Struktura obliczeniowa oparta na ruchu kulek do trójwymiarowej analizy niejednorodności materiału biofilmu

Bettina Buttaro; Gillian Queisser

doi:10.3791/62454

Artykuł metodologiczny

Struktura obliczeniowa oparta na ruchu kulek do trójwymiarowej analizy niejednorodności materiału biofilmu

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62454

⸱

22 czerwca 2021

Bettina Buttaro¹ , Gillian Queisser²

¹Sol Sherry Thrombosis Research Center, Lewis Katz School of Medicine, Temple University, ²Department of Mathematics, Temple University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę analizy i ilościowego określania wzorca ruchu kulek karboksylowych o wielkości 1 μm przez heterogeniczne biofilmy bakteryjne. Porównanie wzorców ruchowych może być wykorzystane do ilościowego określenia różnic we właściwościach materiałowych biofilmów.

Streszczenie

Różnice we właściwościach materiałowych biofilmów bakteryjnych zaobserwowano w biofilmach różnych gatunków bakterii, w obrębie tego samego gatunku w różnych warunkach wzrostu i po potraktowaniu cząsteczkami modyfikującymi matrycę. Aby lepiej określić ilościowo właściwości materiałowe biofilmów 3D, opracowano eksperymentalny i obliczeniowy przepływ pracy, który zastosowano w celu zbadania różnic między biofilmami Enterococcus faecalis, serotypem Salmonella enterica Typhimurium i Escherichia coli, a także roli kędziorów amyloidowych w potwierdzaniu sztywności biofilmów Enterobacteriaceae. Dynamika czasoprzestrzenna kulek karboksylowych o wielkości 1 μm w biofilmach była śledzona w biofilmach 3D o wielkości 20 μm w ciągu 20 minut. Stosy obrazów 4D zostały przetworzone za pomocą wtyczki Mosaic w ImageJ w celu wytworzenia danych 3D trajektorii ruchu koralików. Te dane trajektorii zostały przeanalizowane za pomocą nowo opracowanego zestawu narzędzi Bead Evaluator, w którym dane dotyczące ruchu, w tym długość życia trajektorii, prędkości ściegów, gęstości komórek wzdłuż trajektorii oraz informacje o obwiedni, były obliczane i przechowywane w plikach csv. W tym artykule przedstawiono przebieg pracy od konfiguracji eksperymentalnej i rejestracji obrazu do obliczenia i analizy trajektorii ściegu. Struktura biofilmów zawierających curli skutkowała bardziej stabilnymi interakcjami perełkowymi i mniejszym ruchem kulek niż w biofilmach z mutacjami kulek i enterokokami. Ruch kulek nie wydawał się silnie zależny od gęstości komórek podczas pomiaru prędkości kulki i objętości pola granicznego trajektorii, co potwierdza hipotezę, że inne właściwości materiałowe biofilmów kontrolują dynamikę kulek. Technika ta ma szerokie zastosowanie do ilościowego oznaczania różnic w biofilmach o różnym składzie matrycy, a także biofilmów przed i po zabiegach modyfikujących matrycę.

Wprowadzenie

Biofilmy bakteryjne są wszechobecne jako część ludzkiej mikroflory i nieustannie wchodzą w interakcje z cząsteczkami. Cząsteczki te mają różną wielkość od antybiotyków 1 nm i bakterii 1-3 mm do większych cząstek błonnika w przewodzie pokarmowym. Skład jedno- lub wielogatunkowych biofilmów wpływa na właściwości materiału, a tym samym na wzorzec ruchu cząstek przez biofilmy^1,²^,³^,⁴^,⁵. Jednym z przykładów są bakteryjne amyloidy, które mają zachowaną, fibrylarną strukturę krzyżową warstwy beta⁶. Kędzierzawy amyloidu ulega ekspresji przez bakterie jelitowe, takie jak Escherichia coli i serotyp Salmonella enterica Typhimurium, a geny wykryto w wielu innych typach bakterii⁷. Curli⁸^,^{9 ma wpływ na różne właściwości materiałowe biofilmów}. Curli bezpośrednio oddziałuje z innymi składnikami macierzy, takimi jak zewnątrzkomórkowe DNA (eDNA) i celuloza¹⁰^,¹¹. Curli otacza komórki i wpływa na sztywność błony komórkowej¹² oraz ogólne właściwości lepkosprężyste biofilmu¹³. Curli pośredniczy w zwiększonej wytrzymałości na rozciąganie poprzez wiązanie się z fibronektyną, co powoduje wzrost silnego przylegania do powierzchni szkła¹⁴. Nadchodzące bakteriofagi wiążą się z kędzierzawkami i ograniczają inwazję fagów do biofilmów¹⁵.

Podczas korzystania z wielotestowych powlekanych szkiełek do analizy grubych na około 20 μm Enterococcus faecalis, E. coli i S. Biofilmy Typhimurium przy użyciu mikroskopii konfokalnej, wyraźne różnice między E. coli, S. Można było zaobserwować Typhimurium¹⁰^,¹⁶ i biofilmy E. faecalis (aktualne badanie). Podczas gdy biofilmy z gatunku Enterobacteriaceae miały wysoki poziom sztywności, a obszary o niskiej gęstości komórkowej były łatwe do zobrazowania, uzyskanie wyraźnych obrazów biofilmów E. faecalis o wysokiej rozdzielczości przy użyciu uśredniania linii i klatek wymagało zastosowania nacisku na szkiełko w celu wywołania napięcia powierzchniowego wystarczającego dla stabilności komórek podczas procesu obrazowania. Bakteryjne amyloidy, takie jak kędzierzawe, tworzą wysoce uporządkowane struktury, co sugeruje, że mogą być stosunkowo sztywne¹⁷. To uzasadniło hipotezę, że kędzierzawki amyloidowe mogą indukować sztywność u E. coli i S. Biofilmy Typhimurium. Nie znaleziono jednoznacznych dowodów na to, że E. faecalis wykazywał ekspresję amyloidów w badanych warunkach. Niedawno wykazano, że białko Esp, gen piliny związany z bardziej patogennymi szczepami E. faecalis, wytwarza struktury amyloidowe¹⁸; jednak przy użyciu wyszukiwań blastn i blastp gen ten nie został wykryty w szczepie E. faecalis komensal typu OG1RF użytym w tych badaniach. Feromon cOB1, wytwarzany przez OG1RF, może tworzyć struktury podobne do amyloidu¹⁹. Jednak przy danych warunkach wzrostu biofilmu i metodach wykrywania amyloidu stosowanych wcześniej w przypadku S. Barwienie amyloidem Typhimurium¹⁰ u E. faecalis, nie można wykryć amyloidów OG1RF (dane nie pokazane). Opracowano nową technikę obrazowania czterowymiarowego (4D) w celu porównania ogólnych właściwości materiału wśród lepkich E. faecalis, E. coli i S. Typhimurium, a także w celu określenia udziału amyloidu w biofilmach Enterobacteriaceae przy użyciu mutantów amyloidu S. Typhimurium i E. coli.

W przeszłości koraliki fluorescencyjne były z powodzeniem wykorzystywane do analizy właściwości materiałowych biofilmów w dwóch wymiarach (2D) za pomocą mikroreologii²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵. Można to zastosować do trójwymiarowego biofilmu, badając warstwy optyczne 2D na różnych głębokościach w biofilm²⁶. Obecna technika została opracowana do śledzenia kulek w mikroskali 1 μm w 3D w czasie do wykorzystania w modelowaniu 4D. Jednym z przesłanek była nadrzędna koncepcja wykorzystania modelowania 4D do zrozumienia ruchu plazmidów w społecznościach mikrobioty przewodu pokarmowego. Użyto naładowanych fluorescencyjnie kulek karboksylowych o średnicy 1 μm, ponieważ dobrze odpowiadają, pod względem wielkości i ładunku, E. faecalis, wybranemu organizmowi modelowemu do ruchu i utrzymania plazmidu²⁷^, ²⁸. Opracowano test 4D do ilościowego określenia właściwości fizycznych biofilmów (Rysunek 1A). W opracowanej metodologii do biofilmów dodawano kulki, a ich trajektorie czasoprzestrzenne rejestrowano przez biofilmy o grubości 10-20 μm w ciągu 10-20 minut. Trajektorie koralików w 3D zostały następnie określone ilościowo pod względem długości trajektorii, prędkości koralików, objętości pola granicznego trajektorii (minimalnego pudełka zawierającego trajektorię) oraz gęstości komórkowej pudełka ograniczającego przy użyciu nowo opracowanego zestawu narzędzi. Poniższy protokół może być wykorzystany do generowania danych obrazu 4D bakterii i biofilmów zawierających koraliki, do wstępnego przetwarzania danych za pomocą ImageJ²⁹ i wtyczki Mosaic oraz do analizy trajektorii ścieżek za pomocą zestawu narzędzi Bead Evaluator.

