Method Article

Wewnątrzprzedmiotowy projekt eksperymentalny wykorzystujący zadanie lokalizacji obiektu w szczurach

DOI:

10.3791/62458

⸱

May 6th, 2021

 ,  ,  , 
1Danish Research Institute of Translational Neuroscience (DANDRITE), Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Universitätsklinikum Würzburg, Institut für Klinische Neurobiologie, 3Translational Neuropsychiatry Unit, Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 4Faculty of Science, Radboud University, 5Center for Proteins in Memory - PROMEMO, Danish National Research Foundation, Department of Biomedicine, Aarhus University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zawiera szczegółowe kroki dla zadania lokalizacji obiektu z czterema powtórzeniami przy użyciu tej samej kohorty szczurów. Słabe i silne kodowanie może wytwarzać wspomnienia krótko- i długotrwałe. Elastyczność protokołu z powtarzaniem może być korzystna w badaniach obejmujących operacje chirurgiczne, oszczędzając czas i pracę.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozpoznawanie miejsc obiektów jest główną metodą używaną do badania pamięci przestrzennej u gryzoni. Ta pamięć rozpoznawania miejsca obiektu stanowi podstawę zadania lokalizacji obiektu. Niniejszy artykuł zawiera obszerny protokół, który pomoże w ustaleniu zadania lokalizacji obiektu z opcją do czterech powtórzeń przy użyciu tej samej kohorty szczurów. Zarówno słabe, jak i silne protokoły kodowania mogą być wykorzystywane do badania krótko- i długoterminowych wspomnień przestrzennych o różnej sile oraz do umożliwienia realizacji odpowiednich manipulacji hamujących lub wzmacniających pamięć. Ponadto, powtórzenie testu z przedstawioną tutaj przeciwwagą pozwala na połączenie wyników z dwóch lub więcej testów w celu porównania wewnątrz obiektu w celu zmniejszenia zmienności między szczurami. Ta metoda pomaga zwiększyć moc statystyczną i jest zdecydowanie zalecana, szczególnie w przypadku przeprowadzania eksperymentów, które powodują dużą zmienność indywidualnych zachowań. To bezpośrednio udoskonala badanie poprzez zwiększenie ilości danych uzyskanych od każdego zwierzęcia i zmniejszenie ogólnej liczby potrzebnych zwierząt. Wreszcie, realizacja zadania polegającego na powtarzalnej lokalizacji obiektu zwiększa efektywność badań, które obejmują zabiegi chirurgiczne, oszczędzając czas i pracę.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spontaniczne zadania rozpoznawania (np. rozpoznawanie obiektów, rozpoznawanie miejsc obiektów) były wykorzystywane w dużym stopniu w badaniu pamięci u gryzoni. Testy te różnią się od różnych testów używanych do oceny pamięci, które opierają się na warunkowaniu strachu lub motywacji nagrody, w tym, że spontaniczne zadania rozpoznawania opierają się wyłącznie na spontanicznym zachowaniu eksploracyjnym w kierunku nowych bodźców. To zachowanie, określane jako 'preferencja neotyczna'1, jest nieodłączne dla gryzoni, jak również dla innych gatunków ssaków i niektórych nie-ssaków, takich jak ptaki i ryby2. Rozpoznawanie miejsca obiektu, które zależy od pamięci przestrzennej, można obserwować za pomocą zadania lokalizacji obiektu (znanego również jako zadanie rozpoznawania obiektów przestrzennych)3. Badania nad zmianami chorobowymi wykazały, że rozpoznawanie miejsc obiektów wymaga nienaruszonego hipokampa4,5. Ze względu na stosunkowo prosty protokół treningowy i brak jakiegokolwiek wzmocnienia, zadanie to jest preferowane w wielu badaniach. Brak zarówno pozytywnego, jak i negatywnego wzmocnienia minimalizuje dodatkowe parametry i obszary mózgu, które mogą kierować zachowaniem. W związku z tym zachowanie tutaj jest neutralne i opiera się na ciekawości i pamięci przestrzennej, co pozwala na badanie mechanizmów, które są zaangażowane w kodowanie, konsolidację i odzyskiwanie pamięci przestrzennej.

Protokół zadania lokalizacji obiektów zazwyczaj składa się z sesji habituacji, po których następuje pojedyncza sesja kodowania i prób testowych, oddzielonych okresem opóźnienia, który waha się od kilku minut do godzin. Zdecydowanie zaleca się, aby szczury były traktowane wcześniej, aby zminimalizować poziom stresu zwierząt, a co za tym idzie, zachowanie, które może wpływać na pamięć rozpoznawczą, takie jak niechęć do nowości. Podobnie, dobrze zaprojektowany protokół habituacji odgrywa istotną rolę w zapobieganiu stresowi, który może utrudniać naturalne zachowanie szczura podczas zadania. Jednak zakres obsługi i przyzwyczajenia różni się znacznie między laboratoriami i eksperymentatorami, co może przyczyniać się do niskiej powtarzalności6,7,8. W próbie kodowania szczur ma czas na zbadanie areny z dwoma identycznymi obiektami umieszczonymi w dwóch wyznaczonych rogach. W próbie testowej, która jest opóźniona o pewien okres, szczur ma czas na zbadanie areny za pomocą tej samej pary obiektów, ale tym razem jeden z nich został przeniesiony w nowe miejsce. Spontaniczna preferencja wykazywana przez szczury i wynikający z niej wzrost czasu spędzonego na eksploracji obiektu w nowej lokalizacji wskazują na rozpoznanie przestrzenne i pamięć lokalizacji obiektów3. Modyfikacja próby kodowania (czas trwania i liczba powtórzeń) wpływa na siłę pamięci.

W zależności od celu badania, długość opóźnienia między kodowaniem a próbami testowymi może być modyfikowana w celu modelowania pamięci krótkotrwałej niezależnej od syntezy białek lub pamięci długotrwałej zależnej od syntezy białek. W związku z tym zadanie lokalizacji obiektu może być wykorzystywane do wielu różnych badań, dostosowując protokół w razie potrzeby. Co więcej, między tymi badaniami możliwe jest również zastosowanie manipulacji eksperymentalnych, takich jak interwencje farmakologiczne i optogenetyczne, podobnie jak obrazowanie in vivo. Istnieje kilka badań9,10, które informują o powtarzających się iteracjach zadania lokalizacji obiektów w tej samej kohorcie szczurów. Kontrastuje to z tradycyjnym zastosowaniem, w którym jedno zwierzę ma jedną sesję bez powtórzeń. Jednak skuteczność tych paradygmatów nie została dokładnie zbadana, ani nie ma żadnych prac metodycznych je opisujących. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwszy zgłoszony opis protokołu, który szczegółowo opisuje zadanie lokalizacji obiektu z maksymalnie czterema powtórzeniami przy użyciu tej samej kohorty szczurów, która również systematycznie porównuje wyniki z każdego powtórzenia. Powtórzenia mogą być wykorzystane do zrównoważenia warunków eksperymentalnych, aby umożliwić porównanie wewnątrz obiektu ze zmniejszoną zmiennością między testami. Niezawodna powtarzalność zadania pozwala na łączenie danych, co oznacza, że wystarczająco duża ilość danych może zostać wygenerowana przy użyciu stosunkowo niewielkiej liczby szczurów. Wreszcie, powtórzenia z użyciem tego samego szczura mogą być korzystne w eksperymentach obejmujących operacje chirurgiczne i implantacje, zmniejszając liczbę wymaganych szczurów, co w konsekwencji oszczędza czas i koszty pracy.

