Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy migracji i adhezji komórek w celu zbadania interakcji Leishmania-komórka gospodarza

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62461

⸱

4 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Host - Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj badamy implikacje interakcji Leishmania-gospodarz, badając migrację komórek dendrytycznych zakażonych Leishmanią. Opisano różnicowanie i infekcję komórek dendrytycznych, analizę migracji oraz ocenę kompleksów adhezyjnych i dynamiki aktyny. Metoda ta może być stosowana w innych badaniach migracji komórek gospodarza po zakażeniu Leishmanią lub innymi wewnątrzkomórkowymi gatunkami pasożytów.

Streszczenie

Leishmania to wewnątrzkomórkowy pasożyt pierwotniakowy, który powoduje szerokie spektrum objawów klinicznych, począwszy od samoistnie ustępujących miejscowych zmian skórnych, a skończywszy na wysoce śmiertelnej formie choroby o charakterze trzewnym. Szacuje się, że 12 milionów ludzi na całym świecie jest obecnie zarażonych, a kolejne 350 milionów jest zagrożonych zakażeniem. Wiadomo, że komórki gospodarza zakażone pasożytami Leishmania, takie jak makrofagi lub komórki dendrytyczne, mogą migrować do różnych tkanek gospodarza, jednak sposób, w jaki migracja przyczynia się do rozprzestrzeniania się pasożyta i naprowadzania, pozostaje słabo poznany. Dlatego ocena zdolności tych pasożytów do modulowania odpowiedzi, adhezji i migracji komórek gospodarza rzuci światło na mechanizmy związane z rozprzestrzenianiem się choroby i trzewnościami. Migracja komórkowa to złożony proces, w którym komórki ulegają polaryzacji i wypukłości, co pozwala im na migrację. Proces ten, regulowany przez dynamikę mikrotubul opartych na aktynie i tubulinie, obejmuje różne czynniki, w tym modulację adhezji komórkowej do podłoża. Procesy adhezji i migracji komórek zostały zbadane przy użyciu kilku modeli. W tym miejscu opisujemy metodę charakteryzowania aspektów migracji komórek gospodarza podczas zakażenia Leishmania. Ten szczegółowy protokół przedstawia różnicowanie i infekcję komórek dendrytycznych, analizę ruchliwości i migracji komórek gospodarza oraz tworzenie kompleksów adhezyjnych i dynamikę aktyny. Ten protokół in vitro ma na celu dalsze wyjaśnienie mechanizmów związanych z rozprzestrzenianiem się Leishmania w tkankach gospodarza kręgowców i może być również modyfikowany i stosowany w innych badaniach migracji komórek.

Wprowadzenie

Leishmaniasis, zaniedbana choroba tropikalna wywoływana przez pasożyty pierwotniaków należących do rodzaju Leishmania, powoduje szerokie spektrum objawów klinicznych, od samoleczenia zlokalizowanych zmian skórnych po śmiertelne formy trzewne choroby. Szacuje się, że rocznie pojawia się do miliona nowych przypadków leiszmaniozy, przy czym według doniesień na całym świecie zakażonych jest obecnie 12 milionów osób1. Leiszmanioza trzewna (VL), która nieleczona może być śmiertelna w ponad 95% przypadków, powoduje ponad 50 000 zgonów rocznie, dotykając miliony w Ameryce Południowej, Afryce Wschodniej, Azji Południowej i regionie Morza Śródziemnego2. Główny czynnik etiologiczny VL w nowym świecie, Leishmania infantum, jest przenoszony na ludzi przez zakażone samice muszki piaskowej podczas karmienia krwią3. Pasożyty te są rozpoznawane i internalizowane przez fagocyty, np. makrofagi i komórki dendrytyczne3,4,5. Wewnątrz tych komórek pasożyty różnicują się w swoje wewnątrzkomórkowe formy, znane jako amastigoty, które następnie namnażają się i są transportowane przez układ limfatyczny i krwiobieg do różnych tkanek gospodarza6,7. Jednak mechanizmy, za pomocą których pasożyty Leishmania rozprzestrzeniają się w żywicielu kręgowców, a także rola, jaką odgrywa w tym procesie migracja komórek gospodarza, pozostają niejasne.

Migracja komórek to złożony proces wykonywany przez wszystkie komórki jądrzaste, w tym leukocyty8. Zgodnie z klasycznym cyklicznym modelem migracji komórek, proces ten obejmuje kilka zintegrowanych zdarzeń molekularnych, które można podzielić na pięć etapów: wysunięcie krawędzi wiodącej; przyleganie krawędzi natarcia do styków matrycy; skurcz cytoplazmy komórkowej; uwolnienie tylnej krawędzi ogniwa z miejsc kontaktu; oraz recykling receptorów błonowych od tyłu do przodu komórki9.