Ta technika ma wiele zastosowań do badania właściwości materiałów, jak również śledzenia ruchu cząstek i bakterii w trzech wymiarach. Na przykład, wczesna wersja tej techniki została wykorzystana do scharakteryzowania wpływu przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko curli na integralność strukturalną biofilmów¹⁶. Pełna wersja zawiera wiele narzędzi zapewniających bardziej szczegółową analizę właściwości materiału biofilmu i jest nadal wykorzystywana do badania wpływu leczenia przeciwciałami monoklonalnymi na biofilmy. Cząstki o różnych ładunkach mogą być wykorzystywane do badania właściwości ładunku materiałowego biofilmów i ruchu cząstek przez biofilmy o różnym składzie matrycy. Można to wykorzystać do porównania wyników mikroreologii 2D, które ujawniają właściwości materiału odpowiedzialnego za ruch kulek, które zaobserwowaliśmy w biofilmach, które nie były pod przepływem. Technika ta może być również stosowana w przypadku biofilmów mieszanych gatunków z regionami o różnym składzie biofilmu. Biofilmy mogą być obrazowane na żywo pod przepływem w urządzeniach mikroprzepływowych i komórkach przepływowych w celu zbadania zmian właściwości materiału między biofilmami statycznymi i przepływowymi, a także wpływu przepływu na ruch cząstek. Techniki te można również zastosować do bakterii znakowanych fluorescencyjnie w celu scharakteryzowania ruchu bakterii egzogennych w społeczności biofilmu. Używając trzech kolorów, fluorescencyjnie znakowane bakterie dawcy, fluorescencyjnie znakowane bakterie biorcze i fluorescencyjnie znakowane plazmidy mogą być używane do śledzenia ruchu, dokowania i transferu plazmidów.

Protokół

1. Przygotowanie biofilmu

UWAGA: Biofilmy do analizy mogą być hodowane przy użyciu dowolnej metody, która pozwala na tworzenie się biofilmu na powierzchni szkła optycznego. Struktura biofilmu powinna przylegać do powierzchni optycznej na tyle, aby struktura nie została naruszona podczas etapów mycia i/lub montażu protokołu. Poniżej opisano technikę dla 96-dołkowych optycznych płytek dolnych i 12-milimetrowych szklanych szkiełek nakrywkowych w płytkach 24-dołkowych. Inne opcje obejmują dolne płyty optyczne o różnych rozmiarach i optyczne komory przepływowe z przepływem i bez.

Konfiguracja biofilmu
1. Dodaj pożywkę do wzrostu bakterii do dołków płytki. W tym badaniu, w przypadku E. kału, dodać 2 ml Todda-Hewitta (TH) do płytki 24-dołkowej i dodać 0,4 ml TH do dolnych płytek 96-dołkowych. Dla S. Typhimurium, E. coli i izogeniczne mutanty kędzierzawych csgAB dodać do studzienek 0,7 ml bulionu Luria bez soli (LB). Jeśli używasz dolnych komór optycznych, przejdź do kroku 1.2.
2. Umieść szkiełka nakrywkowe ze szkła 12 mm #1.5 na szalce Petriego i przykryj je etanolem.
3. Za pomocą kleszczy usuń szkiełko nakrywkowe i użyj płomienia, aby podpalić pozostały alkohol. Pozwól, aby alkohol się spalił. Po prostu użyj płomienia, aby je podpalić; Nie trzymaj szkiełka nakrywkowego w płomieniu, ponieważ pęknie. Pozostaw szkiełko nakrywkowe do ostygnięcia przez 10-20 s przed umieszczeniem go w studzience, aby zapobiec pękaniu.
4. Umieść szkiełko nakrywkowe w studzience zawierającej podłoże pod kątem, aby zapobiec jego układaniu się na podłożu. Nie dodawaj szkiełka nakrywkowego do suchego dołka, a następnie dodaj pożywkę, ponieważ spowoduje to przyklejenie się szkiełka nakrywkowego do dna studzienki.
5. Za pomocą sterylnej końcówki pipety ostrożnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do dna studzienki zawierającej pożywkę.
  UWAGA: Pamiętaj, aby dopasować grubość (#1 lub #1.5) szkiełka nakrywkowego lub dolnej płyty optycznej do grubości optyki mikroskopu konfokalnego.
Inkubuj biofilm w odpowiednich warunkach do wzrostu biofilmu. W tych badaniach biofilmy E. faecalis są hodowane jako kultury statyczne w temperaturze 37 °C, a biofilmy E. coli rozwijają się tlenowo w temperaturze 30 °C.
1. W tych badaniach hoduj biofilmy E. faecalis przez 2 dni z przełącznikami pożywki rano i wczesnym wieczorem. Aby zapobiec uszkodzeniu lub przemieszczeniu biofilmu, ostrożnie pochyl płytkę. Umieść końcówkę pipety w pobliżu dolnej krawędzi studzienki i powoli wyciągnij pożywkę. Dodaj pierwszy ml świeżej pożywki w ten sam sposób. Powoli dodawać drugi ml w pobliżu interfejsu pożywka/studzienka.
2. W tych badaniach należy zastosować warunki wzrostu w celu uzyskania optymalnej produkcji loków. Uprawa S. Biofilmy Typhimurium w temperaturze 28 °C przez 6-8 dni inkubowane na skosie, który pozwolił biofilmowi przyczepić się około 2/3 drogi w górę szkiełka, a następnie wyrosnąć jako błonka na granicy faz powietrze-ciecz. Odbyło się to bez zmiany medium. Aby zapobiec wysychaniu pożywki, umieść 24-dołkową płytkę w komorze z miską na wodę.

