Artykuł metodologiczny

Mikronaświetlanie laserowe do badania rekrutacji DNA w fazie S

6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62466

⸱

16 kwietnia 2021

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 2Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, New York University School of Medicine, 3Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje nieinwazyjną metodę efektywnej identyfikacji komórek fazy S do dalszych badań mikroskopowych, takich jak pomiar rekrutacji białka naprawczego DNA za pomocą mikronapromieniowania laserowego.

Streszczenie

Naprawa uszkodzeń DNA utrzymuje integralność genetyczną komórek w wysoce reaktywnym środowisku. Komórki mogą akumulować różnego rodzaju uszkodzenia DNA spowodowane zarówno endogennymi, jak i egzogennymi źródłami, takimi jak aktywność metaboliczna lub promieniowanie UV. Bez naprawy DNA kod genetyczny komórki zostaje naruszony, podważając struktury i funkcje białek i potencjalnie powodując choroby.

Zrozumienie czasoprzestrzennej dynamiki różnych szlaków naprawy DNA w różnych fazach cyklu komórkowego jest kluczowe w dziedzinie naprawy uszkodzeń DNA. Obecne techniki mikroskopii fluorescencyjnej dostarczają doskonałych narzędzi do pomiaru kinetyki rekrutacji różnych białek naprawczych po indukcji uszkodzenia DNA. Synteza DNA podczas fazy S cyklu komórkowego jest szczególnym punktem w losie komórki dotyczącym naprawy DNA. Zapewnia unikalne okno do badania całego genomu pod kątem błędów. Jednocześnie błędy syntezy DNA stanowią również zagrożenie dla integralności DNA, które nie występuje w komórkach niedzielących się. Dlatego procesy naprawy DNA różnią się znacznie w fazie S w porównaniu z innymi fazami cyklu komórkowego, a różnice te są słabo poznane.

Poniższy protokół opisuje przygotowanie linii komórkowych i pomiar dynamiki białek naprawczych DNA w fazie S w lokalnie indukowanych miejscach uszkodzenia DNA, przy użyciu laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w linię laserową 405 nm. Oznaczone PCNA (z mPlum) jest używane jako marker cyklu komórkowego w połączeniu z białkiem naprawczym znakowanym AcGFP (tj. EXO1b) do pomiaru rekrutacji uszkodzeń DNA w fazie S.

Wprowadzenie

Kilka ścieżek naprawy DNA wyewoluowało, aby zwalczać różne rodzaje uszkodzeń DNA, które mogą powstać w komórkach, z których wszystkie są wysoce regulowane zarówno w przestrzeni, jak i w czasie. Jednym z najbardziej wrażliwych okresów cyklu komórkowego jest faza S, w której zachodzi synteza DNA. Chociaż proliferacja ma fundamentalne znaczenie dla życia, stanowi również poważne wyzwanie. Komórki muszą zapewnić wierną replikację swojego genomu, aby uniknąć przekazania mutacji przyszłym pokoleniom. W związku z tym proliferacja stanowi terapeutyczny punkt interwencji, który został wykorzystany do opracowania podejść terapeutycznych w dziedzinie onkologii.

Wszystkie główne techniki używane do badania rekrutacji białek w uszkodzeniach DNA mają swoje mocne i słabe strony. Mikropromieniowanie ma lepszą rozdzielczość przestrzenną i czasową1 niż większość alternatywnych metod, takich jak immunofluorescencyjne obrazowanie ognisk wywołanych promieniowaniem jonizującym (IRIF), immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) lub frakcjonowanie biochemiczne. Jednak mikronapromienianie potwierdza solidność wyżej wymienionych technik, które mogą pobierać próbki z dużej liczby komórek w tym samym czasie.

Aby zbadać naprawę DNA w fazie S, trzeba być w stanie rozróżnić komórki fazy S w asynchronicznej populacji hodowli komórek. Istnieje wiele dobrze znanych metod, aby temu zaradzić, obejmujących synchronizację komórek lub wizualizację różnych faz cyklu komórkowego. Oba podejścia wiążą się jednak z poważnymi wyzwaniami i możliwymi artefaktami. Metody synchronizacji chemicznej szeroko stosowane do wzbogacania komórek we wczesnej fazie S (np. Podwójny blok tymidyny, afidikolina i leczenie hydroksymocznikiem) osiągają synchronizację poprzez indukcję stresu replikacyjnego i ostatecznie uszkodzenie samego DNA. Ogranicza to użycie tych metod do badania procesów naprawy DNA w fazie S2. Synchronizacja poprzez głód i uwalnianie surowicy ma zastosowanie tylko do ograniczonej liczby linii komórkowych, w dużej mierze wykluczając linie komórek rakowych, które w mniejszym stopniu polegają na czynnikach wzrostu dla progresji cyklu komórkowego w porównaniu z nieprzekształconymi liniami komórkowymi. System FUCCI (Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator) jest szczególnie przydatnym narzędziem do badania cyklu komórkowego, ale ma zasadnicze ograniczenie podczas różnicowania faz cyklu komórkowego S i G23.

Tutaj pokazano, że użycie fluorescencyjnie znakowanego PCNA jako nieinwazyjnego markera dla fazy S ogranicza wady metod chemicznej synchronizacji cyklu komórkowego, pozwalając jednocześnie na większą specyficzność i elastyczność niż system FUCCI. Jako pojedynczy marker, PCNA może nie tylko wyróżnić komórki fazy S w populacji asynchronicznej, ale może również pokazać dokładny postęp komórek w fazie S (tj. wczesnej, środkowej lub późnej fazie S)4. Niski poziom ekspresji egzogennego, znakowanego PCNA zapewnia minimalną ingerencję zarówno w progresję cyklu komórkowego, jak i procesy naprawy DNA. Co ważne, PCNA służy również jako wewnętrzna kontrola dla prawidłowej indukcji uszkodzeń DNA, ponieważ bierze udział w naprawie kilku uszkodzeń DNA i jest rekrutowany do lokalnie indukowanych miejsc uszkodzenia DNA1,4.

Eksperymenty przedstawione tutaj pokazują, jak zmierzyć dynamikę rekrutacji EXO1b w fazie S i jak wpływa na to dobrze znany inhibitor PARP, olaparyb. Aktywność nukleazy EXO1b jest istotna dla szerokiego zakresu szlaków naprawy DNA, w tym naprawy niedopasowania (MMR), naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER) i naprawy pęknięć dwuniciowych (DSB). W fazie S EXO1b odgrywa główną rolę w rekombinacji homologicznej (HR) poprzez tworzenie nawisów 3' ssDNA podczas resekcji DNA5. EXO1b jest dalej zaangażowany w replikację DNA, odgrywając rolę w aktywacji punktów kontrolnych w celu ponownego uruchomienia zablokowanych widełek DNA, a także w usuwaniu starterów i dojrzewaniu fragmentów Okazaki na opóźnionej nici podczas przemieszczenia nici w replikacji5. Rekrutacja EXO1b do uszkodzonych miejsc DNA jest regulowana przez bezpośrednią interakcję z poli (ADP-rybozą) (PAR)6,7. Ze względu na liczne implikacje EXO1b specyficzne dla cyklu komórkowego, jest to doskonały wybór do badań rekrutacyjnych specyficznych dla fazy S z wykorzystaniem PCNA.

Protokół

1. Hodowla komórek pochodzących z ludzkiego kostniakomięsaka (U-2 OS)

UWAGA: Komórki U-2 OS są idealne do tych badań, ponieważ mają płaską morfologię, duże jądro i silnie przylegają do kilku powierzchni, w tym szkła. Można również wykorzystać inne linie komórkowe o podobnych cechach.