Aby migracja komórek nastąpiła, muszą zostać uformowane wypukłości, a następnie ustabilizowane poprzez przyłączenie do macierzy zewnątrzkomórkowej. Wśród różnych typów receptorów biorących udział w promowaniu migracji komórek godne uwagi są integryny. Aktywacja integryny powoduje sygnalizację związaną z migracją; Sygnalizacja wewnątrzkomórkowa zachodzi następnie za pośrednictwem ogniskowej kinazy adhezyjnej (FAK) i kinaz rodziny Src, oprócz molecues taliny, winkuliny i paxilliny10,11,12. Fosforylacja paxillin przez aktywowane kinazy, w tym FAK, prowadzi do rekrutacji cząsteczek efektorowych, które przekazują sygnały zewnętrzne, które skłaniają do migracji komórek. Wykazano, że paxillin jest cząsteczką wewnątrzkomórkową, która ma kluczowe znaczenie dla adhezji komórek, polimeryzacji aktyny i procesów migracji komórek13,14,15.

Cytoszkielet aktynowy odgrywa kluczową rolę w polaryzacji i migracji fagocytów16. Podczas procesu migracji komórek wypukłości powstałe w wyniku polimeryzacji aktyny stabilizują się poprzez adhezję komórek do macierzy zewnątrzkomórkowej. Proces ten może być modulowany przez receptory integrynowe związane z cytoszkieletem aktyny17,18,19. Kilka białek wiążących aktynę reguluje szybkość i organizację polimeryzacji aktyny w wypukłościach komórkowych20. Badania wykazały, że RhoA, Rac i Cdc42 regulują reorganizację aktyny po stymulacji przylegających komórek przez czynniki zewnątrzkomórkowe21,22. Podczas migracji Rac1 i Cdc42 znajdują się na krawędzi natarcia komórki, kontrolując odpowiednio wydłużanie się lamellipodiów i filopodiów, podczas gdy RhoA, zlokalizowane z tyłu komórki, reguluje skurcz cytoszkieletu aktomiozyny15,23,24,25.

Badania wykazały, że zakażenie Leishmania moduluje funkcje komórek gospodarza, takie jak adhezja do substratu komórkowego i migracja26,27,28,29,30,31. Niedojrzałe DC znajdują się w tkankach obwodowych; po interakcji z PAMPS komórki te ulegają aktywacji i migrują do drenujących węzłów chłonnych, powodując prezentację antygenu limfocytom T. Poprzednie badanie z wykorzystaniem modelu mysiego wykazało, że zakażenie L. amazonensis powoduje zmniejszenie migracji DC do drenujących węzłów chłonnych29. Wykazano również, że hamowanie procesu adhezji zmniejszało migrację DC po zakażeniu L. major30. Niemniej jednak wpływ migracji DC na rozprzestrzenianie się pasożyta w żywicielu, a także mechanizmy zaangażowane w ten proces, pozostają słabo poznane.

Tutaj prezentujemy skompilowany krok po kroku protokół do przeprowadzenia testu adhezji i migracji in vitro z udziałem ludzkich DC zakażonych Leishmania. Metoda ta obejmuje nie tylko różnicowanie i infekcję DC, ale także pozwala na analizę ruchliwości i migracji komórek gospodarza, tworzenia kompleksów adhezyjnych, a także dynamiki aktyny. Opisany obecnie protokół in vitro pozwala naukowcom na dalsze badanie mechanizmów związanych z rozprzestrzenianiem się Leishmania w tkankach gospodarza kręgowców, a także może być manipulowany i stosowany w innych badaniach migracji komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury opisane tutaj zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Instytutu Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, nr protokołu 2.751.345). Próbki krwi pobrano od zdrowych dawców-ochotników. Procedury doświadczalne na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi w badaniach na zwierzętach przyjętymi przez brazylijską ustawę 11.784/2008 i zostały zatwierdzone i licencjonowane przez Komisję Etyczną ds. Badań na Zwierzętach Instytutu Gonçalo Moniz (IGM-FIOCRUZ, protokół nr 014/2019).