2. Obrazowanie 4D

Przygotowanie mocowania biofilmu
1. Rozcieńczyć kulki karboksylowe FluoSpheres Crimson 1 μm w stosunku 1:50 w PBS (2 x 10⁷ kulek w 1 ml PBS). W przypadku korzystania z dolnych komór optycznych dodać Syto9 w rozcieńczeniu 1 μl do 300 μl preparatu kulkowego.
2. (opcjonalnie) Umyj biofilm, aby usunąć ślady pożywki wzrostowej, jeśli pożywka wzrostowa ma autofluorescencję. W tych eksperymentach przemyj dwukrotnie 1 ml PBS, ostrożnie pochylając płytkę, umieszczając końcówkę pipety w pobliżu dolnej krawędzi studzienki i powoli wyciągając pożywkę. Dodaj PBS, umieszczając końcówkę w pobliżu dolnej krawędzi i powoli napełniaj studzienkę. Technikę tę należy stosować na dnie optycznym oprócz szkiełek nakrywkowych w płytce 24-dołkowej.
3. Usuń nośnik lub PBS. Dodać rozcieńczone kulki szkarłatne przygotowane w ppkt 2.1.1 do biofilmu. W tych badaniach dodaj 1 ml kulek (2x10⁷) do szkiełek nakrywkowych i 0,2 ml kulek (4x10⁶) i Syto9 do 96-dołkowych płytek dolnych optyki.
4. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić asocjację kulek.
5. Usuń koraliki i delikatnie umyj biofilm raz za pomocą PBS, aby usunąć niepowiązane koraliki. W tych badaniach, w przypadku szkiełka nakrywkowego, delikatnie przemyć 1 ml PBS, ponownie napełnić studzienkę 1 ml PBS i przejść do 2.1.6. W przypadku 96-dołkowych płytek dolnych optycznych delikatnie przemyj biofilm 0,2 ml PBS i napełnij studzienkę 0,2 ml PBS. Dolna komora optyczna jest teraz gotowa do obrazowania, więc przejdź do kroku 2.2.
6. (W przypadku korzystania ze szkiełka nakrywkowego) Dodaj 1 μl Syto9 (zielone fluorescencyjne barwienie DNA; rozcieńczone zgodnie z instrukcjami producenta) do środka studzienki na powlekanym 10-dołkowym szkiełku multitestowym. Te powlekane szkiełka nakrywkowe mają głębokość studni 23-25 μm.
7. (W przypadku korzystania z szkiełka nakrywkowego) Używając kleszczy sterylizowanych płomieniem alkoholu, ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe ze studzienki i odwróć do studzienki zawierającej kroplę Syto9. Pozostawienie szkiełka nakrywkowego w 1 ml PBS ułatwia jego usunięcie ze studzienki i pomaga wypłukać niezwiązane kulki z biofilmu.
8. (W przypadku korzystania z szkiełka nakrywkowego) Ostrożnie uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci, nie przesuwając ani nie dociskając szkiełka nakrywkowego, co może spowodować napięcie powierzchniowe, które zatrzyma ruch w bardziej lepkich, mniej sztywnych biofilmach.
9. (Jeśli używasz szkiełka nakrywkowego) Pozostaw lakier do paznokci do wyschnięcia. Ostrożnie przetrzyj zewnętrzną powierzchnię szkiełka nakrywkowego 70% etanolem. Wycierać bez wywierania nacisku na szkiełko nakrywkowe z powodów wymienionych powyżej.
Obrazowanie konfokalne
UWAGA: W tych badaniach należy użyć laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z odwróconym obrazowaniem spektralnym, wyposażonego w system konfokalny TCS z obiektywem 63x. Luneta zostanie wykorzystana do wygenerowania filmu 4D (Rysunek 1). Biofilm 3D będzie składał się z warstw Z wychwytywanych w krokach co 0,5 μm przez biofilmy o grubości 18-20 μm, generując 36-40 warstw Z. Uchwycenie każdego biofilmu 3D zajmie 50-60 sekund. Plastry razem utworzą ramę, którą można zwizualizować jako biofilm 3D. Ten proces zostanie powtórzony 20 razy, aby wygenerować film poklatkowy 4D o łącznym czasie śledzenia 18-20 minut.
1. Ustaw zakres do przechwytywania fluoroforów. W tych badaniach wzbudz Syto9 (barwienie bakteryjnego DNA) laserem o długości 488 nm i zmierz emisję od 495 do 540 nm (Leica Sp5 to mikroskop do obrazowania spektralnego). Wzbudz szkarłatne (czerwone) kulki za pomocą lasera o długości fali 633 nm i zmierz emisję od 650 nm do 700 nm. Te ustawienia fluoroforu można dostosować, aby wychwycić dowolne pożądane fluorofory.
2. Wybierz tryb obrazowania xyzt.
3. Zidentyfikuj obszar biofilmu za pomocą mieszaniny regionów o wyższej i niższej gęstości, aby uchwycić różnice we właściwościach lepkosprężystych w grubych i cienkich obszarach biofilmu.
4. Ustaw stos Z o grubości 18-20 μm. W biofilmie montowanym na szkiełku nakrywkowym należy unikać dotykania przez górną i dolną część biofilmu szkła, aby uniknąć artefaktów zatrzymujących koraliki (patrz dyskusja).
5. Dostosuj wzmocnienie i przesunięcie, aby wykorzystać cały zakres dynamiki intensywności w najjaśniejszym miejscu biofilmu. Minimalizuje to nakładanie się sygnału z niższych warstw biofilmu.
6. Ustaw grubość plastra na 0,5 μm. Pozwala to na szybkie obrazowanie bez utraty informacji o kulkach.
7. Ustaw rozdzielczość na 512 x 512 (0,48 μm). Pozwala to na szybkie obrazowanie, a jednocześnie generuje obrazy o rozdzielczości wystarczającej do zobaczenia struktury biofilmu i szczegółów ruchu kulek.
8. Zminimalizuj czas obrazowania.
9. Ustawiono na przechwycenie 20 ładunków.
10. Zapisz jako .lif (lub podobny plik konfokalny). Film 4D można wygenerować w formacie ImageJ.

3. Generowanie filmu 4D z biofilmu za pomocą ImageJ

Otwórz plik .lif w ImageJ z następującymi ustawieniami: Widok stosu za pomocą Hyperstack, Kolejność stosu XYCZT, tryb kolorów: kolorowany, zaznaczone autoskalowanie. Następnie naciśnij przycisk OK.
Wybierz opcję Obraz > Kolor > Podziel kanały.
Wybierz opcje Obraz > Kolor > Scal kanały > Utwórz > kompozytowe OK.
Wybierz Wtyczki > przeglądarce 3D > Kanały odznacz niebieski > OK.
Wybierz opcję Edytuj > Pokaż zawartość zaznaczoną > zaznaczoną opcję Pokaż obwiednię.
Użyj kliknięcia i przytrzymania myszy, aby wybrać obraz. Następnie obróć obraz, nadal przytrzymując przycisk kliknięcia. Obróć obraz tak, aby spód biofilmu znajdował się na dole, a kąt umożliwiał wizualizację koralików. Następnie zwolnij obraz.
Naciśnij czerwony przycisk nagrywania u dołu okna, aby nagrać wideo.
Zapisz jako plik .avi przy użyciu jpeg jako kompresji.

4. Generowanie danych o trajektoriach

Zainstaluj narzędzie typu open source ImageJ (https://imagej.net/Fiji) i wtyczkę do śledzenia cząstek Mosaic (https://imagej.net/MOSAICsuite).
Zaimportuj plik .lif zawierający dwa kanały dla koralików i bakterii. Podziel kanały i zapisz pliki osobno.
W ImageJ zapisz rozmiar woksela obrazu (wymiary x, y i z) oraz rozmiar kroku czasowego w pliku tekstowym.
W ImageJ przejdź do Wtyczki | Mozaika i uruchom Particle Tracker 2D/3D.
Wprowadź następujące parametry: Promień: 3, Odcięcie: 0,003, Per/Abs: 0,12, Zakres łącza: 2, Przemieszczenie: 10,00 z dynamiką ustawioną na Browna. Proszę zapoznać się z wynikami, aby zapoznać się z uzasadnieniem wyboru Browna w tych eksperymentach.
Wygeneruj trajektorie i wyeksportuj listę trajektorii jako pliki .csv.

5. Analiza trajektorii

Instalacja programu VRL Studio (https://vrl-studio.mihosoft.eu)
Pobierz projekt Biofilm (https:// neurobox3d.github.io/Biofilm/) i uruchom go w VRL Studio
Załaduj plik trajektorii w ImportData
Określ rozmiar piksela x, y i z (użyj ImageJ, aby zlokalizować te wartości) w polu ProcessTrajectories.
Określ interwał klatek w ComputeVelocity (użyj ImageJ, aby zlokalizować tę wartość).
Załaduj bakteryjny plik tiff (patrz krok 3.2) w obszarze Comdensity.
Ustaw ścieżki wyjściowe dla danych prędkości w SaveVelocityDataToFile i danych trajektorii w SaveTrajectoryDataToFile.
Wywołaj metody SaveVelocityDataToFile i SaveTrajectoryDataToFile.
Importowanie danych do programu Excel w celu analizy. Dane te będą obejmować długości trajektorii, długość życia trajektorii, wymiary i objętości pola granicznego trajektorii, średnie prędkości ściegu i wariancje. Analiza oblicza zmienne ważone przy użyciu kanału dla bakterii znakowanych Syto9 w celu obliczenia lokalnych (w ramach danych pól granicznych trajektorii) gęstości komórek. Wynikiem analizy jest obliczenie średnich ważonych prędkości i wariancji, a także średnich ważonych i wariancji wariancji pola ograniczenia.

Wyniki

Metodę tę zastosowano w celu zweryfikowania hipotezy, że curli mogą nadawać sztywność E. coli i Sbiofilmy Typhimurium, ograniczając ruch kulek podczas eksperymentów z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Obecny zestaw narzędzi został wykorzystany do porównania właściwości materiałowych Enterococcus faecalis szczep typowy komensalny OG1RF do Salmonella enterica serotyp Typhimurium, E. coli, oraz ich odpowiednie izogeniczne mutanty curli (Rycina 1B i Wideo uzupełniające 1, Wideo uzupełniające 2, Wideo uzupełniające 3, Wideo uzupełniające 4, Wideo uzupełniające 5, Wideo uzupełniające 6Właściwości materiałowe biofilmu mogą potencjalnie różnić się pod względem sztywności (np. curli związane z eDNA) lub oddziaływań elektrostatycznych i hydrofobowych pomiędzy ujemnie naładowanymi koralikami a komórkami biofilmu i materiałami macierzy, a także gęstości komórkowej.

