Artykuł metodologiczny

Mapowanie pętli R i hybryd RNA:DNA za pomocą metod immunoprecypitacji opartych na S9.6

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62455

⸱

24 sierpnia 2021

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology and Genome Center, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

R-loops stanowią powszechną klasę struktur DNA innych niż B, które występują we wszystkich genomach, w zależności zarówno od sekwencji DNA, jak i topologicznej przychylności. W ostatnich latach pętle R były zaangażowane w różne role adaptacyjne i nieprzystosowawcze i zostały powiązane z niestabilnością genomu w kontekście zaburzeń u ludzi. W związku z tym dokładne mapowanie tych struktur w genomach cieszy się dużym zainteresowaniem wielu badaczy. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) jest opisany tutaj. Jest to solidna i powtarzalna technika, która pozwala na dokładne i półilościowe mapowanie pętli R. Opisano również niedawną wersję metody, w której fragmentacja odbywa się za pomocą sonikacji (sDRIP-seq), która umożliwia mapowanie pętli R specyficzne dla nici i w wysokiej rozdzielczości. W ten sposób sDRIP-seq rozwiązuje niektóre z typowych ograniczeń metody DRIP-seq pod względem rozdzielczości i osierocenia, co czyni ją metodą z wyboru do mapowania pętli R.

Streszczenie

R-loops stanowią powszechną klasę struktur DNA innych niż B, które występują we wszystkich genomach, w zależności zarówno od sekwencji DNA, jak i topologicznej przychylności. W ostatnich latach pętle R były zaangażowane w różne role adaptacyjne i nieprzystosowawcze i zostały powiązane z niestabilnością genomu w kontekście zaburzeń u ludzi. W związku z tym dokładne mapowanie tych struktur w genomach cieszy się dużym zainteresowaniem wielu badaczy. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation followed by high throughput sequencing) jest opisany tutaj. Jest to solidna i powtarzalna technika, która pozwala na dokładne i półilościowe mapowanie pętli R. Opisano również niedawną wersję metody, w której fragmentacja odbywa się za pomocą sonikacji (sDRIP-seq), która umożliwia mapowanie pętli R specyficzne dla nici i w wysokiej rozdzielczości. W ten sposób sDRIP-seq rozwiązuje niektóre z typowych ograniczeń metody DRIP-seq pod względem rozdzielczości i osierocenia, co czyni ją metodą z wyboru do mapowania pętli R.

Wprowadzenie

R-loops to trójniciowe struktury kwasów nukleinowych, które tworzą się głównie podczas transkrypcji po hybrydyzacji powstającego transkryptu RNA z matrycową nicią DNA. Powoduje to powstanie hybrydy RNA:DNA i powoduje przemieszczenie nici DNA bez matrycy w stanie jednoniciowym zapętlonym. Rekonstytucja biochemiczna1,2,3,4 i modelowanie matematyczne5, w połączeniu z innymi pomiarami biofizycznymi6,7, ustaliły, że prawdopodobieństwo wystąpienia pętli R w regionach, które wykazują określone korzystne cechy. Na przykład regiony, które wykazują asymetrię nici w dystrybucji guaniny (G) i cytozyny (C) tak, że RNA jest bogate w G, właściwość zwana dodatnim skosem GC, są faworyzowane do tworzenia pętli R podczas transkrypcji ze względu na wyższą stabilność termodynamiczną hybrydy DNA: RNA w porównaniu z klasą DNA duplex8. Regiony, które wyewoluowały dodatnie skośność GC, takie jak wczesne części wielu genów eukariotycznych4,9,10,11, są podatne na tworzenie pętli R in vitro i in vivo3,4,12. Ujemne naprężenie superhelical DNA również bardzo sprzyja tworzeniu struktury13,14, ponieważ pętle R skutecznie absorbują takie naprężenia topologiczne i przywracają otaczające włókno DNA do korzystnego stanu relaksu5,15.

Historycznie rzecz biorąc, uważano, że struktury pętli R są wynikiem rzadkich, spontanicznych splątań RNA z DNA podczas transkrypcji. Jednak rozwój immunoprecypitacji DNA:RNA (DRIP) w połączeniu z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem DNA (DRIP-seq) pozwolił na pierwsze mapowanie pętli R w całym genomie i ujawnił, że struktury te są znacznie bardziej rozpowszechnione niż oczekiwano w komórkach ludzkich4,16. Pętle R występują w dziesiątkach tysięcy konserwatywnych, transkrybowanych, genowych hotspotów w genomach ssaków, z predylekcją do wysp CpG skośnych GC, które nakładają się na pierwszy intron genów i końcowe regiony wielu genów17. Ogólnie rzecz biorąc, pętle R łącznie zajmują 3%-5% genomu w komórkach ludzkich, co jest zgodne z pomiarami w innych organizmach, w tym drożdżach, roślinach, muchach i myszach18,19,20,21,22.

