Artykuł metodologiczny

Wewnątrzprzedmiotowy projekt eksperymentalny wykorzystujący zadanie lokalizacji obiektu w szczurach

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62458

⸱

6 maja 2021

 ,  ,  , 
1Danish Research Institute of Translational Neuroscience (DANDRITE), Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Universitätsklinikum Würzburg, Institut für Klinische Neurobiologie, 3Translational Neuropsychiatry Unit, Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 4Faculty of Science, Radboud University, 5Center for Proteins in Memory - PROMEMO, Danish National Research Foundation, Department of Biomedicine, Aarhus University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zawiera szczegółowe kroki dla zadania lokalizacji obiektu z czterema powtórzeniami przy użyciu tej samej kohorty szczurów. Słabe i silne kodowanie może wytwarzać wspomnienia krótko- i długotrwałe. Elastyczność protokołu z powtarzaniem może być korzystna w badaniach obejmujących operacje chirurgiczne, oszczędzając czas i pracę.

Streszczenie

Rozpoznawanie miejsc obiektów jest główną metodą używaną do badania pamięci przestrzennej u gryzoni. Ta pamięć rozpoznawania miejsca obiektu stanowi podstawę zadania lokalizacji obiektu. Niniejszy artykuł zawiera obszerny protokół, który pomoże w ustaleniu zadania lokalizacji obiektu z opcją do czterech powtórzeń przy użyciu tej samej kohorty szczurów. Zarówno słabe, jak i silne protokoły kodowania mogą być wykorzystywane do badania krótko- i długoterminowych wspomnień przestrzennych o różnej sile oraz do umożliwienia realizacji odpowiednich manipulacji hamujących lub wzmacniających pamięć. Ponadto, powtórzenie testu z przedstawioną tutaj przeciwwagą pozwala na połączenie wyników z dwóch lub więcej testów w celu porównania wewnątrz obiektu w celu zmniejszenia zmienności między szczurami. Ta metoda pomaga zwiększyć moc statystyczną i jest zdecydowanie zalecana, szczególnie w przypadku przeprowadzania eksperymentów, które powodują dużą zmienność indywidualnych zachowań. To bezpośrednio udoskonala badanie poprzez zwiększenie ilości danych uzyskanych od każdego zwierzęcia i zmniejszenie ogólnej liczby potrzebnych zwierząt. Wreszcie, realizacja zadania polegającego na powtarzalnej lokalizacji obiektu zwiększa efektywność badań, które obejmują zabiegi chirurgiczne, oszczędzając czas i pracę.

Wprowadzenie

Spontaniczne zadania rozpoznawania (np. rozpoznawanie obiektów, rozpoznawanie miejsc obiektów) były wykorzystywane w dużym stopniu w badaniu pamięci u gryzoni. Testy te różnią się od różnych testów używanych do oceny pamięci, które opierają się na warunkowaniu strachu lub motywacji nagrody, w tym, że spontaniczne zadania rozpoznawania opierają się wyłącznie na spontanicznym zachowaniu eksploracyjnym w kierunku nowych bodźców. To zachowanie, określane jako 'preferencja neotyczna'1, jest nieodłączne dla gryzoni, jak również dla innych gatunków ssaków i niektórych nie-ssaków, takich jak ptaki i ryby2. Rozpoznawanie miejsca obiektu, które zależy od pamięci przestrzennej, można obserwować za pomocą zadania lokalizacji obiektu (znanego również jako zadanie rozpoznawania obiektów przestrzennych)3. Badania nad zmianami chorobowymi wykazały, że rozpoznawanie miejsc obiektów wymaga nienaruszonego hipokampa4,5. Ze względu na stosunkowo prosty protokół treningowy i brak jakiegokolwiek wzmocnienia, zadanie to jest preferowane w wielu badaniach. Brak zarówno pozytywnego, jak i negatywnego wzmocnienia minimalizuje dodatkowe parametry i obszary mózgu, które mogą kierować zachowaniem. W związku z tym zachowanie tutaj jest neutralne i opiera się na ciekawości i pamięci przestrzennej, co pozwala na badanie mechanizmów, które są zaangażowane w kodowanie, konsolidację i odzyskiwanie pamięci przestrzennej.

Protokół zadania lokalizacji obiektów zazwyczaj składa się z sesji habituacji, po których następuje pojedyncza sesja kodowania i prób testowych, oddzielonych okresem opóźnienia, który waha się od kilku minut do godzin. Zdecydowanie zaleca się, aby szczury były traktowane wcześniej, aby zminimalizować poziom stresu zwierząt, a co za tym idzie, zachowanie, które może wpływać na pamięć rozpoznawczą, takie jak niechęć do nowości. Podobnie, dobrze zaprojektowany protokół habituacji odgrywa istotną rolę w zapobieganiu stresowi, który może utrudniać naturalne zachowanie szczura podczas zadania. Jednak zakres obsługi i przyzwyczajenia różni się znacznie między laboratoriami i eksperymentatorami, co może przyczyniać się do niskiej powtarzalności6,7,8. W próbie kodowania szczur ma czas na zbadanie areny z dwoma identycznymi obiektami umieszczonymi w dwóch wyznaczonych rogach. W próbie testowej, która jest opóźniona o pewien okres, szczur ma czas na zbadanie areny za pomocą tej samej pary obiektów, ale tym razem jeden z nich został przeniesiony w nowe miejsce. Spontaniczna preferencja wykazywana przez szczury i wynikający z niej wzrost czasu spędzonego na eksploracji obiektu w nowej lokalizacji wskazują na rozpoznanie przestrzenne i pamięć lokalizacji obiektów3. Modyfikacja próby kodowania (czas trwania i liczba powtórzeń) wpływa na siłę pamięci.

W zależności od celu badania, długość opóźnienia między kodowaniem a próbami testowymi może być modyfikowana w celu modelowania pamięci krótkotrwałej niezależnej od syntezy białek lub pamięci długotrwałej zależnej od syntezy białek. W związku z tym zadanie lokalizacji obiektu może być wykorzystywane do wielu różnych badań, dostosowując protokół w razie potrzeby. Co więcej, między tymi badaniami możliwe jest również zastosowanie manipulacji eksperymentalnych, takich jak interwencje farmakologiczne i optogenetyczne, podobnie jak obrazowanie in vivo. Istnieje kilka badań9,10, które informują o powtarzających się iteracjach zadania lokalizacji obiektów w tej samej kohorcie szczurów. Kontrastuje to z tradycyjnym zastosowaniem, w którym jedno zwierzę ma jedną sesję bez powtórzeń. Jednak skuteczność tych paradygmatów nie została dokładnie zbadana, ani nie ma żadnych prac metodycznych je opisujących. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwszy zgłoszony opis protokołu, który szczegółowo opisuje zadanie lokalizacji obiektu z maksymalnie czterema powtórzeniami przy użyciu tej samej kohorty szczurów, która również systematycznie porównuje wyniki z każdego powtórzenia. Powtórzenia mogą być wykorzystane do zrównoważenia warunków eksperymentalnych, aby umożliwić porównanie wewnątrz obiektu ze zmniejszoną zmiennością między testami. Niezawodna powtarzalność zadania pozwala na łączenie danych, co oznacza, że wystarczająco duża ilość danych może zostać wygenerowana przy użyciu stosunkowo niewielkiej liczby szczurów. Wreszcie, powtórzenia z użyciem tego samego szczura mogą być korzystne w eksperymentach obejmujących operacje chirurgiczne i implantacje, zmniejszając liczbę wymaganych szczurów, co w konsekwencji oszczędza czas i koszty pracy.