Powtarzalność
Zestaw narzędzi Biofilm został zaprogramowany w językach Groovy³⁰ i Java³¹ w środowisku VRL-Studio³², co umożliwiło zaprojektowanie modularnego przepływu pracy z automatycznym generowaniem interfejsu użytkownika (UI) dla wszystkich komponentów obliczeniowych. Pozwoliło to na automatyzację procesu, eliminując niezamierzone błędy systematyczne wprowadzone przez eksperymentatora podczas analizy wyników.

Wykorzystanie MSD do potwierdzenia rodzaju ruchu w biofilmach
Do analizy trajektorii za pomocą programu Particle Tracker 2D/3D dostępne są różne ustawienia dynamiki dla analizy różnych typów ruchu kulek. W tych badaniach wybrano ustawienie „Brownian motion” (tj. ruch dyfuzyjny), ponieważ E. faecalis jest bakterią nieporuszającą się, E. coli i Salmonella nie wykazują obecności wici w biofilmach, a eksperymenty przeprowadzono w systemie zamkniętym przy braku przepływu. Ustawienie to można było dodatkowo zweryfikować za pomocą obliczonego średniokwadratowego przemieszczenia (MSD) kulek. Stosując definicję Schemat równania średniokwadratowego przemieszczenia, MSD(m)=1/mΣ(xi-x0)^2, analiza statystyczna. gdzie m jest liczbą segmentów trajektorii, można obliczyć zmianę MSD w przebiegu każdej trajektorii. Trajektorie liniowe wskazują na dyfuzyjny ruch kulek (Rycina 2A). Przy użyciu kwadratowej metody najmniejszych kwadratów obliczono średni wzorzec ruchu wszystkich kulek w biofilmie, co wykazało dominujący charakter liniowy i potwierdziło dyfuzję pasywną jako siłę napędową (Rycina 2A-2F).

Analiza ramki ograniczającej.
Zestaw narzędzi wykorzystuje ImageJ Mosaic oraz Particle Tracker 2D/3D do generowania trajektorii (Krok 4), a następnie, przy użyciu zautomatyzowanego potoku analizy biofilmu, generuje istotne dane dotyczące trajektorii kulek, które mogą służyć do porównania właściwości materiałowych biofilmu. Objętość ramki ograniczającej w µm³ mierzono poprzez konstrukcję minimalnego prostopadłościanu obejmującego trajektorię i pomiar jego objętości (Rycina 3).

E. faecalis biofilmy wykazują większy ruch kulek, z wartościami bounding box w zakresie 1-6000 µm³ (Rycina 3B, 3C i 3D). Wyniki potwierdzają, że ruch obserwowany przy użyciu szkiełka nakrywkowego zamontowanego na powleczonym preparacie z otworem o grubości powłoki około 25 µm (Rycina 3C) w porównaniu do biofilmów hodowanych na dnie szklanych studzienek optycznych i obrazowanych bezpośrednio (Rycina 3D) daje równoważne wyniki z niewielkimi różnicami. Jedyną różnicą było to, że w pobliżu górnej części zamontowanego szkiełka nakrywkowego w biofilmach E. faecalis można było zarejestrować stabilne trajektorie o czasie trwania przekraczającym 10 minut, ale jednocześnie małe wartości bounding box, podczas gdy na płytce z dnem optycznym można było zarejestrować określoną liczbę kulek o wyższej mobilności. Wspólnie sugeruje to, że montaż szklanego preparatu mógł zmienić napięcie powierzchniowe układu na styku górnej części biofilmu ze szkiełkiem w przypadku biofilmu na zamontowanym szkiełku nakrywkowym, co ostatecznie zmniejszyło mobilność niektórych kulek w obszarach biofilmu o mniejszej lepkości (Rycina 3B, 3C, 3D i 3I). Trajektorie należące do tej kategorii stanowiły bardzo niewielki procent i nawet przy tej małej liczbie uwięzionych kulek średnie MSD dla E. faecalis na zamontowanym szkiełku nakrywkowym było nieco wyższe niż MSD obliczone dla biofilmu na płytce z dnem optycznym (Rycina 3).

S. Typhimurium i E. coli wykazały mniejsze objętości ograniczających pól trajektorii kulek, wynoszące 0-10 µm³ (Rysunek 3A, 3B, 3E i 3F), w porównaniu do izogenicznych mutantów curli, których pola ograniczające wynosiły 1-6000 µm³ dla E. coli oraz 1-5000 µm³ dla S. Typhimurium (Rysunek 3A, 3B, 3F i 3H), co świadczy o większej mobilności kulek. Wyniki te sugerują, że obecność amyloidu korelowała ze zwiększoną sztywnością biofilmów, co było zgodne z brakiem zauważalnego ruchu biofilmu na nagraniach wideo. Objętości pól ograniczających były konsekwentnie małe (0-10 µm³) nawet w obszarach biofilmu o niskiej gęstości. Obserwacja ta jest zgodna z wcześniejszymi doniesieniami, że curli mogą występować w obszarach biofilmu o niskiej gęstości komórek¹⁰.

Nie było możliwe porównanie zachowania biofilmu Enterobacteriaceae na płytkach z dnem optycznym, ponieważ bakterie te rosną w formie błon (pellicles) na granicy fazy powietrze-ciecz (Krok 1.2.2). Podczas stosowania szkiełka cover-slip, błona przylegała do szkiełka na granicy faz, a po jego zdjęciu błona spoczywała na szkiełku, tworząc jednolity obszar obrazowania. W przypadku płytki z dnem optycznym hodowanej pod skosem, obrazowanie przeprowadzano przy obecności cieczy w studzience. Oznacza to, że błona wciąż unosiła się nad dnem optycznym, przez co znajdowała się poza głębokością roboczą mikroskopu odwróconego, takiego jak Leica Sp5. Usunięcie wystarczającej ilości medium, aby wprowadzić biofilm w zakres głębokości roboczej mikroskopu, powodowało wysychanie preparatu w trakcie 20-minutowego procesu obrazowania.

Ogólnie rzecz biorąc, wykresy potwierdzają obserwacje wizualne przedstawione w materiałach wideo uzupełniających i są zgodne z zaobserwowanymi różnicami w MSD (Rycina 3I i 3J).

Długość trwania trajektorii
Długość trwania trajektorii mierzono jako liczbę następujących po sobie klatek, w których zarejestrowano kuleczkę (Rycyna 3).

W bardziej lepkich, przypominających ciecz biofilmach E. faecalis wszystkie kulek miały czas trwania trajektorii krótszy niż 10 minut, a większość trajektorii w przypadku biofilmów E. faecalis mieściła się w przedziale od 2 do 5 minut. Jednakże kulki z zarejestrowanym krótkim czasem trwania trajektorii mogły zostać zlokalizowane poprzez inspekcję wizualną w biofilmach E. faecalis w całym oknie czasowym obrazowania (Supplemental Video 1 and 2). Zatem możliwe jest, że kulki poruszają się wzdłuż zarejestrowanej trajektorii, okresowo odseparowując się od biofilmu i kończąc trajektorię, a następnie ponownie łącząc się z biofilmem, w którym momencie inicjowana jest nowa trajektoria. Ostatecznie prowadziłoby to do krótkich czasów trwania trajektorii przy ciągłej obecności kulek w biofilmie. Należy zauważyć, że przy zastosowaniu tej techniki czasy trwania trajektorii, zwłaszcza w lepkim biofilmie, mają tendencję do zaniżania całkowitego czasu, przez który kulka jest związana z biofilmem.