To badanie przedstawia obszerny protokół szczegółowo opisujący, jak wykonać zadanie lokalizacji obiektów u dorosłych szczurów za pomocą prób silnego i słabego kodowania, a następnie prób testowych z opóźnieniami 1-godzinnymi i 24-godzinnymi. Protokół silnego kodowania wytwarza statystycznie istotną pamięć rozpoznawczą podczas testowania z opóźnieniami 1-godzinnymi i 24-godzinnymi, a zatem może być używany do badania zarówno wspomnień krótkotrwałych, jak i długotrwałych po zastosowaniu manipulacji w celu zahamowania tych wspomnień11. W przeciwieństwie do tego, słaby protokół kodowania generuje znaczną ilość pamięci krótkotrwałej tylko wtedy, gdy jest testowany z 1-godzinnym opóźnieniem. Brak pamięci długotrwałej może być wykorzystany do badania manipulacji w celu zwiększenia zapamiętywania pamięci11,12. Protokół ten obejmuje również szczegółowe sesje obsługi i habituacji, które mają na celu zwiększenie możliwości powielania zadania lokalizacji obiektu. Artykuł ten pokazuje również powtórzenie zadania w czterech różnych kontekstach z tą samą kohortą szczurów przy użyciu protokołu słabego kodowania, który potwierdza, że za każdym razem daje powtarzalne i spójne wyniki.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez duńskie władze krajowe (numer licencji: 2018-15-0201-01405) zgodnie z duńskimi i unijnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt.

1. Eksperymentalna konfiguracja i przygotowanie odrębnych kontekstów

  1. Arena lokalizacji obiektu z context
    UWAGA: Poniższa konfiguracja jest pokazana w zamkniętym dźwiękoszczelnym pudełku (Rysunek 1B) ze źródłem światła umieszczonym wzdłuż krawędzi sufitu i kamerą umieszczoną na środku sufitu skrzynki. Arena o wymiarach 60 cm x 60 cm ze ścianami o wysokości 100 cm (Rysunek 1B), jest umieszczona wewnątrz pudełka i jest całkowicie odizolowana od otaczającego pomieszczenia. Wszystkie wskazówki przestrzenne znajdują się wewnątrz areny. Upraszcza to proces tworzenia odrębnych kontekstów. Podobny poziom izolacji od otaczającego pomieszczenia można osiągnąć, zamykając normalną arenę na otwartym polu jednolitą kurtyną wokół ścian.
    1. Uzyskaj kwadratową arenę wykonaną z nieprzezroczystego, nieporowatego twardego tworzywa sztucznego o minimalnej szerokości 60 cm i minimalnej wysokości 50 cm. Wybierz kolor podłogi kontrastujący z kolorem szczura, aby skutecznie rejestrować ruchy szczurów przez zautomatyzowane oprogramowanie (jeśli dotyczy). Umieść arenę albo w pudełku (Rysunek 1B), albo na platformie otoczonej zasłoną.
    2. Aby stworzyć kontekst, uzyskaj drugą warstwę wstawianych ścian (np. pokrycie ścian wykonane z tego samego materiału co arena lub plastikowa tapeta, którą można łatwo wyczyścić) w różnych kolorach i/lub wzorach (np., biały, w paski lub kropki). Wstaw drugą warstwę ścian na arenie tak, aby były od siebie oddzielone.
    3. Uzyskaj trójwymiarowe (3D) wskazówki przestrzenne (1-2 na kontekst) o wymiarach wahających się od 10 cm x 10 cm x 5 cm do 20 cm x 15 cm x 15 cm (szerokość x długość x wysokość) i mają (i) wyraźne kształty geometryczne oraz (ii) kolory kontrastujące z kolorem ściany. Zawieś je na ścianach na tyle wysoko, aby szczury nie mogły dotrzeć do tych wskazówek.
    4. Uzyskaj różne pary przedmiotów (tyle, ile jest numeru kontekstu), które są nieporowate, nie nadają się do żucia i są łatwe do czyszczenia. Staraj się mieć wyraźne kształty geometryczne i tekstury dla każdego nowego obiektu. Wybierz obiekty o szerokości i wysokości od 5 do 15 cm (unikaj wyższych obiektów). Zobacz Rysunek 1D dla przykładów czterech różnych obiektów (stożki, piłki, prostokątne pryzmaty i trójkątne pryzmaty).
      UWAGA: Każdy obiekt powinien być podobny do szczurów, tak aby łączny czas eksploracji dla wszystkich obiektów był porównywalny.
    5. Znajdź najlepsze rozwiązanie do mocowania przedmiotów na podłodze areny (np. za pomocą mat samoprzylepnych, taśmy dwustronnej, przymocowania metalowej płytki pod obiektem i magnesu do parowania pod areną itp.).
    6. Tworząc kolejny kontekst, utwórz ponownie ściany w taki sposób, aby kontrastowały z rozkładem kolorów i wzorem ścian z poprzedniego kontekstu (kontekstów). Korzystaj z nowych wskazówek przestrzennych 3D, które różnią się od wszystkich poprzednich wskazówek i kontrastują z nimi. Zobacz Rysunek 1C, aby zobaczyć przykłady czterech różnych kontekstów.
    7. Uzyskaj źródło światła, które zapewni rozproszone i równomierne oświetlenie na arenie i które ma opcję ściemniania. Dostosuj natężenie światła do około 100-120 luksów w rogach areny po utworzeniu każdego kontekstu. Zaopatrz się w kamerę i umieść ją na środku sufitu pudełka.
      UWAGA: Natężenie światła można ustawić na niższy poziom, jeśli nie jest używane oprogramowanie do automatycznego oceniania.
  2. Zasobnik obiektów
    1. Zaopatrz się w wiadro (o średnicy >50 cm). Nie wybieraj kwadratowego kształtu, aby uniknąć podobieństwa do areny eksperymentalnej. Wypełnij go materiałem pościelowym.
    2. Zdobądź 5-10 obiektów o różnych kształtach i rozmiarach (różniących się od obiektów, które zostaną użyte w eksperymencie) i losowo umieść je wszystkie w wiadrze (Rysunek 1A).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Konfiguracja eksperymentalna, obejmująca cztery odrębne konteksty i obiekty. (A) Zasobnik obiektów do habituacji obiektów. (B) Aparatura doświadczalna (po lewej), obejmująca arenę lokalizacji obiektu, kamerę i źródło światła. Eksperymentalne pudełko i arena przed konfiguracją kontekstową (w środku) oraz arena z konfiguracją kontekstową (po prawej). (C) Cztery konteksty (1-4) z różnymi kolorami i wzorami ścian, a także trójwymiarowymi wskazówkami przestrzennymi. (D) Cztery obiekty, które są używane odpowiednio w kontekstach 1-4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Kamera i oprogramowanie śledzące (opcjonalnie)
    1. Uzyskaj oprogramowanie, które może być używane do zdalnego sterowania kamerą rejestrującą i które może śledzić nosy szczurów. Dokonaj zmian w oprogramowaniu dla każdego konkretnego kontekstu i szczepu szczura przed każdym eksperymentem.
  2. Równoważenie lokalizacji obiektów i grup eksperymentalnych
    1. Przygotuj możliwe kombinacje lokalizacji obiektów na potrzeby kodowania i prób testowych oraz nazwij je licznikami. Utwórz kombinacje w taki sposób, aby obejmowały wszystkie narożniki jako lokalizacje obiektów oraz ruch obiektów od sąsiednich do ukośnych narożników i odwrotnie (Rysunek 2A).
    2. Przygotuj harmonogram konkretnego eksperymentu, dopasowując każdego szczura w jednej grupie eksperymentalnej do licznika. Użyj każdej pary dwóch sparowanych liczników (Rysunek 2A) w jednej grupie, jeśli jest wystarczająca liczba szczurów. Użyj tego samego zestawu liczników dla obu grup eksperymentalnych w jednej sesji kodowania/testu (Rysunek 2B). Ponownie przypisz liczniki do następujących sesji (tj. każdego nowego kontekstu).
      UWAGA: Uruchom szczury w mieszanej kolejności podczas sesji kodowania/testowania (np. nie uruchamiaj wszystkich szczurów w jednej klatce jeden po drugim; zamiast tego obracaj klatki, aby zapewnić spokojne środowisko w klatce z więcej niż jednym szczurem).
    3. W przypadku korzystania z dwóch lub więcej kontekstów w celu zrównoważenia grup eksperymentalnych (np. grupy pamięci 1-godzinnej kontra grupy pamięci 24-godzinnej), przypisz szczury do każdej grupy i zmień grupy w następujących kontekstach (Rysunek 2B).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Reprezentatywne metody równoważenia. (A) Możliwe orientacje obiektów na arenie podczas kodowania i prób testowych są nazwane licznikami. Obiekt 1 jest zawsze obiektem poruszającym się. Co dwa liczniki są równoważone w taki sposób, że zmienia się położenie poruszającego się obiektu. Każdy narożnik jest zajęty dwukrotnie, a obiekt 1 jest przesuwany z przekątnej do sąsiedniego i odwrotnie tyle samo razy. (B) Przykład harmonogramu kodowania/testowania dla dwóch równoważonych sesji (np. konteksty 1 i 2). Szczury są przypisywane do warunków eksperymentalnych w kontekście 1 (sesja X, po lewej). Zestaw par liczników (tj. 1-2, 3-4, 5-6 i 7-8) jest wybierany i przypisywany do każdego szczura w jednej grupie eksperymentalnej. Ten sam zestaw liczników jest przypisany do szczurów w obu grupach eksperymentalnych. W następnej sesji w kontekście 2 (sesja X+1; po prawej) szczury w grupach eksperymentalnych są zmieniane w celu równoważenia i przypisywany jest nowy zestaw par liczników. Należy zwrócić uwagę na czas na początku kodowania i prób testowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Wszystkie sesje obsługi, habituacji i kodowania/testowania w tym protokole zostały zoptymalizowane podczas fazy światła 12-godzinnego cyklu światło/ciemność, dlatego zaleca się, aby eksperymenty były przeprowadzane podczas fazy światła.