To badanie przedstawia obszerny protokół szczegółowo opisujący, jak wykonać zadanie lokalizacji obiektów u dorosłych szczurów za pomocą prób silnego i słabego kodowania, a następnie prób testowych z opóźnieniami 1-godzinnymi i 24-godzinnymi. Protokół silnego kodowania wytwarza statystycznie istotną pamięć rozpoznawczą podczas testowania z opóźnieniami 1-godzinnymi i 24-godzinnymi, a zatem może być używany do badania zarówno wspomnień krótkotrwałych, jak i długotrwałych po zastosowaniu manipulacji w celu zahamowania tych wspomnień11. W przeciwieństwie do tego, słaby protokół kodowania generuje znaczną ilość pamięci krótkotrwałej tylko wtedy, gdy jest testowany z 1-godzinnym opóźnieniem. Brak pamięci długotrwałej może być wykorzystany do badania manipulacji w celu zwiększenia zapamiętywania pamięci11,12. Protokół ten obejmuje również szczegółowe sesje obsługi i habituacji, które mają na celu zwiększenie możliwości powielania zadania lokalizacji obiektu. Artykuł ten pokazuje również powtórzenie zadania w czterech różnych kontekstach z tą samą kohortą szczurów przy użyciu protokołu słabego kodowania, który potwierdza, że za każdym razem daje powtarzalne i spójne wyniki.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez duńskie organy krajowe (numer licencji: 2018-15-0201-01405) zgodnie z duńskimi oraz unijnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt.

1. Układ doświadczalny i przygotowanie różnych kontekstów

  1. Arena lokalizacji obiektu z kontekstem
    UWAGA: Poniższa konfiguracja została zademonstrowana w zamkniętym wygłuszonym boksie (Rysunek 1B) z źródłem światła rozmieszczonym wzdłuż krawędzi sufitu oraz kamerą umieszczoną w centrum sufitu pudła. Arena o wymiarach 60 cm x 60 cm posiada ściany o wysokości 100 cm (Rysunek 1B), jest umieszczana wewnątrz boksu i całkowicie odizolowana od otaczającego pomieszczenia. Wszystkie wskazówki przestrzenne znajdują się wewnątrz areny. Upraszcza to proces tworzenia odrębnych kontekstów. Podobny poziom izolacji od otaczającego pomieszczenia można osiągnąć, otaczając standardową arenę typu open-field jednolitym ekranem wokół ścian.
    1. Należy przygotować kwadratową arenę wykonaną z nieprzezroczystego, nieporowatego tworzywa sztucznego o szerokości minimum 60 cm i wysokości minimum 50 cm. Należy dobrać kolor podłogi kontrastujący z kolorem szczura, aby umożliwić prawidłową rejestrację ruchów zwierzęcia przez oprogramowanie automatyczne (jeśli jest ono stosowane). Arenę należy umieścić wewnątrz pudełka (Rysunek 1B) lub na platformie osłoniętej zasłoną.
    2. Aby stworzyć kontekst, należy uzyskać drugą warstwę ścian wkładanych (np. okładzina ścienna wykonana z tego samego materiału co arena lub plastikowa tapeta, którą można łatwo czyścić) w różnych kolorach i/lub wzorach (np. czarne, białe, w paski lub w kropki). Wstaw do areny drugą warstwę ścian w taki sposób, aby były one od siebie wyraźnie oddzielone.
    3. Przygotuj trójwymiarowe (3D) wskazówki przestrzenne (1-2 na kontekst) o wymiarach od 10 cm x 10 cm x 5 cm do 20 cm x 15 cm x 15 cm (szerokość x długość x wysokość), które posiadają (i) odrębne kształty geometryczne oraz (ii) kolory kontrastujące z kolorem ścian. Zawieś je na ścianach na wysokości uniemożliwiającej szczurom dostęp do tych wskazówek.
    4. Należy przygotować różne pary obiektów (w liczbie odpowiadającej liczbie określonej w kontekście), które są nieporowate, niepodatne na przegryzienie i łatwe do czyszczenia. Należy dążyć do tego, aby każdy nowy obiekt posiadał odmienny kształt geometryczny i teksturę. Należy wybrać obiekty o szerokości i wysokości od 5 do 15 cm (należy unikać obiektów o większej wysokości). Patrz Rycina 1D dla przykładów czterech różnych obiektów (stożków, piłek do futbolu amerykańskiego, graniastosłupów prostokątnych i graniastosłupów trójkątnych).
      UWAGA: Każdy obiekt powinien być dla szczurów równie atrakcyjny, aby całkowity czas eksploracji wszystkich obiektów był porównywalny.
    5. Znajdź najlepsze rozwiązanie do mocowania obiektów na dnie areny (np. przy użyciu mat lepko-adhezyjnych, taśmy dwustronnej, przymocowania metalowej płytki pod obiektem oraz magnesa parującego pod areną itd.).
    6. Tworząc kolejny kontekst, należy odtworzyć ściany w taki sposób, aby kontrastowały one z rozkładem kolorów i wzorów ścian z poprzedniego kontekstu (kontekstów). Należy zastosować nowe wskazówki przestrzenne 3D, które różnią się od wszystkich poprzednich wskazówek i stanowią dla nich kontrast. Patrz Rysunek 1C dla przykładów czterech odrębnych kontekstów.
    7. Należy zapewnić źródło światła, które zagwarantuje rozproszone i równomierne oświetlenie wewnątrz areny oraz posiada funkcję ściemniacza. Po stworzeniu każdego kontekstu należy dostosować natężenie światła do poziomu około 100–120 luksów w narożnikach areny. Należy przygotować kamerę i umieścić ją na środku sufitu skrzynki.
      UWAGA: Natężenie światła można zmniejszyć, jeśli nie jest używane zautomatyzowane oprogramowanie do oceny wyników.
  2. Kubełek na obiekty
    1. Przygotuj wiadro (>(50 cm średnicy). Nie należy wybierać kształtu kwadratowego, aby uniknąć jakiegokolwiek podobieństwa do areny eksperymentalnej. Wypełnić go materiałem ścielącym.
    2. Przygotuj 5–10 obiektów o różnych kształtach i rozmiarach (innych niż obiekty, które zostaną wykorzystane w eksperymencie) i umieść je wszystkie w sposób losowy w wiadrze (Rycina 1A).

Eksperyment rozpoznawania obiektów ze zdjęciami konfiguracji, wariantami kontekstu i odrębnymi obiektami do analizy.
Rysunek 1: Konfiguracja eksperymentalna, obejmująca cztery odrębne konteksty i obiekty. (A) Pojemnik z obiektami do habituacji do obiektów. (B) Aparatura eksperymentalna (lewo), obejmująca arenę z lokalizacją obiektu, kamerę i źródło światła. Pudełko eksperymentalne i arena przed konfiguracją kontekstu (środek) oraz arena po konfiguracji kontekstu (prawo). (C) Cztery konteksty (1-4) z odrębnymi kolorami i wzorami ścian oraz trójwymiarowymi wskazówkami przestrzennymi. (D) Cztery obiekty wykorzystywane odpowiednio w kontekstach 1-4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Kamera i oprogramowanie do śledzenia (opcjonalnie)
    1. Należy pozyskać oprogramowanie umożliwiające zdalne sterowanie rejestratorem kamery oraz śledzenie nosów szczurów. Przed każdym eksperymentem należy dostosować ustawienia oprogramowania do każdego konkretnego kontekstu i szczepu szczurów.
  2. Kontrbalansowanie lokalizacji obiektów i grup eksperymentalnych
    1. Przygotuj możliwe kombinacje lokalizacji obiektów dla prób kodowania i testowych, nazywając je kontrami. Stwórz kombinacje w taki sposób, aby obejmowały wszystkie narożniki jako lokalizacje obiektów, a także przemieszczanie obiektów z narożników sąsiednich do diagonalnych i na odwrót (Rycina 2A).
    2. Przygotuj harmonogram dla konkretnego eksperymentu, przypisując każdego szczura w jednej grupie eksperymentalnej do odpowiedniej kontry. Jeśli liczba szczurów jest wystarczająca, wykorzystaj każdą parę z dwóch powiązanych kontr (Rycina 2A) w obrębie jednej grupy. Użyj tego samego zestawu kontr dla obu grup eksperymentalnych w jednej sesji kodowania/testowania (Rycina 2B). Przypisz kontry na nowo w kolejnych sesjach (tj. dla każdego nowego kontekstu).
      UWAGA: W czasie sesji kodowania/testowania przeprowadzaj próby ze szczurami w mieszanej kolejności (np. nie przeprowadzaj kolejno wszystkich szczurów z jednej klatki; zamiast tego rotuj klatki, aby zapewnić spokojne środowisko w klatkach zawierających więcej niż jednego szczura).
    3. W przypadku stosowania dwóch lub więcej kontekstów w celu kontrbalansowania grup eksperymentalnych (np. grup pamięci 1-godzinnej względem grup pamięci 24-godzinnej), przypisz szczury do każdej grupy, a następnie zamień grupy w kolejnych kontekstach (Rycina 2B).