Analiza gorących punktów tworzących pętlę R w ludzkich komórkach wykazała, że takie regiony kojarzą się ze specyficznymi sygnaturami chromatyny23. Ogólnie rzecz biorąc, pętle R znajdują się w regionach o niższym zajętości nukleosomów i wyższej gęstości polimerazy RNA. U promotorów pętle R wiążą się ze zwiększoną rekrutacją dwóch kotranskrypcyjnie zdeponowanych modyfikacji histonów, H3K4me1 i H3K36me317. Na końcach genów pętle R wiążą się z blisko ułożonymi genami, które przechodzą skuteczną terminację transkrypcji17, zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami24. Wykazano również, że pętle R uczestniczą w inicjacji replikacji DNA w początkach replikacji genomów bakteriofagów, plazmidów, mitochondriów i drożdży25,26,27,28,29,30,31. Ponadto 76% podatnych na pętlę R ludzkich promotorów wysp CpG funkcjonuje jako wczesne, konstytutywne źródła replikacji32,33,34,35, co dodatkowo wzmacnia powiązania między pętlami R a początkami replikacji. Podsumowując, badania te sugerują, że pętle R reprezentują nowy typ sygnału biologicznego, który może wyzwalać określone wyjścia biologiczne w sposób zależny od kontekstu23.

Na początku wykazano, że pętle R tworzą się w sekwencjach przełączania klas podczas procesu rekombinacji przełączników klasy immunoglobulin3,36,37. Uważa się, że takie zaprogramowane pętle R inicjują rekombinację przełączników klas poprzez wprowadzenie dwuniciowych pęknięć DNA38. Od tego czasu szkodliwe powstawanie pętli R, ogólnie rozumiane jako wynikające z nadmiernego tworzenia pętli R, zostało powiązane z niestabilnością genomu i procesami, takimi jak hiperrekombinacja, kolizje transkrypcji-replikacji, replikacja i stres transkrypcyjny (do przeglądu39,40,41,42,43). W związku z tym ulepszone mapowanie struktur pętli R stanowi ekscytujące i zasadnicze wyzwanie dla lepszego rozszyfrowania rozmieszczenia i funkcji tych struktur w zdrowiu i chorobie.

DNA:RNA immunoprecypitacja (DRIP) opiera się na wysokim powinowactwie przeciwciała monoklonalnego S9.6 do hybryd DNA:RNA44. DRIP-seq umożliwia solidne profilowanie tworzenia pętli R w całym genomie4,45. Chociaż jest to przydatne, technika ta ma ograniczoną rozdzielczość ze względu na fakt, że enzymy restrykcyjne są używane do uzyskania delikatnej fragmentacji DNA. Ponadto sekwencja DRIP nie dostarcza informacji na temat kierunkowości powstawania pętli R. W tym miejscu przedstawiamy wariant sekwencji DRIP, który umożliwia mapowanie pętli R w wysokiej rozdzielczości w sposób specyficzny dla pasma. Metoda ta opiera się na sonikacji w celu fragmentacji genomu przed immunoprecypitacją, a zatem metoda ta nazywa się sDRIP-seq (sonikacja DNA: immunoprecypitacja RNA sprzężona z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości) (Figura 1). Zastosowanie sonikacji pozwala na zwiększenie rozdzielczości i ogranicza ograniczenia związane z fragmentacją związaną z enzymami obserwowane w podejściach DRIP-seq46. sDRIP-seq tworzy mapy pętli R, które są silnie zgodne z wynikami zarówno DRIP-seq, jak i wcześniej opisanej metody DRIPc-seq o wysokiej rozdzielczości, w której biblioteki sekwencjonowania są budowane z nici RNA immunoprecypitowanych struktur pętli R45.