2. Obsługa i przyzwyczajenie

  1. Obchodzenie się ze szczurami należy rozpocząć od odsadzenia od piersi (jeśli szczury są hodowane w gospodarstwie macierzystym) lub 2-3 tygodnie przed rozpoczęciem eksperymentów (w przypadku, gdy szczury są zamawiane w placówce zewnętrznej, po umożliwieniu im aklimatyzacji przez tydzień po przybyciu).
  2. Poświęć co najmniej 10-15 minut na każdą klatkę 4 szczurów przez 2 lub 3 dni w tygodniu, aż szczury poczują się komfortowo, będąc dotykane i podnoszone przez eksperymentatora. Dostosuj czas przydzielony na klatkę w zależności od liczby szczurów w klatce.
    UWAGA: Ważne jest, aby wszyscy eksperymentatorzy, którzy spodziewają się pracować ze szczurami, byli obecni podczas obchodzenia się ze szczurami.
  3. W przypadkach, gdy obchodzenie się z dzieckiem rozpoczyna się w momencie odsadzenia, po osiągnięciu tego poziomu należy ograniczyć obchodzenie się z nim do minimum (opcjonalnie). Jeśli rozpoczniesz się 2-3 tygodnie przed eksperymentami, kontynuuj obsługę aż do rozpoczęcia sesji habituacji.
  4. Przyprowadź szczury w ich klatkach do pomieszczenia doświadczalnego, aby przyzwyczaić je do transportu, jak również do pomieszczenia doświadczalnego. Pozwól szczurom siedzieć przez co najmniej 30 minut, aby dać im czas na uspokojenie się i przyzwyczajenie. Po tym czasie należy zwrócić szczury/klatki do pomieszczenia z chowodem.
    UWAGA: Krok 2.4 można połączyć z obsługą i powtarzać tyle razy, ile potrzeba. Na tym etapie można wdrożyć dodatkowe przyzwyczajenie, jeśli protokół obejmuje jakiekolwiek dalsze manipulacje (np. postępowanie z procedurą wstrzyknięć itp.).
  5. Przeprowadź habituację obiektów, aby przyzwyczaić szczury do interakcji z obiektami i zmniejszyć ogólny poziom stresu wynikający z doświadczania nowych środowisk.
    1. W przypadku sesji 1 przynieś wszystkie klatki domowe do pokoju doświadczalnego i pozwól szczurom przyzwyczaić się do pokoju i osiąść na co najmniej 30 minut. Umieść szczury (2-4 szczury) z tej samej klatki razem w wiadrze na 20 minut. Wyczyść wiadro, usuwając wszelkie odchody między każdą grupą szczurów. Powtórz procedurę dla wszystkich klatek. Umieść wszystkie szczury w ich domowych klatkach i wróć do pomieszczenia mieszkalnego.
    2. W przypadku sesji 2, w oddzielnym dniu, przynieś wszystkie klatki do pokoju doświadczalnego i pozostaw je na co najmniej 30 minut. Włóż każdego szczura indywidualnie do wiadra na 10 minut. Umieść szczura z powrotem w klatce domowej i wyczyść wiadro po każdym szczurze. Zwróć wszystkie klatki do pomieszczenia mieszkalnego.
    3. W przypadku sesji 3 powtórz krok 2.5.2 w innym dniu.
  6. Jeśli aparatura doświadczalna jest zamkniętym pudełkiem (Rysunek 1B), zdecyduj się na wykonanie habituacji pustego pudełka, aby przyzwyczaić szczury do nowej aparatury doświadczalnej. W sesji 4 przynieś wszystkie klatki do pokoju doświadczalnego i opuść je na co najmniej 30 minut. Umieść szczury z tej samej klatki razem (2-4 szczury) na pustej arenie bez kontekstu i wskazówek przestrzennych (Rysunek 1B, w środku) przez 20 minut. Umieść wszystkie szczury z powrotem w klatce domowej i przetrzyj arenę 70% etanolem po każdej grupie szczurów.
    UWAGA: Kroki 2.5 i 2.6 powinny być wykonane w ciągu jednego tygodnia, poprzedzającego tydzień przyzwyczajenia kontekstowego (krok 2.7; patrz Rysunek 3). Dopuszczalna jest kilkudniowa przerwa podczas tych kroków. Jednak po rozpoczęciu kroku 2.7 każdy krok powinien być wykonywany w kolejnych dniach, jak określono, aż do końca próby testowej (krok 2.9).
  7. Przeprowadź habituację kontekstu, aby przyzwyczaić szczury do kontekstu i wskazówek 3D, zmniejszyć ogólny poziom stresu i wesprzeć przestrzenne uczenie się środowiska.
    1. Zmodyfikuj pustą arenę, aby utworzyć pierwszy kontekst zgodnie z opisem w sekcji 1.1, ale nie umieszczaj obiektów na arenie. Przygotować urządzenie rejestrujące.
    2. W przypadku sesji 1 przynieś wszystkie klatki do pokoju doświadczalnego i pozostaw je na co najmniej 30 minut. Uruchom rejestrator, jeśli robisz to ręcznie. Umieść pierwszego szczura na środku areny i pozwól mu eksplorować arenę przez 10 minut. Następnie zatrzymaj rejestrator (jeśli jest ręczny) i umieść szczura z powrotem w klatce domowej. Dokładnie przetrzyj arenę 70% etanolem po każdym szczurze, a po zakończeniu zwróć wszystkie klatki do pomieszczenia z budową.
    3. W przypadku sesji 2 i 3 powtórz krok 2.7.2 dla każdego szczura przez dwa kolejne dni, tak aby w sumie na szczura przypadały 3 sesje habituacji kontekstowej.
      UWAGA: Rozważ przetasowanie kolejności, w jakiej szczury wchodzą na arenę, zwłaszcza gdy masz do czynienia z dużą grupą. Pozwala to uniknąć wielokrotnego biegania z określonymi szczurami o tej samej porze dnia.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Projekt eksperymentu behawioralnego, w tym protokoły zadań, przyzwyczajenia i lokalizacji obiektów. Ze szczurami należy obchodzić się regularnie, począwszy od kilku tygodni przed tygodniem przyzwyczajenia. W tygodniu 0 habituacje obiektowe i eksperymentalne są przeprowadzane w ciągu 4 sesji z co najmniej 24-godzinnymi odstępami między nimi. W pierwszym tygodniu habituacja kontekstu jest przeprowadzana przez 3 kolejne sesje z 24-godzinnymi przerwami między nimi, a następnie kodowanie i próby testowe. Przed przystąpieniem do następnej sesji powinien być co najmniej 48 godzin i maksymalnie 1 tydzień przerwy (np. rozpocząć przyzwyczajanie się do następnego kontekstu w 2 lub 3 tygodniu). Skrót: Hab., habituacja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Próba kodowania (sesja 4)
    UWAGA: W przypadku manipulacji farmakologicznych rozsądny czas na podanie środka może przypadać przed lub bezpośrednio po próbie kodowania i/lub przed próbą testową, w zależności od charakteru środka farmakologicznego.
    1. Przynieś wszystkie klatki do pokoju doświadczalnego i pozostaw je na co najmniej 30 minut. Korzystając z przygotowanego wcześniej harmonogramu (Rysunek 2B), umieść pierwszą identyczną parę przedmiotów w wyznaczonych miejscach (w 2 rogach i odległości >10 cm od każdej ze ścian; za każdym razem można użyć kawałka tektury w kształcie litery L, aby zachować tę samą odległość), używając lepkich mat lub taśmy dwustronnej.
    2. Uruchom rejestrator (jeśli jest ręczny). Umieść pierwszego szczura na arenie przodem do ściany lub rogu, który nie jest zajęty przez żaden obiekt (równa odległość od każdego obiektu).
      UWAGA: Wykonaj poniższe czynności dla słabego lub silnego kodowania.
    3. W przypadku słabego kodowania (1 próba) pozwól szczurowi eksplorować arenę i obiekty przez 20 minut. Następnie zatrzymaj rejestrator (jeśli jest ręczny) i umieść szczura z powrotem w klatce domowej. Usuń przedmioty i dokładnie przetrzyj zarówno przedmioty, jak i arenę 70% etanolem.
    4. Powtórz krok 2.8.3 dla wszystkich szczurów, tak aby każdy szczur otrzymał 1 próbę kodowania trwającą 20 minut.
    5. Aby uzyskać silne kodowanie (3 próby), pozwól szczurowi eksplorować arenę i obiekty przez 5 minut. Następnie zatrzymaj rejestrator (jeśli jest ręczny) i umieść szczura z powrotem w klatce domowej. Nie usuwaj przedmiotów. Przetrzyj arenę i przedmioty 70% etanolem.
    6. Powtórz krok 2.8.5 jeszcze dwa razy z tym samym szczurem, tak aby w sumie były 3 próby. Umieść szczura z powrotem w klatce domowej, gdy czas się skończy. Usuń przedmioty w celu dokładnego oczyszczenia i przetrzyj przedmioty oraz arenę 70% etanolem.
      UWAGA: Przerwa między próbami u szczura powinna wynosić około 1-2 minut.
    7. Powtórz kroki 2.8.5-2.8.6 dla każdego szczura.
    8. Jeżeli czas opóźnienia jest krótszy niż 24 godziny, klatki należy przechowywać w pomieszczeniu doświadczalnym do czasu próby badawczej. Jeśli nie, po zakończeniu zwróć wszystkie klatki do pomieszczenia mieszkalnego.
  2. Próba testowa (sesja 4)
    UWAGA: Okres opóźnienia powinien być liczony od początku próby kodowania.
    1. W przypadku 24-godzinnego opóźnienia (lub jakiegokolwiek opóźnienia, które wymaga przeprowadzenia próby testowej następnego dnia), należy przynieść wszystkie klatki do pomieszczenia doświadczalnego, pozostawiając wystarczająco dużo czasu przed pierwszym testem, aby szczury mogły zostać pozostawione na co najmniej 30 minut. Zgodnie z harmonogramem umieść obiekty w wyznaczonych lokalizacjach (jeden z obiektów w nowej lokalizacji).
    2. Gdy nadejdzie czas, uruchom rejestrator (jeśli jest ręczny). Umieść pierwszego szczura na arenie przodem do ściany lub rogu, który nie jest zajęty przez żaden obiekt (równa odległość od każdego obiektu).
    3. Pozwól szczurowi eksplorować arenę i obiekty przez 5 minut. Następnie zatrzymaj rejestrator (jeśli jest ręczny). Umieść szczura z powrotem w klatce domowej. Usuń przedmioty i dokładnie przetrzyj zarówno przedmioty, jak i arenę 70% etanolem.
    4. Powtórz kroki 2.9.2-2.9.3 dla każdego szczura. Zwróć wszystkie klatki z powrotem do pomieszczenia mieszkalnego.
      UWAGA: W każdej kolejnej sesji kodowania/testowej rozpocznij protokół habituacji od kroku 2.7 (habituacja kontekstowa) po przerwie co najmniej 48 godzin i do 1 tygodnia.