Schemat kodowania i testowania liczników, z tabelą sesji; analiza danych w badaniu behawioralnym.
Rysunek 2: Reprezentatywne metody kontrbalansowania. (A) Możliwe orientacje obiektów w arenie podczas prób kodowania i testowania są nazywane licznikami. Obiekt 1 jest zawsze obiektem ruchomym. Każde dwa liczniki są kontrbalansowane w taki sposób, aby zmieniała się lokalizacja obiektu ruchomego. Każdy róg jest zajmowany dwukrotnie, a obiekt 1 jest przenoszony z pozycji przekątnej na sąsiednią i na odwrót taką samą liczbę razy. (B) Przykład harmonogramu kodowania/testowania dla dwóch kontrbalansowanych sesji (np. konteksty 1 i 2). Szczury są przypisane do warunków eksperymentalnych w kontekście 1 (sesja X, lewo). Zbiór par liczników (tj. 1-2, 3-4, 5-6 oraz 7-8) zostaje wybrany i przypisany każdemu szczurowi w jednej grupie eksperymentalnej. Ten sam zestaw liczników jest przypisany szczurom w obu grupach eksperymentalnych. W następnej sesji w kontekście 2 (sesja X+1; prawo), szczury w grupach eksperymentalnych są zmieniane w celu kontrbalansowania i przypisywany jest nowy zestaw par liczników. Należy odnotować czas rozpoczęcia prób kodowania i testowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: Wszystkie czynności związane z obsługą, habituacją oraz sesje kodowania i testowania w niniejszym protokole zostały zoptymalizowane podczas fazy jasnej 12-godzinnego cyklu światło/ciemność, w związku z czym zaleca się przeprowadzanie eksperymentów w fazie jasnej.

2. Obsługa i habituacja

  1. Rozpocząć oswojenie szczurów albo od momentu odsadzenia (jeśli szczury są hodowane w jednostce), albo na 2-3 tygodnie przed rozpoczęciem eksperymentów (w przypadku zamówienia szczurów z zewnętrznej jednostki, po zapewnieniu im jednego tygodnia na aklimatyzację po przyjeździe).
  2. Przez 2 lub 3 dni w tygodniu poświęcać co najmniej 10-15 min na każdą klatkę zawierającą 4 szczury, aż zwierzęta poczują się komfortowo podczas dotykania i podnoszenia przez eksperymentatora. Dostosować czas przeznaczony na każdą klatkę w zależności od liczby szczurów w klatce.
    UWAGA: Ważne jest, aby wszyscy eksperymentatorzy planujący pracę ze szczurami byli obecni podczas oswojenia.
  3. W przypadkach, gdy oswojenie rozpoczyna się w momencie odsadzenia, można ograniczyć częstotliwość manipulacji do minimum (opcjonalnie) po osiągnięciu tego etapu. Jeśli oswojenie rozpoczęto na 2-3 tygodnie przed eksperymentami, kontynuować procedurę aż do rozpoczęcia sesji habituacji.
  4. Przenosić szczury w klatkach do pomieszczenia eksperymentalnego, aby przyzwyczaić je do transportu oraz do samego pomieszczenia. Pozostawić szczury na co najmniej 30 min, aby mogły się uspokoić i zaadaptować. Po tym czasie zwrócić szczury i klatki do pomieszczenia hodowlanego.
    UWAGA: Krok 2.4 można połączyć z oswojeniem i powtarzać tyle razy, ile jest to konieczne. Na tym etapie można wprowadzić dodatkową habituację, jeśli protokół obejmuje dalsze manipulacje (np. oswojenie do procedury iniekcji itp.).
  5. Przeprowadzić habituację do obiektów, aby przyzwyczaić szczury do interakcji z przedmiotami i zredukować ogólny poziom stresu wynikający z kontaktu z nowym środowiskiem.
    1. Podczas sesji 1 przenieść wszystkie klatki macierzyste do pomieszczenia eksperymentalnego i pozwolić szczurom na aklimatyzację w pomieszczeniu przez co najmniej 30 min. Umieścić szczury (2-4 osobniki) z tej samej klatki razem w wiadrze na 20 min. Czyścić wiadro, usuwając odchody pomiędzy każdą grupą szczurów. Powtórzyć procedurę dla wszystkich klatek. Umieścić wszystkie szczury w klatkach macierzystych i przenieść je do pomieszczenia hodowlanego.
    2. Podczas sesji 2, w innym dniu, przenieść wszystkie klatki do pomieszczenia eksperymentalnego i pozostawić je tam na co najmniej 30 min. Umieszczać każdego szczura indywidualnie w wiadrze przez 10 min. Umieścić szczura z powrotem w klatce macierzystej i wyczyścić wiadro po każdym zwierzęciu. Zwrócić wszystkie klatki do pomieszczenia hodowlanego.
    3. Podczas sesji 3 powtórzyć krok 2.5.2 w innym dniu.
  6. Jeśli aparatura eksperymentalna jest zamkniętym boksem (Rysunek 1B), można zdecydować się na habituację do pustego boksu, aby przyzwyczaić szczury do nowego urządzenia. W sesji 4 przenieść wszystkie klatki do pomieszczenia eksperymentalnego i pozostawić je tam na co najmniej 30 min. Umieścić szczury z tej samej klatki razem (2-4 szczury) w pustej arenie bez kontekstu ani wskazówek przestrzennych (Rysunek 1B, środek) na 20 min. Umieścić wszystkie szczury z powrotem w klatce macierzystej i przetrzeć arenę 70% ethanolem po każdej grupie szczurów.
    UWAGA: Kroki 2.5 i 2.6 powinny zostać przeprowadzone w jednym tygodniu, poprzedzającym tydzień habituacji do kontekstu (krok 2.7; patrz Rysunek 3). Dopuszczalna jest przerwa kilku dni podczas tych kroków. Jednak po rozpoczęciu kroku 2.7 każdy kolejny etap powinien być wykonywany w następnych dniach zgodnie z opisem, aż do zakończenia próby testowej (krok 2.9).
  7. Przeprowadzić habituację do kontekstu, aby przyzwyczaić szczury do otoczenia i wskazówek 3D, zredukować ogólny poziom stresu oraz wesprzeć przestrzenną naukę środowiska.
    1. Zmodyfikować pustą arenę, aby stworzyć pierwszy kontekst zgodnie z opisem w sekcji 1.1, ale nie umieszczać w arenie obiektów. Przygotować sprzęt rejestrujący.
    2. Podczas sesji 1 przenieść wszystkie klatki do pomieszczenia eksperymentalnego i pozostawić je tam na co najmniej 30 min. Uruchomić rejestrator, jeśli jest obsługiwany ręcznie. Umieścić pierwszego szczura w centrum areny i pozwolić mu na eksplorację przez 10 min. Następnie zatrzymać rejestrator (jeśli manualny) i umieścić szczura z powrotem w klatce macierzystej. Dokładnie przetrzeć arenę 70% ethanolem po każdym szczurze, a po zakończeniu zwrócić wszystkie klatki do pomieszczenia hodowlanego.
    3. W sesjach 2 i 3 powtórzyć krok 2.7.2 dla każdego szczura przez dwa kolejne dni, tak aby łącznie przeprowadzono 3 sesje habituacji do kontekstu dla każdego szczura.
      UWAGA: Warto rozważyć zmianę kolejności wprowadzania szczurów do areny, szczególnie w przypadku dużej grupy. Pozwala to uniknąć wielokrotnego testowania tych samych osobników o tej samej porze dnia.