  1. Do hodowli linii komórkowych U-2 OS należy użyć pożywki McCoy's 5A uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 . W przypadku badań mikroskopowych utrzymuj hodowlę komórkową w 10-centymetrowym naczyniu, aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek.
  2. Gdy komórki zbliżą się do 90% zbiegu (~7 x 106 komórek/10 cm talerzyk), podziel komórki.
    1. Przepłucz komórki PBS, aby zmyć inhibitory trypsyny zawarte w surowicy.
    2. Dodaj 1 ml trypsyny-EDTA i upewnij się, że warstwa komórkowa jest równomiernie pokryta.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do momentu oderwania warstwy komórek od płytki (około 6 min).
    4. Ponownie zawiesić trypsynizowane komórki w pożywce zawierającej surowicę, aby dezaktywować trypsynę i dodać 1/10 objętości (~0,7 x 106 komórek) do nowej 10-centymetrowej płytki zawierającej 10 ml uzupełnionej pożywki wzrostowej.
  3. Przed eksperymentami należy rutynowo przetestować komórki pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą za pomocą uniwersalnego zestawu do wykrywania mykoplazmy zgodnie z zaleceniami producenta.

2. Zakażenie retrowirusowe

UWAGA: Dla środków bezpieczeństwa BSL-2 i podczas pracy z rekombinowanymi wirusami, proszę zapoznać się z: Wytyczne NIH, Sekcja III-D-3: Rekombinowane wirusy w hodowli tkankowej.

  1. Wysiewaj 4 x 106 HEK293T komórek, aby osiągnąć ~60% zgryźliwości w ciągu 24 godzin po posianiu w 10 cm naczyniu hodowlanym.
    1. W celu uprawy HEK293T należy postępować zgodnie z krokami uprawy U-2 OS opisanymi w 1.1-1.3 niniejszego protokołu. Dla HEK293T zastąp pożywkę McCoy's 5A dla DMEM. Pamiętaj, aby zawsze delikatnie umyć HEK293T komórki, ponieważ słabo przyczepiają się do płytek do hodowli tkankowych.
  2. Transfekcja komórek HEK293T za pomocą odczynnika do transfekcji na bazie lipidów do wirusowego pakowania plazmidów.
    1. W przypadku wektorów retrowirusowych połącz 1,5 μg VSV-G (Addgene #8454) i 1,5 μg wektorów pakujących pUMVC (Addgene #8449) wraz z 3 μg wektora zawierającego interesujący gen (w szkielecie wektora retrowirusowego z opornością na puromycynę) w 250 μl pożywki Opti-MEM o zmniejszonej surowicy w probówce do mikrowirówki. Dodać 1 μl odczynnika P3000 na każdy μg DNA dodany do mieszaniny Opti-MEM/DNA (w tym przypadku 6 μl) i delikatnie wymieszać, stukając. Nie wirować ani nie pipetować w górę iw dół.
    2. W innej probówce do mikrowirówki połączyć 2 μl na μg DNA (w tym przypadku 12 μl) odczynnika do transfekcji z 250 μl pożywki o zredukowanej surowicy Opti-MEM.
    3. Połącz obie mieszaniny (łącznie 500 μl, nie wirować, tylko delikatnie stukać) i pozostawić do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Ostrożnie dodawaj mieszaninę kroplami do zasianych komórek HEK293T, nie odrywając komórek. Delikatnie zakręć talerzami.
  3. Infekcja wirusowa w celu wytworzenia stabilnych linii komórkowych.
    1. Usunąć supernatant zawierający wirusa z komórek HEK293T 72 godziny po transfekcji. Ostrożnie przefiltruj roztwór za pomocą filtra 0,45 μm, aby usunąć resztki komórek i oderwane komórki. Opcjonalnie dodaj 8 μg/ml polibrenu do supernatantu wirusa, aby ułatwić infekcję wirusową.
    2. Dodać supernatant zawierający wirusa do komórek U-2 OS przy ~50% zbiegu w naczyniu o średnicy 10 cm (~3 x 10,6 komórek). Zasiej komórki U-2 OS dzień wcześniej.
    3. Infekować przez 6-16 godzin przed usunięciem i wyrzuceniem supernatantu zawierającego wirusa.
      UWAGA: Aby osiągnąć pożądaną ilość nadekspresji dla interesującego genu, należy inkubować serię rozcieńczeń wirusa przez określony czas. Sprawdź poziomy ekspresji transgenu w każdej nowo utworzonej linii komórkowej z western blot, porównując je z poziomami endogennymi.
    4. Pozwól komórkom dokonać selekcji w obecności odpowiednich antybiotyków (przez 3-4 dni w przypadku puromycyny w końcowym stężeniu 2 μg/ml) i zweryfikować ekspresję genu znakowanego białkiem fluorescencyjnym pod mikroskopem.
    5. Powtórz te kroki, aby wygenerować podwójnie oznakowane linie komórkowe. W prezentowanych tutaj eksperymentach mPlum-PCNA ulegał ekspresji z wektora retrowirusowego (pBABE) w połączeniu z EXO1B-AcGFP, również wyrażanego z wektora retrowirusowego (pRetroQ-AcGFP1-N1).

3. Przygotowanie komórek do mikronapromieniania

  1. Posiewanie komórek: 24 godziny przed eksperymentem poszczepić łącznie 8,0 x 104 komórki w objętości od 500 μl do 1 ml pożywki (dla około 70% zbieżności) na czterokomorowym szkle nakrywkowym z dnem ze szkła borokrzemianowego nr 1,5, co zapewnia idealne wyniki dla mikroskopii konfokalnej o dużym powiększeniu i mikronapromieniowania laserowego. Wyższa konfluencja komórek pozwala na pomiar większej liczby komórek w jednym polu widzenia (FOV); Jednak w pełni zlewające się szkiełka wprowadzą nieprawidłowości cyklu komórkowego.
  2. Pożywki do obrazowania: Na godzinę przed mikronaświetlaniem należy wymienić zwykłą pożywkę wzrostową na FluoroBrite DMEM uzupełnioną 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, 15 mM HEPES (pH = 7,4) i 1 mM pirogronianu sodu. Ten nośnik obrazowania pomaga zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, umożliwiając wykrywanie bardzo słabej fluorescencji. Ponieważ zawiera HEPES, stabilizuje również pH przy braku atmosfery 5% CO2 .
  3. Na tym etapie należy zastosować dodatkowe leczenie przed obrazowaniem. W przedstawionych tutaj eksperymentach komórki poddano wstępnej obróbce na godzinę przed obrazowaniem olaparybem (inhibitor PARP, w końcowym stężeniu 1 μM) lub kontrolą nośnika (DMSO)1,8,9.