1. Izolacja i różnicowanie ludzkich komórek dendrytycznych

  1. Odpipetować 10 ml pożywki o gradifikacji gęstości do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
  2. Oznacz probówki o pojemności 50 ml zgodnie z próbką każdego dawcy.
  3. Pobrać ~ 50 ml krwi żylnej od zdrowych dawców i po pobraniu postępować zgodnie z procedurami opisanymi poniżej w komorze przepływowej.
  4. Pobraną krew ostrożnie przenieść do probówek wirówkowych i rozcieńczyć w roztworze soli fizjologicznej (0,9% chlorku sodu) w stosunku 1:1 w temperaturze pokojowej.
  5. Powoli nałożyć rozcieńczoną krew na wierzch podłoża o gradiencie gęstości.
  6. Probówki wirówkowe zawierające krew i pożywkę o gradiencie gęstości o sile 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowe>
  7. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki.
  8. Zidentyfikować pierścień komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w próbce (kożuch); delikatnie usunąć resztki osocza za pomocą pipety.
    UWAGA: Po odwirowaniu utworzą się następujące warstwy gradientowe: erytrocyty, podłoże gradientu gęstości, pierścień PBMC i osocze. Pierścień PBMC znajduje się pomiędzy ośrodkiem gradientu gęstości a warstwami plazmy.
  9. Przenieś warstwę PBMC przypominającą chmurę do nowej probówki i zwiększ objętość do 30 ml roztworem soli fizjologicznej.
  10. Odwirować probówki zawierające zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml roztworu soli fizjologicznej.
  11. Zebrać podwielokrotność do zliczania komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego. Najpierw rozcieńczyć w stosunku 1:1,000. Następnie użyj 10 μl rozcieńczonych komórek do barwienia błękitem trypanowym i policz komórki za pomocą komory Neubauera, aby określić żywotność komórek.
  12. Ponownie odwirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Ponownie zawieś osad w buforze MACS. Użyj 80 μl buforu na każde 1 x 107 komórek.
    UWAGA: Skład buforu MACS: Przygotować roztwór zawierający sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,2, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA. Rozcieńczyć roztwór buforowy w stosunku 1:20 roztworem płuczącym. Przechowywać bufor w chłodnym miejscu i przechowywać w temperaturze 2-8 °C.
  14. Dodaj mikrogranulki CD14 do zawiesiny komórek przygotowanej w kroku 1.13. Użyj 20 μl mikrogranulek CD14 na każdą 1 x 107 komórek.
    UWAGA: Mikrogranulki CD14 są używane do pozytywnej selekcji ludzkich monocytów z PBMC, ponieważ kulki wiążą się z komórkami CD14-dodatnimi ulegającymi ekspresji na większości monocytów.
  15. Homogenizować roztwór zawierający osad i mikrogranulki za pomocą pipety. Trzymaj na lodzie przez 15 minut.
  16. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  17. Zawieś ponownie komórki w buforze MACS. Użyj 1-2 ml na 1 x 107 komórek w mieszaninie mikrokulek komórkowych.
  18. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  19. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu MACS.
    UWAGA: Jest to maksymalna objętość zawiesiny komórek, która może być przetworzona przez jedną kolumnę.
  20. Zamontuj kolumnę magnetyczną.
  21. Przemyć kolumnę jeden raz, dodając 500 μl buforu MACS. Pozwól, aby bufor przepływał pod wpływem grawitacji przez kolumnę.
    UWAGA: Nie pozwól, aby kolumna wyschła, ponieważ każde powietrze, które dostaje się do środka, może zatkać kolumnę.
  22. Dodać 500 μl roztworu próbki komórki z kroku 1.19 na kolumnę. Pozwolić, aby roztwór próbki komórki przepływał pod wpływem grawitacji przez kolumnę.
  23. Przemyć kolumnę, dodając 500 μl buforu MACS (2x). Świeży bufor należy dodawać tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty. Unikać suszenia.
  24. Odpipetować 1 ml buforu MACS na kolumnę i umieścić ją w nowej probówce pod spodem. Natychmiast wypłukać magnetycznie oznaczone ogniwa, mocno wciskając tłok do kolumny.
  25. Odwirować komórki wzbogacone w CD14 przy ciśnieniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze poniżej 4 °C.
  26. Policz komórki za pomocą komory Neubauera.
  27. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pełnego RPMI z interleukiną-4 (IL-4) (100 μL/ml) + czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) (50 ng / ml).
    UWAGA: GM-CSF to cytokina wydzielana przez makrofagi, limfocyty T, komórki tuczne, komórki NK , komórki śródbłonka i fibroblasty, która indukuje różnicowanie i proliferację mieloidalnych komórek progenitorowych w szpiku kostnym. GM-CSF i IL-4 są używane do indukowania różnicowania komórek dendrytycznych32.
  28. Komórki nasienne na 24-dołkowej płytce o stężeniu 2 × 10 5 komórek na basenik w 500 μl kompletnej pożywki RPMI zawierającej i inkubować komórki przez 7 dni w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.

2. Uprawa Leishmania infantum

UWAGA: Pasożyty Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262) są używane w tym teście. Chomiki zostały zakażone dożylnie 20 μl roztworu zawierającego 1 x 106 L. infantum promastigotes w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Po 1 do 2 miesiącach zwierzęta poddano eutanazji, a amastigotyczne formy Leishmania zostały odzyskane ze śledziony i zróżnicowane w promastigotes33.