Schemat procesu habituacji i kodowania; układ eksperymentalny dla badania zachowania zwierząt w ciągu dwóch tygodni.
Rycina 3: Projekt eksperymentu behawioralnego obejmujący protokoły obchodzenia się z zwierzętami, habituacji oraz zadania lokalizacji obiektów. Szczury powinny być regularnie obchodzone poczynając od kilku tygodni przed tygodniem habituacji. W tygodniu 0 przeprowadzane są 4 sesje habituacji do obiektów i boksu eksperymentalnego w odstępach co najmniej 24 h. W tygodniu 1 habituacja do kontekstu odbywa się podczas 3 kolejnych sesji w odstępach 24-godzinnych, po których następują próby kodowania i testowe. Przed przejściem do następnej sesji powinien upłynąć okres minimum 48 h, a maksymalnie 1 tydzień (np. rozpoczęcie habituacji do kolejnego kontekstu w tygodniu 2 lub 3). Skrót: Hab., habituacja. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Próba kodowania (Sesja 4)
    UWAGA: W przypadku manipulacji farmakologicznych, odpowiedni czas podania preparatu może przypadać przed lub bezpośrednio po próbie(ach) kodowania i/lub przed próbą testową, w zależności od właściwości agenta farmakologicznego.
    1. Przenieść wszystkie klatki do pomieszczenia eksperymentalnego i pozostawić na co najmniej 30 min. Zgodnie z wcześniej przygotowanym harmonogramem (Rysunek 2B), umieścić pierwszą parę identycznych obiektów w wyznaczonych miejscach (w dwóch narożnikach, w odległości >10 cm od każdej z odpowiednich ścian; w celu zachowania tej samej odległości za każdym razem można użyć kawałka tektury w kształcie litery L), mocując je za pomocą mat klejących lub taśmy dwustronnej.
    2. Uruchomić rejestrator (jeśli jest obsługiwany ręcznie). Umieścić pierwszą szczurzą w arenie, przodem do ściany lub narożnika niezajętego przez żaden z obiektów (zachowując równą odległość od każdego obiektu).
      UWAGA: W zależności od wybranego wariantu kodowania (słabego lub silnego), należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
    3. Dla kodowania słabego (1 próba), pozwolić szczurowi na eksplorację areny i obiektów przez 20 min. Następnie zatrzymać rejestrator (jeśli jest obsługiwany ręcznie) i umieścić szczura z powrotem w klatce domowej. Usunąć obiekty, a następnie dokładnie przetrzeć oba obiekty oraz arenę 70% etanolem.
    4. Powtórzyć krok 2.8.3 dla wszystkich szczurów, tak aby każdy osobnik przeszedł 1 próbę kodowania trwającą 20 min.
    5. Dla kodowania silnego (3 próby), pozwolić szczurowi na eksplorację areny i obiektów przez 5 min. Następnie zatrzymać rejestrator (jeśli jest obsługiwany ręcznie) i umieścić szczura z powrotem w klatce domowej. Nie usuwać obiektów. Przetrzeć arenę i obiekty 70% etanolem.
    6. Powtórzyć krok 2.8.5 jeszcze dwa razy z tym samym szczurem, tak aby w sumie przeprowadzono 3 próby. Po upływie czasu umieścić szczura z powrotem w klatce domowej. Usunąć obiekty w celu dokładnego czyszczenia i przetrzeć obiekty oraz arenę 70% etanolem.
      UWAGA: Interwał między próbami dla jednego szczura powinien wynosić około 1-2 min.
    7. Powtórzyć kroki 2.8.5-2.8.6 dla każdego szczura.
    8. Jeśli czas opóźnienia jest krótszy niż 24 h, pozostawić klatki w pomieszczeniu eksperymentalnym do czasu próby testowej. W przeciwnym razie, po zakończeniu, zwrócić wszystkie klatki do pomieszczenia z klatkami.
  2. Próba testowa (Sesja 4)
    UWAGA: Okres opóźnienia należy liczyć od początku próby kodowania.
    1. W przypadku opóźnienia wynoszącego 24 h (lub każdego innego opóźnienia wymagającego przeprowadzenia próby testowej następnego dnia), przenieść wszystkie klatki do pomieszczenia eksperymentalnego z odpowiednim wyprzedzeniem przed pierwszym testem, tak aby szczury mogły pozostać w pomieszczeniu przez co najmniej 30 min. Zgodnie z harmonogramem, umieścić obiekty w wyznaczonych miejscach (jeden z obiektów w nowej lokalizacji).
    2. W wyznaczonym czasie uruchomić rejestrator (jeśli jest obsługiwany ręcznie). Umieścić pierwszego szczura w arenie, przodem do ściany lub narożnika niezajętego przez żaden z obiektów (zachowując równą odległość od każdego obiektu).
    3. Pozwolić szczurowi na eksplorację areny i obiektów przez 5 min. Następnie zatrzymać rejestrator (jeśli jest obsługiwany ręcznie). Umieścić szczura z powrotem w klatce domowej. Usunąć obiekty i dokładnie przetrzeć oba obiekty oraz arenę 70% etanolem.
    4. Powtórzyć kroki 2.9.2-2.9.3 dla każdego szczura. Zwrócić wszystkie klatki do pomieszczenia z klatkami.
      ​UWAGA: W każdej kolejnej sesji kodowania/testowania należy rozpocząć protokół habituacji od kroku 2.7 (habituacja kontekstowa) po odstępie co najmniej 48 h i maksymalnie 1 tygodnia.

3. Analiza danych

  1. Dla każdego szczura oceń czas eksploracji każdego obiektu w próbach kodowania i testowych, korzystając z oprogramowania przeznaczonego do tego celu lub metodą manualną. Oceń próby kodowania przez cały ich czas trwania. Oceń próby testowe przez 2 min, aby uzyskać najlepsze wyniki dyskryminacji3. W przypadku stosowania zautomatyzowanego oprogramowania do oceny online, wyeksportuj dane z programu.
  2. Czas eksploracji licz, gdy szczur ma kontakt z obiektem, węszy przy nim lub jest zwrócony w stronę obiektu w odległości mniejszej niż 2 cm. Wspinanie się i siedzenie na obiekcie uznaj za eksplorację, chyba że uwaga szczura wydaje się być skierowana gdzie indziej niż na obiekt (np. patrzenie w stronę przeciwną do obiektu).
  3. Oblicz całkowity czas eksploracji obu obiektów dla każdego szczura. Rozważ wykluczenie z testu każdego szczura, którego całkowity czas eksploracji w próbie testowej (przy ocenie przez 2 min) był krótszy niż 10 s, ponieważ może to odzwierciedlać niewiarygodną eksplorację.
  4. Oblicz procent eksploracji każdego obiektu (równanie 1) lub indeks dyskryminacji (DI) dla każdego szczura (równanie 2), a następnie oblicz wartości średnie dla grup.
    Wzór na procent eksploracji, przedstawione równanie stosowane w eksperymentach z analizy behawioralnej. (1)
    Wzór na indeks dyskryminacji, stosunek eksploracji obiektu nowego do stabilnego, analiza behawioralna.
    UWAGA: Jeśli procent eksploracji wynosi 50% lub DI wynosi 0, oznacza to, że wynik znajduje się na poziomie przypadku i szczur nie wykazuje preferencji wobec żadnego z obiektów. Średni procent eksploracji i DI podczas prób kodowania powinny wynosić odpowiednio około 50% lub 0. Każdy szczur wykazujący preferencję wyższą niż [średnia ± (2 × SD)] dla któregokolwiek z obiektów w próbie kodowania powinien zostać wykluczony z analizy odpowiedniego testu. Pozwala to na wiarygodną interpretację preferencji w próbie testowej jako pamięci o lokalizacji stabilnego obiektu. Wartość tę można obliczyć dla pojedynczego testu lub dla połączonych danych z kodowania z kilku testów.
  5. Przeanalizuj dane metodą najlepiej dopasowaną do układu eksperymentalnego. Użyj jednopróbkowego testu t w celu wykrycia istotnej preferencji powyżej poziomu przypadku.
  6. W przypadku stosowania więcej niż jednego kontekstu z kontrbalansem, połącz wyniki tej samej warunki eksperymentalnej we wszystkich kontekstach.
    UWAGA: Pozwoli to na utworzenie grup składających się z tych samych szczurów, co umożliwi porównania wewnątrzobiektowe przy użyciu testu t dla prób zależnych dla dwóch grup oraz analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami dla więcej niż dwóch grup.

