymagało zastosowania nacisku na szkiełko w celu wywołania napięcia powierzchniowego wystarczającego dla stabilności komórek podczas procesu obrazowania. Bakteryjne amyloidy, takie jak kędzierzawe, tworzą wysoce uporządkowane struktury, co sugeruje, że mogą być stosunkowo sztywne17. To uzasadniło hipotezę, że kędzierzawki amyloidowe mogą indukować sztywność u E. coli i S. Biofilmy Typhimurium. Nie znaleziono jednoznacznych dowodów na to, że E. faecalis wykazywał ekspresję amyloidów w badanych warunkach. Niedawno wykazano, że białko Esp, gen piliny związany z bardziej patogennymi szczepami E. faecalis, wytwarza struktury amyloidowe18; jednak przy użyciu wyszukiwań blastn i blastp gen ten nie został wykryty w szczepie E. faecalis komensal typu OG1RF użytym w tych badaniach. Feromon cOB1, wytwarzany przez OG1RF, może tworzyć struktury podobne do amyloidu19. Jednak przy danych warunkach wzrostu biofilmu i metodach wykrywania amyloidu stosowanych wcześniej w przypadku S. Barwienie amyloidem Typhimurium10 u E. faecalis, nie można wykryć amyloidów OG1RF (dane nie pokazane). Opracowano nową technikę obrazowania czterowymiarowego (4D) w celu porównania ogólnych właściwości materiału wśród lepkich E. faecalis, E. coli i S. Typhimurium, a także w celu określenia udziału amyloidu w biofilmach Enterobacteriaceae przy użyciu mutantów amyloidu S. Typhimurium i E. coli.

W przeszłości koraliki fluorescencyjne były z powodzeniem wykorzystywane do analizy właściwości materiałowych biofilmów w dwóch wymiarach (2D) za pomocą mikroreologii20,21,22,23,24,25. Można to zastosować do trójwymiarowego biofilmu, badając warstwy optyczne 2D na różnych głębokościach w biofilm26. Obecna technika została opracowana do śledzenia kulek w mikroskali 1 μm w 3D w czasie do wykorzystania w modelowaniu 4D. Jednym z przesłanek była nadrzędna koncepcja wykorzystania modelowania 4D do zrozumienia ruchu plazmidów w społecznościach mikrobioty przewodu pokarmowego. Użyto naładowanych fluorescencyjnie kulek karboksylowych o średnicy 1 μm, ponieważ dobrze odpowiadają, pod względem wielkości i ładunku, E. faecalis, wybranemu organizmowi modelowemu do ruchu i utrzymania plazmidu27, 28. Opracowano test 4D do ilościowego określenia właściwości fizycznych biofilmów (Rysunek 1A). W opracowanej metodologii do biofilmów dodawano kulki, a ich trajektorie czasoprzestrzenne rejestrowano przez biofilmy o grubości 10-20 μm w ciągu 10-20 minut. Trajektorie koralików w 3D zostały następnie określone ilościowo pod względem długości trajektorii, prędkości koralików, objętości pola granicznego trajektorii (minimalnego pudełka zawierającego trajektorię) oraz gęstości komórkowej pudełka ograniczającego przy użyciu nowo opracowanego zestawu narzędzi. Poniższy protokół może być wykorzystany do generowania danych obrazu 4D bakterii i biofilmów zawierających koraliki, do wstępnego przetwarzania danych za pomocą ImageJ29 i wtyczki Mosaic oraz do analizy trajektorii ścieżek za pomocą zestawu narzędzi Bead Evaluator.

Ta technika ma wiele zastosowań do badania właściwości materiałów, jak również śledzenia ruchu cząstek i bakterii w trzech wymiarach. Na przykład, wczesna wersja tej techniki została wykorzystana do scharakteryzowania wpływu przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko curli na integralność strukturalną biofilmów16. Pełna wersja zawiera wiele narzędzi zapewniających bardziej szczegółową analizę właściwości materiału biofilmu i jest nadal wykorzystywana do badania wpływu leczenia przeciwciałami monoklonalnymi na biofilmy. Cząstki o różnych ładunkach mogą być wykorzystywane do badania właściwości ładunku materiałowego biofilmów i ruchu cząstek przez biofilmy o różnym składzie matrycy. Można to wykorzystać do porównania wyników mikroreologii 2D, które ujawniają właściwości materiału odpowiedzialnego za ruch kulek, które zaobserwowaliśmy w biofilmach, które nie były pod przepływem. Technika ta może być również stosowana w przypadku biofilmów mieszanych gatunków z regionami o różnym składzie biofilmu. Biofilmy mogą być obrazowane na żywo pod przepływem w urządzeniach mikroprzepływowych i komórkach przepływowych w celu zbadania zmian właściwości materiału między biofilmami statycznymi i przepływowymi, a także wpływu przepływu na ruch cząstek. Techniki te można również zastosować do bakterii znakowanych fluorescencyjnie w celu scharakteryzowania ruchu bakterii egzogennych w społeczności biofilmu. Używając trzech kolorów, fluorescencyjnie znakowane bakterie dawcy, fluorescencyjnie znakowane bakterie biorcze i fluorescencyjnie znakowane plazmidy mogą być używane do śledzenia ruchu, dokowania i transferu plazmidów.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie biofilmu

UWAGA: Biofilmy do analizy mogą być hodowane przy użyciu dowolnej metody, która pozwala na tworzenie się biofilmu na powierzchni szkła optycznego. Struktura biofilmu powinna przylegać do powierzchni optycznej na tyle, aby struktura nie została naruszona podczas etapów mycia i/lub montażu protokołu. Poniżej opisano technikę dla 96-dołkowych optycznych płytek dolnych i 12-milimetrowych szklanych szkiełek nakrywkowych w płytkach 24-dołkowych. Inne opcje obejmują dolne płyty optyczne o różnych rozmiarach i optyczne komory przepływowe z przepływem i bez.

  1. Konfiguracja biofilmu
    1. Dodaj pożywkę do wzrostu bakterii do dołków płytki. W tym badaniu, w przypadku E. kału, dodać 2 ml Todda-Hewitta (TH) do płytki 24-dołkowej i dodać 0,4 ml TH do dolnych płytek 96-dołkowych. Dla S. Typhimurium, E. coli i izogeniczne mutanty kędzierzawych csgAB dodać do studzienek 0,7 ml bulionu Luria bez soli (LB). Jeśli używasz dolnych komór optycznych, przejdź do kroku 1.2.
    2. Umieść szkiełka nakrywkowe ze szkła 12 mm #1.5 na szalce Petriego i przykryj je etanolem.
    3. Za pomocą kleszczy usuń szkiełko nakrywkowe i użyj płomienia, aby podpalić pozostały alkohol. Pozwól, aby alkohol się spalił. Po prostu użyj płomienia, aby je podpalić; Nie trzymaj szkiełka nakrywkowego w płomieniu, ponieważ pęknie. Pozostaw szkiełko nakrywkowe do ostygnięcia przez 10-20 s przed umieszczeniem go w studzience, aby zapobiec pękaniu.
    4. Umieść szkiełko nakrywkowe w studzience zawierającej podłoże pod kątem, aby zapobiec jego układaniu się na podłożu. Nie dodawaj szkiełka nakrywkowego do suchego dołka, a następnie dodaj pożywkę, ponieważ spowoduje to przyklejenie się szkiełka nakrywkowego do dna studzienki.
    5. Za pomocą sterylnej końcówki pipety ostrożnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do dna studzienki zawierającej pożywkę.
      UWAGA: Pamiętaj, aby dopasować grubość (#1 lub #1.5) szkiełka nakrywkowego lub dolnej płyty optycznej do grubości optyki mikroskopu konfokalnego.
  2. Inkubuj biofilm w odpowiednich warunkach do wzrostu biofilmu. W tych badaniach biofilmy E. faecalis są hodowane jako kultury statyczne w temperaturze 37 °C, a biofilmy E. coli rozwijają się tlenowo w temperaturze 30 °C.
    1. W tych badaniach hoduj biofilmy E. faecalis przez 2 dni z przełącznikami pożywki rano i wczesnym wieczorem. Aby zapobiec uszkodzeniu lub przemieszczeniu biofilmu, ostrożnie pochyl płytkę. Umieść końcówkę pipety w pobliżu dolnej krawędzi studzienki i powoli wyciągnij pożywkę. Dodaj pierwszy ml świeżej pożywki w ten sam sposób. Powoli dodawać drugi ml w pobliżu interfejsu pożywka/studzienka.
    2. W tych badaniach należy zastosować warunki wzrostu w celu uzyskania optymalnej produkcji loków. Uprawa S. Biofilmy Typhimurium w temperaturze 28 °C przez 6-8 dni inkubowane na skosie, który pozwolił biofilmowi przyczepić się około 2/3 drogi w górę szkiełka, a następnie wyrosnąć jako błonka na granicy faz powietrze-ciecz. Odbyło się to bez zmiany medium. Aby zapobiec wysychaniu pożywki, umieść 24-dołkową płytkę w komorze z miską na wodę.