4. Przygotowanie mikroskopu i wybór komórek fazy S do obrazowania.

  1. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć systemu konfokalnego, który ma podobne właściwości do systemu opisanego tutaj. Przedstawione tu eksperymenty zostały przeprowadzone przy użyciu mikroskopu konfokalnego zamontowanego na odwróconym statywie mikroskopu (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Zastosowany tutaj mikroskop został wyposażony w moduł laserowy FRAP o długości fali 50 mW i długości fali 405 nm oraz obiektyw planapochromatyczny o kącie nawiercania 60x 1,4 NA. Głowica skanująca konfokalna miała dwie opcje skanera: skaner galwanowy (do wysokiej rozdzielczości) i skaner rezonansowy (do szybkiego obrazowania).
    1. Wprowadzić do próbki laser do odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) za pomocą sterowanego programowo urządzenia galwanowego XY. Użyj linii laserowej 488 nm do wzbudzenia AcGFP i linii laserowej 561 nm lub 594 nm do wzbudzenia mPlum.
      UWAGA: Poniższa kombinacja filtrów daje optymalne wyniki: przy użyciu filtra długoprzepustowego 560 nm, światło emisyjne o długości fali mniejszej niż 560 nm przepuszczono przez filtr emisyjny 525/50 nm dla AcGFP, podczas gdy światło emisyjne o długości fali wyższej niż 560 nm przepuszczono przez filtr emisyjny 595/50 nm dla mPlum. Można zastosować dowolny odpowiedni zestaw filtrów (np. FITC/TRITC, GFP/mCherry, FITC/TxRed), który zapewnia minimalne przenikanie fluorescencji.
  2. Włącz komorę środowiskową i elementy mikroskopu.
    1. Włącz ogrzewanie (stage, obiektyw i komorę środowiskową, jeśli to możliwe), dopływ CO2 i regulator wilgotności co najmniej 4 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić równowagę termiczną dla stabilnej akwizycji obrazu.
    2. Zainicjuj źródła światła wraz z liniami lasera co najmniej 1 godzinę przed przeniesieniem komórek do mikroskopu.
  3. Wybierz komórki fazy S w populacji asynchronicznej, używając fluorescencyjnie znakowanego PCNA jako markera. Zrób to, wykonując poniższe czynności.
    1. Szukaj unikalnego wzorca lokalizacji PCNA znakowanego mPlum w fazie S, co umożliwia identyfikację tej fazy cyklu komórkowego. PCNA ma całkowicie jednorodny rozkład w jądrze w fazach G1 i G2 cyklu komórkowego, będąc jednocześnie wyłączonym z jąderek. W fazie S PCNA tworzy ogniska w miejscu replikosomów w jądrze. Rysunek 1 pokazuje różne wzorce ognisk PCNA w całej fazie S, co umożliwia nawet rozróżnienie wczesnej, środkowej i późnej fazy S.
    2. Spójrz przez oko, aby wybrać pole widzenia, które ma wystarczającą liczbę komórek fazy S do mikronapromieniowania. Asynchroniczne komórki U-2 OS mają zwykle 30-40% swojej populacji w fazie S.
    3. Staraj się unikać skrajnych poziomów ekspresji (zarówno jasnych, jak i ciemnych komórek) zarówno dla PCNA, jak i białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI), w tym przypadku EXO1b-AcGFP, co może prowadzić do eksperymentalnych artefaktów.
    4. Szukając odpowiedniego pola widzenia, staraj się unikać skanowania pola przez długi czas, aby zminimalizować fotowybielanie i niepożądane uszkodzenia DNA.
    5. Ustaw żądany obszar zainteresowania (ROI) dla mikronapromieniowania. Korzystając z odpowiedniego oprogramowania (patrz Tabela materiałów), ustaw żądany zwrot z inwestycji, wstawiając najpierw linie binarne (ustaw żądaną liczbę linii i odstępy). Kliknij pozycję Binarny, a następnie kliknij pozycję Wstaw wiersz | Okrąg | Elipsa, aby narysować żądaną liczbę linii.
    6. Przekształć te linie binarne w ROI, a na koniec przekształć te ROI w ROI stymulacji. Aby to zrobić, najpierw kliknij ROI, następnie kliknij Przenieś binarny do ROI, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny ROI i wybierz Użyj jako stymulacji ROI: S1. Umieść te linie w polu widzenia, aby przeszły przez jądro komórek. Zwroty z inwestycji o długości 1024 pikseli, które obejmowały całe pole widzenia, były używane w całym protokole.

5. Mikronapromienianie do barwienia immunofluorescencyjnego lub obrazowania poklatkowego.

  1. Określenie optymalnych ustawień mikronapromieniowania.
    1. Przed mikronapromienianiem komórek należy wykonać obraz pola widzenia o wyższej rozdzielczości, aby zidentyfikować ogniska PCNA do późniejszej analizy. Zamiast skanowania sekwencyjnego, nagrywaj jednocześnie oba używane kanały optyczne (zielony i czerwony), aby uniknąć ruchu komórek między skanowaniem na dwóch długościach fali. Dla prawidłowej rozdzielczości ognisk należy stosować rozdzielczość co najmniej 1024 x 1024 pikseli/pole z 1-krotnym zoomem (rozmiar piksela 0,29 μm w zastosowanym tu systemie obrazowania), z prędkością skanowania 1/8 klatki/s (4,85 μs/piksel) z 2-krotnym uśrednianiem. Po ustawieniu tych parametrów w oknach A1 LFOV Compact GUI i A1 LFOV Scan Area naciśnij przycisk Przechwyć, aby nagrać FOV.
      UWAGA: Ważne jest, aby zachować ten sam rozmiar piksela we wszystkich eksperymentach, aby zapewnić porównywalne wyniki.
    2. Aby skonfigurować mikronapromienianie, otwórz zakładkę Stymulacja ND w oprogramowaniu do obrazowania, aby uzyskać dostęp do okna Harmonogram czasowy (A1 LFOV / Galvano Device). Wykorzystuje to skanery galwanograficzne do uzyskania serii obrazów przed stymulacją, stymulacji (za pomocą lasera LUN-F 50 mW 405 nm FRAP), a następnie ponownego uzyskania serii obrazów po stymulacji za pomocą skanerów galwano. Najpierw skonfiguruj trzy fazy w oknie Harmonogram czasowy. W kolumnie Acq/Stim wybierz pozycję Akwizycja | Wybielanie | Akwizycja odpowiednio dla trzech faz. Dla fazy bielenia ustaw S1 jako ROI.
      UWAGA: W przedstawionym tutaj eksperymencie nie uzyskano żadnych obrazów podczas fazy stymulacji.
    3. W oknie Galvano XY ustaw kluczowe czynniki dla mikronapromieniowania: moc wyjściowa lasera 405 nm, czas przebywania (w tym systemie iteracja to domyślnie 1). W prezentowanych tutaj eksperymentach komórki naświetlano laserem FRAP o długości fali 405 nm (50 mW na końcówce światłowodu) przy 100% mocy wyjściowej i czasie przebywania 1000-3000 μs.
      UWAGA: Ponieważ czas przebywania lasera jest określany na piksel, tak długo, jak rozmiar piksela pozostaje taki sam, zależność między czasem przebywania a gęstością mocy będzie porównywalna między różnymi polami widzenia. Rysunek 2A pokazuje wykorzystanie białek specyficznych dla szlaku odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) (FBXL10 dla DSB i NTHL1 dla oksydacyjnych uszkodzeń zasadowych) do optymalizacji ustawień mocy lasera dla specyficznej indukcji uszkodzeń. Te stabilne linie komórkowe zostały wygenerowane z infekcją wirusową zgodnie z sekcją 2 protokołu.
  2. Obrazowanie poklatkowe.
    1. Skonfiguruj obrazowanie poklatkowe dla żądanego okna czasowego i interwałów, korzystając z okien Harmonogram czasowy, Kompaktowy graficzny interfejs użytkownika A1 LFOV i Obszar skanowania A1 LFOV. W przedstawionych tutaj eksperymentach rekrutacja EXO1b i PCNA była obrazowana przez 12 minut, skanując pole widzenia co 5 sekund, przy 1024 x 1024 pikselach / pole, przy użyciu 1-krotnego zoomu (co daje rozmiar piksela 0,29 μm w zastosowanym tutaj systemie obrazowania) z prędkością skanowania 0,35 klatki/s (1,45 μs / piksel) bez uśredniania w celu zmniejszenia fotowybielania.
    2. Zoptymalizuj ustawienia % mocy lasera, wzmocnienia i przesunięcia, aby zmniejszyć fotowybielanie podczas obrazowania w oknie A1 LFOV Compact GUI. Jeśli ktoś ma na celu zmierzenie zarówno POI, jak i PCNA, powinien użyć skanowania symultanicznego zamiast skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć ruchu komórek między skanowaniem pola w poszukiwaniu dwóch oddzielnych fluoroforów.
      1. System obrazowania został użyty z następującymi ustawieniami. Dla linii laserowej 488 nm (20 mW): 7% mocy lasera, wzmocnienie: 45 (detektor GaAsP) z i przesunięciem 2, dla linii laserowej 561 nm (20 mW): 4% mocy lasera, wzmocnienie 40 (detektor GaAsP) z i przesunięciem 2.
    3. W zależności od kinetyki białka wydłuż lub skróć odstęp między obrazami lub czas trwania całkowitego upływu czasu. W oknie Harmonogram czasu ustaw żądany interwał i czas trwania dla wiersza akwizycji trzeciej fazy.
    4. Naciśnij Uruchom teraz, aby wykonać mikronaświetlanie i następujące po nim obrazowanie poklatkowe.
    5. Pod koniec obrazowania poklatkowego zapisz ROI stymulacji jako osobne obrazy, które będą przydatną pomocą w identyfikacji współrzędnych mikropromieniowania w dowolnym oprogramowaniu używanym do analizy.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne.
    UWAGA: Krok 5.1.3 i Rysunek 2A pokazuje użycie znanych białek naprawy DNA do oceny typów uszkodzeń DNA wprowadzonych przez mikronapromienianie. Niektóre zmiany w DNA można również wykryć za pomocą specyficznych przeciwciał po utrwaleniu komórek. Możliwe jest również wykrycie rekrutacji POI poprzez wykrycie przeciwciał białka endogennego. Wizualizacja γH2A. X do sprawdzenia DSB pokazano poniżej (Rysunek 2B). Rysunek 3 pokazuje spójność lokalizacji i rekrutacji PCNA w całym cyklu komórkowym zarówno dla endogennych, jak i egzogennych oznaczonych PCNA.
    1. Po kroku 5.1.3 wykonaj tylko jedno zdjęcie po mikronapromieniowaniu, aby zapewnić prawidłowe zdarzenie FRAP w oparciu o rekrutację mPlum-PCNA. Zanotuj dokładne współrzędne pola widzenia, aby znaleźć pole później po znakowaniu immunofluorescencyjnym.
    2. Wyjąć komorę hodowli komórkowej z mikroskopu i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 5-10 min.
      UWAGA: Paraformaldehyd (PFA) jest toksyczny, a prace należy wykonywać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem. Całe późniejsze płukanie i inkubacja zostaną wykonane przy objętości 0,5 ml w szkiełku z 4 dołkami. Po czasie inkubacji przemyć komórki 0,5 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 i 2 mM KH2PO4) i utrwalić 0,5 ml 4% PFA w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Umyj ogniwa raz PBS, a następnie przemyj je 50 mM NH4Cl w celu ugaszenia resztkowego PFA.
    4. Przepuszczalność komórek przez 15 minut w temperaturze pokojowej z 0,1% Triton X-100 w PBS.
    5. Zablokować próbki na 1 godzinę za pomocą bufora blokującego (5% FBS, 3% BSA, 0,05% Triton X-100 w PBS).
    6. Usunąć roztwór blokujący i dodać rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe (anty-γH2A. X, 1:2000) w buforze blokującym na 1 h przy RT.
    7. Umyć studzienki buforem blokującym 3 x 10 min.
    8. Dodać rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe (koniugat anty-mysz Alexa 488 Plus, 1:2000) w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze suchej masy.
    9. Umyć studzienki buforem blokującym 3 x 10 min.
    10. Wybarwić jądro przeciwstawnie 1 μg/ml roztworu DAPI w PBS przez 15 minut.
    11. Umyj komórki raz za pomocą PBS. Obrazowanie można wykonać bezpośrednio w PBS lub roztworze PBS z odczynnikami zapobiegającymi blaknięciu (np. AFR3) w celu zmniejszenia fotowybielania.