  1. Hodować L. infantum promastigotes wyizolowane z wcześniej zakażonych śledziony chomika w pochyłej 25 cm kolbie do hodowli komórkowej zawierającej 3 ml pożywki Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) i 5 ml uzupełnionej minimalnej pożywki niezbędnej (MEM).
    UWAGA: W tym teście pożywkę MEM uzupełniono 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 24,5 nM heminą bydlęcą.
  2. Inkubować w temperaturze 24 °C przez 7 dni w inkubatorze BZT (zapotrzebowanie na biotlen).
  3. Odpipetować 100 μl kultury promastigotów do nowej kolby hodowlanej o średnicy 25 cm2 zawierającej 5 ml uzupełnionej pożywki MEM.
  4. Inkubować kulturę promastygotów w temperaturze 24 °C w inkubatorze BZT, aż promastigoty osiągną fazę stacjonarną. Okresowo licz hodowane promastygoty, przenosząc podwielokrotność zawiesiny pasożyta rozcieńczonej w soli fizjologicznej do komory Neubauera (tj. hemocytometru) w celu określenia stacjonarnej fazy wzrostu.
    UWAGA: Nie zaleca się stosowania pasożytów pierwszego pasażu po hodowli w pożywce NNN, aby uniknąć pozostałości śladów krwi królika.
  5. Przenieść 1 x 105 stacjonarnej kultury promastigoty L. infantum fazy wzrostu do nowej kolby do hodowli komórkowych o długości 25 cm i dodać 5 ml pożywki z dodatkiem MEM.
  6. Okresowo monitorować wzrost kultury przez około 7 dni za pomocą komory Neubauera, aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Pasożyty są teraz gotowe do użycia w eksperymentalnych procedurach infekcji.
    UWAGA: Uważa się, że kultury promastigoty są zdolne do infekcji przez maksymalnie 7 pasaży in vitro; dodatkowe pasaże mogą powodować utratę zjadliwości.

3. Zakażenie ludzkimi komórkami dendrytycznymi

  1. Wewnątrz biologicznej komory z przepływem laminarnym przenieść całą zawartość kolby do hodowli pasożytów do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
  2. Dodać zimny roztwór soli fizjologicznej do końcowej objętości 40 ml.
  3. Wirować przy 1 600x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml zimnego roztworu soli (powtórzyć kroki 3.3-3.4 trzy razy).
  5. Po umyciu komórek w celu usunięcia wszelkich nieżywotnych pasożytów, ponownie zawieś osad w 1 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej.
  6. Przepuść zawartość powoli przez strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 16 G 5 razy, aby oddzielić skupiska pasożytów.
  7. Usunąć podwielokrotność, aby określić stężenie pasożyta w hemocytometrze (obliczyć średnią liczbę pasożytów w 4 kwadrantach x współczynnik rozcieńczenia x 104).
  8. Przemyć komórki dendrytyczne, dodając 1 ml roztworu soli i odwirowując komórki w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (3 razy).
  9. Obliczyć ilość L. infantum wymaganą do eksperymentalnej infekcji; stosunek: 20 pasożytów na komórkę.
  10. Umieścić wymaganą objętość L. infantum w każdym dołku płytek do hodowli komórkowych.
  11. Inkubować komórki dendrytyczne z pasożytami przez 4 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C w temperaturze poniżej 5% CO2 .
  12. Po kroku 3.11 odwirować płytki o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze poniżej 4 °C.

4. Test migracji z użyciem wkładek do hodowli komórkowych

  1. Po zakażeniu przemyj komórki dendrytyczne (zakażone lub nie) 3 razy 1 ml roztworu soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej, aby usunąć niezinternalizowane pasożyty. Po każdym myciu odwirować płytki o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze poniżej 4 °C.
  2. Po usunięciu niezinternalizowanych pasożytów należy odłączyć komórki, dodając 200 μl odczynnika do dysocjacji komórek do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut. Przechowywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
  3. Homogenizuj komórki za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl, aby umożliwić ich rozluźnienie.
  4. Przenieś zdysocjowane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  5. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Zawiesić osad w 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS.
  7. Zawartość każdej probówki przepuścić powoli przez strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 25 G 5 razy, aby oddzielić komórki.
  8. Usunąć podwielokrotność, rozcieńczyć za pomocą błękitu trypanowego, aby określić stężenie komórek za pomocą hemocytometru (średnia żywotnych komórek w 4 kwadrantach × współczynnik rozcieńczenia × 104).
  9. Przygotowanie wkładek do mikropłytek do hodowli komórkowych:
    UWAGA: Wstawki do hodowli komórkowych (membrana poliwęglanowa o porach 5,0 μM) są zalecane do testów migracji z wykorzystaniem komórek dendrytycznych, makrofagów i monocytów, ponieważ wstawki te umożliwiają fagocytom przejście przez błony.
    1. Usuń wkładki sterylną pęsetą i umieść w pustych studzienkach.
    2. Dodać 600 μl pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS do każdej studzienki; dodać chemoatraktant chemoatraktant chemookinowy (motyw C-C) ligand 3 (CCL3) (1 μl na każdy 1 ml pożywki).
      UWAGA: CCL3 to chemokina, która reguluje migrację DC34.
    3. Za pomocą sterylnej pęsety umieść wkładki w studzienkach zawierających pożywkę.
  10. Dodać 2 x 105 komórek dendrytycznych (zakażonych lub nie) w 100 μl pożywki do każdej wkładki.
  11. Inkubować przez 4 godziny, aby umożliwić migrację komórek.
  12. Po 4 godzinach wyjąć płytkę i zassać pożywkę. Dodać 100 μl 4% paraformaldehydu i inkubować przez 15 min.
  13. Usunąć paraformaldehyd i dodać 100 μl roztworu soli fizjologicznej.
    UWAGA: Płyty można przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego montażu.
  14. Zebrać supernatant z wkładek lub studzienek, aby policzyć odpowiednio komórki niemigrujące lub te, które przeszły przez błonę. Inkubować z paraformaldehydem 4% przez 15 minut.
  15. Skoncentruj komórki za pomocą techniki cytowirowania35.
  16. Dodać 10 μl podłoża montażowego z DAPI do membran i umieścić szkiełka nakrywkowe na studzienkach.
  17. Montaż membrany wkładu.
    UWAGA: Ten krok można wykonać na zewnątrz szaf bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Usuń membrany wkładek ze studzienek.
    2. Zeskrob powierzchnię wkładki wacikiem, aby usunąć wszelkie komórki, które nie migrowały.
    3. Za pomocą skalpela usuń membranę z wkładu.
    4. Umieść membranę na szkiełku, komórkami skierowanymi do góry.
    5. Do każdej membrany dodać 10 μl podłoża montażowego z DAPI, a następnie nałożyć szkiełka nakrywkowe.
    6. Przykryj płyty folią aluminiową.
    7. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie przechowywać w temperaturze -20 °C
  18. Aby przeanalizować migrację komórek, policz liczbę komórek w polu (nie mniej niż 10 pól) za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy długości fali wzbudzenia laserowego 405 nm.