W biofilmach S. Typhimurium, które charakteryzowały się mniejszymi objętościami ograniczających ramek (bounding box), większość kulek (około 80%) wykazywała długie czasy trwania trajektorii wynoszące 16-20 klatek, co odpowiadało około 15-20 minutom czasu rzeczywistego (Rysunek 3A, 3G i 3H). W przeciwieństwie do nich, biofilmy izogenicznych mutantów curli zawierały więcej mobilnych kulek z objętościami ograniczających ramek w zakresie od 1-6000 µm³ (E. coli) i 1-5000 µm³ (S. Typhimurium) (Rysunek 3A, 3B, 3F i 3H). W kontraście do biofilmów E. faecalis, w których >70% trajektorii miało objętości ograniczających ramek większe niż 10 µm³, biofilmy gatunków z rodziny Enterobacteriaceae wykazały jedynie 30% trajektorii kulek o objętościach ograniczających ramek powyżej 10 µm³. Mimo że całkowite czasy trwania trajektorii kulek były krótsze w biofilmach mutantów curli, niektóre trajektorie odzwierciedlały znaczący ruch kulek oraz długie czasy trwania trajektorii (Rysunek 3H). Obserwacja ta może wskazywać, że zmienność ta może odpowiadać różnym właściwościom materiałowym biofilmu, takim jak wiskoelastyczność, i/lub zmianom chemii powierzchni cząstek, np. ładunku.

Analiza długości trajektorii i prędkości kulek
Długość trajektorii jest pomiarem odległości przebytej przez kuleczki w µmPomiar ten jest zgodny z prędkością ruchu kulek w µm/sZgodnie z większymi objętościami ramki ograniczającej, kuleczki w E. faecalis biofilmy wykazywały 10-krotnie dłuższe trajektorie, 5-20 µmkontrastowo z <4 µm w biofilmach zawierających włókna curli. Zgodnie z krótszymi trajektoriami (Rycina 4A). E. faecalis kulki osiągały prędkości nawet 15-krotnie wyższe, przy czym większość z nich poruszała się z prędkościami w zakresie 0,01-0.15 µm/s prędkości względem siebie <0.006 µm/s (Rycina 4B). Niemniej jednak w biofilmach mutantów curli odnotowano ogólnie niższe prędkości i krótsze trajektorie w porównaniu do E. faecalis biofilmy, lecz dłuższe trajektorie i wyższe prędkości niż w przypadku szczepów rodzicielskich zawierających curli (Rycina 4A oraz 4B).

Warto zauważyć, że włóknista, przypominająca sieć struktura curli³⁰ może wpływać na mobilność w sposób anizotropowy, ograniczając ruch w płaszczyźnie xy i umożliwiając zwiększoną mobilność w kierunku z (Rysunek 2G). Duża pula trajektorii (około 800) należąca do w przybliżeniu 50 unikalnych kuleczek w biofilmach zawierających curli byłaby spójna z ograniczeniami metody Mosaic Particle Tracking, która zlicza każdą z tych szybko poruszających się kuleczek jako pojedynczą kuleczkę w osiach x, y i z. Do potwierdzenia tej obserwacji niezbędne będą dalsze badania oraz rozwój oprogramowania.

Analiza zależności ruchu kulek od gęstości komórkowej
Zależność ruchu kulek od gęstości komórkowej określono przy użyciu średnich ważonych prędkości i ich wariancji, a także średnich/średnich ważonych i wariancji objętości ramek ograniczających (bounding box). Do obliczenia lokalnych gęstości komórkowych w obliczeniach prędkości ważonych wykorzystano drugi kanał obrazowania dla bakterii znakowanych Syto9. Gęstość komórkową obliczono poprzez uśrednienie danych wokselowych Syto9 w obrębie ramki ograniczającej każdego krawędziowego odcinka trajektorii (Rysunek 5, prawa strona). W ten sposób prędkość kulek może być ważona lokalną gęstością komórek na każdym odcinku. Istnieje wiele rodzajów barwników, które można wykorzystać do wizualizacji bakterii, w tym barwniki ścian komórkowych, błon oraz zawartości DNA. Do wyznaczenia gęstości komórkowej wybrano Syto9, ponieważ daje on najbardziej spójny sygnał niezależnie od wizualizowanego przekroju optycznego w osi Z. Barwniki otoczkowe (ściany komórkowej i błony) będą dawać różny sygnał w zależności od pozycji przekroju Z. Jeśli przekrój Z obejmuje górną lub dolną część komórki, sygnał będzie silniejszy niż w przypadku przekroju Z przechodzącego przez środek komórki, gdzie zabarwiony jest tylko jej zarys.

Trajektorie kulek z kanału czerwonego śledzono przez 20 klatek, przy czym pojedyncze trajektorie miały minimalny czas życia wynoszący 2 klatki i maksymalny 20 klatek, z 19 segmentami trajektorii łączącymi klatki (Rycina 5). Aby zbadać zależność mobilności kulek od gęstości komórek, wyznaczono intensywność GFP na voksel (każdy z pojedynczych pomiarów w obrazie o rozmiarach 512x512 vokseli). Gęstość komórek wokół każdego segmentu trajektorii kulek obliczono jako średnią lokalną gęstość w ramce otaczającej dany segment.

W przypadku niektórych biofilmów można było odnotować statystycznie istotną zależność od gęstości (Rysunek 6), najsilniej w przypadku biofilmów E. faecalis hodowanych na szklanym zakryciu i odwróconych na szkiełku wieloodworowym (Rysunek 6A). Przeciwnie, biofilmy E. faecalis hodowane na dnie płytki 96-dołkowej (Rysunek 6B) nie wykazały zależności od gęstości. Podsumowując, sugeruje to, że wysoce płynne biofilmy E. faecalis mogły zostać potencjalnie nieznacznie ściśnięte z powodu zamontowania ich na szkiełku wieloodworowym, co jest zgodne z redukcją liczby kulek poruszających się szybciej oraz tych o niewielkich objętościach ramki ograniczającej, które zostały uwięzione u góry biofilmu przy szklanym szkiełku (Rysunek 3C vs Rysunek 3D). Zarówno biofilmy Salmonella i E. coli (Rysunek 6C i 6D), jak i ich mutanty izogeniczne (Rysunek 6E i 6F) wykazały niewielką lub żadną zależność od gęstości komórkowej.