3. Analiza danych

  1. Dla każdego szczura oceń czas eksploracji dla każdego obiektu zarówno w próbach kodowania, jak i testów, używając oprogramowania przeznaczonego do tego celu lub korzystając z konfiguracji ręcznej. Oceniaj próby kodowania przez cały czas trwania. Oceniaj próby testowe przez 2 minuty, aby uzyskać najlepszą wydajność dyskryminacji3. W przypadku korzystania z automatycznego oceniania oprogramowania online wyeksportuj dane oceniania z oprogramowania.
  2. Policz czas eksploracji, kiedy szczur ma kontakt z obiektem, obwąchuje obiekt lub jest zwrócony twarzą do obiektu w odległości mniejszej niż 2 cm. Uwzględnij wspinanie się i siedzenie na obiekcie jako eksplorację, chyba że uwaga szczura wydaje się być skierowana gdzieś indziej niż obiekt (np. odwraca wzrok od obiektu).
  3. Oblicz całkowity czas eksploracji dla obu obiektów dla każdego szczura. Rozważ wykluczenie z tego testu szczura, którego całkowity czas eksploracji jest krótszy niż 10 s w próbie testowej (dla 2 minut oceny), ponieważ może to odzwierciedlać niewiarygodną eksplorację.
  4. Oblicz procent eksploracji dla każdego obiektu (równanie 1) lub wskaźnik dyskryminacji (DI) dla każdego szczura (równanie 2) i oblicz średnie wartości dla grup.
    figure-protocol-4 (1)
    figure-protocol-5
    UWAGA: Jeśli % eksploracji wynosi 50% lub DI wynosi 0, oznacza to, że wydajność jest na poziomie szansy, a szczur nie ma preferencji dla żadnego z obiektów. Średni procent eksploracji i DI podczas prób kodowania powinien wynosić odpowiednio ~50% lub 0. Każdy szczur wykazujący preferencję wyższą niż [średnia ± (2 × SD)] dla któregokolwiek z obiektów w próbie kodowania powinien zostać wyłączony z analizy odpowiedniego testu. Pozwala to na wiarygodną interpretację preferencji w próbie testowej jako pamięci stabilnej lokalizacji obiektu. Wartość tę można obliczyć dla pojedynczego testu lub dla połączonych danych kodowania z kilku testów.
  5. Przeanalizuj dane za pomocą metody najlepiej pasującej do konfiguracji eksperymentalnej. Użyj testu t dla jednej próby, aby wykryć istotną preferencję powyżej poziomu szansy.
  6. Używając więcej niż jednego kontekstu z równoważeniem, połącz wyniki tego samego warunku eksperymentalnego w różnych kontekstach.
    UWAGA: Spowoduje to powstanie grup składających się z tych samych szczurów, umożliwiając porównanie wewnątrz obiektu przy użyciu sparowanego testu t dla dwóch grup i przy użyciu analizy wariancji powtarzanych pomiarów (ANOVA) dla więcej niż dwóch grup.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazane tutaj są reprezentatywne wyniki zarówno dla silnego, jak i słabego protokołu kodowania opisanego przy użyciu transgenicznych samców transgenicznych szczurów z hydroksylazą tyrozyny (Th)-Cre13 ze szczepem Long-Evans skrzyżowanym wstecznie cztery razy z szczepem Lister Hooded i dzikim typem szczurów Lister Hooded. Wykorzystano transgeniczne szczury Th-Cre, ponieważ ta linia szczurów będzie wykorzystywana w przyszłych badaniach z udziałem optogenetyki. Za pomocą każdego protokołu testowano pamięć z opóźnieniami od 1 do 24 godzin. Testy po 1 godzinie wykazują pamięć krótkotrwałą, podczas gdy testy 24-godzinne wykazują pamięć długotrwałą. Wartość wykluczenia preferencji kodowania została obliczona zgodnie z opisem w protokole, przy użyciu połączonych danych z pięciu testów (silne i słabe protokoły kodowania) jako [50,8% ± (2×10,8%)]. Szczury, które miały preferencje kodowania powyżej i poniżej tych wartości, zostały wykluczone z analiz odpowiednich testów.