2. Obrazowanie 4D

  1. Przygotowanie mocowania biofilmu
    1. Rozcieńczyć kulki karboksylowe FluoSpheres Crimson 1 μm w stosunku 1:50 w PBS (2 x 107 kulek w 1 ml PBS). W przypadku korzystania z dolnych komór optycznych dodać Syto9 w rozcieńczeniu 1 μl do 300 μl preparatu kulkowego.
    2. (opcjonalnie) Umyj biofilm, aby usunąć ślady pożywki wzrostowej, jeśli pożywka wzrostowa ma autofluorescencję. W tych eksperymentach przemyj dwukrotnie 1 ml PBS, ostrożnie pochylając płytkę, umieszczając końcówkę pipety w pobliżu dolnej krawędzi studzienki i powoli wyciągając pożywkę. Dodaj PBS, umieszczając końcówkę w pobliżu dolnej krawędzi i powoli napełniaj studzienkę. Technikę tę należy stosować na dnie optycznym oprócz szkiełek nakrywkowych w płytce 24-dołkowej.
    3. Usuń nośnik lub PBS. Dodać rozcieńczone kulki szkarłatne przygotowane w ppkt 2.1.1 do biofilmu. W tych badaniach dodaj 1 ml kulek (2x107) do szkiełek nakrywkowych i 0,2 ml kulek (4x106) i Syto9 do 96-dołkowych płytek dolnych optyki.
    4. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić asocjację kulek.
    5. Usuń koraliki i delikatnie umyj biofilm raz za pomocą PBS, aby usunąć niepowiązane koraliki. W tych badaniach, w przypadku szkiełka nakrywkowego, delikatnie przemyć 1 ml PBS, ponownie napełnić studzienkę 1 ml PBS i przejść do 2.1.6. W przypadku 96-dołkowych płytek dolnych optycznych delikatnie przemyj biofilm 0,2 ml PBS i napełnij studzienkę 0,2 ml PBS. Dolna komora optyczna jest teraz gotowa do obrazowania, więc przejdź do kroku 2.2.
    6. (W przypadku korzystania ze szkiełka nakrywkowego) Dodaj 1 μl Syto9 (zielone fluorescencyjne barwienie DNA; rozcieńczone zgodnie z instrukcjami producenta) do środka studzienki na powlekanym 10-dołkowym szkiełku multitestowym. Te powlekane szkiełka nakrywkowe mają głębokość studni 23-25 μm.
    7. (W przypadku korzystania z szkiełka nakrywkowego) Używając kleszczy sterylizowanych płomieniem alkoholu, ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe ze studzienki i odwróć do studzienki zawierającej kroplę Syto9. Pozostawienie szkiełka nakrywkowego w 1 ml PBS ułatwia jego usunięcie ze studzienki i pomaga wypłukać niezwiązane kulki z biofilmu.
    8. (W przypadku korzystania z szkiełka nakrywkowego) Ostrożnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, nie przesuwając ani nie dociskając szkiełka nakrywkowego, co może spowodować napięcie powierzchniowe, które zatrzyma ruch w bardziej lepkich, mniej sztywnych biofilmach.
    9. (Jeśli używasz szkiełka nakrywkowego) Pozostaw lakier do paznokci do wyschnięcia. Ostrożnie przetrzyj zewnętrzną powierzchnię szkiełka nakrywkowego 70% etanolem. Wycierać bez wywierania nacisku na szkiełko nakrywkowe z powodów wymienionych powyżej.
  2. Obrazowanie konfokalne
    UWAGA: W tych badaniach należy użyć laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z odwróconym obrazowaniem spektralnym, wyposażonego w system konfokalny TCS z obiektywem 63x. Luneta zostanie wykorzystana do wygenerowania filmu 4D (Rysunek 1). Biofilm 3D będzie składał się z warstw Z wychwytywanych w krokach co 0,5 μm przez biofilmy o grubości 18-20 μm, generując 36-40 warstw Z. Uchwycenie każdego biofilmu 3D zajmie 50-60 sekund. Plastry razem utworzą ramę, którą można zwizualizować jako biofilm 3D. Ten proces zostanie powtórzony 20 razy, aby wygenerować film poklatkowy 4D o łącznym czasie śledzenia 18-20 minut.
    1. Ustaw zakres do przechwytywania fluoroforów. W tych badaniach wzbudz Syto9 (barwienie bakteryjnego DNA) laserem o długości 488 nm i zmierz emisję od 495 do 540 nm (Leica Sp5 to mikroskop do obrazowania spektralnego). Wzbudz szkarłatne (czerwone) kulki za pomocą lasera o długości fali 633 nm i zmierz emisję od 650 nm do 700 nm. Te ustawienia fluoroforu można dostosować, aby wychwycić dowolne pożądane fluorofory.
    2. Wybierz tryb obrazowania xyzt.
    3. Zidentyfikuj obszar biofilmu za pomocą mieszaniny regionów o wyższej i niższej gęstości, aby uchwycić różnice we właściwościach lepkosprężystych w grubych i cienkich obszarach biofilmu.
    4. Ustaw stos Z o grubości 18-20 μm. W biofilmie montowanym na szkiełku nakrywkowym należy unikać dotykania przez górną i dolną część biofilmu szkła, aby uniknąć artefaktów zatrzymujących koraliki (patrz dyskusja).
    5. Dostosuj wzmocnienie i przesunięcie, aby wykorzystać cały zakres dynamiki intensywności w najjaśniejszym miejscu biofilmu. Minimalizuje to nakładanie się sygnału z niższych warstw biofilmu.
    6. Ustaw grubość plastra na 0,5 μm. Pozwala to na szybkie obrazowanie bez utraty informacji o kulkach.
    7. Ustaw rozdzielczość na 512 x 512 (0,48 μm). Pozwala to na szybkie obrazowanie, a jednocześnie generuje obrazy o rozdzielczości wystarczającej do zobaczenia struktury biofilmu i szczegółów ruchu kulek.
    8. Zminimalizuj czas obrazowania.
    9. Ustawiono na przechwycenie 20 ładunków.
    10. Zapisz jako .lif (lub podobny plik konfokalny). Film 4D można wygenerować w formacie ImageJ.

3. Generowanie filmu 4D z biofilmu za pomocą ImageJ

  1. Otwórz plik .lif w ImageJ z następującymi ustawieniami: Widok stosu za pomocą Hyperstack, Kolejność stosu XYCZT, tryb kolorów: kolorowany, zaznaczone autoskalowanie. Następnie naciśnij przycisk OK.
  2. Wybierz opcję Obraz > Kolor > Podziel kanały.
  3. Wybierz opcje Obraz > Kolor > Scal kanały > Utwórz > kompozytowe OK.
  4. Wybierz Wtyczki > przeglądarce 3D > Kanały odznacz niebieski > OK.
  5. Wybierz opcję Edytuj > Pokaż zawartość zaznaczoną > zaznaczoną opcję Pokaż obwiednię.
  6. Użyj kliknięcia i przytrzymania myszy, aby wybrać obraz. Następnie obróć obraz, nadal przytrzymując przycisk kliknięcia. Obróć obraz tak, aby spód biofilmu znajdował się na dole, a kąt umożliwiał wizualizację koralików. Następnie zwolnij obraz.
  7. Naciśnij czerwony przycisk nagrywania u dołu okna, aby nagrać wideo.
  8. Zapisz jako plik .avi przy użyciu jpeg jako kompresji.