6. Analiza rekrutacji

UWAGA: Rysunek 4A pokazuje reprezentatywne obrazy rekrutacji Exo1b i PCNA w obecności DMSO lub olaparybu. Rysunek 4B przedstawia reprezentatywny obraz do analizy danych. Średnie wartości fluorescencji obliczono, mierząc średnie intensywności AcGFP za pomocą prostokąta wzdłuż ścieżki laserowej podświetlonej przez mPlum-PCNA (A, żółte prostokąty) w różnych punktach czasowych przy użyciu Fidżi. PCNA może służyć jako kontrola wewnętrzna w celu podkreślenia udanego napromieniania wzdłuż współrzędnych ROI. Podobnie, średnie wartości fluorescencji AcGFP obliczono również dla nieuszkodzonych obszarów jądra (B, niebieskie prostokąty). Intensywność sygnału tła mierzono na obszarach niezamieszkałych (C, czerwone prostokąty) i odejmowano od średnich wartości fluorescencji (rys. A i B). W związku z tym względna średnia jednostka fluorescencyjna (RFU) dla każdego punktu zbierania danych została obliczona za pomocą równania RFU = (A − C)/ (B − C)8,9. Wynikowe wartości RFU obszaru poddanego mikronapromieniowaniu są znormalizowane do wartości RFU sprzed mikronapromieniowania.

  1. Aby określić region A miejsca napromieniowanego mikro, należy wykluczyć z pomiaru regiony jąder, ogniska replikacji i nieregularne obszary jądrowe komórki. Przytrzymaj Shift między rysowaniem dwóch ROI na Fidżi, aby pogrupować dwa oddzielne regiony jako jeden.
    UWAGA: Rekrutacja białek będzie się różnić w zależności od różnych genów i warunków napromieniowania; w związku z tym wielkość obszaru A musi być określana indywidualnie. Po określeniu szerokości piksela w regionie A powinna ona pozostać stała dla wszelkich rekrutacji porównawczych. W prezentowanych tu eksperymentach wykorzystano 7 prostokątów o szerokości piksela.
  2. Wyklucz z analizy komórki, które poruszały się w czasie trwania nagranych filmów. Aby uwzględnić komórki o wysokiej mobilności, opisana analiza musi być przeprowadzana klatka po klatce.
  3. Aby zwizualizować profil rekrutacji, należy wykreślić znormalizowane wartości RFU w czasie za pomocą oprogramowania statystycznego.
  4. Obliczyć różnicę we wskazanym punkcie czasowym między leczeniem DMSO a olaparybem (n=31) za pomocą testu Manna-Whitneya.

Wyniki

Komórki reagują na każdy rodzaj uszkodzenia DNA w specyficzny sposób, który zależy również od fazy cyklu komórkowego, w której się znajdują. Na przykład po mikroirradiacji pęknięcia dwuniciowe (DSB) będą naprawiane albo poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ), albo przez HR, w zależności od fazy cyklu komórkowego. Nukleazy działające najintensywniej podczas faz S i G2 cyklu komórkowego tworzą nawisy DNA, które są kluczowe dla prawidłowego przebiegu HR. Aby umożliwić ocenę komórek w fazie S, jako jednobarwny marker cyklu komórkowego wykorzystano PCNA. Rysunek 1A przedstawia profil lokalizacji mPlum-PCNA podczas przebiegu cyklu komórkowego. PCNA wykazuje całkowicie jednorodny rozkład w jądrze w fazach G1 i G2 (będąc jednocześnie w większości wykluczonym z jąderek). W fazie S PCNA lokalizuje się w miejscach replikacji DNA, co można zaobserwować jako jasne punkty w jądrze. W komórkach we wczesnej fazie S punkty te są stosunkowo małe i równomiernie rozłożone w całym jądrze komórkowym. Wraz z przejściem w środkową fazę S punkty stają się rozmyte i lokalizują się bardziej w kierunku obwodu jądra oraz jąderek. W późnej fazie S liczba punktów zmniejsza się, ale stają się one coraz większe, ponieważ PCNA koncentruje się w późnych miejscach replikacji (Rysunek 1B). Co ważne, egzogenna ekspresja PCNA z wektora pBABE była niższa niż poziomy endogenne, ale wystarczająca do detekcji mikroskopowej, co minimalizuje potencjalne artefakty w przebiegu cyklu komórkowego i DDR. Rysunek 1C pokazuje zakres nadekspresji PCNA w porównaniu z poziomami endogennymi. Należy zauważyć, że prążek odpowiadający mPlum-PCNA migruje wolniej ze względu na jego większy rozmiar.

Naszym celem było wprowadzenie DSB podczas mikroirradiacji w celu zbadania zależnej od PARP1/2 rekrutacji EXO1b do tych uszkodzeń w fazie S. Rysunek 2A pokazuje, że niskie dawki energii (czas ekspozycji 1000 µs) nie indukują rekrutacji EGFP-FBXL10, białka reagującego na DSB (składnika kompleksu FRUCC 8), podczas gdy były one wystarczające do indukcji rekrutacji NTHL1-mCherry, białka szlaku naprawy przez wycinanie zasad (BER), rekrutowanego do miejsc oksydacyjnych uszkodzeń DNA10,11,12. Przy czasie ekspozycji 3000 µs rekrutowane są zarówno EGFP-FBXL10, jak i NTHL1-mCherry, co świadczy o tym, że moc lasera generuje zarówno uszkodzenia oksydacyjne, jak i DSB. Potwierdzeniem tych wyników jest Rysunek 2B, przedstawiający barwienie immunofluorescencyjne przeciwko γH2A.X (marker DSB), które jest wyraźnie bardziej widoczne przy zastosowaniu wyższych dawek energii. PCNA służy zarówno jako marker cyklu komórkowego, jak i marker skutecznej mikroirradiacji, ponieważ ulega on odpowiedniej rekrutacji przy obu ustawieniach czasu ekspozycji lasera. Co istotne, do tej funkcji reporterowej można wykorzystać zarówno egzogenne, jak i endogenne PCNA znakowane białkiem fluorescencyjnym, ponieważ zachowują się one podobnie (Rysunek 3). Endogennie znakowane PCNA uzyskano poprzez wstawienie mRuby w ramce z pierwszym eksonem do jednego allelu locus PCNA13 (linia komórkowa była uprzejmym darem od Jörga Mansfelda).