5. Test adhezji i ocena polimeryzacji aktyny metodą immunofluorescencji

UWAGA: Do tego testu użyj 24-dołkowych płytek z szkiełkami nakrywkowymi.

  1. Po zakażeniu komórek przez 4 godziny przemyj każdą studzienkę 3 razy sterylnym roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane pasożyty.
  2. Odwirować płytkę przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Dodać 500 μl 4% paraformaldehydu do każdej studzienki przez 15 minut.
  3. Usuń paraformaldehyd i dodaj 1 ml roztworu soli fizjologicznej.
  4. Przygotować roztwory zgodnie z opisem w tabeli 1.
Podstawowe rozwiązaniazwiązek chemicznyRozcieńczalnika
Roztwór chlorku amonu0,134 g NH4Cl50 ml PBS 1X
Saponina 15%150 mg saponiny1 ml de PBS 1X
Albumina z surowicy bydlęcej (ABS) 10%1 g ABS10 ml PBS 1X
Rozwiązania drugorzędneSkładnik 1Składnik 2Składnik 3
Saponina 0,15%1 ml saponiny 15%100 ml PBS 1X-
PBS 1X / ABS 3% / Saponina 0,15%13,8 ml PBS 1X6 ml ABS 10%200 μL saponiny 15%
PBS1X / ABS 0,3% / Saponina 0,15%:19,2 ml PBS 1X0,6 ml ABS 10%200 μL saponiny 15%
PBS 1X / ABS 1% / Saponina 0,15%17,8 ml PBS 1X2 ml ABS 10%200 μL saponiny 15%

Tabela 1: Przepisy buforowe.

  1. Barwienie immunologiczne
    UWAGA: Następujące czynności należy wykonać pod wpływem mieszania.
    1. Szkiełka nakrywkowe myć 3 razy za pomocą 1x PBS przez 5 min.
    2. Dodawać 500 μl roztworu chlorku amonu do studzienki przez 10 minut.
    3. Szkiełka nakrywkowe myć 3 razy za pomocą 1x PBS przez 5 min.
    4. Przepuszczać błonę z saponiną 0,15% przez 15 min.
    5. Inkubować komórki z roztworem blokującym (PBS 1x / ABS 3% / Saponina 0,15%) przez 1 godzinę.
    6. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą PBS 1x/Saponin 0,15% przez 5 min.
    7. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w PBS 1x / ABS 1% / Saponina 0,15% jako: Królik anty-FAK (pTyr397): rozcieńczenie 1:500, Królik anty-paxilin (pTyr118): rozcieńczenie 1:100. Mouse Anti-Rac1: rozcieńczenie 1:100. Królik Anti-Cdc42: Rozcieńczenie 1:200. Królik Anti-RhoA: rozcieńczenie 1:200.
    8. Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w PBS 1x/ABS 1%/Saponina 0,15% przez 1 h.
      UWAGA: FAK i Paxillin są kluczowymi cząsteczkami biorącymi udział w tworzeniu kompleksów adhezyjnych13,14,15. Rodzina Rho GTPazy jest odpowiedzialna za organizację cytoszkieletu aktynowego. RAC1 i Cdc42, znajdujące się na przedniej krawędzi komórki, kontrolują tworzenie odpowiednio lamellipodiów i filopodiów; RhoA znajduje się z tyłu komórki i bierze udział w skurczu cytoszkieletu15, 23,24,25.
    9. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy z 1x PBS/Saponina 0,15% przez 5 min.
    10. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe lub falloidynę w następujący sposób: IgG przeciw królicowi, Alexa Fluor 568: rozcieńczenie 1:500; Anty-mysie IgG, Alexa Fluor 488: rozcieńczenie 1:500; Anty-mysie IgG, Alexa Fluor 594: rozcieńczenie 1:500; Phalloidyna Alexa Fluor 488: rozcieńczenie 1:1200.
    11. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym lub falloidyną rozcieńczoną w 1x PBS/ABS 0,3%, saponinie 0,15% przez 45 min.
      UWAGA: Inkubację przeciwciała drugorzędowego lub falloidyny należy przeprowadzać przy braku światła. Przykryj płyty folią aluminiową, aby chronić przed światłem podczas wykonywania następujących czynności.
    12. Szkiełka nakrywkowe myć 3 razy za pomocą 1x PBS przez 5 min.
    13. Usuń szkiełka nakrywkowe ze studzienek.
    14. W przypadku braku światła dodać 10 μl podłoża montażowego z DAPI na czyste mikroskopijne szkiełka podstawowe.
    15. Umieść szkiełka nakrywkowe komórkami skierowanymi w dół, aby umożliwić kontakt między komórkami a roztworem DAPI.
      UWAGA: Przykryj szkiełka folią aluminiową, aby chronić przed światłem.
    16. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    17. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