Wyniki

Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki dla protokołów kodowania silnego i słabego, opisanych z użyciem samców szczurów transgenicznych tyrozynohydroksylazy (Th)-Cre13 szczepu Long-Evans, wstecznie skrzyżowanych czterokrotnie ze szczepem Lister Hooded, oraz szczurów typu dzikiego Lister Hooded. Wykorzystano szczury transgeniczne Th-Cre, ponieważ linia ta będzie stosowana w przyszłych badaniach z zakresu optogenetyki. W każdym protokole pamięć testowano z opóźnieniem 1 i 24 h. Testy po 1 h obrazują pamięć krótkotrwałą, natomiast testy po 24 h obrazują pamięć długotrwałą. Wartość wykluczająca dla preferencji kodowania została obliczona zgodnie z opisem w protokole, na podstawie połączonych danych z pięciu testów (protokoły kodowania silnego i słabego) jako [50,8% ± (2×10,8%)]. Szczury, których preferencja kodowania znajdowała się powyżej lub poniżej tych wartości, zostały wykluczone z analiz odpowiednich testów.

Do eksperymentów z silnym kodowaniem wykorzystano 16 szczurów, a do eksperymentów ze słabym kodowaniem 19 szczurów. Podczas prób silnego kodowania (kodowanie 3 × 5 min; Rysunek 4A) nie stwierdzono istotnej preferencji dla żadnego z obiektów (52,0 ± 1,9%, n = 16, t15 = 1,1, p = 0,29; test t dla jednej próby względem poziomu przypadku). Ten protokół silnego kodowania doprowadził do preferencji obiektu w nowej lokalizacji, co objawiło się średnią procentową eksploracją, która była istotnie wyższa od poziomu przypadku (50%) w testach z opóźnieniem 1 h oraz 24 h (pamięć 1-h, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t7 = 11,8, p < 0,001; pamięć 24-h, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t7 = 2,8, p = 0,025; test t dla jednej próby względem poziomu przypadku). Nie stwierdzono istotnej różnicy między pamięcią 1-h a 24-h (p = 0,056; nieparzysty test t Welcha).

Podczas prób z słabym kodowaniem (kodowanie przez 20 min; wyniki z czterech kontekstów połączone; Rysunek 4B) nie stwierdzono istotnej preferencji dla żadnego z obiektów (51,1 ± 1,0%, n = 66, t65 = 1,2, p = 0,24; test t dla jednej próby względem poziomu przypadkowego). Ten protokół słabego kodowania spowodował istotny wzrost preferencji dla obiektu w nowej lokalizacji w porównaniu z poziomem przypadkowym w testach z opóźnieniem 1 h, ale nie w testach z opóźnieniem 24 h (połączone dane z wszystkich czterech kontekstów; pamięć 1-h, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t31 = 8,2, p < 0,001; pamięć 24-h, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t33 = 0,16, p = 0,87; test t dla jednej próby względem poziomu przypadkowego). Stwierdzono istotną różnicę między wynikami w testach z opóźnieniem 1 h i 24 h (pamięć 1-h: n = 32, pamięć 24-h: n = 34, t61,5 = 5,2, p < 0,001; nieparzysty test t Welcha).

Pamięci na poziomie grupy nie zaobserwowano w teście z 24-godzinną przerwą, co wskazywały wyniki na poziomie przypadku, jednak odnotowano różnice międzyosobnicze. Tak większa zmienność w warunkach słabej lub braku pamięci (np. test po 24 h) jest powszechnie obserwowana ze względu na bardziej losową eksplorację obiektów. Dlatego ważne jest, aby nie interpretować wyników poszczególnych szczurów indywidualnie. Zamiast tego, rozkład indywidualnych punktów danych można wykorzystać wraz ze średnią grupową jako wiarygodny wynik testu. Im silniejsze kodowanie, tym bardziej jednorodne staje się zachowanie szczurów i tym mniejsza liczba zwierząt jest potrzebna do osiągnięcia istotności statystycznej, co można zaobserwować na Rysunku 4A dla protokołu silnego kodowania. W przeciwieństwie do tego, w przypadku warunków słabych niezbędne są większe grupy w celu uzyskania wiarygodnych wyników (Rysunek 4B).

Schemat kodowania pamięci z wykresami słupkowymi porównującymi czas eksploracji przy silnym i słabym kodowaniu.
Rycina 4: Wydajność pamięci po silnym i słabym kodowaniu. (A) Próba silnego kodowania (kodowanie 3 × 5 min), po której nastąpiły próby testowe po 1 h lub 24 h. Podczas prób kodowania nie stwierdzono istotnej preferencji żadnego z obiektów (n = 16). Silne kodowanie spowodowało istotny wzrost preferencji obiektu w nowym miejscu w testach z opóźnieniem 1 h oraz 24 h w porównaniu do poziomu przypadkowego (pamięć 1 h i 24 h: n = 8 w każdej grupie). Nie stwierdzono istotnych różnic między grupami. (B) Próba słabego kodowania (kodowanie 20 min), po której nastąpiły próby testowe po 1 h lub 24 h. Podczas prób kodowania nie stwierdzono istotnej preferencji żadnego z obiektów w skali grupy (n = 66). Słabe kodowanie spowodowało istotny wzrost preferencji obiektu w nowym miejscu w teście z opóźnieniem 1 h, ale nie 24 h, w porównaniu do poziomu przypadkowego (pamięć 1 h: n = 32; pamięć 24 h: n = 34). Stwierdzono istotną różnicę w wynikach testów z opóźnieniem 1 h i 24 h. Wyniki zostały połączone z czterech kontekstów. Pojedyncze punkty danych przedstawiono jako kropki. Wszystkie słupki przedstawiają procent eksploracji obiektu w nowym miejscu jako średnia ± SEM. *p < 0.05, ***p < 0.001; jednopróbkowy test t względem poziomu przypadkowego (50%, linia przerywana). ###p < 0.001; ns, brak istotności; nieparzysty test t Welcha. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Istotną zaletą tego ugruntowanego protokołu jest możliwość jego przeprowadzenia czterokrotnie w czterech różnych kontekstach (Rysunek 1C) z wykorzystaniem tej samej grupy szczurów. Wyniki przedstawione na Rysunku 5 obrazują jeden z możliwych sposobów zastosowania kontrbalansowania z dwiema grupami eksperymentalnymi (grupy z pamięcią 1-h i 24-h). Dwie grupy zostały poddane kontrbalansowaniu w obrębie dwóch kontekstów (konteksty 1 i 2), a następnie powtórzono tę procedurę w dwóch dodatkowych kontekstach (konteksty 3 i 4; Rysunek 5A). Wyniki z czterech kontekstów zaprezentowano pojedynczo na Rysunku 5B,D, gdzie pamięć każdej grupy eksperymentalnej oceniano poprzez porównanie preferencji z poziomem przypadkowym w każdym kontekście (pamięć 1-h: Kontekst 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t8 = 5,5, p < 0,001; Kontekst 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t8 = 4,0, p = 0,004; Kontekst 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t6 = 4,0, p = 0,007; Kontekst 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t6 = 2,7, p = 0,035; pamięć 24-h: Kontekst 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t8 = 0,77, p = 0,46; Kontekst 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t8 = 0,18, p = 0,86; Kontekst 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t7 = 1,7, p = 0,12; Kontekst 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t7 = 0,52, p = 0,62; jednopróbkowy test t względem poziomu przypadkowego).

W kontekstach 1, 2 i 4 porównanie międzyosobnicze grup wykazało istotne różnice między pamięcią 1-h a 24-h (pamięć 1-h kontra pamięć 24-h: Kontekst 1, t12.7 = 3.4, p = 0.005; Kontekst 2, t15.2 = 2.6, p = 0.019; Kontekst 3, t13.0 = 1.4, p = 0.17; Kontekst 4, t12.2 = 2.4, p = 0.032; nieparzysty test t Welcha). Aby uzyskać lepszą reprezentację i umożliwić porównanie wewnątrzobiektowe danych, połączono wyniki z dwóch zrównoważonych kontekstów (Rysunek 5C,E). Połączone grupy eksperymentalne ponownie porównano indywidualnie z poziomem przypadkowym (połączone Konteksty 1 i 2: pamięć 1-h, 67.8 ± 2.6%, n = 18, t17 = 6.7, p < 0.001; pamięć 24-h, 47.1 ± 3.9%, n = 18, t17 = 0.74, p = 0.47; połączone Konteksty 3 i 4: pamięć 1-h, 65.3 ± 3.3%, n = 14, t13 = 4.7, p < 0.001; pamięć 24-h, 52.4 ± 3.2%, n = 16, t15 = 0.73, p = 0.48; jednopróbkowy test t względem poziomu przypadkowego). Następnie porównano ze sobą grupy eksperymentalne.