4. Generowanie danych o trajektoriach

  1. Zainstaluj narzędzie typu open source ImageJ (https://imagej.net/Fiji) i wtyczkę do śledzenia cząstek Mosaic (https://imagej.net/MOSAICsuite).
  2. Zaimportuj plik .lif zawierający dwa kanały dla koralików i bakterii. Podziel kanały i zapisz pliki osobno.
  3. W ImageJ zapisz rozmiar woksela obrazu (wymiary x, y i z) oraz rozmiar kroku czasowego w pliku tekstowym.
  4. W ImageJ przejdź do Wtyczki | Mozaika i uruchom Particle Tracker 2D/3D.
  5. Wprowadź następujące parametry: Promień: 3, Odcięcie: 0,003, Per/Abs: 0,12, Zakres łącza: 2, Przemieszczenie: 10,00 z dynamiką ustawioną na Browna. Proszę zapoznać się z wynikami, aby zapoznać się z uzasadnieniem wyboru Browna w tych eksperymentach.
  6. Wygeneruj trajektorie i wyeksportuj listę trajektorii jako pliki .csv.

5. Analiza trajektorii

  1. Instalacja programu VRL Studio (https://vrl-studio.mihosoft.eu)
  2. Pobierz projekt Biofilm (https:// neurobox3d.github.io/Biofilm/) i uruchom go w VRL Studio
  3. Załaduj plik trajektorii w ImportData
  4. Określ rozmiar piksela x, y i z (użyj ImageJ, aby zlokalizować te wartości) w polu ProcessTrajectories.
  5. Określ interwał klatek w ComputeVelocity (użyj ImageJ, aby zlokalizować tę wartość).
  6. Załaduj bakteryjny plik tiff (patrz krok 3.2) w obszarze Comdensity.
  7. Ustaw ścieżki wyjściowe dla danych prędkości w SaveVelocityDataToFile i danych trajektorii w SaveTrajectoryDataToFile.
  8. Wywołaj metody SaveVelocityDataToFile i SaveTrajectoryDataToFile.
  9. Importowanie danych do programu Excel w celu analizy. Dane te będą obejmować długości trajektorii, długość życia trajektorii, wymiary i objętości pola granicznego trajektorii, średnie prędkości ściegu i wariancje. Analiza oblicza zmienne ważone przy użyciu kanału dla bakterii znakowanych Syto9 w celu obliczenia lokalnych (w ramach danych pól granicznych trajektorii) gęstości komórek. Wynikiem analizy jest obliczenie średnich ważonych prędkości i wariancji, a także średnich ważonych i wariancji wariancji pola ograniczenia.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda została użyta do przetestowania hipotezy, że curli może nadawać sztywność E. coli i S. Biofilmy Typhimurium, zmniejszające ruch kulek podczas eksperymentów z mikroskopią konfokalną. Obecny zestaw narzędzi został wykorzystany do porównania właściwości materiałowych szczepu komensalnego typu Enterococcus faecalis OG1RF z serotypem Salmonella enterica Typhimurium, E. coli i ich odpowiednimi izogenicznymi mutantami curli (Rysunek 1B i Wideo uzupełniające 1, Wideo uzupełniające 2,Dodatkowe wideo 3, Dodatkowe wideo 4, Dodatkowe wideo 5, Dodatkowe wideo 6). Właściwości materiału biofilmu mogą potencjalnie różnić się pod względem sztywności (np. loki związane z eDNA) lub oddziaływań elektrostatycznych i hydrofobowych między ujemnie naładowanymi kulkami a komórkami biofilmu i materiałami matrycowymi, a także gęstości komórek.

Odtwarzalność
Zestaw narzędzi Biofilm został zaprogramowany w Groovy30 i Java31 w VRL-Studio32, umożliwiając modułowy projekt przepływu pracy z automatycznym generowaniem interfejsu użytkownika (UI) wszystkich komponentów obliczeniowych. Pozwoliło to na zautomatyzowany przepływ pracy, eliminując niezamierzone uprzedzenia wywołane przez eksperymentatora podczas analizy wyników.

Użycie MSD do potwierdzenia rodzaju ruchu w biofilmach
Do analizy trajektorii za pomocą Particle Tracker 2D/3D dostępne są różne ustawienia dynamiki do analizy różnych typów ruchu ściegów. Do tych badań wybrano ustawienie "ruchy Browna" (tj. ruch napędzany dyfuzją), ponieważ E. faecalis jest bakterią nieruchliwą, E. coli i Salmonella nie wyrażają wici w biofilmach, a eksperymenty przeprowadzono w systemie zamkniętym przy braku przepływu. To ustawienie można dodatkowo zweryfikować za pomocą obliczonych średnich kwadratowych przemieszczeń (MSD) koralików. Korzystając z definicji figure-results-1 gdzie m to liczba segmentów trajektorii, można obliczyć zmianę MSD w trakcie każdej trajektorii. Trajektorie liniowe wskazują na dyfuzyjny ruch kulek (Rysunek 2A). Korzystając z kwadratowego dopasowania najmniejszych kwadratów, obliczono średni wzorzec ruchu wszystkich koralików w biofilmie, pokazując dominujący porządek liniowy i zatwierdzając dyfuzję bierną jako siłę napędową (Rysunek 2A-2F).

Analiza pola ograniczenia.
Zestaw narzędzi wykorzystuje ImageJ Mosaic i Particle Tracker 2D/3D do generowania trajektorii (Krok 4), a następnie, korzystając z automatycznego potoku analizy biofilmu, generuje ważne dane o trajektoriach ściegów, które można wykorzystać do porównania właściwości materiału biofilmu. Objętość pola granicznego w μm3 została zmierzona poprzez skonstruowanie minimalnego pudełka, które zawiera trajektorię i zmierzenie jego objętości ( Rysunek 3).

E. biofilmy faecalis mają większy ruch koralików z wartościami pola ograniczającego 1-6000 μm3 (Rysunek 3B, 3C i 3D). Wyniki potwierdzają, że ruch obserwowany w szklanym szkiełku nakrywkowym zamontowanym na powlekanym szkiełku podstawowym z powłoką o grubości około 25 μm (Rysunek 3C) w porównaniu z biofilmami wyhodowanymi na dnie studzienek szkła optycznego i bezpośrednio zobrazowanymi ( Rysunek 3D) daje równoważne wyniki z niewielkimi różnicami. Jedyna różnica polegała na tym, że w pobliżu górnej części zamontowanego szkiełka nakrywkowego E. faecalis biofilm osiąga stabilne trajektorie o długości życia większej niż 10 minut, ale jednocześnie można zarejestrować małe pola graniczne, podczas gdy w dolnej płytce optycznej można zarejestrować wybraną liczbę koralików o większej ruchliwości. Podsumowując, sugeruje to, że zamontowanie szkiełka mogło zmienić napięcie powierzchniowe systemu w górnej części biofilmu w stosunku do szkiełka w zamontowanym biofilmie nakrywkowym, co ostatecznie zmniejszyło ruchliwość niektórych kulek w mniej lepkich obszarach biofilmu (Rysunek 3B, 3C, 3D i 3I). Trajektorie, które należą do tej kategorii, okazały się stanowić bardzo mały odsetek i nawet przy tak małej liczbie uwięzionych kulek, średni MSD E. faecalis na zamontowanym szkiełku nakrywkowym był nieco wyższy niż MSD obliczony na podstawie biofilmu dolnej płytki optycznej (Rysunek 3).