6. Mikroskopia konfokalna, akwizycja obrazu i kwantyfikacja za pomocą FIJI

UWAGA: Aby uzyskać/uchwycić obrazy immunofluorescencji, użyj konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. W celu uzyskania optymalnej rozdzielczości zalecana jest soczewka obiektywowa 63x z olejem.

  1. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do osiągnięcia temperatury pokojowej, chronione przed światłem, przez co najmniej 30 minut przed uzyskaniem obrazu.
  2. Wyczyść szkiełka nakrywkowe chusteczką chłonną.
  3. Dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu i umieść każde szkiełko pod mikroskopem.
  4. Przesuwaj obiektyw, aż olej dotknie suwaka.
  5. Obserwuj i wyreguluj ostrość mikroskopu; wybierz obiektyw 63x z olejem.
  6. Włącz lasery o długości fal 488 nm, 552 nm i 405 nm.
  7. Wybierz rozdzielczość obrazu: 1024 x 1024.
  8. Kliknij przycisk Na żywo, ustaw stos Z i naciśnij Start. Powtórz proces, a następnie naciśnij End.
  9. Po wybraniu opcji Maksymalna projekcja w menu Narzędzia poczekaj na uzyskanie obrazu.
  10. Zapisz eksperyment.
  11. Eksportuj obrazy w formacie .lif na komputerze. Użyj oprogramowania do analizy obrazów FIJI o otwartym kodzie źródłowym do analizy obrazów.
  12. Wybierz obrazy do analizy i wybierz opcję Duplikuj obraz.
  13. Aby obraz był w skali szarości, wybierz opcję Obraz | Dostosuj | Próg koloru. Wybierz wartości 0 i 255 (nasycenie).
  14. Wybierz metodę progową: Domyślna.
  15. Wybierz kolor progu: B i W (czarno-biały).
  16. Nie wybieraj opcji Ciemne tło.
  17. Wybierz: Proces | Binarny | Opcje, a następnie wybierz odpowiednie dane do pomiaru: Obszar, Min, Maksimum, wartość szarości, gęstość całkowania.
  18. Wybierz narzędzie wolnych rąk na pasku narzędzi Fidżi i ostrożnie prześledź każdą komórkę ręcznie.
  19. Z menu Analizuj wybierz opcję Ustaw miary. Upewnij się, że wybrana jest intensywność zintegrowana z obszarem i średnia wartość szarości. Powtórz ten proces dla każdej komórki.
  20. Zaznacz wszystkie dane w oknie Wyniki, a następnie skopiuj je i wklej do pliku arkusza kalkulacyjnego.
  21. Oblicz skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek (CTCF): CTCF (Gęstość całkowania = Powierzchnia wybranej komórki x Średnia fluorescencja odczytów tła).
  22. Otwórz plik zawierający dane za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej, aby przeprowadzić analizę statystyczną.