Wizualizacja timelapse'owa biofilmu 3D; przekroje Z, analiza trajektorii; dane mikroskopowe, śledzenie biofilmu bakteryjnego.
Rycina 1. Schemat obrazowania i analizy (kroki 2-4) (A) Biofilmy obrazowano zgodnie z opisem w sekcji 2.2. Na podstawie obrazów biofilmów (patrz pkt 3) wygenerowano trajektorie kulek zgodnie z opisem w sekcji 4. Wykorzystując trajektorie, obliczono istotne dane za pomocą narzędzi analitycznych (patrz pkt 5) (B) Biofilmy hodowano zgodnie z opisem w kroku 1 na szkiełkach nakrywkowych (E. faecalis, Wideo 1), S. Typhimurium (Wideo 3), E. coli (Wideo 5) oraz izogenicznymi mutantami curli (Wideo 4, Wideo 6) lub w 96-dołkowej płytce z dnem optycznym (E. faecalis dno, Wideo 2). Biały pasek skali odpowiada 20 mm. Rycina powtórzona za zgodą z (31). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Analiza ruchliwości bakterii; wykresy przedstawiają średni kwadrat przemieszczenia; obrazy mikroskopowe E. coli, E. faecalis.
Rysunek 2. Stwierdzono, że ruch kulek w biofilmach ma charakter dyfuzyjny (ruch Browna, patrz krok 5) (A-F) Dane MSD wykazują zachowanie liniowe (czerwona linia), co potwierdza ruch Browna. Biofilmy hodowano zgodnie z krokiem 1 (G) Przykład eliptycznego ruchu kulek zaobserwowanego w biofilmach E. coli oraz S. Typhimurium, pochodzący z jednej klatki testu 4D biofilmu E. coli (H) Przykład dużych zmian w wzorach rozmieszczenia kulek między klatką 3 a 4, pochodzący z optycznego dołka dna dla E. faecalis. Należy zauważyć, że sam biofilm wywołuje pewien przepływ (Wideo 1 i 2), co sprawia wrażenie, że klatka 3 i 4 są zorientowane inaczej. Rysunek przedrukowano za zgodą z (31). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza szczepów bakteryjnych; czas trwania trajektorii, ramka ograniczająca; wykresy; wizualizacja danych eksperymentalnych.
Rysunek 3. Analiza różnic w sztywności przy użyciu ramek ograniczających i czasu trwania trajektorii. Biofilmy hodowano zgodnie z opisem w kroku 1 na szkiełkach nakrywkach (E. faecalis, Wideo 1), S. Typhimurium (Wideo 3), E. coli (Wideo 5) i izogenicznych mutantach curli (Wideo 4, Wideo 6) lub w 96-dołkowej płytce z dnem optycznym (dno E. faecalis, Wideo 2). Czas trwania trajektorii przedstawiono jako % całkowitej liczby trajektorii kulek (A) oraz na wykresach rozrzutu (C-H), wraz z objętościami ramek ograniczających (obliczonymi w kroku 5) (I). Porównanie MSD kulek w różnych biofilmach (H) Średnie MSD dla każdego typu biofilmu. Słupki wskazują 95% przedział ufności danych. Rysunek powielony za zgodą z (31). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe porównujące długości trajektorii i prędkości kulek, podkreślające różnice w naprężeniu w μm i μm/s.
Rycina 4. Analiza różnic w długości trajektorii i prędkości kulek. Biofilmy hodowano zgodnie z opisem w kroku 1. Długości trajektorii podano w µm i przedstawiono jako % całkowitej liczby trajektorii kulek (A). Prędkość podano w µm/s i przedstawiono jako % całkowitej liczby trajektorii kulek (B). Rycina opracowana za zgodą autorów (31). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat analizy biofilmu 4D: przekroje Z, ruch segmentów, gęstość komórkowa, mapowanie trajektorii.
Rycina 5. Schemat analizy segmentów trajektorii. Ta rycina została opracowana za zgodą autorów z (31). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza zależności prędkości bakterii od gęstości; wykresy; E. faecalis, S. Typhimurium, E. coli; wskaźniki R².
Rysunek 6Badanie wpływu gęstości biofilmu na prędkość kulek przy użyciu potoku analizy biofilmu (krok 5). Wyniki wskazały, że prędkość kulek nie zależy wyłącznie od gęstości komórek. Biofilmy hodowano zgodnie z opisem w kroku 1. Trajektorie analizowano w skali pojedynczych segmentów trajektorii (Rysunek 5). Dla każdego segmentu prędkość kulek w µm/s wykreślono w zależności od gęstości komórkowej w obrębie ramki ograniczającej (średnia wartość GFP na woxel wewnątrz ramki ograniczającej). Czerwona linia przedstawia regresję liniową, a zielona linia przebieg regresji wykładniczej. Rysunek powielono za zgodą autorów z (31). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wideo uzupełniające 1. Wideo 4D z 24-godzinnego biofilmu E. faecalis OG1RF hodowanego na szkiełku nakrywkowym z grubością 1,5. Wideo poklatkowe 4D zostało przygotowane przy użyciu mikroskopu o rozdzielczości 512x512. Seria Z składająca się z 40 obrazów została wygenerowana poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 µm w krokach 0,5 µm. Każda seria Z stanowiła jedną klatkę i wymagała 50-60 s na przechwycenie. Przechwycono serię 20 następujących po sobie klatek, aby stworzyć wideo 4D. Prędkość odtwarzania wideo wynosi około 120x. Wideo jest reprezentatywne dla co najmniej 6 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Uzupełniający film 2. Film 4D z 24-godzinnego wzrostu biofilmu E. faecalis OG1RF na płytce 96-dołkowej z optycznym dnem. Film poklatkowy 4D został przygotowany przy użyciu mikroskopu w rozdzielczości 512x512. Seria Z składająca się z 40 obrazów została wygenerowana poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 µm w krokach 0,5 µm. Każda seria Z stanowiła jedną klatkę i wymagała 50-60 s na zarejestrowanie. W celu przygotowania filmu 4D zarejestrowano serię 20 następujących po sobie klatek. Prędkość odtwarzania filmu wynosi około 120x. Film jest reprezentatywny dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film .

Materiał uzupełniający Wideo 3. Wideo 4D biofilmu Salmonella enterica serotyp Typhimurium ATCC 14028 hodowanego przez 6-7 dni na szklanych lamelkach optycznych o grubości 1,5. Wideo time-lapse 4D zostało przygotowane przy użyciu mikroskopu w rozdzielczości 512x512. Serię Z składającą się z 40 obrazów uzyskano poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 µm w krokach 0,5 µm. Każda seria Z stanowiła jedną klatkę i jej rejestracja trwała 50-60 s. W celu przygotowania wideo 4D zarejestrowano serię 20 następujących po sobie klatek. Prędkość odtwarzania wideo wynosi około 120x. Wideo jest reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać to wideo .

Uzupełniające wideo 4. Wideo 4D biofilów Salmonella enterica serotypu Typhimurium ATCC 14028 z mutacją w genach curli (csgBA), hodowanych na szkiełkach przedmiotowych o grubości 1,5 przez 6-7 dni. Wideo poklatkowe 4D zostało wykonane przy użyciu mikroskopu o rozdzielczości 512x512. Seria Z składająca się z 40 obrazów została utworzona poprzez obrazowanie obszaru biofilu o grubości około 20 µm w krokach co 0,5 µm. Każda seria Z stanowiła jedną klatkę i jej zarejestrowanie trwało 50-60 s. W celu uzyskania wideo 4D zarejestrowano serię 20 następujących po sobie klatek. Prędkość odtwarzania wideo wynosi około 120x. Wideo jest reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo .

Dodatkowy film 5. Film 4D szczepu E. coli UTI89 hodowanego na szkiełkach dekoporycznych o grubości 1,5 przez 6–7 dni. Film poklatkowy 4D został wykonany przy użyciu mikroskopu w rozdzielczości 512x512. Serię Z składającą się z 40 obrazów uzyskano poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 µm w krokach co 0,5 µm. Każda seria Z stanowiła jedną klatkę i wymagała 50–60 s na zarejestrowanie. W celu przygotowania filmu 4D zarejestrowano serię 20 sąsiednich klatek. Prędkość odtwarzania filmu wynosi około 120x. Film jest reprezentatywny dla 3 niezależnych eksperymentów. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film .

Uzupełniający film 6. Film 4D mutantów curli (csgBA) szczepu E. coli UTI89 hodowanych na grubych szkiełkach optycznych o grubości 1,5 przez 6-7 dni. Film pokadrowy 4D został utworzony przy użyciu mikroskopu o rozdzielczości 512x512. Seria Z składająca się z 40 obrazów została uzyskana poprzez obrazowanie obszaru biofilmu o grubości około 20 µm w krokach 0,5 µm. Każda seria Z stanowiła jedną klatkę i wymagała 50-60 s na zarejestrowanie. Aby stworzyć film 4D, zarejestrowano serię 20 następujących po sobie klatek. Odtwarzanie filmu odbywa się z prędkością około 120x. Film jest reprezentatywny dla 3 niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film .

Dyskusja

Kroki krytyczne i rozwiązywanie problemów
Największym wyzwaniem tej techniki jest użycie zamontowanego szkiełka nakrywkowego z bardzo lepkim biofilmem, takim jak E. faecalis. Szkiełko nakrywkowe należy ostrożnie i dokładnie umieścić na szkiełku wielodołkowym bez zmiany jego położenia. Na etapie uszczelniania należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do dociśnięcia szkiełka nakrywkowego lub przypadkowego wepchnięcia/przesunięcia go po powierzchni szkiełka. Każdy ruch lub ciśnienie może wytworzyć napięcie powierzchniowe i zablokować ruch lepkiego biofilmu. Jeśli to możliwe, porównanie właściwości materiału biofilmu poprzez obrazowanie biofilmu na dnie optycznym z mocowaniem szkiełka nakrywkowego pozwoli na ocenę techniki. Prawidłowo wykonany montaż szkiełka nakrywkowego bardzo przypominał biofilm w dolnej płytce optycznej dla E. faecalis.