S. Trajektorie kulek Typhimurium i E. coli miały mniejsze objętości pola granicznego 0-10 μm3 (Rysunek 3A, 3B, 3E i 3F), w porównaniu z izogenicznymi mutantami curli z ramkami granicznymi 1-6000 μm3 dla E. coli i 1-5000 μm3 dla S. Typhimurium (Ryc. 3A, 3B, 3F i 3H), wykazująca większą ruchliwość koralików. Wyniki te sugerowały, że obecność amyloidu korelowała ze zwiększoną sztywnością biofilmów i była zgodna z brakiem zauważalnego ruchu biofilmu na nagraniach. Objętości pola granicznego były konsekwentnie małe (0-10μm3) nawet w obszarach biofilmu o niskiej gęstości. Ta obserwacja jest zgodna z wcześniejszymi obserwacjami, że kędzierzawe mogą być obecne w obszarach o niskiej gęstości komórek biofilmu10.

Nie było możliwe porównanie zachowania biofilmów Enterobacteriaceae na dolnych płytkach optycznych, ponieważ rosną one jako błonki na granicy powietrze-ciecz (Krok 1.2.2). W przypadku stosowania szkiełka nakrywkowego, błonka przymocowana do szkiełka nakrywkowego na granicy faz, a po usunięciu szkiełka nakrywkowego błonka układa się na szkiełku nakrywkowym, tworząc pojedynczą powierzchnię obrazu. W dolnej płycie optycznej wyrosłej pod kątem obrazowanie wykonano z cieczą znajdującą się jeszcze w studni. Oznacza to, że błonka nadal unosi się nad dnem optyki i sprawia, że błonka wykracza poza głębokość roboczą odwróconej lunety, takiej jak Leica Sp5. Usunięcie wystarczającej ilości podłoża, aby wprowadzić biofilm na głębokość roboczą mikroskopu, spowodowało wyschnięcie próbki w ciągu 20-minutowego procesu obrazowania.

Ogólnie rzecz biorąc, wykresy potwierdzają obserwacje wizualne w dodatkowych filmach i są zgodne z zaobserwowanymi różnicami MSD (Rysunek 3I i 3J).

Długość życia trajektorii
Długość życia trajektorii została zmierzona jako liczba kolejnych klatek, w których zarejestrowano koralik (Rysunek 3).

W bardziej lepkich, płynnych biofilmach E. faecalis, wszystkie kulki miały trajektorię życia krótszą niż 10 minut, a większość trajektorii wahała się między 2-5 minutami dla biofilmów E. faecalis. Jednak kulki o zarejestrowanej krótkiej długości życia trajektorii mogą być zlokalizowane przez oględziny w biofilmach E. faecalis w całym oknie czasowym obrazowania (Dodatkowe wideo 1 i 2). W związku z tym możliwe jest, że koraliki poruszają się po zarejestrowanej trajektorii, okresowo odłączając się od biofilmu i kończąc trajektorię, a następnie ponownie łącząc się z biofilmem, w którym to momencie inicjowana jest nowa trajektoria. To ostatecznie doprowadziłoby do krótkiej żywotności trajektorii przy ciągłej obecności kulek w biofilmie. Ważne jest, aby pamiętać, że przy użyciu tej techniki długość życia trajektorii, zwłaszcza w lepkim biofilmie, ma tendencję do zaniżania całkowitego czasu, w którym kulka jest związana z biofilmem.

W S. Biofilmy Typhimurium, które miały mniejsze objętości ramek ograniczających, większość koralików (około 80%) miała długą żywotność trajektorii wynoszącą 16-20 klatek, co odpowiada około 15-20 minutom w czasie rzeczywistym (Rysunek 3A, 3G i 3H). W przeciwieństwie do nich, izogeniczne zmutowane biofilmy kędzierzawych zawierały więcej ruchomych kulek o objętościach pola ograniczającego w zakresie od 1-6000 μm3 (E. coli) do 1-5000 μm3 (S. Typhimurium) (Rysunek 3A, 3B, 3F i 3H). Jednak w przeciwieństwie do biofilmów E. faecalis o trajektoriach >70% o objętościach pola granicznego większych niż 10 μm3, biofilmy gatunków Enterobacteriaceae zarejestrowały tylko 30% trajektorii kulek z objętościami ramek ograniczających powyżej 10 μm3. Mimo że ogólna długość życia trajektorii koralików była krótsza w biofilmach zmutowanych kędzierzawych, niektóre trajektorie odzwierciedlały znaczny ruch koralików i długie czasy życia trajektorii (Rysunek 3H). Obserwacja ta może wskazywać, że ta zmienność może odpowiadać różnym właściwościom materiału biofilmu, takim jak lepkosprężystość i/lub zmianom chemicznym powierzchni cząstek, takim jak ładunek.

Analiza długości i prędkości trajektorii koralików
Długość trajektorii jest miarą odległości przebytej przez koraliki w μm. Pomiar ten jest zgodny z prędkością ruchu ściegu w μm/s. Zgodnie z większymi objętościami ramek ograniczających, koraliki w biofilmach E. faecalis miały 10-krotnie dłuższe trajektorie, 5-20 μm, w porównaniu z <4 μm w biofilmach zawierających curli. Zgodne z krótszymi trajektoriami (Rysunek 4A). Koraliki E. faecalis mierzyły do 15 razy większe prędkości, przy czym większość kulek miała prędkości w zakresie 0,01-0,15 μm/s w porównaniu z prędkościami <0,006 μm/s (Rysunek 4B). Niemniej jednak, zmutowane biofilmy kędzierzawych mierzyły ogólnie niższe prędkości i krótsze trajektorie w porównaniu z biofilmami E. faecalis, ale dłuższe trajektorie i wyższe prędkości niż w przypadku kędzierzawych zawierających szczepy rodzicielskie (Ryc. 4A i 4B).

Warto zwrócić uwagę na fakt, że struktura przypominająca sieć fibrylarną curli30 może wpływać na mobilność w sposób anizotropowy, redukując ruch w płaszczyźnie xy i umożliwiając zwiększoną mobilność w kierunku z (Rysunek 2G). Duża pula trajektorii (około 800) należąca do około 50 unikalnych koralików w biofilmach zawierających curli byłaby zgodna z ograniczeniami śledzenia cząstek mozaiki, licząc każdy z tych szybko poruszających się koralików jako pojedynczy koralik w x, y i z. Aby potwierdzić tę obserwację, konieczne będą dodatkowe badania i rozwój oprogramowania.

Analiza zależności ruchu koralików od gęstości komórek
Zależność ruchu koralików od gęstości komórkowej określono za pomocą średnich ważonych prędkości i wariancji, a także średnich/średnich ważonych i wariancji objętości ramki granicznej. Drugi kanał obrazowania dla bakterii znakowanych Syto9 wykorzystano do obliczenia lokalnych gęstości komórkowych w obliczeniach prędkości ważonych. Gęstość komórkową obliczono, uśredniając dane wokseli Syto9 w polu granicznym każdej krawędzi trajektorii ( Rysunek 5, po prawej). W ten sposób prędkość ściegu może być ważona przez krawędziowe (lokalne) gęstości komórek. Istnieje wiele rodzajów barwników, które można wykorzystać do wizualizacji bakterii, w tym plamy ściany komórkowej, błon i zawartości DNA. Do określenia gęstości komórkowej wybrano Syto9, ponieważ daje najbardziej spójny sygnał bez względu na to, który optyczny wycinek Z jest wizualizowany. Barwienia otoczki (ściana komórkowa i membrana) będą dawać inny sygnał w zależności od położenia warstwy Z. Jeśli wycinek Z obejmuje górną lub dolną część komórki, sygnał będzie silniejszy niż w przypadku, gdy wycinek Z przechodzi przez środek komórki, gdzie zabarwiony jest tylko kontur komórki.

Trajektorie ściegu z kanału czerwonego były śledzone przez 20 klatek, gdzie poszczególne trajektorie miały minimalną żywotność 2 klatek i maksymalnie 20 ramek z 19 segmentami trajektorii łączącymi klatki (Rysunek 5). Aby zbadać zależność gęstości komórek od ruchliwości kulek, określono intensywność GFP na woksel (każdy z indywidualnych pomiarów na obrazie woksela 512x512). Gęstość komórek wokół każdego segmentu trajektorii ściegu została obliczona jako lokalnie uśredniona gęstość w ramce granicznej segmentu.