W obliczu mnóstwa metod do wyboru, użytkownicy mogą zastanawiać się, które konkretne podejście oparte na DRIP jest preferowane dla ich potrzeb. Oferujemy następujące porady. DRIP-seq, pomimo swoich ograniczeń, jest technicznie najłatwiejszy i jest najbardziej wytrzymały (najwyższe plony) ze wszystkich trzech omawianych tutaj metod; W związku z tym pozostaje on szeroko użyteczny. Opublikowano liczne zestawy danych DRIP-seq, które stanowią użyteczny punkt odniesienia dla nowych zestawów danych. Wreszcie, proces analizy bioinformatycznej jest prostszy, ponieważ dane nie są pozostawione na lodzie. Zaleca się, aby nowi użytkownicy zaczęli doskonalić swoje umiejętności mapowania pętli R za pomocą DRIP, a następnie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) i sekwencji DRIP. sDRIP-seq reprezentuje nieco wyższy stopień trudności technicznej: wydajność jest nieznacznie zmniejszona z powodu sonikacji (omówionej poniżej), a proces biblioteki sekwencjonowania jest nieco bardziej złożony. Jednak zysk wynikający z utknięcia na mieliźnie i wyższej rozdzielczości jest nieoceniony. Należy zauważyć, że sDRIP-seq wychwyci zarówno dwuniciowe hybrydy RNA:DNA, jak i trójniciowe pętle R. Ze względu na etapy budowy biblioteki, DRIP-seq nie wychwyci dwuniciowych hybryd RNA:DNA. DRIPc-seq jest najbardziej wymagający technicznie i wymaga większej ilości materiałów wyjściowych. W zamian oferuje najwyższą rozdzielczość i osierocenia. Ponieważ biblioteki sekwencjonowania są zbudowane z części RNA pętli R lub hybryd, sekwencja DRIPc może ucierpieć z powodu możliwego zanieczyszczenia RNA, zwłaszcza, że S9.6 ma szczątkowe powinowactwo do dsRNA19,47,48. sDRIP-seq umożliwia mapowanie specyficzne dla nici w wysokiej rozdzielczości bez obaw o zanieczyszczenie RNA, ponieważ biblioteki sekwencjonowania pochodzą z nici DNA. Ogólnie rzecz biorąc, te trzy metody pozostają użyteczne i prezentują różne stopnie złożoności oraz nieco inne zastrzeżenia. Wszystkie trzy generują jednak wysoce spójne zestawy danych48 i są bardzo wrażliwe na wstępne traktowanie RNazy H, co stanowi istotną kontrolę zapewniającą specyficzność sygnału45,49. Należy zauważyć, że biorąc pod uwagę wybór wielkości narzucony bibliotekom sekwencjonowania, małe hybrydy (szacowane <75 pz), takie jak te, które tworzą się przejściowo wokół miejsc inicjacji replikacji replikacji DNA o opóźnionej nici (startery Okazaki) zostaną wykluczone. Podobnie, ponieważ wszystkie metody DRIP obejmują fragmentację DNA, niestabilne pętle R, które wymagają ujemnego superzwijania DNA dla swojej stabilności, zostaną utracone5. W związku z tym podejścia DRIP mogą zaniżać obciążenia pętli R, szczególnie w przypadku krótkich, niestabilnych pętli R, które najlepiej uchwycić za pomocą podejść in vivo45,48. Należy zauważyć, że pętle R mogą być również profilowane w sposób niezależny od S9.6 przy głębokim pokryciu, wysokiej rozdzielczości i w sposób specyficzny dla nici na pojedynczych cząsteczkach DNA po traktowaniu wodorosiarczynu sodu12. Dodatkowo, strategie wykorzystujące katalitycznie nieaktywny enzym RNaza H1 zostały wykorzystane do mapowania natywnych pętli R in vivo, podkreślając krótkie, niestabilne pętle R, które tworzą się głównie w wstrzymanych promotorach50,51,52.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół jest zoptymalizowany dla ludzkiej linii komórkowej Ntera-2 hodowanej w hodowli, ale został pomyślnie zaadaptowany bez modyfikacji do szeregu innych ludzkich linii komórkowych (HEK293, K562, HeLa, U2OS), komórek pierwotnych (fibroblasty, limfocyty B), jak również w innych organizmach z małymi modyfikacjami (myszy, muchy).

1. Pobieranie i liza komórek

  1. Hodowla komórek Ntera-2 do 75%-85% konfluencji. Upewnij się, że optymalna liczba komórek wynosi od 5 do 6 milionów komórek z >90% żywotną liczbą, aby rozpocząć dowolną procedurę DRIP.
  2. Umyj komórki raz 1x PBS, dodaj 1,5 ml Trypsyny-EDTA 1x, a następnie inkubuj przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, aż komórki oddzielą się od naczynia.
  3. Dodaj 5 ml ciepłej pożywki i dobrze odpipetuj w celu ponownego zawieszenia komórek w zawiesinie pojedynczej komórki. Przenieś zawartość do nowej probówki o pojemności 15 ml i delikatnie granuluj komórki w masie 300 x g przez 3 minuty.
  4. Umyj komórki raz 5 ml 1x PBS i delikatnie granuluj komórki w 300 x g przez 3 minuty.
  5. Całkowicie zawieś komórki w 1,6 ml buforu TE (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Dodać 5 μl proteinazy K (20 mg/ml roztworu podstawowego) i 50 μl SDS (20% roztwór podstawowy) i delikatnie odwrócić probówki pięć razy, aż roztwór stanie się lepki. Nie próbuj pipetować roztworu, tylko wymieszaj przez odwrócenie.
  6. Inkubować probówki przez noc w temperaturze 37 °C.

2. Ekstrakcja DNA

  1. Wlej lizat DNA do wstępnie odwirowanej probówki z żelem o wysokiej gęstości o wysokiej gęstości i dodaj 1 objętość (1,6 ml) alkoholu izoamylowego fenol/chloroform (25:24:1). Delikatnie odwróć pięć razy i wiruj z prędkością 1 500 x g przez 5 minut.
  2. Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu (NaOAc) (pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu do nowej probówki o pojemności 15 ml. Wlej górną fazę wodną z probówki z żelem z blokadą fazową i delikatnie odwróć, aż DNA zostanie całkowicie wytrącone (do 10 min).
  3. Nawiń nici DNA za pomocą końcówki o pojemności 1 000 μl o szerokim otworze i przenieś do czystej probówki o pojemności 2 ml, uważając, aby nie przenieść pozostałego supernatantu.
  4. Umyj DNA, dodając 1,5 ml 80% etanolu i delikatnie odwróć probówkę pięć razy. Inkubować przez 10 minut.
  5. Powtórz poprzedni krok dwa razy. Nie odwirowywać podczas etapów mycia. Ostrożnie usuń jak najwięcej etanolu, pipetując po ostatnim praniu, starając się nie naruszyć DNA.
  6. Pozwól DNA całkowicie wyschnąć na powietrzu, jednocześnie odwracając probówkę. Ten krok może zająć 30 min -1 h w zależności od ilości DNA.
  7. Dodaj 125 μl buforu TE bezpośrednio na osad DNA, aby rozdrobnić DNA poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym lub 100 μl buforu TE, aby ścinać DNA poprzez sonikację. Przechowywać na lodzie przez 1 godzinę i delikatnie zawiesić DNA, pipetując kilka razy końcówką o pojemności 200 μl o szerokim otworze. Pozostawić na lodzie na 1 godzinę przed rozpoczęciem etapu rozdrobnienia.