Do eksperymentów z silnym kodowaniem użyto 16 szczurów, a do eksperymentów ze słabym kodowaniem użyto 19 szczurów. Podczas prób silnego kodowania (kodowanie od 3 × 5 minut; Rysunek 4A), nie było znaczącej preferencji dla żadnego z obiektów (52,0 ± 1,9%, n = 16, t15 = 1,1, p = 0,29; test t dla jednej próby w porównaniu z poziomem szansy). Ten silny protokół kodowania doprowadził do preferowania obiektu w nowej lokalizacji, co wykazano pod względem średniego procentu eksploracji, który był znacznie wyższy niż poziom szansy (50%) w testach z opóźnieniami zarówno 1-godzinnymi, jak i 24-godzinnymi (pamięć 1-godzinna, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t7 = 11,8, p < 0,001; pamięć 24-godzinna, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t7 = 2,8, p = 0,025; test t dla jednej próby w funkcji poziomu szansy). Nie stwierdzono istotnej różnicy między pamięcią 1-godzinną a 24-godzinną (p = 0,056; niesparowany test t Welcha).

Podczas prób słabego kodowania (kodowanie 20 min; wyniki zebrane z czterech kontekstów; Rysunek 4B), nie było znaczącej preferencji dla żadnego z obiektów (51,1 ± 1,0%, n = 66, t65 = 1,2, p = 0,24; test t dla jednej próby w porównaniu z poziomem szansy). Ten słaby protokół kodowania spowodował znaczny wzrost preferencji dla obiektu w nowej lokalizacji w porównaniu z poziomem przypadkowości w testach z opóźnieniem 1-godzinnym, ale nie 24-godzinnym (połączone dane ze wszystkich czterech kontekstów; pamięć 1-godzinna, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t31 = 8,2, p < 0,001; pamięć 24-godzinna, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t33 = 0,16, p = 0,87; test t dla jednej próby w funkcji poziomu szansy). Stwierdzono istotną różnicę między wynikami w testach z opóźnieniami 1-godzinnymi i 24-godzinnymi (pamięć 1-godzinna: n = 32, pamięć 24-godzinna: n = 34, t61,5 = 5,2, p < 0,001; niesparowany test t Welcha).

Pamięć na poziomie grupy nie została zaobserwowana w teście 24-godzinnego opóźnienia jako indeksowana przez wydajność na poziomie przypadku, ale wykazywała indywidualne różnice. Ta wyższa zmienność w warunkach słabej pamięci lub braku pamięci (np. test 24-godzinny) była często obserwowana ze względu na bardziej losową eksplorację obiektów. Dlatego ważne jest, aby nie interpretować wydajności szczurów indywidualnie. Zamiast tego rozkład poszczególnych punktów danych może być używany wraz ze średnią grupową jako wiarygodny wynik testu. Im silniejsze kodowanie, tym bardziej jednolite staje się zachowanie szczurów i tym mniejsza liczba szczurów jest potrzebna do osiągnięcia istotności statystycznej, co można zaobserwować w Rysunek 4A dla protokołu silnego kodowania. W przeciwieństwie do tego, większe grupy są potrzebne do uzyskania wiarygodnych wyników dla słabych warunków (Rysunek 4B).

figure-results-1
Rysunek 4: Wydajność pamięci po silnym i słabym kodowaniu. (A) Próba silnego kodowania (kodowanie 3 × 5 minut), po której następują próby testowe 1-godzinne lub 24-godzinne. Nie stwierdzono istotnej preferencji dla żadnego z obiektów podczas prób kodowania (n = 16). Silne kodowanie spowodowało znacznie zwiększoną preferencję dla obiektu w nowej lokalizacji w testach z opóźnieniami zarówno 1-godzinnymi, jak i 24-godzinnymi w porównaniu z poziomem przypadkowym (pamięć 1-godzinna i 24-godzinna: n = 8 w każdej grupie). Nie stwierdzono istotnej różnicy między grupami. (B) Próba słabego kodowania (kodowanie 20 min), po której następują 1-godzinne lub 24-godzinne próby testowe. Nie stwierdzono istotnej preferencji dla żadnego z obiektów jako grupy podczas prób kodowania (n = 66). Słabe kodowanie spowodowało znacznie zwiększoną preferencję dla obiektu w nowym miejscu w teście z 1-godzinnym, ale nie 24-godzinnym opóźnieniem, w porównaniu z poziomem przypadkowym (pamięć 1-godzinna: n = 32; pamięć 24-godzinna: n = 34). Wystąpiła znacząca różnica między wydajnością w testach z opóźnieniami 1 i 24 godzinnymi. Wyniki połączono w czterech kontekstach. Poszczególne punkty danych są prezentowane jako kropki. Wszystkie słupki pokazują procent eksploracji obiektu w nowej lokalizacji jako średnią ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001; Test t dla jednej próby w funkcji poziomu szansy (50%, linia przerywana). ###p < 0,001; ns, nieznaczące; niesparowany test t-Welcha. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Istotną zaletą tego uznanego protokołu jest to, że można go wykonać cztery razy przy użyciu czterech różnych kontekstów (Rysunek 1C) z tą samą kohortą szczurów. Wyniki pokazane w Rysunek 5 pokazują jeden z możliwych sposobów użycia równoważenia z dwiema grupami eksperymentalnymi (1-godzinne i 24-godzinne grupy pamięci). Obie grupy były równoważone w dwóch kontekstach (konteksty 1 i 2), co zostało powtórzone w dwóch dodatkowych kontekstach (konteksty 3 i 4; Rysunek 5A). Wyniki z czterech kontekstów są prezentowane indywidualnie w Rysunek 5B,D, gdzie pamięć dla każdej grupy eksperymentalnej została oceniona, porównując preferencję do poziomu szansy w każdym kontekście (pamięć 1-godzinna: Kontekst 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t8 = 5,5, p < 0,001; Kontekst 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t8 = 4,0, p = 0,004; Kontekst 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t6 = 4,0, p = 0,007; Kontekst 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t6 = 2,7, p = 0,035; Pamięć 24-godzinna: Kontekst 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t8 = 0,77, p = 0,46; Kontekst 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t8 = 0,18, p = 0,86; Kontekst 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t7 = 1,7, p = 0,12; Kontekst 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t7 = 0,52, p = 0,62; test t dla jednej próby w funkcji poziomu szansy).

W kontekstach 1, 2 i 4, międzyobiektowe porównanie grup ujawniło znaczące różnice między pamięcią 1-godzinną a 24-godzinną (pamięć 1-godzinna kontra pamięć 24-godzinna: Kontekst 1, t12,7 = 3,4, p = 0,005; Kontekst 2, t15,2 = 2,6, p = 0,019; Kontekst 3, t13,0 = 1,4, p = 0,17; Kontekst 4, t12,2 = 2,4, p = 0,032; niesparowany test t-Welcha). Aby uzyskać lepszą reprezentację i porównanie danych w obrębie obiektu, połączono wyniki z dwóch równoważonych kontekstów (Rysunek 5C,E). Połączone grupy eksperymentalne ponownie porównano indywidualnie z poziomem szansy (Konteksty 1 i 2 łącznie: pamięć 1-godzinna, 67,8 ± 2,6%, n = 18, t17 = 6,7, p < 0,001; pamięć 24-godzinna, 47,1 ± 3,9%, n = 18, t17 = 0,74, p = 0,47; Konteksty 3 i 4 łącznie: pamięć 1-godzinna, 65,3 ± 3,3%, n = 14, t13 = 4,7, p < 0,001; Pamięć 24-godzinna, 52,4 ± 3,2%, n = 16, t15 = 0,73, p = 0,48; test t dla jednej próby w funkcji poziomu szansy). Następnie grupy eksperymentalne porównano ze sobą.