Dla niektórych biofilmów statystycznie istotną zależność od gęstości można udokumentować (Rysunek 6), szczególnie dla biofilmów E. faecalis, które zostały wyhodowane na szklanym szkiełku nakrywkowym i odwrócone na szkiełku wielodołkowym (Rysunek 6A). Wręcz przeciwnie, biofilmy E. faecalis, które były hodowane na dnie płytki 96-dołkowej (Ryc. 6B) nie wykazały zależności od gęstości. Podsumowując, sugeruje to, że wysoce płynne biofilmy E. faecalis mogą być potencjalnie lekko ściskane z powodu montażu na szkiełku wielodołkowym, co jest zgodne ze zmniejszeniem liczby kulek poruszających się szybciej i tych z małymi objętościami pola ograniczającego, które są uwięzione w górnej części biofilmu na szkiełku (Rysunek 3C vs Rysunek 3D). Zarówno biofilmy Salmonelli, jak i E. coli (Rysunek 6C i 6D), jak i ich izogeniczne mutanty (Figury 6E i 6F) wykazywały niewielką lub żadną zależność od gęstości komórkowej.

figure-results-2
Rysunek 1. Potok obrazowania i analizy (kroki 2-4) (A) Biofilmy są obrazowane zgodnie z opisem w 2.2. Korzystając z obrazowanych biofilmów (patrz 3), wygenerowano trajektorie ściegów zgodnie z opisem w punkcie 4. Korzystając z trajektorii, odpowiednie dane obliczono za pomocą zestawu narzędzi do analizy (patrz 5) (B) Biofilmy hodowano zgodnie z opisem w kroku 1 na szkiełkach nakrywkowych (E. faecalis, Wideo 1), S. Typhimurium (Wideo 3), E. coli (Wideo 5) i izogeniczne mutanty curli (Wideo 4, Wideo 6) lub w 96-dołkowej płytce z dnem optycznym (E. faecalis bottom, Wideo 2). Biała podziałka wynosi 20 mm. Rysunek ten jest reprodukowany za zgodą (31). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 2. Ustalono, że ruch kulek w biofilmach ma charakter dyfuzyjny (ruch Browna, patrz krok 5) (A-F) Dane MSD pokazują zachowanie liniowe (czerwona linia), aby potwierdzić ruch Browna. Biofilmy hodowano zgodnie z krokiem 1 (G) Przykład eliptycznego ruchu kulek zaobserwowanego w biofilmach E. coli i S. Typhimurium pobranych z jednej klatki testu biofilmu 4D E. coli (H) Przykład dużych zmian we wzorach kulek między ramką 3 a 4 pobranej ze studzienki dna optycznego E. faecalis. Zauważ, że sam biofilm wywołuje pewien przepływ (Wideo 1 i 2), co sprawia, że wydaje się, że klatka 3 i 4 są inaczej zorientowane. Rysunek ten jest reprodukowany za zgodą (31). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 3. Analiza różnic w sztywności za pomocą ramek ograniczających i długości życia trajektorii. Biofilmy hodowano zgodnie z opisem w kroku 1 na szkiełkach nakrywkowych (E. faecalis, Wideo 1), S. Typhimurium (Wideo 3), E. coli (Wideo 5) i izogeniczne mutanty curli (Wideo 4, Wideo 6) lub w 96-dołkowej płytce z dnem optycznym (E. faecalis bottom, Wideo 2). Długość życia trajektorii jest przedstawiona w % całkowitych trajektorii ścieżek (A) i wykresów rozrzutu (C-H), wraz z objętościami ramek ograniczających (obliczonymi w kroku 5) (I) Porównanie zaburzeń układu mięśniowo-szkieletowego ścieżek w różnych biofilmach (H) Średnie zaburzenia układu mięśniowo-szkieletowego każdego rodzaju biofilmu. Paski wskazują 95% przedział ufności danych. Rysunek ten jest reprodukowany za zgodą (31). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 4. Analiza różnic w długości trajektorii i prędkości ściegu. Biofilmy hodowano zgodnie z opisem w kroku 1. Długości trajektorii są podane w μm i są przedstawiane jako % całkowitych trajektorii ściegu (A). Prędkość jest podawana w μm/s i przedstawiana jako % całkowitych trajektorii ściegu (B). Rysunek ten został zaadaptowany za zgodą (31). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 5. Zarys analizy segmentów trajektorii. Rysunek ten został zaadaptowany za zgodą (31). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 6. Badanie wpływu gęstości biofilmu na prędkość ściegu przy użyciu potoku analizy biofilmu (krok 5). Wyniki wskazują, że prędkość kulek nie zależy wyłącznie od gęstości komórek. Biofilmy hodowano zgodnie z opisem w kroku 1. Trajektorie analizowano w skali poszczególnych segmentów trajektorii (Rysunek 5). Dla każdego segmentu prędkość ściegu w μm/s wykreślono w stosunku do gęstości komórkowej pola ograniczającego (średnia GFP na woksel w ramce ograniczającej). Czerwona linia pokazuje regresję liniową, a zielona linia to ślad regresji wykładniczej. Rysunek ten jest reprodukowany za zgodą (31). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo 1. Film 4D przedstawiający 24-godzinny biofilm E. faecalis OG1RF wyhodowany na szkiełku nakrywkowym o grubości 1,5 grubości. Film poklatkowy 4D został wygenerowany przy użyciu mikroskopu w rozdzielczości 512x512. Seria Z składająca się z 40 obrazów została wygenerowana poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 μm w krokach co 0,5 μm. Każda seria Z składała się z jednej klatki, a jej uchwycenie wymagało 50-60 s. Seria 20 sąsiadujących ze sobą klatek została zarejestrowana w celu stworzenia filmu 4D. Odtwarzanie wideo odbywa się z prędkością około 120x. Film jest reprezentatywny dla co najmniej 6 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Uzupełniający Wideo 2. Film 4D przedstawiający 24-godzinny biofilm E. faecalis OG1RF wyhodowany na 96-dołkowej dolnej płycie optycznej. Film poklatkowy 4D został wygenerowany przy użyciu mikroskopu w rozdzielczości 512x512. Seria Z składająca się z 40 obrazów została wygenerowana poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 μm w krokach co 0,5 μm. Każda seria Z składała się z jednej klatki, a jej uchwycenie wymagało 50-60 s. Seria 20 sąsiadujących ze sobą klatek została zarejestrowana w celu stworzenia filmu 4D. Odtwarzanie wideo odbywa się z prędkością około 120x. Film jest reprezentatywny dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten video.

Uzupełniający Wideo 3. Film 4D przedstawiający serotyp Salmonella enterica Typhimurium biofilm ATCC 14028 uprawiany na szkiełkach nakrywkowych ze szkła optycznego o grubości 1,5 przez 6-7 dni. Film poklatkowy 4D został wygenerowany przy użyciu mikroskopu w rozdzielczości 512x512. Seria Z składająca się z 40 obrazów została wygenerowana poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 μm w krokach co 0,5 μm. Każda seria Z składała się z jednej klatki, a jej uchwycenie wymagało 50-60 s. Seria 20 sąsiadujących ze sobą klatek została zarejestrowana w celu stworzenia filmu 4D. Odtwarzanie wideo odbywa się z prędkością około 120x. Film jest reprezentatywny dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten video.

Uzupełniający Wideo 4. Film 4D z serotypem Salmonella enterica Biofilmy ATCC 14028 curli (csgBA) hodowano na szkiełkach nakrywkowych o grubości 1,5 grubości przez 6-7 dni. Film poklatkowy 4D został wygenerowany przy użyciu mikroskopu w rozdzielczości 512x512. Seria Z składająca się z 40 obrazów została wygenerowana poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 μm w krokach co 0,5 μm. Każda seria Z składała się z jednej klatki, a jej uchwycenie wymagało 50-60 s. Seria 20 sąsiadujących ze sobą klatek została zarejestrowana w celu stworzenia filmu 4D. Odtwarzanie wideo odbywa się z prędkością około 120x. Film jest reprezentatywny dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten video.