Rysunek 4A oraz Rysunek 4C przedstawiają rekrutację EXO1b znakowanego AcGFP w komórkach w fazie S. Maksymalny poziom akumulacji EXO1b w miejscach mikroirradiacji zostaje osiągnięty po około 1 minucie, a następnie białko powoli zaczyna odłączać się od uszkodzeń DNA. Wzbogacenie w miejscach mikroirradiacji jest oznaczone na wykresie jako wartość > 1 względnej jednostki fluorescencji. W obecności olaparibu akumulacja EXO1b w pasie laserowym w 1. minucie jest znacząco mniejsza w porównaniu z kontrolą nośnikiem. Wyniki te są zgodne z literaturą6,7. Rysunek 4B prezentuje reprezentatywne obszary do kwantyfikacji (obszary A, B i C), zgodnie z opisem w punkcie 6 protokołu. Rysunek 4D pokazuje porównywalne poziomy ekspresji endogennego EXO1b oraz egzogennego EXO1b-AcGFP w komórkach wykorzystanych do mikroirradiacji.

Mikroskopia fluorescencyjna cyklu komórkowego; synteza DNA w fazie S; obraz mikroskopowy; analiza białek.
Rycina 1: Wzorzec lokalizacji PCNA. (A) Obrazy przedstawiają wzorzec lokalizacji stabilnie zintegrowanego egzogennego PCNA w trakcie cyklu komórkowego w komórkach U-2 OS. (B) Obrazy przedstawiają wzorce ognisk PCNA w różnych etapach fazy S (wczesnej, środkowej i późnej) w komórkach U-2 OS. (C) Western blot wykazujący endogenne i egzogenne poziomy PCNA w komórkach U-2 OS wykorzystanych do obrazowania. Pasek skali reprezentuje 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, EGFP-FBXL10 i NTHL1-mCherry, badanie czasu ekspozycji, fazy komórek.
Rysunek 2: Indukcja DSB poprzez zoptymalizowaną moc wyjściową lasera. (A) Ustawienia lasera mogą zostać zoptymalizowane w celu indukcji różnych form uszkodzeń DNA. Do identyfikacji odpowiednio DSB oraz miejsc uszkodzeń oksydacyjnych wykorzystano komórki U-2 OS stabilnie eksponujące zarówno EGFP-FBXL10, jak i NTHL1-mCherry. Mikroirradiację linią lasera 405 nm przeprowadzono na asynchronicznych komórkach U-2 OS z czasem ekspozycji wynoszącym 1000 µs lub 3000 µs. Pasek skali reprezentuje 20 µm. (B) Barwienie immunofluorescencyjne przeciwko γH2A.X wykonano na ludzkich komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (hTERT RPE-1) posiadających endogenne PCNA z tagiem mRuby. Komórki utrwalono i przetworzono 5 minut po mikroirradiacji z czasem ekspozycji wynoszącym 1000 µs lub 3000 µs. Pasek skali reprezentuje 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; mRuby-PCNA, mPlum-PCNA; cykl komórkowy, faza G1/G2, faza S, czas ekspozycji.
Rycina 3: Porównawka rekrutacji endogennego mRuby-PCNA i egzogennego mPlum-PCNA do miejsc mikro-napromieniowania przy czasie ekspozycji lasera 1000 µs lub 3000 µs. Zarówno endogenne, jak i egzogenne znakowane białka PCNA tworzą ogniska replikacyjne podczas fazy S. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna EXO1b i PCNA, DMSO vs. olaparib, analiza względnej fluorescencji.
Rysunek 4: Rekrutacja EXO1b zależna od PARP1/2 w fazie S. Komórki U-2 OS stabilnie eksponujące EXO1b-AcGFP i mPlum-PCNA poddano mikroirradiancji linią lasera FRAP 405 nm przy czasie przebywania 3000 µs. (A) Reprezentatywne obrazy mikroirradianowanych komórek w określonych punktach czasowych po wstępnym traktowaniu kontrolą nośnikiem (DMSO) lub olaparibem (1 µM). Pasek skali reprezentuje 20 µm. (B) Reprezentatywne obrazy zdefiniowanych obszarów A, B i C dla analizy rekrutacji. Pasek skali reprezentuje 20 µm. (C) Dynamikę rekrutacji w miejscach uszkodzeń DNA zarejestrowano za pomocą obrazowania żywych komórek. Względne średnie wartości fluorescencji oraz obrazy pozyskiwano co 5 s przez 12 min. Dla każdego warunku oceniono ≥30 komórek. Średnie względne wartości fluorescencji (ciągłe czarne linie) i błąd standardowy (zakres przedstawiony przez zacieniowany obszar) wykreślono w funkcji czasu. Linia przerywana pokazuje wartości rekrutacji w 1 min po mikroirradiancji. Różnicę między traktowaniem DMSO (n=32) a olaparibem (n=31) obliczono za pomocą testu Mann-Whitneya. Gwiazdka oznacza p<0.0001. (D) Western blot porównuje poziomy ekspresji endogennego EXO1b i egzogennego EXO1b-AcGFP w komórkach użytych do mikroirradiancji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Krytyczne kroki i potencjalne rozwiązywanie problemów/modyfikacje protokołu
Właściwe naczynie do hodowli tkankowej do mikronapromieniania ma kluczowe znaczenie dla sukcesu. Większość systemów obrazowania o wysokiej rozdzielczości jest zoptymalizowana pod kątem grubości szkła nakrywkowego 0,17 mm. Używanie komór obrazowania o większej lub mniejszej grubości lub wykonanych z polimerów z tworzywa sztucznego (niezoptymalizowanych pod kątem obrazowania 405 nm) może znacznie obniżyć jakość obrazu. Używając szklanych powierzchni, upewnij się, że są one poddane hodowli tkankowej w celu zwiększenia przyczepności komórek. Jeśli nie zostaną poddane obróbce kultur tkankowych, komory te będą musiały zostać pokryte, na przykład, poli-D-lizyną przed wysiewem komórek. Podczas powlekania komórek w komorze nakrywkowej idealna gęstość komórek ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć nieprawidłowości cyklu komórkowego i dodatkowego stresu dla komórek. Właściwa równowaga termiczna elementów mikroskopu przed eksperymentami w celu utrzymania stabilnej temperatury ma kluczowe znaczenie zarówno dla utrzymania ostrości przez cały czas obrazowania poklatkowego, jak i jest niezbędna do zapewnienia jednorodnego DDR w czasie i próbkach.

Bardzo ważne jest, aby komórki były w dobrym stanie przed mikronapromienianiem, aby zmniejszyć ilość danych artefaktów. Jeśli komórki mają nieregularną morfologię po infekcji/selekcji, pozwól komórkom przejść przez wiele pasaży, aż morfologia powróci do normy. Zawsze upewnij się, że użyte linie komórkowe są wolne od zanieczyszczenia mykoplazmą. Wśród wielu niekorzystnych skutków zakażenia mykoplazmą, powoduje ono również uszkodzenie DNA komórek gospodarza i może wpływać na ich szlaki DDR14,15. Najbardziej czułym sposobem wykrywania mykoplazmy w hodowli komórkowej jest PCR (w porównaniu z wykrywaniem za pomocą DAPI lub Hoechst).