W obu parach kontekstów odnotowano istotne różnice między grupami, co wykazały porównania wewnątrzobiektowe (pamięć po 1 h versus pamięć po 24 h: połączone konteksty 1 i 2, t16 = 3.5, p = 0.003; połączone konteksty 3 i 4, t13 = 2.4, p = 0.032; parowy test t). Podobne wyniki uzyskano również u szczurów rasy Lister Hooded typu dzikiego w protokole słabego kodowania, wykorzystując konteksty 1 i 4 w dwóch zrównoważonych sesjach (dane nie przedstawiono). Powtarzalność i wiarygodność wyników potwierdzono, porównując każdy zestaw danych za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA. Nie wykryto istotnych różnic pomiędzy czterema kontekstami (pamięć po 1 h: F3,28 = 0.31, p = 0.81; pamięć po 24 h: F3,30 = 0.99, p = 0.41). Zatem test lokalizacji przedmiotu można powtarzać w sposób wiarygodny przy minimalnym wpływie powtórzeń, pod warunkiem przestrzegania instrukcji zawartych w niniejszym protokole.

Schemat badania behawioralnego z wykresami słupkowymi przedstawiającymi czas eksploracji w różnych kontekstach i przy różnych opóźnieniach testowych.
Rycina 5: Różne sposoby prezentacji i analizy wyników protokołu słabego kodowania z dwiema grupami eksperymentalnymi zrównoważonymi w ramach dwóch sesji. (A) Schemat eksperymentalny dla zrównoważenia z dwiema grupami eksperymentalnymi (grupy pamięci 1-h i 24-h) w ramach dwóch sesji (konteksty 1 i 2). Zrównoważenie powtórzono w dwóch dodatkowych sesjach (konteksty 3 i 4). (B i D) Wyniki z każdego kontekstu i grup eksperymentalnych porównywano indywidualnie z poziomem przypadkowym oraz względem siebie. We wszystkich czterech kontekstach preferencja obiektu w nowej lokalizacji w testach z opóźnieniem 1-h była znacząco zwiększona w porównaniu z poziomem przypadkowym [Kontekst 1 i 2: n = 9 na grupę (B); Kontekst 3 i 4: n = 7 na grupę (D)]. W testach z opóźnieniem 24-h preferencja obiektu w nowej lokalizacji nie różniła się od poziomu przypadkowego (Kontekst 1 i 2: n = 9 na grupę; Kontekst 3 i 4: n = 8 na grupę). Porównanie międzyosobnicze wykazało istotną różnicę między preferencjami grup eksperymentalnych w kontekstach 1, 2 i 4, ale nie w kontekście 3. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; test t dla jednej próby względem poziomu przypadkowego (50%, linia przerywana). #p < 0.05; ##p < 0.01; ns, brak istotności; nieparowany test t Welcha. (C i E) Wyniki przedstawiono po połączeniu grup eksperymentalnych z dwóch zrównoważonych kontekstów [Konteksty 1 i 2 połączone, n = 17 na grupę (C); Konteksty 3 i 4 połączone, n = 14 na grupę (E)]. Preferencja obiektu w nowej lokalizacji była znacząco zwiększona w porównaniu z poziomem przypadkowym w testach z opóźnieniem 1-h, ale nie 24-h, w obu parach kontekstów. Porównanie wewnątrzobiektowe grup eksperymentalnych wykazało istotne różnice między preferencjami obiektu w nowej lokalizacji w testach z opóźnieniem 1-h i 24-h w obu parach kontekstów. ***p < 0.001; test t dla jednej próby względem poziomu przypadkowego (50%, linia przerywana). #p < 0.05, ##p < 0.01; parowy test t. Pojedyncze punkty danych przedstawiono jako kropki. Wszystkie słupki wskazują procent eksploracji obiektu w nowej lokalizacji jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Zadanie lokalizacji obiektów może być wykorzystywane w różnych badaniach do badania pamięci przestrzennej, jak opisano wcześniej. Elastyczność konfiguracji umożliwia modelowanie pamięci krótkotrwałej i długotrwałej o różnej sile i może być łatwo wdrożona przy niskich kosztach. Ponieważ jednak w protokole znajduje się wiele parametrów, które mogą wpływać na wyniki, a różne badania różnią się nieznacznie w tych parametrach6, można napotkać trudności z pomyślnym wdrożeniem zadania po raz pierwszy. Powyższy protokół ma na celu płynne przeprowadzenie czytelników przez ten proces. Dalsze kluczowe kroki, które mogą mieć znaczenie dla pomyślnej realizacji zadania z dużą powtarzalnością, zostaną omówione poniżej.

Chociaż sesja kodowania/testowania często jest głównym celem podczas przeprowadzania eksperymentów z lokalizacją obiektów, protokoły obsługi i przyzwyczajenia mają głęboki wpływ na wynik tego rodzaju testów behawioralnych, w których wynik zależy od niezakłóconego naturalnego zachowania szczurów14,15. W związku z tym kroki poprzedzające sesję kodowania/testową powinny być zaprojektowane z ostrożnością, ponieważ mogą wpływać na zachowanie i pamięć szczurów, a w konsekwencji wpływać na wyniki końcowe. Dobry poziom obchodzenia się i przyzwyczajenia, tak aby szczury zapoznały się z eksperymentatorem i zadaniem, zminimalizuje wpływ czynników stresowych, jednocześnie zwiększając prawdopodobieństwo wykazywania naturalnych zachowań8. Jak wspomniano w protokole, obchodzenie się z młodymi może rozpocząć się już w momencie odsadzenia szczeniąt, jeśli szczep szczura jest utrzymywany w obiekcie macierzystym. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach (dane nie pokazane) oraz na podstawie kilku wcześniejszych badań16,17, ta wczesna obsługa skutkuje niskim poziomem lęku i zwiększoną ciekawością w kolejnych miesiącach.

Ponieważ zadanie lokalizacji obiektu zależy wyłącznie od wewnętrznego popędu eksploracyjnego szczurów, oczekiwane zachowanie może być łatwo utrudnione, jeśli szczury nie są chętne do eksploracji lub niechętnie zbliżają się do nowości, co jest określane jako "zachowanie neofobiczne"1. W związku z tym zdecydowanie zaleca się dołączenie dokładnego protokołu postępowania i habituacji zgodnie z konkretnymi potrzebami badania. Protokół ten może być wykorzystany jako przewodnik po minimalnych wymaganiach, a dalsze kroki mogą zostać wdrożone (np. jeśli badanie ma obejmować wstrzyknięcia na późniejszym etapie, wymagane jest przyzwyczajenie do procedur iniekcji i określona pozycja trzymania). Szczep i wiek szczurów doświadczalnych to dwa inne wpływowe czynniki, które należy wziąć pod uwagę przed planowaniem eksperymentu, aby uniknąć nieoptymalnych wyników. Różne szczepy szczurów mogą mieć różne zachowania i wyjściowe poziomy lęku 18,19,20, dlatego w zależności od zastosowanego szczepu może być wymagane specyficzne dostosowanie protokołu.