Uzupełniający Wideo 5. Film 4D przedstawiający E. coli UTI89 hodowaną na szkiełkach nakrywkowych o grubości 1,5 grubości przez 6-7 dni. Film poklatkowy 4D został wygenerowany przy użyciu mikroskopu w rozdzielczości 512x512. Seria Z składająca się z 40 obrazów została wygenerowana poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 μm w krokach co 0,5 μm. Każda seria Z składała się z jednej klatki, a jej uchwycenie wymagało 50-60 s. Seria 20 sąsiadujących ze sobą klatek została zarejestrowana w celu stworzenia filmu 4D. Odtwarzanie wideo odbywa się z prędkością około 120x. Film jest reprezentatywny dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten video.

Uzupełniający Wideo 6. Wideo 4D E. coli UTI89 curli (csgBA) mutant hodowany na szkiełkach nakrywkowych o grubości 1,5 grubości przez 6-7 dni. Film poklatkowy 4D został wygenerowany przy użyciu mikroskopu w rozdzielczości 512x512. Seria Z składająca się z 40 obrazów została wygenerowana poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 μm w krokach co 0,5 μm. Każda seria Z składała się z jednej klatki, a jej uchwycenie wymagało 50-60 s. Seria 20 sąsiadujących ze sobą klatek została zarejestrowana w celu stworzenia filmu 4D. Odtwarzanie wideo odbywa się z prędkością około 120x. Film jest reprezentatywny dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten video.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki krytyczne i rozwiązywanie problemów
Największym wyzwaniem tej techniki jest użycie zamontowanego szkiełka nakrywkowego z bardzo lepkim biofilmem, takim jak E. faecalis. Szkiełko nakrywkowe należy ostrożnie i dokładnie umieścić na szkiełku wielodołkowym bez zmiany jego położenia. Na etapie uszczelniania należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do dociśnięcia szkiełka nakrywkowego lub przypadkowego wepchnięcia/przesunięcia go po powierzchni szkiełka. Każdy ruch lub ciśnienie może wytworzyć napięcie powierzchniowe i zablokować ruch lepkiego biofilmu. Jeśli to możliwe, porównanie właściwości materiału biofilmu poprzez obrazowanie biofilmu na dnie optycznym z mocowaniem szkiełka nakrywkowego pozwoli na ocenę techniki. Prawidłowo wykonany montaż szkiełka nakrywkowego bardzo przypominał biofilm w dolnej płytce optycznej dla E. faecalis.

Ponadto w przypadku stosowania zamontowanego szkiełka nakrywkowego należy unikać obrazowania powierzchni styku biofilmu z szkiełkiem nakrywkowym na dole lub szkiełkiem podstawowym na samej górze. W przypadku korzystania z odwróconej lunety, z szkiełkiem nakrywkowym na dole, u podstawy biofilmu mogą znajdować się uwięzione kulki na szkiełku nakrywkowym. Kulki te przechodzą przez biofilm i zostają uwięzione na szkiełku nakrywkowym nawet po delikatnym umyciu. Mają współrzędne x, y i z równe 0 oraz współrzędne pola ograniczenia równe 0. Jednak w przypadku niektórych zastosowań, takich jak badanie integralności biofilmu po zabiegu, te punkty danych mogą być wykorzystywane jako narzędzie. Zdolność kulek do przenikania przez gruby obszar biofilmu do dna szkiełka nakrywkowego może być wykorzystana do oceny integralności biofilmu po zabiegu (manuskrypt w przygotowaniu we współpracy z laboratorium Tükel). Na szczycie biofilmu, w lepkim biofilmie, takim jak E. faecalis, mieliśmy pewne dowody na zagęszczenie narzucone przez szkiełko nakrywkowe. Ograniczyło to ruch niektórych koralików na styku szkiełek i mogło wprowadzić pewną zależność od gęstości do analizy ruchu ściegów.

Etapy płukania były konieczne dla biofilmów, ponieważ pożywka wzrostowa ma silną autofluorescencję w kanale zielonym. Decydujemy się na użycie nadmiaru koralików i usunięcie niepowiązanych koralików przez pranie, aby zmaksymalizować powiązane koraliki, aby uzyskać najdokładniejszą charakterystykę obserwowanych obszarów.

Liczba ściegów i płukań potrzebnych do uzyskania pożądanych zestawów danych musi być określona empirycznie. Obecność zbyt wielu kulek w biofilmie generuje niemożliwie duże zbiory danych, które są trudne do analizy. Obecność zbyt małej liczby kulek nie powoduje dokładnego pobierania próbek środowisk biofilmu. Jednak kontrola liczby dodawanych kulek (2x107 kulek w 1 ml PBS) i zastosowanie etapów płukania spowodowały, że liczba kulek (40-140) kojarzących się z biofilmem w zależności od jego struktury, układu przestrzennego i składu.

Podczas badania biofilmów z mieszanymi lepkimi i sztywnymi obszarami, kulki mogą z czasem zostać uwięzione w sztywnych obszarach. W takim przypadku obrazowanie należy rozpocząć natychmiast po dodaniu kulek. Często nie można tego osiągnąć za pomocą szkiełek nakrywkowych, ale wymaga to optycznych płytek dennych lub komórek przepływowych, w których obrazowanie można wykonać natychmiast po dodaniu kulek i etapu mycia.

Modyfikacje i przyszłe zastosowania
Stosowanie urządzeń mikroprzepływowych. W naszych badaniach optymalne warunki stworzone do badania biofilmów Enterobacteriaceae wymagały wzrostu biofilmu w postaci błonki na granicy faz powietrze-ciecz. Ograniczyło to zastosowanie dolnych płytek optycznych i urządzeń mikroprzepływowych w badaniach. Jednakże, gdy pozwalają na to warunki tworzenia biofilmu, biofilmy można hodować w komorach mikroprzepływowych lub komórkach przepływowych. Biofilmy można następnie wypłukać, a perełki wprowadzić za pomocą urządzenia mikroprzepływowego przy minimalnym naruszeniu biofilmu.

Dodawanie kulek podczas wzrostu biofilmu. Zdecydowaliśmy się dodać nadmiar kulek do biofilmów, a następnie usunąć niepowiązane kulki poprzez delikatne mycie, aby zoptymalizować liczbę kulek obecnych podczas analizy. W lepkich biofilmach E. faecalis możliwe jest, że kulki odłączyły się i ponownie związały w ciągu 20-minutowego czasu obrazowania. Jeśli niewielka liczba kulek zostanie dodana w różnych momentach podczas wzrostu biofilmu, możliwe będzie uwięzienie kulek w biofilmie, co pozwoli na dokładniejsze scharakteryzowanie ruchu biofilmu w bardziej lepkich biofilmach.

Wybór regionu do zobrazowania. Do badań właściwości materiału najlepiej wybrać grube i cienkie obszary biofilmu. Jednak podczas badania zmian właściwości materiałowych biofilmu poddanego działaniu środka, można zobrazować grube zlewające się obszary w celu określenia zmian właściwości lepkosprężystych i penetracji ściegu w tych obszarach. W tym przypadku poszukiwanie kulek, które przeniknęły przez biofilm i zostały uwięzione na szkiełku nakrywkowym, jest użyteczną miarą rozerwania biofilmu.

Obrazowanie w przepływie. Za pomocą szklanych komórek przepływowych lub urządzeń mikroprzepływowych można obrazować ruch kulek lub bakterii w przepływowym biofilmie. Można to zrobić na różne sposoby. Można to zrobić poprzez wstrzyknięcie kulek do całej komory, a następnie krótką inkubację, aby umożliwić powiązanie kulek z biofilmem. Niepowiązane kulki można usunąć przez mycie, a biofilm zobrazować z przepływem lub bez. I odwrotnie, niewielka liczba kulek może zostać wprowadzona po jednej stronie komory, a ich ruch przez i w biofilmie może być śledzony pod przepływem. Podczas korzystania z przepływu należy zachować ostrożność przy wyborze ustawień śledzenia ściegu mozaiki (krok 4.5). W obecnych badaniach ustawienie dynamiki było Brownowskie. Obliczenia MSD potwierdziły, że ruch był prawdopodobnie dyfuzyjny, co sprawiło, że Brownian był odpowiednim ustawieniem.