3. Fragmentacja DNA

UWAGA: Dla sekwencyjnego sekwencjonowania DRIP opartego na enzymach restrykcyjnych, wykonaj krok 3.1. W przypadku sekwencji DRIP opartej na sonikacji, przejdź do kroku 3.2.

  1. Fragmentacja enzymu restrykcyjnego (RE)
    1. Strawić ponownie zawieszone genomowe DNA (bardzo lepkie) za pomocą koktajlu RE zgodnie z instrukcjami dostawcy.
      1. Dodać 0,1 mM spermidyny do końcowej reakcji. Użyj koktajlu 4-5 enzymów z 30 U każdego enzymu w łącznej objętości 150 μL.
        UWAGA: Początkowy koktajl dla DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)4 został opracowany w celu wygenerowania średniej długości fragmentu wynoszącej 5 kilozasad. Unikaj wszelkich zakłóceń w metylacji CpG i oszczędzaj bogate w GC regiony genomu. Możliwe są również inne koktajle16). Koktajle te są odpowiednie zarówno dla genomu ludzkiego, jak i mysiego, ale można je dostosować w razie potrzeby.
      2. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
        UWAGA: Mieszanina DNA po strawieniu nie powinna już być lepka. Wszelka pozostała lepkość na tym etapie wskazuje na niepełne trawienie.
      3. W przypadku zaobserwowania, dodać dodatkowe 10 j. każdego enzymu i inkubować przez kolejne 2-4 godziny w temperaturze 37 °C.
        UWAGA: Użytkownicy mogą nie trawić całego osadu w przypadku, gdy zebrali więcej komórek niż jest to tutaj zalecane.
    2. Delikatnie odpipetować strawione w nocy DNA (150 μl) do wstępnie odwirowanej probówki z żelem o pojemności 2 ml. Dodać 100 μl wody i jedną objętość (250 μl) alkoholu fenolowo-chloroformowo-izoamylowego (25:24:1). Delikatnie odwróć pięć razy i wiruj w dół przy 16 000 x g przez 10 minut.
    3. Dodać 1,5 μl glikogenu, 1/10 objętości 3 M NaOAc (pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Odpipetować DNA z probówki z żelem z synchronizacją fazową i wymieszać, odwracając pięć razy. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -20 °C.
    4. Wirować w temperaturze 16 000 x g przez 35 minut w temperaturze 4 °C. Umyć DNA 200 μl 80% etanolu i wirować w temperaturze 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Wysuszyć osad na powietrzu i dodać do niego 50 μl buforu TE. Pozostaw probówkę na lodzie na 30 minut i delikatnie zawieś DNA.
    6. Zmierzyć stężenie (OD260) rozdrobnionego DNA za pomocą spektrofotometru.
    7. Opcjonalnie, ale zalecane: Załaduj 1 μg strawionego DNA na 0,8% żelu agarozowy wraz ze znacznikiem wielkości, aby sprawdzić, czy trawienie zostało zakończone. Uruchom żel na godzinę przy 100 V.
      UWAGA: Jeśli jest niekompletny, można dodać dodatkowy enzym. Niepełne trawienie może prowadzić do utraty rozdzielczości po immunoprecypitacji.
    8. Po tym etapie należy potraktować 10 μg strawionego DNA 4 μl rybonukleazy H (RNazy H) przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C, aby upewnić się, że sygnał odzyskany podczas immunoprecypitacji pochodzi z hybryd DNA:RNA. Następnie przejdź do immunoprecypitacji S9.6 (krok 4).
      UWAGA: Strawione DNA można przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C przez okres do jednego miesiąca bez znaczącej utraty plonów.
  2. Sonikacja
    1. Sonikować całość lub część wyekstrahowanego DNA w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml w całkowitej objętości 100 μl. Wykonaj 15-20 cykli po 30 s ON / 30 s OFF na sonikatorze (wiruj po 5, 10 i 15 cyklach, aby zapewnić jednorodną sonikację).
    2. Zmierzyć stężenie (OD260) sonikowanego DNA na spektrofotometrze.
      UWAGA: Na tym etapie lepkość DNA powinna zniknąć.
    3. Uruchom żel agarozowy, aby potwierdzić rozkład wielkości sonikowanego DNA (300-500 pz).
      UWAGA: Nadmierna sonikacja DNA może prowadzić do znacznego zmniejszenia wydajności wynikającej z pęknięcia i dysocjacji struktur pętli R.
    4. Po tym etapie należy potraktować 10 μg sonikowanego DNA 4 μl RNazy H przez 1-2 godziny w temperaturze 37 °C, aby upewnić się, że sygnał uzyskany po immunoprecypitacji pochodzi z hybryd DNA:RNA. Następnie przejdź do immunoprecypitacji S9.6 (krok 4).

4. Immunoprecypitacja S9.6

UWAGA: Etapy immunoprecypitacji są podobne, niezależnie od tego, czy DNA zostało rozdrobnione przez RE, czy przez sonikację.