Ponadto w przypadku stosowania zamontowanego szkiełka nakrywkowego należy unikać obrazowania powierzchni styku biofilmu z szkiełkiem nakrywkowym na dole lub szkiełkiem podstawowym na samej górze. W przypadku korzystania z odwróconej lunety, z szkiełkiem nakrywkowym na dole, u podstawy biofilmu mogą znajdować się uwięzione kulki na szkiełku nakrywkowym. Kulki te przechodzą przez biofilm i zostają uwięzione na szkiełku nakrywkowym nawet po delikatnym umyciu. Mają współrzędne x, y i z równe 0 oraz współrzędne pola ograniczenia równe 0. Jednak w przypadku niektórych zastosowań, takich jak badanie integralności biofilmu po zabiegu, te punkty danych mogą być wykorzystywane jako narzędzie. Zdolność kulek do przenikania przez gruby obszar biofilmu do dna szkiełka nakrywkowego może być wykorzystana do oceny integralności biofilmu po zabiegu (manuskrypt w przygotowaniu we współpracy z laboratorium Tükel). Na szczycie biofilmu, w lepkim biofilmie, takim jak E. faecalis, mieliśmy pewne dowody na zagęszczenie narzucone przez szkiełko nakrywkowe. Ograniczyło to ruch niektórych koralików na styku szkiełek i mogło wprowadzić pewną zależność od gęstości do analizy ruchu ściegów.

Etapy płukania były konieczne dla biofilmów, ponieważ pożywka wzrostowa ma silną autofluorescencję w kanale zielonym. Decydujemy się na użycie nadmiaru koralików i usunięcie niepowiązanych koralików przez pranie, aby zmaksymalizować powiązane koraliki, aby uzyskać najdokładniejszą charakterystykę obserwowanych obszarów.

Liczba ściegów i płukań potrzebnych do uzyskania pożądanych zestawów danych musi być określona empirycznie. Obecność zbyt wielu kulek w biofilmie generuje niemożliwie duże zbiory danych, które są trudne do analizy. Obecność zbyt małej liczby kulek nie powoduje dokładnego pobierania próbek środowisk biofilmu. Jednak kontrola liczby dodawanych kulek (2x10⁷ kulek w 1 ml PBS) i zastosowanie etapów płukania spowodowały, że liczba kulek (40-140) kojarzących się z biofilmem w zależności od jego struktury, układu przestrzennego i składu.

Podczas badania biofilmów z mieszanymi lepkimi i sztywnymi obszarami, kulki mogą z czasem zostać uwięzione w sztywnych obszarach. W takim przypadku obrazowanie należy rozpocząć natychmiast po dodaniu kulek. Często nie można tego osiągnąć za pomocą szkiełek nakrywkowych, ale wymaga to optycznych płytek dennych lub komórek przepływowych, w których obrazowanie można wykonać natychmiast po dodaniu kulek i etapu mycia.

Modyfikacje i przyszłe zastosowania
Stosowanie urządzeń mikroprzepływowych. W naszych badaniach optymalne warunki stworzone do badania biofilmów Enterobacteriaceae wymagały wzrostu biofilmu w postaci błonki na granicy faz powietrze-ciecz. Ograniczyło to zastosowanie dolnych płytek optycznych i urządzeń mikroprzepływowych w badaniach. Jednakże, gdy pozwalają na to warunki tworzenia biofilmu, biofilmy można hodować w komorach mikroprzepływowych lub komórkach przepływowych. Biofilmy można następnie wypłukać, a perełki wprowadzić za pomocą urządzenia mikroprzepływowego przy minimalnym naruszeniu biofilmu.

Dodawanie kulek podczas wzrostu biofilmu. Zdecydowaliśmy się dodać nadmiar kulek do biofilmów, a następnie usunąć niepowiązane kulki poprzez delikatne mycie, aby zoptymalizować liczbę kulek obecnych podczas analizy. W lepkich biofilmach E. faecalis możliwe jest, że kulki odłączyły się i ponownie związały w ciągu 20-minutowego czasu obrazowania. Jeśli niewielka liczba kulek zostanie dodana w różnych momentach podczas wzrostu biofilmu, możliwe będzie uwięzienie kulek w biofilmie, co pozwoli na dokładniejsze scharakteryzowanie ruchu biofilmu w bardziej lepkich biofilmach.

Wybór regionu do zobrazowania. Do badań właściwości materiału najlepiej wybrać grube i cienkie obszary biofilmu. Jednak podczas badania zmian właściwości materiałowych biofilmu poddanego działaniu środka, można zobrazować grube zlewające się obszary w celu określenia zmian właściwości lepkosprężystych i penetracji ściegu w tych obszarach. W tym przypadku poszukiwanie kulek, które przeniknęły przez biofilm i zostały uwięzione na szkiełku nakrywkowym, jest użyteczną miarą rozerwania biofilmu.

Obrazowanie w przepływie. Za pomocą szklanych komórek przepływowych lub urządzeń mikroprzepływowych można obrazować ruch kulek lub bakterii w przepływowym biofilmie. Można to zrobić na różne sposoby. Można to zrobić poprzez wstrzyknięcie kulek do całej komory, a następnie krótką inkubację, aby umożliwić powiązanie kulek z biofilmem. Niepowiązane kulki można usunąć przez mycie, a biofilm zobrazować z przepływem lub bez. I odwrotnie, niewielka liczba kulek może zostać wprowadzona po jednej stronie komory, a ich ruch przez i w biofilmie może być śledzony pod przepływem. Podczas korzystania z przepływu należy zachować ostrożność przy wyborze ustawień śledzenia ściegu mozaiki (krok 4.5). W obecnych badaniach ustawienie dynamiki było Brownowskie. Obliczenia MSD potwierdziły, że ruch był prawdopodobnie dyfuzyjny, co sprawiło, że Brownian był odpowiednim ustawieniem.

Barwienie matrycy. W obecnych badaniach barwienie Syto9 bada gęstość komórkową, a nie gęstość struktury biofilmu. Na przykład obecność amyloidów prawdopodobnie zwiększa gęstość materiału matrycy biofilmu. Zależność ruchu od gęstości amyloidu można określić za pomocą barwników na matrycy fluorescencyjnej zamiast Syto9.

Bakterie znakowane fluorescencyjnie. Bakterie znakowane fluorescencyjnie mogą być wykorzystywane do śledzenia ruchu bakterii egzogennych przez biofilmy (np. bakterie zawierające plazmid). Wyzwanie związane z bakteriami znakowanymi fluorescencyjnie, takimi jak enterokoki, polega na tym, że tworzą one pojedyncze, diplocoki i krótkie łańcuchy, co komplikuje zdolność dokładnego śledzenia bakterii. Proces ten byłby łatwiejszy, gdyby bakterie miały morfologię jednokomórkową.

Ograniczenia
Ograniczenia w wizualizacji trajektorii i łączeniu.
Jednym z ograniczeń metody jest wizualizacja trajektorii i zszywanie. Zrekonstruowane i przeanalizowane trajektorie składają się ze współrzędnych punktów x, y, z, gdzie kolejne punkty wyznaczają tor liniowy pomiędzy tymi punktami. Wizualizację takich odcinkowych trajektorii liniowych można uzyskać za pomocą różnych narzędzi. Jednym z podejść było użycie notesów języka Python i Jupyter wraz z wtyczkami języka Python, bibliotekami Pandas i Matplotlib. Chociaż możliwe było zobrazowanie poszczególnych istniejących trajektorii w artykule w Journal of Bacteriology, w którym technika ta została pierwotnie opublikowana³⁴, nadal istniały znaczące ograniczenia, które zostaną rozwiązane w przyszłych badaniach.

Obecnie liczba zrekonstruowanych trajektorii jest większa niż liczba kulek w biofilmie, co oznacza, że wiele trajektorii może odpowiadać jednemu koralikowi. Może to być spowodowane słabym sygnałem konfokalnym w jednej klatce, w której Mosaic zakończy trajektorię i zainicjuje drugą. Może to być zarejestrowane jako wiele krótszych trajektorii dla jednego koralika, szczególnie w mniej lepkich biofilmach. Inną przyczyną dużej liczby trajektorii jest brak ściegów trajektorii. Zwłaszcza w biofilmach dna dna wzrokowego E. faecalis kulki wizualnie pozostają związane z biofilmem podczas obrazowania (Dodatkowe wideo 2). Nie było jednak trajektorii dłuższych niż 10, a ponad 90% trajektorii miało żywotność 5 klatek lub mniej (rysunek 3D). Jeśli oprogramowanie jest używane do analizowania tylko trajektorii powyżej określonej długości (np. podczas śledzenia komórek, które są zdolne do przenoszenia plazmidów), krótsze trajektorie mogą być automatycznie usuwane ze zbioru danych. Istnieją jednak inne cele, dla których zszywanie trajektorii może być bardzo ważne. Wreszcie, niemożność śledzenia szybkiego ruchu kulek jako pojedynczej trajektorii może skutkować większą liczbą trajektorii w biofilmach Enterobacteriaceae ze względu na szybki ruch w kierunku Z, co skutkuje powstawaniem kulek w kształcie eliptyków (ryc. 2G). Możliwość zszywania trajektorii zakłóconych przez szybki ruch anizotropowy będzie ważna dla zbadania wpływu macierzy amyloidowej curli na Enterobacteriaceae.