Barwienie matrycy. W obecnych badaniach barwienie Syto9 bada gęstość komórkową, a nie gęstość struktury biofilmu. Na przykład obecność amyloidów prawdopodobnie zwiększa gęstość materiału matrycy biofilmu. Zależność ruchu od gęstości amyloidu można określić za pomocą barwników na matrycy fluorescencyjnej zamiast Syto9.

Bakterie znakowane fluorescencyjnie. Bakterie znakowane fluorescencyjnie mogą być wykorzystywane do śledzenia ruchu bakterii egzogennych przez biofilmy (np. bakterie zawierające plazmid). Wyzwanie związane z bakteriami znakowanymi fluorescencyjnie, takimi jak enterokoki, polega na tym, że tworzą one pojedyncze, diplocoki i krótkie łańcuchy, co komplikuje zdolność dokładnego śledzenia bakterii. Proces ten byłby łatwiejszy, gdyby bakterie miały morfologię jednokomórkową.

Ograniczenia
Ograniczenia w wizualizacji trajektorii i łączeniu.
Jednym z ograniczeń metody jest wizualizacja trajektorii i zszywanie. Zrekonstruowane i przeanalizowane trajektorie składają się ze współrzędnych punktów x, y, z, gdzie kolejne punkty wyznaczają tor liniowy pomiędzy tymi punktami. Wizualizację takich odcinkowych trajektorii liniowych można uzyskać za pomocą różnych narzędzi. Jednym z podejść było użycie notesów języka Python i Jupyter wraz z wtyczkami języka Python, bibliotekami Pandas i Matplotlib. Chociaż możliwe było zobrazowanie poszczególnych istniejących trajektorii w artykule w Journal of Bacteriology, w którym technika ta została pierwotnie opublikowana34, nadal istniały znaczące ograniczenia, które zostaną rozwiązane w przyszłych badaniach.

Obecnie liczba zrekonstruowanych trajektorii jest większa niż liczba kulek w biofilmie, co oznacza, że wiele trajektorii może odpowiadać jednemu koralikowi. Może to być spowodowane słabym sygnałem konfokalnym w jednej klatce, w której Mosaic zakończy trajektorię i zainicjuje drugą. Może to być zarejestrowane jako wiele krótszych trajektorii dla jednego koralika, szczególnie w mniej lepkich biofilmach. Inną przyczyną dużej liczby trajektorii jest brak ściegów trajektorii. Zwłaszcza w biofilmach dna dna wzrokowego E. faecalis kulki wizualnie pozostają związane z biofilmem podczas obrazowania (Dodatkowe wideo 2). Nie było jednak trajektorii dłuższych niż 10, a ponad 90% trajektorii miało żywotność 5 klatek lub mniej (rysunek 3D). Jeśli oprogramowanie jest używane do analizowania tylko trajektorii powyżej określonej długości (np. podczas śledzenia komórek, które są zdolne do przenoszenia plazmidów), krótsze trajektorie mogą być automatycznie usuwane ze zbioru danych. Istnieją jednak inne cele, dla których zszywanie trajektorii może być bardzo ważne. Wreszcie, niemożność śledzenia szybkiego ruchu kulek jako pojedynczej trajektorii może skutkować większą liczbą trajektorii w biofilmach Enterobacteriaceae ze względu na szybki ruch w kierunku Z, co skutkuje powstawaniem kulek w kształcie eliptyków (ryc. 2G). Możliwość zszywania trajektorii zakłóconych przez szybki ruch anizotropowy będzie ważna dla zbadania wpływu macierzy amyloidowej curli na Enterobacteriaceae.

Znaczenie
Opracowano obliczeniowy przepływ pracy w celu zbadania trajektorii ścieżek w celu porównania właściwości materiałowych biofilmów 3D. Przepływ pracy umożliwia naukowcom zidentyfikowanie krytycznych parametrów, które można wykorzystać w modelowaniu obliczeniowym dynamiki płynów w heterogenicznych biofilmach. Za pomocą tego ewaluatora kulek o otwartym kodzie źródłowym można było zbadać wpływ bakteryjnych kędziorów amyloidowych na właściwości materiału, wykazując zwiększoną sztywność matrycy biofilmu spowodowaną curli. W bardziej ogólnym kontekście, ewaluator może być wykorzystany do badania zmian w strukturze biofilmu wywołanych przez leczenie biofilmu lub różne warunki środowiskowe, takie jak przepływ. Na przykład narzędzie jest wykorzystywane do analizy wpływu leczenia przeciwciałami monoklonalnymi na rozerwanie struktur biofilmu we współpracy z laboratorium Tükel (LKSOM Temple University). Zestaw narzędzi do oceny ściegów jest w pełni adaptowalny i można go rozbudowywać w sposób modułowy za pomocą VRL-Studio, aby jeszcze bardziej ulepszyć i rozszerzyć jego funkcje.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca w laboratoriach GQ i BAB nie otrzymała żadnego konkretnego grantu od żadnej agencji finansującej w sektorze publicznym, komercyjnym lub non-profit. Autorzy dziękują dr Isaacowi Klapperowi (Wydział Matematyki, Temple University) za pomocną dyskusję oraz Çagla Tükel (Wydział Mikrobiologii i Immunologii, Temple University) za ekspertyzę w zakresie Enterobacteriaceae w pierwszej publikacji dotyczącej stosowania tej techniki.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Płytki 96-dołkowe, nr 1,5 niepowlekane szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 5 mmMatTekP96G1.55F
Okulary osłonowe Fisherbrand: kołaFisher Scientific12-293-232PSzkiełko nakrywkowe ze szkła optycznego 1,5
Invitrogen Syto 9 Zielona fluorescencyjna plama kwasu nukleinowegoInvitrogenS34854
Sondy molekularne FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 1 um, szkarłatna fluorescencja (625/645)Sondy molekularneF8816