  1. Przygotować trzy probówki i podwielokrotność 4,4 μg rozdrobnionego DNA w końcowej objętości 500 μl buforu TE na probówkę. Zaoszczędź 50 μl (1/10 objętości) z każdej probówki, aby wykorzystać je później jako wejściowe DNA.
  2. Dodać 50 μl 10x buforu wiążącego (100 mM NaPO4 pH 7, 1,4 M NaCl, 0,5% Triton X-100) i 10 μl przeciwciała S9.6 (1 mg / ml) do 450 μl rozcieńczonego DNA.
  3. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze minirurkowym z prędkością 7-10 obr./min.
  4. Dla każdej probówki przepłukać 50 μl zawiesiny z kulki agarozowej A/G z białkiem 700 μl 1x buforu wiążącego, odwracając probówki na mini-rotatorze przy 7-10 obr./min w temperaturze pokojowej przez 10 min. Odwiruj kulki przy 1,100 x g przez 1 min i wyrzuć supernatant. Powtórz ten krok raz.
  5. Dodać DNA z kroku 4.3 do 50 μl kulek i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, odwracając przy 7-10 obr./min na mini-rotatorze.
  6. Wirować kulki przez 1 minutę w temperaturze 1 100 x g i wyrzucić supernatant.
  7. Przepłukać kulki 750 μl 1x buforu wiążącego, odwracając z prędkością 7-10 obr./min na mini-rotatorze przez 15 minut. Wirować przez 1 min przy 1 100 x g i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok raz.
  8. Dodać 250 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, 0,5% SDS) i 7 μl proteinazy K (20 mg/ml bulionu) do kulek i inkubować z rotacją w temperaturze 55 °C (12 obr./min) przez 45 min.
  9. Wirować koraliki przez 1 minutę przy 1 100 x g. Przenieść supernatant do wstępnie odwirowanej probówki świetlnej z żelu o pojemności 2 ml i dodać jedną objętość (250 μl) alkoholu izoamylowego fenol/chloroform (25:24:1). Odwróć probówki pięć razy i wiruj przez 10 minut w temperaturze 16 000 x g w temperaturze pokojowej.
  10. Dodać 1,5 μl glikogenu, 1/10 objętości 3M NaOAc (pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Odpipetować DNA z probówki z żelem z synchronizacją fazową i wymieszać, odwracając pięć razy. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -20 °C.
  11. Wirować w temperaturze 16 000 x g przez 35 minut w temperaturze 4 °C. Umyć DNA 200 μl 80% etanolu i wirować w temperaturze 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Wysuszyć granulki na powietrzu i dodać 15 μl 10 mM Tris-Cl (pH 8) do każdej probówki. Pozostaw probówki na lodzie na 20 minut i delikatnie zawieś. Połączyć zawartość trzech probówek w jedną probówkę (45 μl).
  13. Sprawdź skuteczność DRIP za pomocą qPCR przy użyciu 5 μl z 45 μl zawieszonego DNA (patrz wyniki reprezentatywne). Rozcieńczyć 5 μl w 10 μl wody i użyć 2 μl na reakcję.

5. Etap wstępnej biblioteki tylko dla sonicznego DNA

UWAGA: Sonikacja prowadzi do przerwania przemieszczonej nici ssDNA pętli R. W ten sposób trójniciowe struktury pętli R są przekształcane w dwuniciowe hybrydy DNA:RNA po sonikacji. W rezultacie, te hybrydy DNA:RNA muszą zostać przekształcone z powrotem w dwuniciowe DNA przed budową biblioteki. W tym przypadku stosuje się drugi etap syntezy nici. Alternatywnym podejściem, które zostało z powodzeniem zastosowane, jest wykonanie ligacji jednoniciowego DNA, a następnie syntezy drugiej nici53.

  1. Do 40 μl DNA DRIP z kroku 4.12 dodaj 20 μL 5x buforu drugiej nici (200 mM Tris pH 7, 22 mM MgCl2, 425 mM KCl), 10 mM mieszanki dNTP (dATP, dCTP, dGTP i dTTT lub dUTP, jeśli użytkownik planuje osiągnąć sekwencjonowanie DRIP specyficzne dla nici), 1 μL 16 mM NAD, i 32 μL wody. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 5 minut na lodzie.
  2. Dodać 1 μl polimerazy DNA I (10 jednostek), 0,3 μl RNazy H (1,6 jednostki) i 0,5 μl ligazy DNA E. coli. Mieszać i inkubować w temperaturze 16 °C przez 30 minut.
  3. Natychmiast oczyść reakcję za pomocą kulek paramagnetycznych o stosunku 1,6x. Eluować DNA w 40 μl 10 mM Tris-Cl (pH 8).

6. Etap sonikacji przed biblioteką tylko dla DNA RE

UWAGA: DRIP prowadzi do odzyskiwania fragmentów RE, które często mają długość kilobaz, a więc nie nadają się do natychmiastowej budowy biblioteki.