Optymalna nadekspresja białka naprawczego będącego przedmiotem zainteresowania powinna być porównywalna z poziomami endogennymi, jednak wystarczająco wysoka, aby można ją było wykryć. Promotor stosowany na wektorach wirusowych, miano wirusa podczas infekcji i długość czasu infekcji można dostosować w celu uzyskania idealnych poziomów ekspresji. Aby uzyskać spójne wyniki, wyizoluj poszczególne klony komórek, aby zapewnić jednorodny poziom ekspresji i normalną morfologię komórek. Zaleca się stosowanie konstruktów wektorowych, które nie wykazują nadekspresji znakowanego PCNA na poziomach wyższych niż endogenne dla prawidłowego cyklu komórkowego i funkcji markera naprawy DNA. Nawet niski poziom nadekspresji PCNA jest wystarczający do rozróżnienia komórek fazy S. Retrowirusowe wektory pBABE są z powodzeniem stosowane w tym celu (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA może być oznaczone dowolnymi monomerycznymi czerwonymi (np. mPlum, mCherry, mRuby itp.) lub monomerycznymi zielonymi białkami fluorescencyjnymi (np. mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald itp.), które można następnie połączyć z alternatywnie oznaczonym punktem POI. Nadekspresja fluorescencyjnie oznaczonego punktu POI ma pewne ograniczenia i kwestie. Znaczniki fluorescencyjne mogą zakłócać normalne funkcjonowanie i lokalizację białek. W związku z tym należy wziąć pod uwagę lokalizację znacznika (zacisk N lub C). Zawsze używaj monomerycznych białek fluorescencyjnych, ponieważ oligomeryzacja wariantów niemonomerycznych może wpływać na funkcję POI.

Ustawienia lasera muszą być określone dla każdego systemu obrazowania, ponieważ wiele elementów ścieżki optycznej będzie miało wpływ na rzeczywistą moc dostarczaną do komórek. Mikronaświetlanie laserowe może powodować kilka rodzajów uszkodzeń DNA w zależności od długości fali wzbudzenia, mocy wyjściowej lasera FRAP oraz tego, czy zastosowano jakiekolwiek czynniki wstępnie uczulające (takie jak bromodeoksyurydyna lub Hoechst). Lasery o długości fali 405 nm mogą powodować oksydacyjne uszkodzenia DNA, pęknięcia jedno- i dwuniciowe16,17. Dzięki zastosowaniu wyższych ustawień mocy lasera zwiększa się ilość DSB. W tym protokole nie zastosowano metod wstępnego uczulenia, ale techniki te są szeroko omówione w literaturze i ponownie podsumowane w poniższej dyskusji. Naszym zdaniem najlepszym sposobem sprawdzenia, czy pożądana zmiana została wygenerowana, jest przeprowadzenie testów na rekrutację znanych genów specyficznych dla szlaku uszkodzenia DNA. Rekrutacja NTHL1 lub OGG1, składników szlaku BER, sugeruje indukcję utlenionych zasad DNA 10,11,17,18,19, podczas gdy FBXL10 lub XRCC5 wskazują na obecność DSB 8,20,21. Rekrutacja XRCC1 może wskazywać zarówno na obecność utlenionych zasad DNA, jak i pęknięć jednoniciowych (SSB)22,23. XPC (tj. RAD4) jest dobrym wskaźnikiem NER, który usuwa masywne addukty DNA generowane przez światło ultrafioletowe (UV)17,24. Ponieważ rekrutacja białek egzogennych może wprowadzać pewne nieprawidłowości, barwienie immunofluorescencyjne endogennych białek lub markerów naprawy DNA (takich jak γH2A. X dla pęknięć dwuniciowych) może potwierdzić obecność specyficznych zmian w DNA. Alternatywnie można również zastosować przeciwciała wywołane przeciwko określonym typom uszkodzeń DNA. Aby dostosować dostarczaną moc lasera, można zmienić zarówno czas przebywania, jak i moc lasera.

Za pomocą modelowania matematycznego można przeprowadzić szczegółową analizę kinetyczną, która może dostarczyć cennych informacji na temat właściwości rekrutacyjnych punktu POI (np. udział wielu domen wiążących DNA, wrażliwość na różne zdarzenia sygnalizacyjne itp.). Zautomatyzowana ocena rekrutacji i śledzenie komórek mogą być połączone w celu stworzenia solidnych przepływów pracy 1,25.

Zalety i ograniczenia wstępnego uczulania DNA
Wstępne uwrażliwienie DNA przed mikronapromieniowaniem jest powszechnie stosowanym narzędziem do rekrutacji białek naprawy DNA16,17. Uwrażliwienie DNA przed mikronapromieniowaniem sprawia, że jest ono bardziej podatne na DSB. Dwie najczęstsze metody wstępnego uczulania DNA to wstępne traktowanie komórek bromodeoksyurydyną (BrdU) lub barwnikiem Hoechsta. W przypadku systemów, które nie są zdolne do mikronaświetlania przy dużych mocach lasera, metody te mogą być konieczne do indukowania uszkodzeń DNA, takich jak DSB. Dodatkowo, w przypadku braku detektora światła przechodzącego lub sygnału fluorescencyjnego podkreślającego jądro komórkowe (na przykład podczas badania rekrutacji nieoznakowanych endogennych białek naprawy DNA), Hoechst działa zarówno jako narzędzie uczulające, jak i fluorescencyjne barwienie jądrowe. Jednak wstępne uczulenie DNA może wprowadzić poważne komplikacje. BrdU (stosowany w końcowym stężeniu 10 μM) musi być dodawany do komórek w ciągu 24 godzin (lub czasu odpowiadającego pełnemu cyklowi komórkowemu w użytej linii komórkowej), aby prawidłowo włączyć się do DNA i może powodować zakłócenia cyklu komórkowego26. Hoechst 33342 (stosowany w końcowym stężeniu 1 μg/ml) jest cytotoksyczny po długich okresach inkubacji, ale wymaga wystarczającej ilości czasu na nasycenie jądra barwnikiem. Dlatego należy go stosować tylko 15-20 minut przed mikronapromienianiem; W przeciwnym razie dane rekrutacyjne nie będą spójne. Wybarwione w ten sposób komórki nie mogą być trzymane w hodowli dłużej niż kilka godzin27,28. Upewnij się, że nie używasz Hoechst 33358, który nie jest tak przepuszczalny dla komórek jak barwnik Hoechst 33342. Wstępne uczulenie może również wprowadzić niepotrzebną wariancję między eksperymentami i sprawia, że eksperyment jest jeszcze bardziej wrażliwy na różnice w gęstości komórek (ponieważ wpłynie to na ilość wprowadzonego barwnika / komórkę).

Zalety i ograniczenia mikroskopii konfokalnej
Szybkość obrazowania w mikroskopii konfokalnej może być ograniczona w porównaniu z mikroskopią szerokokątną. Jednak mikroskop konfokalny wyposażony w skaner rezonansowy może znacznie poprawić szybkość obrazowania (kosztem rozdzielczości), zbliżając się do prędkości mikroskopii z wirującym dyskiem. Trzy cechy sprawiają, że system konfokalny A1R HD25 jest doskonałym wyborem dla prezentowanego tutaj protokołu. Po pierwsze, pole widzenia systemu wynoszące 25 mm umożliwia obrazowanie od 15 do 20 komórek w jednym zeskanowanym polu (w porównaniu z 5-10 komórkami w zwykłych konfiguracjach), ograniczając liczbę akwizycji niezbędnych do uzyskania wystarczającej liczby komórek do analizy statystycznej. Po drugie, moduł FRAP i dwie głowice skanujące umożliwiają obrazowanie i mikronaświetlanie komórek jednocześnie, a nie tylko sekwencyjnie. Wreszcie, elastyczność wynikająca z posiadania zarówno skanerów rezonansowych, jak i galwanograficznych zapewnia możliwość łatwego przełączania między obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości czasowej z wyjątkową prędkością, która minimalizuje wygaszanie fluoroforów, a obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, które wykorzystuje wolniejsze prędkości skanowania do tworzenia obrazów o wyższym stosunku sygnału do szumu. O ile zastosowany system pozwalał na wspomnianą wcześniej elastyczność, upodabniając się do szerzej dostępnych konfiguracji mikroskopów konfokalnych, o tyle w prezentowanych eksperymentach wykorzystano jedynie skaner galwanowy (zarówno do mikronaświetlania, jak i późniejszego obrazowania).