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2, 435-444 (2011).">Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2, 435-444 (2011).
  2. Extracellular matrix structure governs invasion resistance in bacterial biofilms. ISME Journal. 9, 1700-1709 (2015).">Nadell, C. D., Drescher, K., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Extracellular matrix structure governs invasion resistance in bacterial biofilms. ISME Journal. 9, 1700-1709 (2015).
  3. Material properties of biofilms - key methods for understanding permeability and mechanics. Reports on Progress in Physics. 78, 036601(2015).">Billings, N., Birjiniuk, A., Samad, T. S., Doyle, P. S., Ribbeck, K. Material properties of biofilms - key methods for understanding permeability and mechanics. Reports on Progress in Physics. 78, 036601(2015).
  4. The mechanical properties of microbial surfaces and biofilms. The Cell Surface. 5, 100028(2019).">Araújo, G. R. deS., Viana, N. B., Gómez, F., Pontes, B., Frases, S. The mechanical properties of microbial surfaces and biofilms. The Cell Surface. 5, 100028(2019).
  5. Modulation of the mechanical properties of bacterial biofilms in response to environmental challenges. Biomaterials Science. 5, 887-900 (2017).">Tallawi, M., Opitz, M., Lieleg, O. Modulation of the mechanical properties of bacterial biofilms in response to environmental challenges. Biomaterials Science. 5, 887-900 (2017).
  6. Curli-Containing Enteric Biofilms Inside and Out, Matrix Composition, Immune Recognition, and Disease Implications. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82, (2018).">Tursi, S. A., Tükel, Ç Curli-Containing Enteric Biofilms Inside and Out, Matrix Composition, Immune Recognition, and Disease Implications. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82, (2018).
  7. Curli functional amyloid systems are phylogenetically widespread and display large diversity in operon and protein structure. PLoS One. 7 (12), 51274(2012).">Dueholm, M. S., Albertsen, M., Otzen, D., Nielsen, P. H. Curli functional amyloid systems are phylogenetically widespread and display large diversity in operon and protein structure. PLoS One. 7 (12), 51274(2012).
  8. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. mBio. 4, 00645(2013).">Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. mBio. 4, 00645(2013).
  9. Curli fibers are required for development of biofilm architecture in Escherichia coli K-12 and enhance bacterial adherence to human uroepithelial cells. Microbiology and Immunology. 49, 875-884 (2005).">Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli fibers are required for development of biofilm architecture in Escherichia coli K-12 and enhance bacterial adherence to human uroepithelial cells. Microbiology and Immunology. 49, 875-884 (2005).
  10. Amyloid-DNA Composites of Bacterial Biofilms Stimulate Autoimmunity. Immunity. 42, 1171-1184 (2015).">Gallo, P. M., et al. Amyloid-DNA Composites of Bacterial Biofilms Stimulate Autoimmunity. Immunity. 42, 1171-1184 (2015).
  11. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. Journal of Bacteriology. 195, 5540-5554 (2013).">Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. Journal of Bacteriology. 195, 5540-5554 (2013).
  12. Characterization of curli A production on living bacterial surfaces by scanning probe microscopy. Biophysical Journal. 103, 1666-1671 (2012).">Oh, Y. J. Characterization of curli A production on living bacterial surfaces by scanning probe microscopy. Biophysical Journal. 103, 1666-1671 (2012).
  13. Amyloid peptides derived from CsgA and FapC modify the viscoelastic properties of biofilm model matrices. Biofouling. 30, 415-426 (2014).">Lembré, P., Di Martino, P., Vendrely, C. Amyloid peptides derived from CsgA and FapC modify the viscoelastic properties of biofilm model matrices. Biofouling. 30, 415-426 (2014).
  14. Curli mediate bacterial adhesion to fibronectin via tensile multiple bonds. Scientific Reports. 6, 33909(2016).">Oh, Y. J., et al. Curli mediate bacterial adhesion to fibronectin via tensile multiple bonds. Scientific Reports. 6, 33909(2016).
  15. Dynamic biofilm architecture confers individual and collective mechanisms of viral protection. Nature Microbiology. 3, 26-31 (2018).">Vidakovic, L., Singh, P. K., Hartmann, R., Nadell, C. D., Drescher, K. Dynamic biofilm architecture confers individual and collective mechanisms of viral protection. Nature Microbiology. 3, 26-31 (2018).
  16. Salmonella Typhimurium biofilm disruption by a human antibody that binds a pan-amyloid epitope on curli. Nature Communications. 11, 1007(2020).">Tursi, S. A., et al. Salmonella Typhimurium biofilm disruption by a human antibody that binds a pan-amyloid epitope on curli. Nature Communications. 11, 1007(2020).
  17. Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens. 15 (8), 1007978(2019).">Perov, S., et al. Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens. 15 (8), 1007978(2019).
  18. The biofilm-associated surface protein Esp of Enterococcus faecalis forms amyloid-like fibers. Npj Biofilms and Microbiomes. 6, 15(2020).">Taglialegna, A., et al. The biofilm-associated surface protein Esp of Enterococcus faecalis forms amyloid-like fibers. Npj Biofilms and Microbiomes. 6, 15(2020).
  19. Pheromone peptide cOB1 from native Enterococcus faecalis forms amyloid-like structures, A new paradigm for peptide pheromones. Journal of Peptide Science. 25, 3178(2019).">Gour, S., Kumar, V., Rana, M., Yadav, J. K. Pheromone peptide cOB1 from native Enterococcus faecalis forms amyloid-like structures, A new paradigm for peptide pheromones. Journal of Peptide Science. 25, 3178(2019).
  20. Liquid flow in biofilm systems. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2711-2716 (1994).">Stoodley, P., Debeer, D., Lewandowski, Z. Liquid flow in biofilm systems. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2711-2716 (1994).
  21. Single particle tracking reveals spatial and dynamic organization of the E. coli biofilm matrix. New Journal of Physics. 16, 085014(2014).">Birjiniuk, A., et al. Single particle tracking reveals spatial and dynamic organization of the E. coli biofilm matrix. New Journal of Physics. 16, 085014(2014).
  22. Dynamic remodeling of microbial biofilms by functionally distinct exopolysaccharides. mBio. 5, 01536(2014).">Chew, S. C., et al. Dynamic remodeling of microbial biofilms by functionally distinct exopolysaccharides. mBio. 5, 01536(2014).
  23. Revealing region-specific biofilm viscoelastic properties by means of a micro-rheological approach. Npj Biofilms and Microbiomes. 2, 5(2016).">Cao, H., et al. Revealing region-specific biofilm viscoelastic properties by means of a micro-rheological approach. Npj Biofilms and Microbiomes. 2, 5(2016).
  24. Mapping of bacterial biofilm local mechanics by magnetic microparticle actuation. Biophysical Journal. 103, 1400-1408 (2012).">Galy, O., et al. Mapping of bacterial biofilm local mechanics by magnetic microparticle actuation. Biophysical Journal. 103, 1400-1408 (2012).
  25. Microrheology of bacterial biofilms in vitro, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Langmuir. 24, 13549-13555 (2008).">Rogers, S. S., vander Walle, C., Waigh, T. A. Microrheology of bacterial biofilms in vitro, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Langmuir. 24, 13549-13555 (2008).
  26. Microrheology and Spatial Heterogeneity of Staphylococcus aureus Biofilms Modulated by Hydrodynamic Shear and Biofilm-Degrading Enzymes. Langmuir. 35 (9), 3553-3561 (2019).">Hart, J. W., Waigh, T. A., Lu, J. R., Roberts, I. S. Microrheology and Spatial Heterogeneity of Staphylococcus aureus Biofilms Modulated by Hydrodynamic Shear and Biofilm-Degrading Enzymes. Langmuir. 35 (9), 3553-3561 (2019).
  27. Influence of culture heterogeneity in cell surface charge on adhesion and biofilm formation by Enterococcus faecalis. Journal of Bacteriology. 188, 2421-2426 (2006).">van Merode, A. E. J., van der Mei, H. C., Busscher, H. J., Krom, B. P. Influence of culture heterogeneity in cell surface charge on adhesion and biofilm formation by Enterococcus faecalis. Journal of Bacteriology. 188, 2421-2426 (2006).
  28. Link between Culture Zeta Potential Homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Applied and Environmental Microbiology. 78, 2282-2288 (2012).">Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between Culture Zeta Potential Homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Applied and Environmental Microbiology. 78, 2282-2288 (2012).
  29. NIH Image to ImageJ, 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).">Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ, 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  30. http://groovy-lang.org (2021).">Groovy-Lang. , Available from: http://groovy-lang.org (2021).
  31. https://docs.oracle.com/en/java (2021).">Oracle.com. , Available from: https://docs.oracle.com/en/java (2021).
  32. Visual reflection library, a framework for declarative GUI programming on the Java platform. Computing and Visualization in Science. 16, 181-192 (2013).">Hoffer, M., Poliwoda, C., Wittum, G. Visual reflection library, a framework for declarative GUI programming on the Java platform. Computing and Visualization in Science. 16, 181-192 (2013).
  33. Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens. 15, 1007978(2019).">Perov, S., et al. Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens. 15, 1007978(2019).
  34. Development of a New Bead Movement-Based Computational Framework Shows that Bacterial Amyloid Curli Reduces Bead Mobility in Biofilms. Journal of Bacteriology. 202, 00253(2020).">Malhotra, K., et al. Development of a New Bead Movement-Based Computational Framework Shows that Bacterial Amyloid Curli Reduces Bead Mobility in Biofilms. Journal of Bacteriology. 202, 00253(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biofilm Material HeterogeneityBead Movement Analysis3D BiofilmsTrajectory ComputationImageJ Mosaic PluginBead Evaluator ToolboxCurli AmyloidEnterococcus Faecalis BiofilmsSalmonella Typhimurium BiofilmsEscherichia Coli Biofilms
Video Coming Soon

Related Articles