  1. Aby zmniejszyć rozmiar materiału do budowy biblioteki, należy poddać sonikę immunoprecypitowanemu DNA w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml. Wykonaj 12 cykli po 15 s ON / 60 s OFF na sonikatorze (wiruj po sześciu cyklach, aby zapewnić jednorodną sonikację). Przejdź do kroku 7.
    UWAGA: Materiał immunoprecypitowany nadal zawiera trójniciowe pętle R, które reagują na sonikację inaczej niż flankujące dwuniciowe DNA.
  2. Opcjonalny krok: Aby wyrównać profile DRIP, przed sonikacją należy potraktować materiał immunoprecypitowany 1 μl RNazy H w 1x buforze RNazy H przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

7. Budowa biblioteki

  1. Wykonaj naprawę końcową, dodając do 40 μl z kroku 4.12 (fragmentacja RE) lub kroku 5.3 (ścinanie sonikacyjne) 5 μl 10-krotnego buforu modułu naprawy końcówek, 2,5 μl 10 mM ATP i 2,5 μl enzymu modułu naprawy końcówek (łącznie 50 μL). Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 1 μg DNA wejściowego ponownie strawionego i sonikowanego (DRIP) lub sonikowanego (sDRIP) w celu utworzenia kontrolnych bibliotek sekwencjonowania odpowiadających wejściowemu DNA.
  2. Oczyść reakcję za pomocą kulek paramagnetycznych (współczynnik 1,6x) i eluuj w 34 μl 10 mM Tris-Cl (pH 8).
  3. Przeprowadzić A-tailing, dodając 5 μl buforu 2, 10 μl 1 mM dATP i 1 μl egzo- Klenowa (łącznie 50 μL). Dobrze wymieszać i inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Oczyść reakcję za pomocą kulek paramagnetycznych (współczynnik 1,6x) i eluuj w 12 μl 10 mM Tris-Cl (pH 8).
  5. Adaptery ligacyjne poprzez dodanie 15 μl 2x buforu do szybkiej ligacji, 1 μl adapterów 15 μM i 2 μl szybkiej ligazy (łącznie 30 μL). Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Oczyść reakcję za pomocą kulek paramagnetycznych (stosunek 1x) i eluuj w 20 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8).
  7. Jeśli przeprowadzono ścinanie sonikacją i zastosowano dUTP w kroku 5.1, dodać 1,5 μl (1,5 U) N-glikozylazy uracylu i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby uzyskać DRIP specyficzne dla nici.
  8. PCR amplifikuje 10 μl biblioteki z kroku 6.6 lub 6.7. Dodać 1 μl startera PCR 1.0 P5 (patrz tabela materiałów), 1 μl startera PCR 2.0 P7 (patrz tabela materiałów), 15 μl mieszanki wzorcowej i 3 μl wody. Dobrze wymieszaj.
  9. W termocyklerze uruchom program, jak pokazano w Tabeli 1.
  10. Przejdź do dwuetapowego czyszczenia biblioteki za pomocą koralików paramagnetycznych. Najpierw użyj proporcji 0,65x, aby usunąć fragmenty o długości powyżej 500 pz. Zachować supernatant. Postępuj do proporcji 1x na supernatancie, aby usunąć fragmenty poniżej 200 pz. Eluować w 12 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8).

8. Kontrola jakości

  1. Aby sprawdzić wzbogacenie pętli R za pomocą qPCR na dwóch ujemnych i trzech dodatnich loci przy użyciu metody Pfaffl, użyj 1 μl biblioteki czyszczącej z kroku 6.10. Rozcieńczyć 1 μl biblioteki w 10 μl wody i użyć 2 μl na locus.
  2. Sprawdź rozkład rozmiarów oczyszczonej biblioteki z kroku 6.10 za pomocą zestawu DNA o wysokiej czułości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zarówno DRIP, jak i sDRIP można analizować za pomocą qPCR (Rysunek 2A) i/lub sekwencjonowania (Rysunek 2B). Po etapie immunoprecypitacji jakość eksperymentu należy najpierw potwierdzić za pomocą qPCR w loci kontrolnych dodatnich i ujemnych, a także przy użyciu kontroli traktowanych RNazą H. Primery odpowiadające często stosowanym loci w wielu ludzkich liniach komórkowych podano w Tabeli 2. Wyniki qPCR powinny być przedstawione jako procent mater...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisano tutaj dwa protokoły mapowania struktur pętli R w potencjalnie dowolnym organizmie przy użyciu przeciwciała S9.6. DRIP-seq stanowi pierwszą opracowaną technikę mapowania pętli R obejmującą cały genom. Jest to łatwa, solidna i powtarzalna technika, która pozwala na mapowanie rozmieszczenia pętli R wzdłuż dowolnego genomu. Druga technika, określana jako sDRIP-seq, jest również solidna i powtarzalna, ale osiąga wyższą rozdzielczość i specyficzność nici dzięki włączeniu etapu sonikacji i protokołu budowy biblioteki se...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca w laboratorium Chedin jest wspierana przez grant z National Institutes of Health (R01 GM120607).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka 15 ml Żel blokujący fazę Maxtract o wysokiej gęstościQiagen129065
2 ml Rurka żelowa do blokowania fazy lekkaVWR10847-800
Koraliki agarozy A/GThermoFisher Scientific20421
Koraliki Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
AmpErase N-glikozylaza UracilThermoFisher ScientificN8080096
Adaptery indeksująceIlluminaOdpowiada TrueSeq Pojedyncze indeksy
Fragment Klenowa (egzo- od 3' do 5')New England BioLabsM0212S
NEBNext Moduł naprawczy końcaStartery PCR New England BioLabsE6050
do amplifikacjibibliotekipodkład 1.0 P5 (5' AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3')
Startery PCR do amplifikacjiStarter PCR 2.0 P7 (5' CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3')
Alkohol izoamylowy fenol/chloroform 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR master mixThermoFisher ScientificF548S
NewEngland BioLabsM2200S
Rybonukleaza HNew England BioLabsM0297S
S9.6 PrzeciwciałoKerafastENH001Te trzy źródła są równoważne
Przeciwciało S9.6Millipore/SigmaMABE1095
Przeciwciało S9.6Abcamab234957
bibliotecznej Zestaw do szybkiego ligowania