W obu parach kontekstowych wystąpiły znaczące różnice między grupami, co ujawniły porównania wewnątrzobiektowe (pamięć 1-godzinna kontra pamięć 24-godzinna: Konteksty 1 i 2 połączone, t16 = 3,5, p = 0,003; Konteksty 3 i 4 łącznie, t13 = 2,4, p = 0,032; sparowany test t). Porównywalne wyniki uzyskano również u szczurów z kapturem Lister typu dzikiego w słabym protokole kodowania przy użyciu kontekstów 1 i 4 dla dwóch przeciwzrównoważonych sesji (dane nie pokazane). Powtarzalność i wiarygodność wyników zweryfikowano poprzez porównanie każdego zestawu danych przy użyciu jednoczynnikowej analizy ANOVA. Nie stwierdzono istotnej różnicy między czterema kontekstami (pamięć 1-godzinna: F3,28 = 0,31, p = 0,81; pamięć 24-godzinna: F3,30 = 0,99, p = 0,41). W związku z tym test lokalizacji obiektu można niezawodnie powtórzyć przy minimalnym wpływie powtórzeń, pod warunkiem, że przestrzegane są instrukcje zawarte w tym protokole.

figure-results-2
Rysunek 5: Różne sposoby prezentacji i analizy wyników protokołu słabego kodowania z dwiema grupami eksperymentalnymi równoważonymi przez dwie sesje. (A) Eksperymentalny projekt równoważenia z dwiema grupami eksperymentalnymi (grupy pamięci 1-godzinnej i 24-godzinnej) w dwóch sesjach (konteksty 1 i 2). Przeciwwaga została powtórzona w dwóch dodatkowych sesjach (konteksty 3 i 4). (B i D) Wyniki z każdego kontekstu i grup eksperymentalnych zostały indywidualnie porównane pod względem poziomu szansy i między sobą. We wszystkich czterech kontekstach preferencja dla obiektu w nowej lokalizacji w testach z 1-godzinnym opóźnieniem była znacznie zwiększona w porównaniu z poziomem szansy [Kontekst 1 i 2: n = 9 na grupę (B); Kontekst 3 i 4: n = 7 na grupę (D)]. W 24-godzinnych testach opóźnienia preferencja dla obiektu w nowej lokalizacji nie różniła się od przypadku (Kontekst 1 i 2: n = 9 na grupę; Kontekst 3 i 4: n = 8 na grupę). Stwierdzono istotną różnicę między preferencjami grup eksperymentalnych w kontekstach 1, 2 i 4, ale nie w kontekście 3, co ujawniło porównanie między osobami. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Test t dla jednej próby w funkcji poziomu szansy (50%, linia przerywana). #p < 0.05; ##p < 0,01; ns, nieznaczące; niesparowany test t-Welcha. (C i E) Wyniki przedstawiono po połączeniu grup eksperymentalnych z dwóch równoważonych kontekstów [Konteksty 1 i 2 łącznie, n = 17 na grupę (C); Konteksty 3 i 4 łącznie, n = 14 na grupę (E)]. Preferencja dla obiektu w nowej lokalizacji była znacznie zwiększona w porównaniu z poziomem szansy w testach z 1-godzinnym, ale nie 24-godzinnym opóźnieniem, w obu parach kontekstów. Wewnątrzobiektowe porównanie grup eksperymentalnych ujawniło istotne różnice między preferencjami dla obiektu w nowej lokalizacji w testach z 1-godzinnym i 24-godzinnym opóźnieniem w obu parach kontekstów. p < 0,001; Test t dla jednej próby w funkcji poziomu szansy (50%, linia przerywana). #p < 0,05, ##p < 0,01; sparowany test t. Poszczególne punkty danych są prezentowane jako kropki. Wszystkie słupki pokazują procent eksploracji obiektu w nowej lokalizacji jako średnią ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zadanie lokalizacji obiektów może być wykorzystywane w różnych badaniach do badania pamięci przestrzennej, jak opisano wcześniej. Elastyczność konfiguracji umożliwia modelowanie pamięci krótkotrwałej i długotrwałej o różnej sile i może być łatwo wdrożona przy niskich kosztach. Ponieważ jednak w protokole znajduje się wiele parametrów, które mogą wpływać na wyniki, a różne badania różnią się nieznacznie w tych parametrach6, można napotkać trudności z pomyślnym wdrożeniem zadania po raz pierwszy. Powyższy protokół ma na celu płynne przeprowadzenie czytelników przez ten proces. Dalsze kluczowe kroki, które mogą mieć znaczenie dla pomyślnej realizacji zadania z dużą powtarzalnością, zostaną omówione poniżej.

Chociaż sesja kodowania/testowania często jest głównym celem podczas przeprowadzania eksperymentów z lokalizacją obiektów, protokoły obsługi i przyzwyczajenia mają głęboki wpływ na wynik tego rodzaju testów behawioralnych, w których wynik zależy od niezakłóconego naturalnego zachowania szczurów14,15. W związku z tym kroki poprzedzające sesję kodowania/testową powinny być zaprojektowane z ostrożnością, ponieważ mogą wpływać na zachowanie i pamięć szczurów, a w konsekwencji wpływać na wyniki końcowe. Dobry poziom obchodzenia się i przyzwyczajenia, tak aby szczury zapoznały się z eksperymentatorem i zadaniem, zminimalizuje wpływ czynników stresowych, jednocześnie zwiększając prawdopodobieństwo wykazywania naturalnych zachowań8. Jak wspomniano w protokole, obchodzenie się z młodymi może rozpocząć się już w momencie odsadzenia szczeniąt, jeśli szczep szczura jest utrzymywany w obiekcie macierzystym. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach (dane nie pokazane) oraz na podstawie kilku wcześniejszych badań16,17, ta wczesna obsługa skutkuje niskim poziomem lęku i zwiększoną ciekawością w kolejnych miesiącach.

Ponieważ zadanie lokalizacji obiektu zależy wyłącznie od wewnętrznego popędu eksploracyjnego szczurów, oczekiwane zachowanie może być łatwo utrudnione, jeśli szczury nie są chętne do eksploracji lub niechętnie zbliżają się do nowości, co jest określane jako "zachowanie neofobiczne"1. W związku z tym zdecydowanie zaleca się dołączenie dokładnego protokołu postępowania i habituacji zgodnie z konkretnymi potrzebami badania. Protokół ten może być wykorzystany jako przewodnik po minimalnych wymaganiach, a dalsze kroki mogą zostać wdrożone (np. jeśli badanie ma obejmować wstrzyknięcia na późniejszym etapie, wymagane jest przyzwyczajenie do procedur iniekcji i określona pozycja trzymania). Szczep i wiek szczurów doświadczalnych to dwa inne wpływowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę przed planowaniem eksperymentu, aby uniknąć nieoptymalnych wyników. Różne szczepy szczurów mogą mieć różne zachowania i wyjściowe poziomy lęku 18,19,20, dlatego w zależności od zastosowanego szczepu może być wymagane specyficzne dostosowanie protokołu.