Znaczenie
Opracowano obliczeniowy przepływ pracy w celu zbadania trajektorii ścieżek w celu porównania właściwości materiałowych biofilmów 3D. Przepływ pracy umożliwia naukowcom zidentyfikowanie krytycznych parametrów, które można wykorzystać w modelowaniu obliczeniowym dynamiki płynów w heterogenicznych biofilmach. Za pomocą tego ewaluatora kulek o otwartym kodzie źródłowym można było zbadać wpływ bakteryjnych kędziorów amyloidowych na właściwości materiału, wykazując zwiększoną sztywność matrycy biofilmu spowodowaną curli. W bardziej ogólnym kontekście, ewaluator może być wykorzystany do badania zmian w strukturze biofilmu wywołanych przez leczenie biofilmu lub różne warunki środowiskowe, takie jak przepływ. Na przykład narzędzie jest wykorzystywane do analizy wpływu leczenia przeciwciałami monoklonalnymi na rozerwanie struktur biofilmu we współpracy z laboratorium Tükel (LKSOM Temple University). Zestaw narzędzi do oceny ściegów jest w pełni adaptowalny i można go rozbudowywać w sposób modułowy za pomocą VRL-Studio, aby jeszcze bardziej ulepszyć i rozszerzyć jego funkcje.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca w laboratoriach GQ i BAB nie otrzymała żadnego konkretnego grantu od żadnej agencji finansującej w sektorze publicznym, komercyjnym lub non-profit. Autorzy dziękują dr Isaacowi Klapperowi (Wydział Matematyki, Temple University) za pomocną dyskusję oraz Çagla Tükel (Wydział Mikrobiologii i Immunologii, Temple University) za ekspertyzę w zakresie Enterobacteriaceae w pierwszej publikacji dotyczącej stosowania tej techniki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 96-dołkowe, nr 1,5 niepowlekane szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 5 mm	MatTek	P96G1.55F
Okulary osłonowe Fisherbrand: koła	Fisher Scientific	12-293-232P	Szkiełko nakrywkowe ze szkła optycznego 1,5
Invitrogen Syto 9 Zielona fluorescencyjna plama kwasu nukleinowego	Invitrogen	S34854
Sondy molekularne FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 1 um, szkarłatna fluorescencja (625/645)	Sondy molekularne	F8816

Bibliografia

Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2, 435-444 (2011).
Nadell, C. D., Drescher, K., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Extracellular matrix structure governs invasion resistance in bacterial biofilms. ISME Journal. 9, 1700-1709 (2015).
Billings, N., Birjiniuk, A., Samad, T. S., Doyle, P. S., Ribbeck, K. Material properties of biofilms - key methods for understanding permeability and mechanics. Reports on Progress in Physics. 78, 036601(2015).
Araújo, G. R. deS., Viana, N. B., Gómez, F., Pontes, B., Frases, S. The mechanical properties of microbial surfaces and biofilms. The Cell Surface. 5, 100028(2019).
Tallawi, M., Opitz, M., Lieleg, O. Modulation of the mechanical properties of bacterial biofilms in response to environmental challenges. Biomaterials Science. 5, 887-900 (2017).
Tursi, S. A., Tükel, Ç Curli-Containing Enteric Biofilms Inside and Out, Matrix Composition, Immune Recognition, and Disease Implications. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82, (2018).
Dueholm, M. S., Albertsen, M., Otzen, D., Nielsen, P. H. Curli functional amyloid systems are phylogenetically widespread and display large diversity in operon and protein structure. PLoS One. 7 (12), 51274(2012).
Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. mBio. 4, 00645(2013).
Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli fibers are required for development of biofilm architecture in Escherichia coli K-12 and enhance bacterial adherence to human uroepithelial cells. Microbiology and Immunology. 49, 875-884 (2005).
Gallo, P. M., et al. Amyloid-DNA Composites of Bacterial Biofilms Stimulate Autoimmunity. Immunity. 42, 1171-1184 (2015).
Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. Journal of Bacteriology. 195, 5540-5554 (2013).
Oh, Y. J. Characterization of curli A production on living bacterial surfaces by scanning probe microscopy. Biophysical Journal. 103, 1666-1671 (2012).
Lembré, P., Di Martino, P., Vendrely, C. Amyloid peptides derived from CsgA and FapC modify the viscoelastic properties of biofilm model matrices. Biofouling. 30, 415-426 (2014).
Oh, Y. J., et al. Curli mediate bacterial adhesion to fibronectin via tensile multiple bonds. Scientific Reports. 6, 33909(2016).
Vidakovic, L., Singh, P. K., Hartmann, R., Nadell, C. D., Drescher, K. Dynamic biofilm architecture confers individual and collective mechanisms of viral protection. Nature Microbiology. 3, 26-31 (2018).
Tursi, S. A., et al. Salmonella Typhimurium biofilm disruption by a human antibody that binds a pan-amyloid epitope on curli. Nature Communications. 11, 1007(2020).
Perov, S., et al. Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens. 15 (8), 1007978(2019).
Taglialegna, A., et al. The biofilm-associated surface protein Esp of Enterococcus faecalis forms amyloid-like fibers. Npj Biofilms and Microbiomes. 6, 15(2020).
Gour, S., Kumar, V., Rana, M., Yadav, J. K. Pheromone peptide cOB1 from native Enterococcus faecalis forms amyloid-like structures, A new paradigm for peptide pheromones. Journal of Peptide Science. 25, 3178(2019).
Stoodley, P., Debeer, D., Lewandowski, Z. Liquid flow in biofilm systems. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2711-2716 (1994).
Birjiniuk, A., et al. Single particle tracking reveals spatial and dynamic organization of the E. coli biofilm matrix. New Journal of Physics. 16, 085014(2014).
Chew, S. C., et al. Dynamic remodeling of microbial biofilms by functionally distinct exopolysaccharides. mBio. 5, 01536(2014).
Cao, H., et al. Revealing region-specific biofilm viscoelastic properties by means of a micro-rheological approach. Npj Biofilms and Microbiomes. 2, 5(2016).
Galy, O., et al. Mapping of bacterial biofilm local mechanics by magnetic microparticle actuation. Biophysical Journal. 103, 1400-1408 (2012).
Rogers, S. S., vander Walle, C., Waigh, T. A. Microrheology of bacterial biofilms in vitro, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Langmuir. 24, 13549-13555 (2008).
Hart, J. W., Waigh, T. A., Lu, J. R., Roberts, I. S. Microrheology and Spatial Heterogeneity of Staphylococcus aureus Biofilms Modulated by Hydrodynamic Shear and Biofilm-Degrading Enzymes. Langmuir. 35 (9), 3553-3561 (2019).
van Merode, A. E. J., van der Mei, H. C., Busscher, H. J., Krom, B. P. Influence of culture heterogeneity in cell surface charge on adhesion and biofilm formation by Enterococcus faecalis. Journal of Bacteriology. 188, 2421-2426 (2006).
Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between Culture Zeta Potential Homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Applied and Environmental Microbiology. 78, 2282-2288 (2012).
Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ, 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
Groovy-Lang. , Available from: http://groovy-lang.org (2021).
Oracle.com. , Available from: https://docs.oracle.com/en/java (2021).
Hoffer, M., Poliwoda, C., Wittum, G. Visual reflection library, a framework for declarative GUI programming on the Java platform. Computing and Visualization in Science. 16, 181-192 (2013).
Perov, S., et al. Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens. 15, 1007978(2019).
Malhotra, K., et al. Development of a New Bead Movement-Based Computational Framework Shows that Bacterial Amyloid Curli Reduces Bead Mobility in Biofilms. Journal of Bacteriology. 202, 00253(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza ruchu kulek biofilmy 3D obliczanie trajektorii wtyczka ImageJ Mosaic Bead Evaluator Toolbox amyloidy curli biofilmy Enterococcus faecalis biofilmy Salmonella typhimurium biofilmy Escherichia coli