Zalety i ograniczenia mikronapromieniania
Chociaż mikropromieniowanie zapewnia niezrównaną rozdzielczość przestrzenną i czasową, nie jest pozbawione ograniczeń. Uszkodzenia DNA spowodowane mikropromieniowaniem laserowym są silnie skupione w określonych częściach jądra w porównaniu z naturalnie występującymi czynnikami uszkadzającymi. W związku z tym odpowiedź chromatyny na mikropromieniowanie może się różnić w porównaniu z jednorodnie rozłożonymi uszkodzeniami. Ponadto mikronapromienianie jest czasochłonne i może być przeprowadzone tylko na kilkudziesięciu komórkach, podczas gdy duże metody biochemiczne oparte na populacji (frakcjonowanie chromatyny, immunoprecypitacja, ChIP) mogą zapewnić zwiększoną odporność poprzez badanie tysięcy komórek jednocześnie. Weryfikacja obserwacji dokonanych za pomocą mikronapromieniania tradycyjnymi technikami biochemicznymi jest skuteczną strategią pozwalającą na uzyskanie wiarygodnych wniosków. Chociaż możliwe jest jednoczesne mikronapromienianie wielu komórek w określonym polu widzenia, system obrazowania będzie potrzebował więcej czasu na wykonanie zadania. W związku z tym pomiar dynamiki białek, które bardzo szybko rekrutują się do zmian w DNA, ogranicza liczbę możliwych ROI dla mikronapromieniania stosowanego jednocześnie. W systemie obrazowania używanym w tym protokole mikronaświetlanie pojedynczego ROI o długości 1024 pikseli trwa 1032 ms przy użyciu czasu przebywania 1000 μs i 3088 ms przy użyciu czasu przebywania 3000 μs. Użycie wielu linii ROI znacznie wydłuży czas potrzebny na zakończenie mikronaświetlania (np. zwrot z inwestycji o długości 7 x 1024 pikseli zajmuje 14402 ms przy użyciu czasu przebywania 1000 μs i 21598 ms przy użyciu czasu przebywania 3000 μs). Ten czas jest stracony na akwizycję obrazu i należy go wziąć pod uwagę. Podczas obrazowania szybkich zdarzeń rekrutacyjnych należy stosować jak najkrótszy zwrot z inwestycji i mikronaświetlać tylko jedną komórkę na raz.

Zalety i ograniczenia w stosunku do metod synchronizacji
W przypadku badań specyficznych dla cyklu komórkowego istniejące metody obejmują albo synchronizację komórek w określonych fazach cyklu komórkowego, albo wykorzystanie reporterów fluorescencyjnych w celu zidentyfikowania określonej fazy cyklu komórkowego komórki. Jednak każda z tych metod wiąże się z własnymi wyzwaniami i ograniczeniami.

System FUCCI3 (opierający się na białku fluorescencyjnym oznaczonym skróconymi formami CDT1 i Gemininy) jest szczególnie przydatnym narzędziem do badań cyklu komórkowego, ale ma ograniczenia, jeśli chodzi o różnicowanie faz S i G2 cyklu komórkowego. Poziomy bliźniąt są już wysokie od połowy fazy S i utrzymują się na wysokim poziomie aż do fazy M, co utrudnia rozdzielenie tych faz. Zastosowanie systemu FUCCI oznacza również, że do obrazowania punktu POI nie można wykorzystać dwóch kanałów optycznych mikroskopu.

Nienowotworowe linie komórkowe mogą być zsynchronizowane z G0 poprzez usunięcie czynników wzrostu znajdujących się w surowicy (głód surowicy), powodując niewielkie lub żadne uszkodzenie DNA komórek. Jednak większość linii komórek nowotworowych będzie częściowo kontynuować postęp w cyklu komórkowym, nawet bez odpowiedniej ilości surowicy w ich pożywce. Dodatkowo komórki częściowo zaczynają tracić synchronizację pod koniec G1, wczesna faza S. Oprócz głodu surowicy istnieje wiele chemicznych metod osiągania synchronizacji cyklu komórkowego. Bloki hydroksymocznika, afidikoliny i tymidyny są metodami zatrzymywania replikacji DNA w celu synchronizacji komórek we wczesnej fazie S. Chociaż metody te są tanie i proste, wprowadzają stres replikacyjny, który powoduje uszkodzenie DNA. Wykazano, że te inhibitory replikacji DNA indukują fosforylację H2A. X, dobrze znany marker DSB 2,29. Metoda użycia znakowanego PCNA jako markera dla komórek fazy S zmniejsza potencjał artefaktów spowodowanych synchronizacją chemiczną i może być stosowana do szerokiego zakresu linii komórkowych w porównaniu z głodem surowicy.

Konkluzja
Uszkodzenie DNA jest siłą napędową chorób genetycznych, w których zmiany mutagenne mogą prowadzić do złośliwej transformacji komórek. Celowanie w maszynerię syntezy DNA jest podstawową strategią terapeutyczną w leczeniu chorób hiperproliferacyjnych, takich jak rak. Aby leczyć te choroby w bardziej ukierunkowany sposób, musimy lepiej zrozumieć białka, które naprawiają uszkodzenia DNA. Opisany tutaj protokół pomaga w badaniach opartych na mikronapromieniowaniu w fazie S, minimalizując wyzwania związane z tradycyjnymi metodami synchronizacji w celu zmniejszenia możliwych artefaktów i zwiększenia odtwarzalności eksperymentów.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że publikacja prezentowanej pracy była sponsorowana przez firmę Nikon Corporation. Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Podziękowania