Bibliografia

  1. Reaban, M. E., Lebowitz, J., Griffin, J. A. Transcription induces the formation of a stable RNA.DNA hybrid in the immunoglobulin alpha switch region. The Journal of Biological Chemistry. 269 (34), 21850-21857 (1994).
  2. Daniels, G. A., Lieber, M. R. RNA:DNA complex formation upon transcription of immunoglobulin switch regions: implications for the mechanism and regulation of class switch recombination. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5006-5011 (1995).
  3. Yu, K., Chedin, F., Hsieh, C. L., Wilson, T. E., Lieber, M. R. R-loops at immunoglobulin class switch regions in the chromosomes of stimulated B cells. Nature Immunology. 4 (5), 442-451 (2003).
  4. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chedin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. 45 (6), 814-825 (2012).
  5. Stolz, R., et al. Interplay between DNA sequence and negative superhelicity drives R-loop structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (13), 6260-6269 (2019).
  6. Duquette, M. L., Handa, P., Vincent, J. A., Taylor, A. F., Maizels, N. Intracellular transcription of G-rich DNAs induces formation of G-loops, novel structures containing G4 DNA. Genes & Development. 18 (13), 1618-1629 (2004).
  7. Carrasco-Salas, Y., et al. The extruded non-template strand determines the architecture of R-loops. Nucleic Acids Research. 47 (13), 6783-6795 (2019).
  8. Huppert, J. L. Thermodynamic prediction of RNA-DNA duplex-forming regions in the human genome. Molecular Biosystems. 4 (6), 686-691 (2008).
  9. Hartono, S. R., Korf, I. F., Chedin, F. GC skew is a conserved property of unmethylated CpG island promoters across vertebrates. Nucleic Acids Research. 43 (20), 9729-9741 (2015).
  10. Green, P., Ewing, B., Miller, W., Thomas, P. J., Green, E. D. Transcription-associated mutational asymmetry in mammalian evolution. Nature Genetics. 33 (4), 514-517 (2003).
  11. Polak, P., Arndt, P. F. Transcription induces strand-specific mutations at the 5' end of human genes. Genome Research. 18 (8), 1216-1223 (2008).
  12. Malig, M., Hartono, S. R., Giafaglione, J. M., Sanz, L. A., Chedin, F. Ultra-deep Coverage Single-molecule R-loop Footprinting Reveals Principles of R-loop Formation. Journal of Moleclar Biology. 432 (7), 2271-2288 (2020).
  13. Masse, E., Phoenix, P., Drolet, M. DNA topoisomerases regulate R-loop formation during transcription of the rrnB operon in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 272 (19), 12816-12823 (1997).
  14. Drolet, M., et al. The problem of hypernegative supercoiling and R-loop formation in transcription. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 8, 210-221 (2003).
  15. Chedin, F., Benham, C. J. Emerging roles for R-loop structures in the management of topological stress. The Journal of Biological Chemistry. 295 (14), 4684-4695 (2020).
  16. Ginno, P. A., Lim, Y. W., Lott, P. L., Korf, I., Chedin, F. GC skew at the 5' and 3' ends of human genes links R-loop formation to epigenetic regulation and transcription termination. Genome Research. 23 (10), 1590-1600 (2013).
  17. Sanz, L. A., et al. conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals. Molecular Cell. 63 (1), 167-178 (2016).
  18. El Hage, A., Webb, S., Kerr, A., Tollervey, D. Genome-wide distribution of RNA-DNA hybrids identifies RNase H targets in tRNA genes, retrotransposons and mitochondria. PLoS Genetics. 10 (10), 1004716(2014).
  19. Hartono, S. R., et al. The affinity of the S9.6 Antibody for Double-Stranded RNAs impacts the accurate mapping of R-loops in fission yeast. Journal of Molecular Biology. 430 (3), 272-284 (2018).
  20. Wahba, L., Costantino, L., Tan, F. J., Zimmer, A., Koshland, D. S1-DRIP-seq identifies high expression and polyA tracts as major contributors to R-loop formation. Genes & Development. 30 (11), 1327-1338 (2016).
  21. Alecki, C., et al. RNA-DNA strand exchange by the Drosophila Polycomb complex PRC2. Nature Communications. 11 (1), 1781(2020).
  22. Xu, W., et al. The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome. Nature Plants. 3 (9), 704-714 (2017).
  23. Chedin, F. Nascent connections: R-Loops and chromatin patterning. Trends in Genetics: TIG. 32 (12), 828-838 (2016).
  24. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J., Gromak, N. Human senataxin resolves RNA/DNA hybrids formed at transcriptional pause sites to promote Xrn2-dependent termination. Molecular Cell. 42 (6), 794-805 (2011).
  25. Kreuzer, K. N., Brister, J. R. Initiation of bacteriophage T4 DNA replication and replication fork dynamics: a review in the Virology Journal series on bacteriophage T4 and its relatives. Virology Journal. 7, 358(2010).
  26. Carles-Kinch, K., Kreuzer, K. N. RNA-DNA hybrid formation at a bacteriophage T4 replication origin. Journal of Molecular Biology. 266 (5), 915-926 (1997).
  27. Masukata, H., Tomizawa, J. A mechanism of formation of a persistent hybrid between elongating RNA and template DNA. Cell. 62 (2), 331-338 (1990).