Potwierdzono, że protokół ten działa dobrze u transgenicznych szczurów Th-Cre ze szczepem Long-Evans czterokrotnie skrzyżowanym wstecznie ze szczepem Lister Hooded i dzikim typem Lister Hooded. Logicznie idealny wiek początkowy dla szczurów w eksperymentach behawioralnych to około 12 tygodni20, ale należy wziąć pod uwagę zmienność między szczepami i specyficzne wymagania zadania. Możliwe jest również wykorzystanie rozwijających się szczurów, jeśli jest to interesujące dla badania, chociaż mogą być wymagane korekty w protokole, które nie są tutaj uwzględnione. Jednak ważne jest, aby zastanowić się, czy szczur w danym wieku rozwinął funkcje poznawcze wymagane do skutecznego wykonania tego zadania. Badanie21 badające tę kwestię wykazało, że tylko dorastające szczury w 38. dniu po urodzeniu, a nie wcześniej, wykazywały allocentryczną pamięć przestrzenną odzwierciedloną w preferencji dla obiektu w nowej lokalizacji, jak zaobserwowano u dorosłych szczurów. Przedstawiony tutaj protokół okazał się skuteczny na szczurach, które miały 15-16 tygodni na początku pierwszej sesji kodowania/testu. Wcześniej ten sam protokół silnego kodowania dawał wyniki nieoptymalne lub ujemne przy użyciu 23-tygodniowych szczurów, które nie osiągnęły optymalnego poziomu przyzwyczajenia z powodu braku obsługi i przyzwyczajenia w wystarczająco młodym wieku. Szczury te albo nie zachowywały się inaczej niż na poziomie przypadku, albo w rzeczywistości wykazywały awersję do nowości, co zaobserwowano w kategoriach preferencji dla stabilnych obiektów zamiast obiektów przemieszczonych (dane nie pokazane). Wyniki te dostarczają dowodów na to, że wiek i czas obchodzenia się z habituacją mogą mieć wpływ na skuteczność habituacji, a w efekcie przyczyniać się do obserwacji zachowań lękowych i neofobicznych w testach.

W tym miejscu przedstawiono dwa różne protokoły, zapewniające silne lub słabe kodowanie w zadaniu lokalizacji obiektu. Podczas ustanawiania tych protokołów zaobserwowano, że zainteresowanie obiektami spadało po 5-10 minutach eksploracji podczas pojedynczych długich prób (np. 20-minutowego kodowania), a szczury ostatecznie przestały eksplorować. Powoduje to słabszą pamięć lokalizacji obiektów. Protokół kodowania, który przeplata próby kodowania krótkimi okresami odpoczynku (np. kodowanie 3 x 5 min), przezwycięża ten problem i prowadzi do wysokiej eksploracji podczas prób. Tak więc czas aktywnej eksploracji i różny układ tych dwóch protokołów kodowania wpływa na siłę pamięci, która jest silniejsza po kodowaniu 3 x 5 min niż po 20-minutowych protokołach kodowania. Podobne wyniki można również osiągnąć przy użyciu nieco innych czasów trwania w przypadku pojedynczych protokołów badania klinicznego w porównaniu z protokołami badania z przeplotem, a także można dokonać korekt w celu dostosowania do potrzeb badania i szczepu szczurów.

W przeciwieństwie do protokołów wykorzystujących zwykłe, białe, otwarte pole z tylko zewnętrznymi wskazówkami w pomieszczeniu, przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje arenę z odrębnymi kontekstami i wskazówkami wewnątrz labiryntu, które prawdopodobnie wymagają więcej czasu na naukę. W związku z tym zaleca się dodanie kroku habituacji kontekstu w protokole przed próbą kodowania. Pozwoli to szczurom na stworzenie mapy przestrzennej każdego kontekstu podczas habituacji i skróci czas trwania kolejnej próby kodowania, ponieważ szczury będą musiały zakodować tylko lokalizacje obiektów w odniesieniu do tej mapy. Co więcej, przyzwyczajenie do kontekstu pozwoli szczurom przyzwyczaić się do wszelkich możliwych dystraktorów w każdym kontekście, takich jak wskazówki przestrzenne 3D, minimalizując zachowania inne niż eksploracja obiektów w następnej sesji kodowania/testu. Dzięki wdrożeniu dokładnej metody równoważenia składającej się z kilku poziomów (tj. szerokiego zakresu kombinacji lokalizacji obiektów (liczników) i kierunku przemieszczenia obiektu), niepożądane preferencje, które mogą wzrosnąć z powodu różnic w natężeniu światła i kolorach/wzorach ścian w rogach areny, są zminimalizowane.

Podczas powtarzania zadania należy wziąć pod uwagę kilka czynników, aby zwiększyć powtarzalność między sesjami kodowania/testowego i zminimalizować wpływ powtórzeń. Po pierwsze, należy zaprojektować odrębne konteksty (tak wiele, jak liczba powtórzeń sesji kodowania/testów), aby uniknąć akumulacji pamięci przestrzennej, która może być spowodowana wykonywaniem powtarzających się sesji przy użyciu tego samego kontekstu. Aby to osiągnąć, użyto aparatu z wymiennymi ściankami o różnych kolorach i wzorach (ryc. 1B,C). Wyraźne ściany i obiekty 3D (takie jak zabawki lub małe przedmioty codziennego użytku o różnych kolorach i kształtach, patrz protokół i rysunek 1C) zawieszone na ścianach są przestrzennymi wskazówkami i punktami orientacyjnymi, których szczury potencjalnie używają do uczenia się lokalizacji obiektów w odniesieniu do ich kontekstów. W przypadku, gdy test nie wytworzy preferencji dla poruszanego obiektu, można rozważyć zmianę tych parametrów kontekstu (projekt ściany i wskazówki przestrzenne). Alternatywnie, do zadań związanych z lokalizacją obiektów można użyć areny w kształcie prostokąta lub koła zamiast kwadratowej areny, jak w tym protokole. Mówi się, że okrągłe areny eliminują preferencje dotyczące narożników22, które często obserwuje się na arenach z rogami, a zatem mogą być korzystne, gdy mamy do czynienia ze szczególnie niespokojnym szczepem szczurów lub myszy. Podczas gdy wymagania dotyczące tworzenia czterech odrębnych kontekstów w tym protokole działają najbardziej optymalnie w przypadku czworokątnego kształtu, okrągła arena może być również funkcjonalna po pewnych poprawkach.

Po drugie, odstępy czasu między każdą sesją kodowania/testowania powinny być określone w taki sposób, aby szczury za każdym razem zachowywały ten sam poziom zainteresowania, unikając jednocześnie ryzyka skumulowanego uczenia się wynikającego z gęstego harmonogramu powtórzeń. Zazwyczaj wystarczający jest interwał co najmniej dwukrotnie dłuższy niż czas opóźnienia między kodowaniem a próbami testowymi, przy czym dłuższe interwały są bardziej korzystne dla więcej niż dwóch powtórzeń. Oznacza to, że podczas gdy minimum 48-godzinny odstęp po 24-godzinnym teście jest wystarczający dla jednego lub dwóch powtórzeń, zaleca się stosowanie 1-tygodniowego odstępu dla czterech powtórzeń. Jak pokazują wyniki przedstawione na rysunku 5 oraz porównanie za pomocą ANOVA, zadanie można z powodzeniem powtórzyć czterokrotnie. Na tej podstawie ustalony protokół może być wykorzystany do zrównoważenia do czterech warunków eksperymentalnych. Liczba grup eksperymentalnych określa liczbę powtórzeń sesji kodowania/prób w różnych kontekstach. Wyniki przedstawione na rysunku 5 reprezentują jeden z możliwych sposobów wykorzystania protokołu z dwiema grupami eksperymentalnymi. Grupy zostały zrównoważone w dwóch sesjach, a te same warunki powtórzono w dwóch dodatkowych sesjach (dla celów walidacji). Drugi zestaw sesji z przeciwwagą może być również wykorzystany do zrównoważenia nowych warunków. Podobnie, trzy lub cztery warunki eksperymentalne mogą być porównane za pomocą odpowiednio trzech lub czterech sesji z przeciwwagą.