Potwierdzono, że protokół ten działa dobrze u transgenicznych szczurów Th-Cre ze szczepem Long-Evans czterokrotnie skrzyżowanym wstecznie ze szczepem Lister Hooded i dzikim typem Lister Hooded. Logicznie idealny wiek początkowy dla szczurów w eksperymentach behawioralnych to około 12 tygodni20, ale należy wziąć pod uwagę zmienność między szczepami i specyficzne wymagania zadania. Możliwe jest również wykorzystanie rozwijających się szczurów, jeśli jest to interesujące dla badania, chociaż mogą być wymagane korekty w protokole, które nie są tutaj uwzględnione. Jednak ważne jest, aby zastanowić się, czy szczur w danym wieku rozwinął funkcje poznawcze wymagane do skutecznego wykonania tego zadania. Badanie21 badające tę kwestię wykazało, że tylko dorastające szczury w 38. dniu po urodzeniu, a nie wcześniej, wykazywały allocentryczną pamięć przestrzenną odzwierciedloną w preferencji dla obiektu w nowej lokalizacji, jak zaobserwowano u dorosłych szczurów. Przedstawiony tutaj protokół okazał się skuteczny na szczurach, które miały 15-16 tygodni na początku pierwszej sesji kodowania/testu. Wcześniej ten sam protokół silnego kodowania dawał wyniki nieoptymalne lub ujemne przy użyciu 23-tygodniowych szczurów, które nie osiągnęły optymalnego poziomu przyzwyczajenia z powodu braku obsługi i przyzwyczajenia w wystarczająco młodym wieku. Szczury te albo nie zachowywały się inaczej niż na poziomie przypadku, albo w rzeczywistości wykazywały awersję do nowości, co zaobserwowano w kategoriach preferencji dla stabilnych obiektów zamiast obiektów przemieszczonych (dane nie pokazane). Wyniki te dostarczają dowodów na to, że wiek i czas obchodzenia się z habituacją mogą mieć wpływ na skuteczność habituacji, a w efekcie przyczyniać się do obserwacji zachowań lękowych i neofobicznych w testach.

W tym miejscu przedstawiono dwa różne protokoły, zapewniające silne lub słabe kodowanie w zadaniu lokalizacji obiektu. Podczas ustanawiania tych protokołów zaobserwowano, że zainteresowanie obiektami spadało po 5-10 minutach eksploracji podczas pojedynczych długich prób (np. 20-minutowego kodowania), a szczury ostatecznie przestały eksplorować. Powoduje to słabszą pamięć lokalizacji obiektów. Protokół kodowania, który przeplata próby kodowania krótkimi okresami odpoczynku (np. kodowanie 3 x 5 min), przezwycięża ten problem i prowadzi do wysokiej eksploracji podczas prób. Tak więc czas aktywnej eksploracji i różny układ tych dwóch protokołów kodowania wpływa na siłę pamięci, która jest silniejsza po kodowaniu 3 x 5 min niż po 20-minutowych protokołach kodowania. Podobne wyniki można również osiągnąć przy użyciu nieco innych czasów trwania w przypadku pojedynczych protokołów badania klinicznego w porównaniu z protokołami badania z przeplotem, a także można dokonać korekt w celu dostosowania do potrzeb badania i szczepu szczurów.

W przeciwieństwie do protokołów wykorzystujących zwykłe, białe, otwarte pole z tylko zewnętrznymi wskazówkami w pomieszczeniu, przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje arenę z odrębnymi kontekstami i wskazówkami wewnątrz labiryntu, które prawdopodobnie wymagają więcej czasu na naukę. W związku z tym zaleca się dodanie kroku habituacji kontekstu w protokole przed próbą kodowania. Pozwoli to szczurom na stworzenie mapy przestrzennej każdego kontekstu podczas habituacji i skróci czas trwania kolejnej próby kodowania, ponieważ szczury będą musiały zakodować tylko lokalizacje obiektów w odniesieniu do tej mapy. Co więcej, przyzwyczajenie do kontekstu pozwoli szczurom przyzwyczaić się do wszelkich możliwych dystraktorów w każdym kontekście, takich jak wskazówki przestrzenne 3D, minimalizując zachowania inne niż eksploracja obiektów w następnej sesji kodowania/testu. Dzięki wdrożeniu dokładnej metody równoważenia składającej się z kilku poziomów (tj. szerokiego zakresu kombinacji lokalizacji obiektów (liczników) i kierunku przemieszczenia obiektu), niepożądane preferencje, które mogą wzrosnąć z powodu różnic w natężeniu światła i kolorach/wzorach ścian w rogach areny, są zminimalizowane.

Podczas powtarzania zadania należy wziąć pod uwagę kilka czynników, aby zwiększyć powtarzalność między sesjami kodowania/testowego i zminimalizować wpływ powtórzeń. Po pierwsze, należy zaprojektować odrębne konteksty (tak wiele, jak liczba powtórzeń sesji kodowania/testów), aby uniknąć akumulacji pamięci przestrzennej, która może być spowodowana wykonywaniem powtarzających się sesji przy użyciu tego samego kontekstu. Aby to osiągnąć, użyto aparatu z wymiennymi ściankami o różnych kolorach i wzorach (ryc. 1B,C). Wyraźne ściany i obiekty 3D (takie jak zabawki lub małe przedmioty codziennego użytku o różnych kolorach i kształtach, patrz protokół i rysunek 1C) zawieszone na ścianach są przestrzennymi wskazówkami i punktami orientacyjnymi, których szczury potencjalnie używają do uczenia się lokalizacji obiektów w odniesieniu do ich kontekstów. W przypadku, gdy test nie wytworzy preferencji dla poruszanego obiektu, można rozważyć zmianę tych parametrów kontekstu (projekt ściany i wskazówki przestrzenne). Alternatywnie, do zadań związanych z lokalizacją obiektów można użyć areny w kształcie prostokąta lub koła zamiast kwadratowej areny, jak w tym protokole. Mówi się, że okrągłe areny eliminują preferencje dotyczące narożników22, które często obserwuje się na arenach z rogami, a zatem mogą być korzystne, gdy mamy do czynienia ze szczególnie niespokojnym szczepem szczurów lub myszy. Podczas gdy wymagania dotyczące tworzenia czterech odrębnych kontekstów w tym protokole działają najbardziej optymalnie w przypadku czworokątnego kształtu, okrągła arena może być również funkcjonalna po pewnych poprawkach.

Po drugie, odstępy czasu między każdą sesją kodowania/testowania powinny być określone w taki sposób, aby szczury za każdym razem zachowywały ten sam poziom zainteresowania, unikając jednocześnie ryzyka skumulowanego uczenia się wynikającego z gęstego harmonogramu powtórzeń. Zazwyczaj wystarczający jest interwał co najmniej dwukrotnie dłuższy niż czas opóźnienia między kodowaniem a próbami testowymi, przy czym dłuższe interwały są bardziej korzystne dla więcej niż dwóch powtórzeń. Oznacza to, że podczas gdy minimum 48-godzinny odstęp po 24-godzinnym teście jest wystarczający dla jednego lub dwóch powtórzeń, zaleca się stosowanie 1-tygodniowego odstępu dla czterech powtórzeń. Jak pokazują wyniki przedstawione na rysunku 5 oraz porównanie za pomocą ANOVA, zadanie można z powodzeniem powtórzyć czterokrotnie. Na tej podstawie ustalony protokół może być wykorzystany do zrównoważenia do czterech warunków eksperymentalnych. Liczba grup eksperymentalnych określa liczbę powtórzeń sesji kodowania/prób w różnych kontekstach. Wyniki przedstawione na rysunku 5 reprezentują jeden z możliwych sposobów wykorzystania protokołu z dwiema grupami eksperymentalnymi. Grupy zostały zrównoważone w dwóch sesjach, a te same warunki powtórzono w dwóch dodatkowych sesjach (dla celów walidacji). Drugi zestaw sesji z przeciwwagą może być również wykorzystany do zrównoważenia nowych warunków. Podobnie, trzy lub cztery warunki eksperymentalne mogą być porównane za pomocą odpowiednio trzech lub czterech sesji z przeciwwagą.

W takich przypadkach konteksty powinny być zaprojektowane tak, aby uwzględniały kontrastujące cechy opisane w protokole. Warto zauważyć, że konstrukcja z przeciwwagą może nie być odpowiednia dla eksperymentów, w których mają być stosowane dodatkowe manipulacje, takie jak interwencja farmakologiczna, która może pozostawić długotrwały efekt lub uszkodzenie. Aby utrzymać skuteczność i powtarzalność testów, eksperyment powinien być odpowiednio zaprojektowany. Dane z powtarzanych testów mogą być prezentowane i analizowane na kilka sposobów, jak pokazano na rysunku 5. W celu wstępnej analizy, grupy eksperymentalne w każdym kontekście mogą być indywidualnie porównane do poziomu szansy za pomocą testu t dla jednej próby w celu określenia wszelkich istotnych preferencji (Rysunek 5B,D). Może to być pomocne w szybkim zrozumieniu danych, ale zapewnia tylko pośrednie porównanie grup. Tak więc, aby porównać dwie lub więcej grup, dane należy analizować za pomocą testów t dla dwóch prób (sparowanych lub niesparowanych) lub odpowiednio ANOVA. Może to mieć formę międzyosobowego porównania grup w ramach jednej sesji kodowania/testu (Rysunek 4A i Rysunek 5B,D) lub wewnątrzobiektowego porównania grup z dwóch (lub więcej) równoważonych kontekstów (Rysunek 5C,E). Ta ostatnia metoda jest zdecydowanie zalecana, zwłaszcza gdy mamy do czynienia ze słabymi warunkami pamięci, co, jak wyjaśniono wcześniej, skutkuje dużą wariancją z powodu losowości w zachowaniu.