7. Analiza statystyczna

  1. Otwórz nowy projekt, gdy pojawi się powitalne okno dialogowe.
  2. Wybierz typ wykresu i medium z SD.
  3. Zastosuj wartości uzyskane z wyników eksperymentalnych do tabeli.
  4. Wybierz pozycję Statystyki opisowe i wybierz kolumnę opcji Statystyka [wszystkie testy], aby przeanalizować rozkład danych.
  5. Jeśli dane są zgodne z rozkładem Gaussa, wybierz test t, aby przeanalizować próbki, porównując dwie pary. Jeśli rozkład jest inny niż gaussowski, przeanalizuj dane za pomocą testu Manna-Whitneya.
  6. Wybierz najlepszą opcję wykresu, aby uzyskać optymalną reprezentację danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany w niniejszym dokumencie protokół umożliwia ocenę migracji komórek oraz związanych z nią mechanizmów, takich jak dynamika aktyny i adhezja, dostarczając tym samym narzędzia do określania migracji zainfekowanych Leishmania komórek gospodarza w obrębie kręgowca. Przedstawione tutaj wyniki wykazują, że ten test in vitro zapewnia szybkie i spójne wskazówki dotyczące zmian w adhezji komórkowej, migracji i dynamice aktyny przed przystąpieniem do eksperymentów in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda oceny migracji komórek za pomocą systemu wstawiania błony do hodowli komórkowej pozwala naukowcom badać odpowiedź migracyjną komórek w środowisku dwuwymiarowym. W tej technice niektóre kroki są uważane za krytyczne. Po pierwsze, zróżnicowanie ludzkich DC i zakażenie Leishmania są decydujące, ponieważ wskaźnik zakażeń jest zależny od dawcy. Użycie więcej niż jednego dawcy na eksperyment i zdrowych kultur Leishmania pozwoli na uzyskanie bardziej spójnych wyników. Kluczowe jest również...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Bahia Research Support Foundation (Fapesb), grant numer 9092/2015. Autorzy dziękują CNPq, Capes i Fapesb za wsparcie finansowe w postaci stypendiów. Autorzy pragną podziękować Andrisowi K. Walterowi za krytyczną analizę, korektę języka angielskiego i pomoc w redakcji manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła o rozmiarze 16Descarpack353101
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowychJET-BIOFILJ011024
25 IgłaDescarpack353601
Albumina z surowicy bydlęcejSigma AldrichA2153-100G
Chlorek amonuSigma AldrichA-0171
IgG przeciw myszy, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anty-mysie IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anty-królicze IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MikrokulkiMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Kolba do hodowli komórkowych 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Mikroskop konfokalnyLeicaTCS SP8
Szkiełka nakrywkowe 13mmPerfecta10210013CE
Kleszcze preparacyjneVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Rurka FalconKASVIK19-0051
Surowica bydlęcapłodu gibco
Mikroskop fluorescencyjnyOlympus  BX51
Szkiełko szkiełkowe  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bydlęceSigma AldrichH2250
HemocytometrPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
Bufor MACSMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Niezbędne MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemThermoFisherAM9624
Membrana poliwęglanowa Transwell - Wielkość porów 5,0 i mikro; mZestaw DAPI Corning3421
ProLong GoldInvitrogenP36931
Królik anty-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Królik anty-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Królik anty-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Królik anty-RhoAInvitrogenOSR00266W
Rekombinowany ludzki CCL3R& D Systems270-LD-010
Rekombinowany człowiek GM-CSFPeproTech300-03
Rekombinowany człowiek IL-4PeproTech200-04
Rekombinowany człowiek M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Strzykawka 3 mlDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061
16000044