W takich przypadkach konteksty powinny być zaprojektowane tak, aby uwzględniały kontrastujące cechy opisane w protokole. Warto zauważyć, że konstrukcja z przeciwwagą może nie być odpowiednia dla eksperymentów, w których mają być stosowane dodatkowe manipulacje, takie jak interwencja farmakologiczna, która może pozostawić długotrwały efekt lub uszkodzenie. Aby utrzymać skuteczność i powtarzalność testów, eksperyment powinien być odpowiednio zaprojektowany. Dane z powtarzanych testów mogą być prezentowane i analizowane na kilka sposobów, jak pokazano na rysunku 5. W celu wstępnej analizy, grupy eksperymentalne w każdym kontekście mogą być indywidualnie porównane do poziomu szansy za pomocą testu t dla jednej próby w celu określenia wszelkich istotnych preferencji (Rysunek 5B,D). Może to być pomocne w szybkim zrozumieniu danych, ale zapewnia tylko pośrednie porównanie grup. Tak więc, aby porównać dwie lub więcej grup, dane należy analizować za pomocą testów t dla dwóch prób (sparowanych lub niesparowanych) lub odpowiednio ANOVA. Może to mieć formę międzyosobowego porównania grup w ramach jednej sesji kodowania/testu (Rysunek 4A i Rysunek 5B,D) lub wewnątrzobiektowego porównania grup z dwóch (lub więcej) równoważonych kontekstów (Rysunek 5C,E). Ta ostatnia metoda jest zdecydowanie zalecana, zwłaszcza gdy mamy do czynienia ze słabymi warunkami pamięci, co, jak wyjaśniono wcześniej, skutkuje dużą wariancją z powodu losowości w zachowaniu.

Połączenie zrównoważonych kontekstów prowadzi do powstania większych grup, które są zobowiązane do wiarygodnej wizualizacji zachowania grupy przy minimalnej zmienności. Stosując protokół z powtórzeniami w sesjach z przeciwwagą, można spodziewać się zmniejszenia liczby szczurów do około jednej trzeciej liczby, która byłaby wymagana przy użyciu pojedynczego testu o tej samej mocy statystycznej. Zwykle wystarczająca jest wielkość próby w zakresie od 7 do 15 szczurów (łącznie) dla sesji z przeciwwagą i w zakresie od 20 do 50 szczurów (od 10 do 25 na grupę) dla pojedynczej sesji, przy wielkości efektu i mocy większej niż 0,8. Zmniejszenie liczby potrzebnych zwierząt i wzrost informacji, które uzyskujemy od każdego zwierzęcia za pomocą tego protokołu, zarówno udoskonala badanie, jak i służy zasadom 3R etycznego wykorzystywania zwierząt w badaniach. Na tym etapie ważne jest, aby pamiętać, że losowe zachowanie szczurów, któremu nie towarzyszy silna pamięć, może skutkować indywidualnymi silnymi preferencjami zarówno poniżej, jak i powyżej szansy, ale średnia grupowa powinna dawać preferencję nie różniącą się znacząco od przypadku. Poszczególne dane należy interpretować ostrożnie. Rozkład poszczególnych punktów danych w grupie może być również pomocny w interpretacji wyników. Jak widać na rys. 4 i rys. 5, rozkład zmienia się w zależności od siły pamięci. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj protokół może być łatwo zastosowany w celu realizacji zadania lokalizacji obiektu z powtórzeniami w celu modelowania krótkotrwałej i/lub długotrwałej pamięci przestrzennej. Prosty i elastyczny protokół treningowy oraz możliwość wdrażania kolejnych manipulacji sprawiają, że zadanie to jest popularnym wyborem. Te modyfikacje protokołu umożliwiają badanie poszczególnych kroków, takich jak pozyskiwanie, konsolidacja i przywoływanie pamięci.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O'Hara i Davidowi Bettowi za wnikliwe komentarze i sugestie. Badanie to było wspierane przez program Erasmus+ (dla G.B. i L.N.); Graduate School of Health, Uniwersytet w Aarhus (do K.H.); Nagroda dla Młodego Badacza Fundacji Novo Nordisk 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) oraz PROMEMO - Center for Proteins in Memory, Centrum Doskonałości finansowane przez Duńską Narodową Fundację Badawczą (DNRF133) (do T.T.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pole otwarte/eksperymentalneO'Hara & Co (Japonia)OF-3001Otwarta skrzynka polowa do zadania lokalizacji obiektu
Obiekt 1: stożkiO'Hara & Co (Japonia)ORO-RR
Obiekt 2: piłki nożneO'Hara & Co (Japonia)ORO-RB
Obiekt 3: prostokątne blokiO'Hara & Co (Japonia)ORO-RCBloki prostokątne zostały zmodyfikowane po zakupie
Aparatura do zadań lokalizacji obiektówO'Hara & Co (Japonia)SPP-4501Skrzynka tłumiąca dźwięk, która zawiera skrzynkę otwartego pola do zadania lokalizacji obiektu
Oprogramowanie śledząceO'Hara & Co (Japonia)TimeSSIDo śledzenia ruchu i funkcji automatycznej kamery
Dziki typ Lister Szczury kapturoweCharles River603

Bibliografia

  1. Hughes, R. N. Neotic preferences in laboratory rodents: issues, assessment and substrates. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (3), 441-464 (2007).
  2. Blaser, R., Heyser, C. Spontaneous object recognition: a promising approach to the comparative study of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 183(2015).
  3. Dix, S. L., Aggleton, J. P. Extending the spontaneous preference test of recognition: evidence of object-location and object-context recognition. Behavioral Brain Research. 99 (2), 191-200 (1999).
  4. Barker, G. R., Warburton, E. C. When is the hippocampus involved in recognition memory. Journal of Neuroscience. 31 (29), 10721-10731 (2011).
  5. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  6. Gulinello, M., et al. Rigor and reproducibility in rodent behavioral research. Neurobiology of Learning and Memory. 165, 106780(2019).
  7. Rudeck, J., Vogl, S., Banneke, S., Schonfelder, G., Lewejohann, L. Repeatability analysis improves the reliability of behavioral data. PLoS One. 15 (4), 0230900(2020).
  8. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999(2017).
  9. Migues, P. V., et al. Blocking synaptic removal of GluA2-containing AMPA receptors prevents the natural forgetting of long-term memories. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3481-3494 (2016).
  10. Maingret, N., Girardeau, G., Todorova, R., Goutierre, M., Zugaro, M. Hippocampo-cortical coupling mediates memory consolidation during sleep. Nature Neuroscience. 19 (7), 959-964 (2016).
  11. Chao, O. Y., de Souza Silva, M. A., Yang, Y. M., Huston, J. P. The medial prefrontal cortex - hippocampus circuit that integrates information of object, place and time to construct episodic memory in rodents: Behavioral, anatomical and neurochemical properties. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 113, 373-407 (2020).
  12. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
  13. Witten, I. B., et al. Recombinase-driver rat lines: tools, techniques, and optogenetic application to dopamine-mediated reinforcement. Neuron. 72 (5), 721-733 (2011).
  14. Costa, R., Tamascia, M. L., Nogueira, M. D., Casarini, D. E., Marcondes, F. K. Handling of adolescent rats improves learning and memory and decreases anxiety. Journal of the American Association for Labaratory Animal Science. 51 (5), 548-553 (2012).
  15. Schmitt, U., Hiemke, C. Strain differences in open-field and elevated plus-maze behavior of rats without and with pretest handling. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 59 (4), 807-811 (1998).
  16. Kosten, T. A., Kim, J. J., Lee, H. J. Early life manipulations alter learning and memory in rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (9), 1985-2006 (2012).
  17. Denenberg, V. H., Grota, L. J. Social-seeking and novelty-seeking behavior as a function of differential rearing histories. Journal of Abnormal and Social Psychology. 69 (4), 453-456 (1964).
  18. Clemens, L. E., Jansson, E. K., Portal, E., Riess, O., Nguyen, H. P. A behavioral comparison of the common laboratory rat strains Lister Hooded, Lewis, Fischer 344 and Wistar in an automated homecage system. Genes, Brain, and Behavior. 13 (3), 305-321 (2014).
  19. Ennaceur, A., Michalikova, S., Bradford, A., Ahmed, S. Detailed analysis of the behavior of Lister and Wistar rats in anxiety, object recognition and object location tasks. Behavioral Brain Research. 159 (2), 247-266 (2005).
  20. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936-946 (2006).
  21. Contreras, M. P., Born, J., Inostroza, M. The expression of allocentric object-place recognition memory during development. Behavioral Brain Research. 372, 112013(2019).
  22. Yaski, O., Eilam, D. How do global and local geometries shape exploratory behavior in rats. Behavioral Brain Research. 187 (2), 334-342 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

pami przestrzennaschemat wewn trzgrupowyrozpoznawanie miejsca obiektuzachowanie szczurahabituacja do kontekstusilne kodowanies abe kodowanieschemat zr wnowa onyczas eksploracji

Powiązane artykuły