Autorzy dziękują M. Pagano za jego nieustanne wsparcie, a także D. Simoneschi, A. Marzio i G. Tang za krytyczną recenzję manuskryptu. B. Miwatani-Minter dziękuje R. Miwatani i B. Minterowi za ich nieustające wsparcie. G. Rona dziękuje K. Ronane Jurasz i G. Rona za ich nieustające wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek amonuSigma-AldrichA9434-500GDo gaszenia formaldehydu
Przeciwciało poliklonalne królika anty-EXO1 Proteintech16253-1-APprzeciwciało pierwszorzędowe
Anty-fosfo-histon H2A. X (Ser139) Przeciwciało, klon JBW301Millipore05-636przeciwciało pierwszorzędowe
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich3117332001BSA do blokowania
BrdU (5-Bromo-2'-deoksyurydyny)Środek wstępnie uczulającyMerck19-160
Citifluor™ Roztwór montażowy AFR3Mikroskopia elektronowa Sciences17973-10roztwór PBS zapobiegający blaknięciu do obrazowania
DAPISigma-AldrichD9542-1MGbarwienie kwasem nukleinowym
DMEM MediumThermo Fisher Scientific10569010Pożywka do hodowli komórkowych dla komórek
HEK293T DMSOSigma-AldrichD2650-100MLRozpuszczalnik
EGFP-FBXL10Addgene#126542wektor ekspresji wirusa dla EGFP-FBXL10
EXO1b-AcGFP  (w pRetroQ)niestandardowe klonowanienacDNA EXO1b zostało sklonowane w miejscach NheI, BamHI wektora pRetroQ-AcGFP1-N1.
Płodowa surowica bydlęcaGibco16140071Suplement
FluoroBrite DMEMThermo Fisher ScientificA1896701Wolne od czerwieni fenolowej do mikroskopii
Kozia anty-mysia IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32723wtórne
HEK293T komórkachATCCATCC CRL-3216Linia komórkowa do pakowania wirusów
HEPESSigma-AldrichH0887-100MLŚrodek buforujący uzupełniający pożywkę do obrazowania żywych komórek
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570wstępnie uczulający
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Odczynnik do transfekcji
McCoy' s 5A (zmodyfikowany) MediumLife Technologies16600-108Pożywka do hodowli komórkowych dla komórek U-2 OS
mCherry-PCNAAddgene#55117niewirusowy konstrukt PCNA odpowiedni do markera cyklu komórkowego
mPlum-PCNAAddgene#55994niewirusowy konstrukt PCNA odpowiedni do markera cyklu komórkowego
mPlum-PCNA (w pBABE)niestandardowe klonowanienacDNA mPlum-PCNA zostało sklonowane z Addgene #55994 w miejscach BamHI, SalI pBABE (puro)
Konfokalna głowica skanująca i kontroler Nikon A1R-HD25Systemobrazowania konfokalnego Nikon na system obrazowania konfokalnego
Jednostka laserowa Nikon LUN4Nikonnasystem wzbudzenia
Nikon LUN-F 50 mW 405 nm Jednostka laserowa FRAPNikonnaFRAP Nikon
Oprogramowanie kontrolera konfokalnego NIS Elements NikonOprogramowanie do sterowania konfokalnego
Mikroskop odwrócony Nikon Ti2-ENikonnapodstawie odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego
Modułowy system oświetlenia Nikon Ti2-LAPPNikonnasystem oświetlenia
NTHL1-mCherry (w pRetroQ)niestandardowe klonowanienaNTHL1 cDNA zostało sklonowane w miejscach NheI, SalI wektora pRetroQ-mCherry-N1.
Szkło nakrywkowe komorowe Nunc Lab-Tek II (4 dołki)Thermo Fisher Scientific155382PKMikroskopia żywych komórek Komora do hodowli komórkowych
OlaparibSelleck ChemicalsPARPS1060
Opti-MEM o obniżonej surowicyThermo Fisher Scientific31985062Podłoże rozcieńczające do transfekcji
przejściowej Wodny roztwór paraformaldehydu (32%)Thermo Fisher Scientific50-980-494Utrwalacz
pBABE (higro)Addgene#1765retrowirusowy wektor ekspresyjny (dla niskich poziomów ekspresji)
pBABE (neo)Addgene#1767retrowirusowy wektor ekspresyjny (dla niskich poziomów ekspresji)
pBABE (puro)Addgene#1764retrowirusowy wektor ekspresyjny (dla niskich poziomów ekspresji)
pBABE (zeo)Addgene#1766retrowirusowy wektor ekspresyjny (dla niskich poziomów ekspresji)
Przeciwciało PCNA (PC10)Przeciwciało pierwotneSanta Cruzsc-56
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x)Gibco10378016Suplement podłoża
polybreneSigma-AldrichTR-1003Zwiększ skuteczność infekcji wirusowej
pRetroQ-AcGFP-C1Takara632506retrowirusowy wektor ekspresyjny
pRetroQ-AcGFP-N1Takara632505retrowirusowy wektor ekspresyjny
pRetroQ-mCherry-C1Takara632567retrowirusowy wektor ekspresyjny
pRetroQ-mCherry-N1Takara632568retrowirusowy wektor ekspresyjny
pUMVCAddgene#8449Wektor opakowania wirusowego
Pirogronian soduThermo Fisher Scientific11360070Suplement do obrazowania żywych komórek
Triton X-100 roztwór wodny (10%)Sigma-Aldrich11332481001Rozcieńczony w PBS do buforu przepuszczalności komórek
Roztwór trypsyny-EDTA 10XSigma-Aldrich59418C-100MLRozcieńczony w PBS w celu rozszczepienia komórek
U-2 OS CellsATCC&nbsp; HTB-96Optymalna linia komórkowa do eksperymentów mikroskopowych
Uniwersalny zestaw do wykrywania mykoplazmyZestaw do wykrywania mykoplazmy na bazieATCC30-1012K
VSV-GAddgene#8454Wektor otoczki białka wirusowego
do kontroli i rozpuszczania pojazdów przeciwciało środek Inhibitor PCR

Bibliografia

  1. Aleksandrov, R., et al. Protein dynamics in complex DNA lesions. Molecular Cell. 69 (6), 1046-1061 (2018).
  2. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H., Podhorecka, M. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: Analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  3. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  4. Herce, H. D., Rajan, M., Lattig-Tunnemann, G., Fillies, M., Cardoso, M. C. A novel cell permeable DNA replication and repair marker. Nucleus. 5 (6), 590-600 (2014).
  5. Keijzers, G., et al. Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in dna replication with putative roles in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), (2018).
  6. Cheruiyot, A., et al. Poly(ADP-ribose)-binding promotes Exo1 damage recruitment and suppresses its nuclease activities. DNA Repair (Amsterdam). 35, 106-115 (2015).
  7. Zhang, F., Shi, J., Chen, S. H., Bian, C., Yu, X. The PIN domain of EXO1 recognizes poly(ADP-ribose) in DNA damage response. Nucleic Acids Research. 43 (22), 10782-10794 (2015).
  8. Rona, G., et al. PARP1-dependent recruitment of the FBXL10-RNF68-RNF2 ubiquitin ligase to sites of DNA damage controls H2A.Z loading. elife. 7, (2018).
  9. Young, L. M., et al. TIMELESS forms a complex with PARP1 distinct from its complex with TIPIN and plays a role in the dna damage response. Cell Reports. 13 (3), 451-459 (2015).
  10. Kong, X., et al. Laser microirradiation to study in vivo cellular responses to simple and complex dna damage. Journal of Visualized Experiments. (131), e56213(2018).
  11. Kong, X., et al. Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), 23548(2011).
  12. Lan, L., et al. Novel method for site-specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2330-2345 (2014).
  13. Zerjatke, T., et al. Quantitative cell cycle analysis based on an endogenous all-in-one reporter for cell tracking and classification. Cell Reports. 19 (9), 1953-1966 (2017).
  14. Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity. Mutation Research. 845, 403054(2019).
  15. Sun, G., et al. Mycoplasma pneumoniae infection induces reactive oxygen species and DNA damage in A549 human lung carcinoma cells. Infection and Immunity. 76 (10), 4405-4413 (2008).
  16. Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amsterdam). 31, 52-63 (2015).
  17. Muster, B., Rapp, A., Cardoso, M. C. Systematic analysis of DNA damage induction and DNA repair pathway activation by continuous wave visible light laser micro-irradiation. AIMS Genetics. 4 (1), 47-68 (2017).
  18. Ikeda, S., et al. Purification and characterization of human NTH1, a homolog of Escherichia coli endonuclease III. Direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue. Journal of Biological Chemistry. 273 (34), 21585-21593 (1998).
  19. Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 94 (14), 7429-7434 (1997).
  20. Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (20), 2575-2584 (2015).
  21. Taccioli, G. E., et al. Ku80: product of the XRCC5 gene and its role in DNA repair and V(D)J recombination. Science. 265 (5177), 1442-1445 (1994).
  22. Marsin, S., et al. Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1. Journal of Biological Chemistry. 278 (45), 44068-44074 (2003).
  23. Thompson, L. H., Brookman, K. W., Jones, N. J., Allen, S. A., Carrano, A. V. Molecular cloning of the human XRCC1 gene, which corrects defective DNA strand break repair and sister chromatid exchange. Molecular and Cell Biology. 10 (12), 6160-6171 (1990).
  24. Scharer, O. D. Nucleotide excision repair in eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 5 (10), 012609(2013).
  25. Oeck, S., et al. High-throughput evaluation of protein migration and localization after laser micro-irradiation. Science Reports. 9 (1), 3148(2019).
  26. Mistrik, M., et al. Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique. Science Reports. 6, 19567(2016).
  27. Durand, R. E., Olive, P. L. Cytotoxicity, mutagenicity and dna damage by hoechst 33342. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (2), 111-116 (1982).
  28. Tobey, R. A., Oishi, N., Crissman, H. A. Cell cycle synchronization: reversible induction of G2 synchrony in cultured rodent and human diploid fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 87 (13), 5104-5108 (1990).
  29. Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX phosphorylation: Its role in DNA damage response and cancer therapy. Journal of Nucleic Acids. 2010, (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Naprawa uszkodze DNAkom rki w fazie Smarker PCNAmikroskopia konfokalnabia ka naprawy DNAkinetyka rekrutacji do DNAanaliza cyklu kom rkowegoobrazowanie timelapsedetekcja uszkodze DNA
Mikronaświetlanie laserowe do badania rekrutacji DNA w fazie S
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.