Bibliografia

  1. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. The Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  2. Bi, K., Chen, Y., Zhao, S., Kuang, Y., John Wu, C. H. Current Visceral Leishmaniasis Research: A Research Review to Inspire Future Study. BioMed Research International. 2018, (2018).
  3. Serafim, T. D., Iniguez, E., Oliveira, F. Leishmania infantum. Trends in Parasitology. 36 (1), 80-81 (2020).
  4. Van Assche, T., Deschacht, M., da Luz, R. A. I., Maes, L., Cos, P. Leishmania-macrophage interactions: Insights into the redox biology. Free Radical Biology and Medicine. 51 (2), 337-351 (2011).
  5. Podinovskaia, M., Descoteaux, A. Leishmania and the macrophage: A multifaceted interaction. Future Microbiology. 10 (1), 111-129 (2015).
  6. Antoine, J. C., Prina, E., Jouanne, C., Bongrand, P. Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensis-infected macrophages maintain an acidic pH. Infection and Immunity. 58 (3), (1990).
  7. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  8. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  9. Sheetz, M. P., Felsenfeld, D., Galbraith, C. G., Choquet, D. Cell migration as a five-step cycle. Biochemical Society symposium. 65, 233-243 (1999).
  10. Yano, H., et al. Roles played by a subset of integrin signaling molecules in cadherin-based cell-cell adhesion. Journal of Cell Biology. 166 (2), 283-295 (2004).
  11. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: In command and control of cell motility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (1), 56-68 (2005).
  12. Deramaudt, T. B., et al. Altering FAK-Paxillin Interactions Reduces Adhesion, Migration and Invasion Processes. PLoS One. 9 (3), (2014).
  13. Turner, C. E. Paxillin and focal adhesion signalling. Nature Cell Biology. 2 (12), (2000).
  14. Linder, S., Aepfelbacher, M. Podosomes: Adhesion hot spots of invasive cells. Trends in Cell Biology. 13 (7), 376-385 (2003).
  15. Huveneers, S., Danen, E. H. J. Adhesion signaling - Crosstalk between integrins, Src and Rho. Journal of Cell Science. 122 (8), 1059-1069 (2009).
  16. Jones, G. E. Cellular signaling in macrophage migration and chemotaxis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 593-602 (2000).
  17. De Fougerolles, A. R., Koteliansky, V. E. Regulation of monocyte gene expression by the extracellular matrix and its functional implications. Immunological Reviews. 186 (1), 208-220 (2002).
  18. Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. a, Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. The Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 9998-10006 (2011).
  19. Verkhovsky, A. B., et al. Orientational order of the lamellipodial actin network as demonstrated in living motile cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (11), 4667-4675 (2003).
  20. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  21. Hall, A. Small GTP-binding proteins, and the regulation of the actin cytoskeleton. Annual Review of Cell Biology. 10, 31-54 (1994).
  22. Machesky, L. M., Hall, A. Rho: A connection between membrane receptor signalling and the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 6 (8), 304-310 (1996).
  23. Ridley, A. J., Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 70 (3), 389-399 (1992).
  24. DeMali, K. A., Burridge, K. Coupling membrane protrusion and cell adhesion. Journal of Cell Science. 116 (12), 2389-2397 (2003).
  25. López-Colomé, A. M., Lee-Rivera, I., Benavides-Hidalgo, R., López, E. Paxillin: A crossroad in pathological cell migration. Journal of Hematology and Oncology. 10 (1), (2017).
  26. Carvalhal, D. G. F., et al. The modelling of mononuclear phagocyte-connective tissue adhesion in vitro: Application to disclose a specific inhibitory effect of Leishmania infection. Experimental Parasitology. 107 (3-4), 189-199 (2004).
  27. Pinheiro, N. F., et al. Leishmania infection impairs β1-integrin function and chemokine receptor expression in mononuclear phagocytes. Infection and Immunity. 74 (7), 3912-3921 (2006).
  28. de Menezes, J. P. B., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), (2017).
  29. Hermida, M. D. R., Doria, P. G., Taguchi, A. M. P., Mengel, J. O., dos-Santos, W. L. C. Leishmania amazonensis infection impairs dendritic cell migration from the inflammatory site to the draining lymph node. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 450(2014).
  30. Ballet, R., et al. Blocking junctional adhesion molecule c enhances dendritic cell migration and boosts the immune responses against Leishmania major. PLoS Pathogens. 10 (12), (2014).
  31. Rocha, M. I., et al. Leishmania infantum enhances migration of macrophages via a phosphoinositide 3-Kinase î-dependent pathway. ACS Infectious Diseases. 6 (7), 1643-1649 (2020).
  32. Hiasa, M., et al. GM-CSF and IL-4 induce dendritic cell differentiation and disrupt osteoclastogenesis through M-CSF receptor shedding by up-regulation of TNF-α converting enzyme (TACE). Blood. 114 (20), 4517-4526 (2009).
  33. de Melo, C. V. B., et al. Phenotypical characterization of spleen remodeling in murine experimental visceral leishmaniasis. Frontiers in Immunology. 11, 653(2020).
  34. Gibaldi, D., et al. CCL3/macrophage inflammatory protein-1α is dually involved in parasite persistence and induction of a TNF- and IFNγ-enriched inflammatory milieu in Trypanosoma cruzi-induced chronic cardiomyopathy. Frontiers in Immunology. 11, 306(2020).
  35. Finger, P. T., Papp, C., Latkany, P., Kurli, M., Iacob, C. E. Anterior chamber paracentesis cytology (cytospin technique) for the diagnosis of intraocular lymphoma. British Journal of Ophthalmology. 90 (6), 690-692 (2006).
  36. Zhang, C., Barrios, M. P., Alani, R. M., Cabodi, M., Wong, J. Y. A microfluidic Transwell to study chemotaxis. Experimental Cell Research. 342 (2), 159-165 (2016).
  37. Glynn, S. A., O'Sullivan, D., Eustace, A. J., Clynes, M., O'Donovan, N. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors, simvastatin, lovastatin and mevastatin inhibit proliferation and invasion of melanoma cells. BMC Cancer. 8, (2008).
  38. van de Merbel, A. F., vander Horst, G., Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Protocols for migration and invasion studies in prostate cancer. Methods in Molecular Biology. 1786, 67-79 (2018).
  39. Omar Zaki, S. S., Kanesan, L., Leong, M. Y. D., Vidyadaran, S. The influence of serum-supplemented culture media in a transwell migration assay. Cell Biology International. 43 (10), 1201-1204 (2019).
  40. Borovikov, I. S. Izuchenie strukturnykh izmeneniǐ sokratitel'nykh belkov myshechnogo volokna s pomoshch'iu poliarizatsionnoǐ ul'trafioletovoǐ fluorestsentnoǐ mikroskopii. VIII. Vliianie glutaral'degida i falloidina na konformatsiiu F-aktina. Tsitologiya. 26 (11), 1262-1266 (1984).
  41. Cooper, J. A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. The Journal of Cell Biology. 105 (4), 1473-1478 (1987).
  42. Allen, W. E., Jones, G. E., Pollard, J. W., Ridley, A. J. Rho, Rac and Cdc42 regulate actin organization and cell adhesion in macrophages. Journal of Cell Science. 110, 707-720 (1997).
  43. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zaka enie Leishmaniakom rki dendrytycznemigracja makrofag wdynamika aktynykompleksy adhezyjnetest in vitrorozprzestrzenianie si paso yta

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.