Połączenie zrównoważonych kontekstów prowadzi do powstania większych grup, które są zobowiązane do wiarygodnej wizualizacji zachowania grupy przy minimalnej zmienności. Stosując protokół z powtórzeniami w sesjach z przeciwwagą, można spodziewać się zmniejszenia liczby szczurów do około jednej trzeciej liczby, która byłaby wymagana przy użyciu pojedynczego testu o tej samej mocy statystycznej. Zwykle wystarczająca jest wielkość próby w zakresie od 7 do 15 szczurów (łącznie) dla sesji z przeciwwagą i w zakresie od 20 do 50 szczurów (od 10 do 25 na grupę) dla pojedynczej sesji, przy wielkości efektu i mocy większej niż 0,8. Zmniejszenie liczby potrzebnych zwierząt i wzrost informacji, które uzyskujemy od każdego zwierzęcia za pomocą tego protokołu, zarówno udoskonala badanie, jak i służy zasadom 3R etycznego wykorzystywania zwierząt w badaniach. Na tym etapie ważne jest, aby pamiętać, że losowe zachowanie szczurów, któremu nie towarzyszy silna pamięć, może skutkować indywidualnymi silnymi preferencjami zarówno poniżej, jak i powyżej szansy, ale średnia grupowa powinna dawać preferencję nie różniącą się znacząco od przypadku. Poszczególne dane należy interpretować ostrożnie. Rozkład poszczególnych punktów danych w grupie może być również pomocny w interpretacji wyników. Jak widać na rys. 4 i rys. 5, rozkład zmienia się w zależności od siły pamięci. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj protokół może być łatwo zastosowany w celu realizacji zadania lokalizacji obiektu z powtórzeniami w celu modelowania krótkotrwałej i/lub długotrwałej pamięci przestrzennej. Prosty i elastyczny protokół treningowy oraz możliwość wdrażania kolejnych manipulacji sprawiają, że zadanie to jest popularnym wyborem. Te modyfikacje protokołu umożliwiają badanie poszczególnych kroków, takich jak pozyskiwanie, konsolidacja i przywoływanie pamięci.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O'Hara i Davidowi Bettowi za wnikliwe komentarze i sugestie. Badanie to było wspierane przez program Erasmus+ (dla G.B. i L.N.); Graduate School of Health, Uniwersytet w Aarhus (do K.H.); Nagroda dla Młodego Badacza Fundacji Novo Nordisk 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) oraz PROMEMO - Center for Proteins in Memory, Centrum Doskonałości finansowane przez Duńską Narodową Fundację Badawczą (DNRF133) (do T.T.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pole otwarte/eksperymentalneO'Hara & Co (Japonia)OF-3001Otwarta skrzynka polowa do zadania lokalizacji obiektu
Obiekt 1: stożkiO'Hara & Co (Japonia)ORO-RR
Obiekt 2: piłki nożneO'Hara & Co (Japonia)ORO-RB
Obiekt 3: prostokątne blokiO'Hara & Co (Japonia)ORO-RCBloki prostokątne zostały zmodyfikowane po zakupie
Aparatura do zadań lokalizacji obiektówO'Hara & Co (Japonia)SPP-4501Skrzynka tłumiąca dźwięk, która zawiera skrzynkę otwartego pola do zadania lokalizacji obiektu
Oprogramowanie śledząceO'Hara & Co (Japonia)TimeSSIDo śledzenia ruchu i funkcji automatycznej kamery
Dziki typ Lister Szczury kapturoweCharles River603

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hughes, R. N. Neotic preferences in laboratory rodents: issues, assessment and substrates. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (3), 441-464 (2007).
  2. Blaser, R., Heyser, C. Spontaneous object recognition: a promising approach to the comparative study of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 183(2015).
  3. Dix, S. L., Aggleton, J. P. Extending the spontaneous preference test of recognition: evidence of object-location and object-context recognition. Behavioral Brain Research. 99 (2), 191-200 (1999).
  4. Barker, G. R., Warburton, E. C. When is the hippocampus involved in recognition memory. Journal of Neuroscience. 31 (29), 10721-10731 (2011).
  5. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  6. Gulinello, M., et al. Rigor and reproducibility in rodent behavioral research. Neurobiology of Learning and Memory. 165, 106780(2019).
  7. Rudeck, J., Vogl, S., Banneke, S., Schonfelder, G., Lewejohann, L. Repeatability analysis improves the reliability of behavioral data. PLoS One. 15 (4), 0230900(2020).
  8. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999(2017).
  9. Migues, P. V., et al. Blocking synaptic removal of GluA2-containing AMPA receptors prevents the natural forgetting of long-term memories. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3481-3494 (2016).
  10. Maingret, N., Girardeau, G., Todorova, R., Goutierre, M., Zugaro, M. Hippocampo-cortical coupling mediates memory consolidation during sleep. Nature Neuroscience. 19 (7), 959-964 (2016).
  11. Chao, O. Y., de Souza Silva, M. A., Yang, Y. M., Huston, J. P. The medial prefrontal cortex - hippocampus circuit that integrates information of object, place and time to construct episodic memory in rodents: Behavioral, anatomical and neurochemical properties. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 113, 373-407 (2020).
  12. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
  13. Witten, I. B., et al. Recombinase-driver rat lines: tools, techniques, and optogenetic application to dopamine-mediated reinforcement. Neuron. 72 (5), 721-733 (2011).
  14. Costa, R., Tamascia, M. L., Nogueira, M. D., Casarini, D. E., Marcondes, F. K. Handling of adolescent rats improves learning and memory and decreases anxiety. Journal of the American Association for Labaratory Animal Science. 51 (5), 548-553 (2012).
  15. Schmitt, U., Hiemke, C. Strain differences in open-field and elevated plus-maze behavior of rats without and with pretest handling. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 59 (4), 807-811 (1998).
  16. Kosten, T. A., Kim, J. J., Lee, H. J. Early life manipulations alter learning and memory in rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (9), 1985-2006 (2012).
  17. Denenberg, V. H., Grota, L. J. Social-seeking and novelty-seeking behavior as a function of differential rearing histories. Journal of Abnormal and Social Psychology. 69 (4), 453-456 (1964).
  18. Clemens, L. E., Jansson, E. K., Portal, E., Riess, O., Nguyen, H. P. A behavioral comparison of the common laboratory rat strains Lister Hooded, Lewis, Fischer 344 and Wistar in an automated homecage system. Genes, Brain, and Behavior. 13 (3), 305-321 (2014).
  19. Ennaceur, A., Michalikova, S., Bradford, A., Ahmed, S. Detailed analysis of the behavior of Lister and Wistar rats in anxiety, object recognition and object location tasks. Behavioral Brain Research. 159 (2), 247-266 (2005).
  20. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936-946 (2006).
  21. Contreras, M. P., Born, J., Inostroza, M. The expression of allocentric object-place recognition memory during development. Behavioral Brain Research. 372, 112013(2019).
  22. Yaski, O., Eilam, D. How do global and local geometries shape exploratory behavior in rats. Behavioral Brain Research. 187 (2), 334-342 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Object Location TaskSpatial MemoryWithin Subject DesignObject Place RecognitionRat BehaviorContext HabituationStrong EncodingWeak EncodingCounterbalanced DesignExploration Time

Related Articles