  28. Itoh, T., Tomizawa, J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2450-2454 (1980).
  29. Stuckey, R., Garcia-Rodriguez, N., Aguilera, A., Wellinger, R. E. Role for RNA:DNA hybrids in origin-independent replication priming in a eukaryotic system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5779-5784 (2015).
  30. Lee, D. Y., Clayton, D. A. Initiation of mitochondrial DNA replication by transcription and R-loop processing. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30614-30621 (1998).
  31. Xu, B., Clayton, D. A. A persistent RNA-DNA hybrid is formed during transcription at a phylogenetically conserved mitochondrial DNA sequence. Molecular and Cellular Biology. 15 (1), 580-589 (1995).
  32. Cadoret, J. C., et al. Genome-wide studies highlight indirect links between human replication origins and gene regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15837-15842 (2008).
  33. Sequeira-Mendes, J., et al. Transcription initiation activity sets replication origin efficiency in mammalian cells. PLoS Genetics. 5 (4), 1000446(2009).
  34. Picard, F., et al. The spatiotemporal program of DNA replication is associated with specific combinations of chromatin marks in human cells. PLoS Genetics. 10 (5), 1004282(2014).
  35. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genetics. 10 (5), 1004319(2014).
  36. Huang, F. T., Yu, K., Hsieh, C. L., Lieber, M. R. Downstream boundary of chromosomal R-loops at murine switch regions: implications for the mechanism of class switch recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5030-5035 (2006).
  37. Huang, F. T., et al. Sequence dependence of chromosomal R-loops at the immunoglobulin heavy-chain Smu class switch region. Molecular and Cellular Biology. 27 (16), 5921-5932 (2007).
  38. Yu, K., Lieber, M. R. Current insights into the mechanism of mammalian immunoglobulin class switch recombination. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 54 (4), 333-351 (2019).
  39. Crossley, M. P., Bocek, M., Cimprich, K. A. R-Loops as cellular regulators and genomic threats. Molecular Cell. 73 (3), 398-411 (2019).
  40. Santos-Pereira, J. M., Aguilera, A. R loops: new modulators of genome dynamics and function. Nature Reviews. Genetics. 16 (10), 583-597 (2015).
  41. Garcia-Muse, T., Aguilera, A. R Loops: From physiological to pathological roles. Cell. 179 (3), 604-618 (2019).
  42. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J. A double-edged sword: R loops as threats to genome integrity and powerful regulators of gene expression. Genes & Development. 28 (13), 1384-1396 (2014).
  43. Costantino, L., Koshland, D. The Yin and Yang of R-loop biology. Current Opinion in Cell Biology. 34, 39-45 (2015).
  44. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. Journal of Immunological Methods. 89 (1), 123-130 (1986).
  45. Sanz, L. A., Chedin, F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nature Protocols. 14 (6), 1734-1755 (2019).
  46. Halasz, L., et al. RNA-DNA hybrid (R-loop) immunoprecipitation mapping: an analytical workflow to evaluate inherent biases. Genome Research. 27 (6), 1063-1073 (2017).
  47. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. Journal of Molecular Recognition. 26 (8), 376-381 (2013).
  48. Chedin, F., Hartono, S. R., Sanz, L. A., Vanoosthuyse, V. Best practices for the visualization, mapping, and manipulation of R-loops. The EMBO Journal. 40 (4), 106394(2021).
  49. Smolka, J. A., Sanz, L. A., Hartono, S. R., Chedin, F. Recognition of RNAs by the S9.6 antibody creates pervasive artefacts when imaging RNA:DNA hybrids. Journal of Cell Biology. 220 (6), 202004079(2021).
  50. Chen, J. Y., Zhang, X., Fu, X. D., Chen, L. R-ChIP for genome-wide mapping of R-loops by using catalytically inactive RNASEH1. Nature Protocols. 14 (5), 1661-1685 (2019).
  51. Yan, Q., Sarma, K. MapR: A Method for Identifying native R-loops genome wide. Current Protocols in Molecular Biology. 130 (1), 113(2020).
  52. Wang, K., et al. Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor. Science Advances. 7 (8), (2021).
  53. Crossley, M. P., Bocek, M. J., Hamperl, S., Swigut, T., Cimprich, K. A. qDRIP: a method to quantitatively assess RNA-DNA hybrid formation genome-wide. Nucleic Acids Research. 48 (14), 84(2020).
  54. Svikovic, S., et al. R-loop formation during S phase is restricted by PrimPol-mediated repriming. The EMBO Journal. 38 (3), 99793(2019).
  55. Yang, X., et al. m(6)A promotes R-loop formation to facilitate transcription termination. Cell Research. 29 (12), 1035-1038 (2019).
  56. Vanoosthuyse, V. Strengths and weaknesses of the current strategies to map and characterize R-Loops. Non-coding RNA. 4 (2), 9(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

DRIP Seqimmunoprecypitacja S9 6niestabilno genomicznasekwencjonowanie wysokoprzepustowesDRIP Seqmapowanie specyficzne dla nicistruktura DNAfragmentacja sonikacyjna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły