Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną 1H R 1ρ RNA

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do pomiaru dynamiki mikro- do milisekundowej na ¹³C/¹⁵N-znakowanych i nieznakowanych RNA ^{za pomocą}spektroskopii 1 H R_1ρ spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) z dyspersją relaksacyjną. Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu próbek o wysokiej czystości i konfiguracji eksperymentów NMR.

Streszczenie

RNA to wysoce elastyczna biomolekuła, w której zmiany w strukturach odgrywają kluczową rolę w funkcjach, które cząsteczki RNA pełnią jako przekaźniki i modulatory komórkowe. Podczas gdy te dynamiczne stany pozostają ukryte dla większości metod strukturalnych, spektroskopia dyspersji relaksacyjnej (RD) R_1ρ umożliwia badanie dynamiki konformacyjnej w reżimie mikro- i milisekundowym z rozdzielczością atomową. Wykorzystanie ¹H jako obserwowanego jądra jeszcze bardziej rozszerza objęty reżim czasowy i daje bezpośredni dostęp do wiązań wodorowych i parowania zasad.

Wyzwaniem w takim badaniu jest przygotowanie próbki o wysokiej czystości i wysokiej wydajności, potencjalnie ^{znakowanej 13}C i ¹⁵N, a także przeprowadzenie eksperymentów i dopasowanie danych do wyodrębnienia populacji, kursu wymiany i struktury drugorzędowej wcześniej niewidocznego stanu. Protokół ten zapewnia kluczowe praktyczne kroki w przygotowaniu próbki, aby zapewnić przygotowanie odpowiedniej próbki RNA i konfigurację eksperymentów ¹ H R_1ρ zarówno z izotopowo znakowanymi, jak i nieznakowanymi próbkami RNA.

Wprowadzenie

RNA pełnią wiele funkcji regulacyjnych¹, catalytic^2, and structural³ funkcje w komórce, z których wiele jest skorelowanych z elastyczną strukturą molekularną i skomplikowanymi zmianami tych struktur^4,5^,6,7. Stany o niskim zaludnieniu pozostają niewidoczne dla większości metod wyznaczania struktury lub nie pozwalają na badanie tych ukrytych stanów w wysokiej rozdzielczości atomowej. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w stanie roztworu łączy oba aspekty, zapewniając dostęp do pojedynczych jąder atomowych, a także oferując duży zestaw eksperymentów ukierunkowanych na dynamikę we wszystkich reżimach czasowych⁸. Eksperymenty RD NMR zapewniają dostęp do wymiany konformacyjnej w pośredniej skali czasowej, w której można spodziewać się zmian we wzorcach parowania zasad i lokalnych rearanżacjach strukturalnych^{5,9,10,11,12,13,14}. Eksperymenty RD są wykonywane jako długie pomiary R₂ w postaci ciągu impulsów Carra-Purcella-Meibooma-Gilla¹⁵ lub jako pomiary relaksacji w obracającej się ramce, zwane R_1ρ RD experiments¹⁶.

Chociaż oba mogą być używane do wyodrębniania populacji i różnicy kursu wymiany oraz przesunięcia chemicznego do stanu mniejszego, eksperymenty R_1ρ RD również dają znak różnicy przesunięcia chemicznego stanu wzbudzonego. Pozwala to na wnioskowanie o strukturze drugorzędowej, która silnie koreluje z przesunięciem chemicznym w strukturach RNA¹⁷. Przesunięcie chemiczne jest dobrym wskaźnikiem spiralności w przypadku aromatycznych protonów i atomów węgla na zasadach nukleotydowych, partnerów parowania zasad dla protonów imino oraz zmarszczek cukru na atomach C4' i C1'^18,19. Należy zauważyć, że niedawno opublikowano eksperyment z transferem nasycenia wymiany chemicznej (CEST) z wykorzystaniem wyższej mocy blokady spinowej (SL), przesuwając tym samym zastosowanie eksperymentu CEST do szybszych skal czasowych wymiany, jako alternatywa dla eksperymentu R_1ρ RD dla układów o jednym stanie wzbudzonym.

Chociaż izotopy ¹³C i ¹⁵N były często używane do uzyskania dostępu do wymiany strukturalnej, ostatnie prace z tego laboratorium używały protonów aromatycznych i imino jako sond do wymiany konformacyjnej^9,10. Wykorzystanie ¹H jako obserwowanego jądra niesie za sobą szereg korzyści, na przykład dostęp do wymiany w szybszych i wolniejszych skalach czasowych, wyższą czułość i krótsze czasy pomiarów. Jest to dodatkowo ułatwione dzięki podejściu SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE), zapewniającemu dostęp do aromatycznych protonów poprzez depulację jednowymiarowego (1D) widma za pomocą homojądrowych sprzężeń skalarnych, zamiast heterojądrowego transferu magnesowania, oraz eliminując potrzebę etykietowania izotopów²⁰. Protokół ten dotyczy pomiaru w eksperymentach ¹H R_1ρ RD jednolicie ¹³C/¹⁵próbek znakowanych N i nieznakowanych. W związku z tym w niniejszym artykule przedstawiono metodę przygotowania próbki, która została uznana za najbardziej uniwersalną dla różnych potrzeb związanych z przygotowaniem próbek²¹ i omówiono alternatywy w ostatniej sekcji tego artykułu (Rysunek 1).

W tym momencie czytelnik powinien zauważyć, że inne techniki przygotowania próbek są dopuszczalne dla eksperymentów ¹H R_1ρ RD, oraz że inne metody analizy strukturalnej i funkcjonalnej mogą być przeprowadzone na próbkach zsyntetyzowanych za pomocą prezentowanej techniki. ¹Eksperymenty H R_1ρ RD wymagają wysokich stężeń RNA (najlepiej >1 mM), a także wysokiej jednorodności, zarówno pod względem długości RNA, jak i konformacji strukturalnej, aby zapewnić wiarygodną charakterystykę dynamiki molekularnej. Transkrypcja in vitro (IVT) jest metodą wybieraną przez wielu badaczy do produkcji ¹³próbek RNA znakowanych C/¹⁵N ze względu na dostępność znakowanych trifosforanów nukleozydów (NTP) i łatwe włączenie do reakcji enzymatycznej²². Jednak szeroko stosowana polimeraza RNA T7 (T7RNAP)^23,24,25 cierpi na niską jednorodność 5' w przypadku niektórych sekwencji inicjacyjnych^26,27 i często również jednorodność 3' podczas spływu transkrypcji²⁸. Oczyszczanie docelowych gatunków RNA staje się droższe i bardziej pracochłonne ze względu na zapotrzebowanie na duże ilości ~200 nmol. Zastosowana tutaj metoda została przedstawiona wcześniej, gdzie zalety zostały omówione na large²¹. Krótko mówiąc, rozwiązuje opisane problemy poprzez transkrypcję większego transkryptu tandemowego, który jest następnie specyficznie dla miejsca rozszczepiany przez RNazę Escherichia coli, kierowaną przez chimeryczny oligonukleotyd ^29,30 (zobacz Rysunek 2, aby uzyskać szczegółowe informacje).

Włączenie sekwencji dystansowej na końcach 5' i 3' transkryptu tandemowego pozwala na użycie sekwencji inicjacji o wysokiej wydajności i usunięcie zwisów końcowych w pobliżu miejsca linearyzacji matrycy plazmidu, odpowiednio (Rysunek 2B). Wykazano, że metoda ta znacznie poprawiła plony, jednocześnie zmniejszając koszty i robociznę, z zastrzeżeniem bardziej złożonej syntezy matrycy i potrzeby dodatkowego enzymu i oligonukleotydu. Wysoka specyficzność łupliwości RNazy H ułatwia oczyszczanie ze względu na brak gatunków RNA w podobnym zakresie wielkości. Obecny protokół wykorzystuje etap wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z wymianą jonową, który został niedawno opublikowany przez to laboratorium³¹, chociaż możliwe są inne metody. ¹H R_1ρ RD można na ogół uzyskać na znakowanych lub nieznakowanych próbkach z dwiema odpowiednimi sekwencjami impulsów, "znakowanym" eksperymentem opartym na heterojądrowej pojedynczej korelacji kwantowej (HSQC) 1 H R_1ρ z wymiarem pośrednim ¹³C < klasa sup = "xref">10 i "nieznakowanym" ¹ H R_1ρ Eksperyment oparty na SELOPE z ¹H wymiar pośredni²⁰.

Te dwuwymiarowe (2D) eksperymenty mogą służyć jako pierwsze sprawdzenie, niezależnie od tego, czy dynamika na skali czasowej R_1ρ jest obecna w próbce. Można uzyskać przegląd RD dla wszystkich rozwiązanych pików w widmach i zidentyfikować piki będące przedmiotem zainteresowania w celu dokładniejszej analizy RD. Oznacza to, że nawet nieoznakowane próbki mogą zostać sprawdzone przed podjęciem decyzji o wyprodukowaniu droższej, oznakowanej próbki. Po wybraniu piku z wkładem wymiany konformacyjnej do dokładniejszego zbadania, najlepiej jest przełączyć się na wersje 1D powyższych eksperymentów (jeśli pik można jeszcze rozwiązać) w celu przeprowadzenia tak zwanych eksperymentów offrezonansowych. W wersji oznaczonej transfer HSQC do ¹³C jest zastępowany etapem selektywnej heterojądrowej polaryzacji krzyżowej (HCP), jak to jest używane w eksperymentach ¹³C R_1ρ ^32,33,34,35, podczas gdy w przypadku eksperymentu SELOPE eksperyment jest po prostu uruchamiany jako 1D, co jest szczególnie przydatne dla sygnałów H8 i H2, które leżą na przekątna w każdym razie w 2D. Jednym z kryteriów dotyczących tego, którą sekwencję zastosować, pod warunkiem, że dostępne są zarówno znakowane, jak i nieznakowane próbki, jest to, jak dobrze wyizolowany jest szczyt zainteresowania w dwóch eksperymentach.

Ogólnie, eksperyment SELOPE jest zalecany dla próbek RNA do 50 nukleotydów. W przypadku większych RNA nakładanie się będzie większe; jednak strukturalnie interesujące nukleotydy często pojawiają się w regionach przesunięć chemicznych, które mniej się na siebie nakładają i nadal mogą być dostępne w jeszcze większych RNA. Innym argumentem byłoby to, że w próbkach nieznakowanych nie występuje sprzężenie J między ¹H a ¹²C. Jednakże, ponieważ minimalna moc blokady spinowej jest definiowana przez minimalną moc użytą do rozłączenia tych dwóch spinów (~1 kHz) w oznaczonym eksperymencie, nieoznakowany eksperyment pozwala na użycie szerszego zakresu mocy blokady spinowej (SL), a tym samym dostęp do szerszej skali czasowej wymiany. Te eksperymenty off-resonansowe dostarczają k_ex dodatkowych informacji, takich jak populacja stanu wzbudzonego (alternatywny konformist), p_ES, a także bardzo cenne informacje o przesunięciu chemicznym w postaci Δω (różnica przesunięć chemicznych stanu podstawowego i stanu wzbudzonego).

Rysunek 1: Przebieg pracy prezentowanego protokołu. Przygotowanie przed właściwą produkcją próbki na dużą skalę, polegające na przygotowaniu matrycy i potwierdzeniu udanej transkrypcji in vitro i rozszczepienia RNazy H. Produkcja na dużą skalę, w tym oczyszczanie HPLC, napełnianie probówki NMR i potwierdzenie fałdowania RNA. W przypadku syntezy znakowanej izotopowo tego samego dnia należy przeprowadzić nieznakowane oczyszczanie w celu optymalizacji gradientu. Charakterystyka dynamiki konformacyjnej metodą NMR za pomocą eksperymentów R_1ρ. Każdy etap można przeprowadzić niezależnie, np. analizę ¹H R_1ρ RD można zastosować do dowolnej odpowiedniej próbki RNA wyprodukowanej inną metodą. Skróty: IVT = transkrypcja in vitro; HPLC = wysokosprawna chromatografia cieczowa; NMR = magnetyczny rezonans jądrowy; RD = dyspersja relaksacyjna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Celem tego protokołu jest dostarczenie praktycznych szczegółów i krytycznych parametrów do badania dynamiki konformacyjnej z dyspersją relaksacyjną ¹H R_1ρ w cząsteczkach spinki do włosów RNA. Po dostarczeniu szczegółowego protokołu projektowania, syntezy i oczyszczania docelowego RNA metodą wymiany jonowej HPLC, który można przeprowadzić przy użyciu wszystkich, niektórych lub żadnych NTP w wersjach ^{znakowanych N 13}C / ¹⁵, opisano przebieg pracy finalizacji próbki NMR i potwierdzenia wymiany konformacyjnej za pomocą spektroskopii NMR. Na koniec opisano szczegóły dotyczące konfiguracji eksperymentów ¹H R_1ρ RD na spektrometrze Bruker NMR (Rysunek 1). W protokole przedstawiono każdy krok konfiguracji wersji 1D dla oznaczonych próbek oraz dodatkowe komentarze i tabelę do dostosowania do konfiguracji wersji SELOPE (Tabela 2). Po protokole omówiono krytyczne etapy i alternatywne drogi przygotowania próbki i konfiguracji ¹H R_1ρ RD.

Protokół

Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie zgłoszonego protokołu tandemowego IVT. (A) Transkrypcja tandemowa z zlinearyzowanej matrycy plazmidowej z T7RNAP (po lewej) i sukcesywne rozszczepianie transkryptu przez RNAse H w celu uzyskania docelowej długości RNA, kierowane przez chimeryczny przewodnik DNA (po prawej). (B) Szczegółowy schemat matrycy tandemowej rozpoczynającej się od wirusowego promotora T7RNAP, sekwencji inicjacyjnej. Sekwencja docelowa (ciemnoniebieska, przykład tutaj ma długość 20 nt) jest powtarzana "n" razy. Powtórzenia otoczone sekwencjami dystansowymi 5′ i 3′ składającymi się odpowiednio z ostatnich ośmiu i pierwszych czterech nukleotydów, aby umożliwić usunięcie sekwencji inicjacyjnych i restrykcyjnych z pierwszej i ostatniej jednostki powtórzenia. (C) Hybrydyzacja transkryptu tandemowego (czerwony) i chimerycznych prowadnic rozszczepienia (zielony). RNaza H rozszczepia RNA przeciwnie do końca 5′ DNA. Boki 2′-OMe RNA zwiększają swoistość poprzez zwiększenie powinowactwa wiązania przewodnika cięcia do docelowego RNA. Ten rysunek został zmodyfikowany z ²¹. Skróty: T7RNAP = polimeraza RNA T7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie do nowego konstruktu RNA

1. Projektowanie i przygotowanie plazmidu
   1. Napisz sekwencję szablonów w narzędziu do klonowania, np. Serial Cloner.
   2. Weź sekwencję promotoryczną T7 i dodaj sekwencję inicjacyjną o wysokiej wydajności (T7: 5'-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3').
      UWAGA: Transkrypcja rozpocznie się od nukleotydu wskazanego daszkiem (^). Sekwencja inicjacji GGGAGA jest zmienna, ale silnie zależna od sekwencji; Dlatego zaleca się stosowanie tej sekwencji.
   3. Dodaj ostatnie 8 nukleotydów (nt) sekwencji docelowej jako dystans 5' (5'S).
   4. Dodaj powtórzenia sekwencji docelowej (TS).
   5. Dodaj pierwsze cztery nukleotydy jako dystans 3' po powtórzeniach (5'S).
   6. Dodaj witrynę z ograniczeniami BamHI (RS) lub podobną unikatową witrynę z ograniczeniami.
      UWAGA: Cała sekwencja, jak pokazano, zostanie sklonowana lub łatwo uporządkowana w bakteryjnym plazmidzie o wysokiej kopii (np. pUC19): 5'-T7-5'S-(TS)_n-3'S-RS-3' (Rysunek 2B). Liczba powtórzeń powinna być tak duża, jak pozwala na to synteza genów (maksymalnie 600 nt w tym protokole).
   7. Amplifikuj plazmid w E. coli za pomocą zestawu komercyjnego.
   8. Linearyzować oczyszczony plazmid w stężeniu 20 ng/μl, używając odpowiedniego miejsca restrykcyjnego. Ograniczenie skali trawi z BamHI do 1 ml.
   9. Oczyść strawiony plazmid i potwierdź pomyślną linearyzację na 1% żelu agarozowym. Zlinearyzowany plazmid należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
2. Projekt prowadnicy łupliwości (Rysunek 2C)
   1. Napisz ostatnie osiem nukleotydów docelowej sekwencji RNA w kierunku 5'-3' i dodaj pierwsze cztery nukleotydy docelowej sekwencji RNA na końcu 3' również w kierunku 5'-3'.
   2. Wygeneruj odwrotne dopełnienie DNA tej sekwencji
   3. Zmień pierwsze i ostatnie cztery nukleotydy na ich modyfikacje 2'-OMe, dodając "m" przed literą nukleotydu.
      UWAGA: Do syntezy zamiast mT stosuje się mU.
   4. Zamów oligo ze standardowym oczyszczaniem odsalającym.
      UWAGA: Sprawdź, czy wygenerowany oligo może związać się w innym miejscu niż połączenie dwóch sekwencji RNA. Wymagana jest pełna komplementarność w centralnych czterech nukleotydach DNA, podczas gdy regiony flankujące mogą pozwolić na niedopasowanie. Jeśli to konieczne, rozszerz boki do 18 nt, aby wygenerować unikalną sekwencję wiązania³⁶.
3. Mała produkcja IVT
   UWAGA: W przypadku pracy bez RNaz należy przygotować wszystkie odczynniki w warunkach sterylnych i wolnych od RNaz. Użyj odczynnika do odkażania RNazy (patrz tabela materiałów) i 95% v/v etanolu do czyszczenia powierzchni roboczych i pipet przed użyciem. Umyj rękawiczki z 95% etanolem i noś niestrzępiące się ubrania z długimi rękawami. Aby zminimalizować zanieczyszczenie RNazą, nie należy oddychać przez otwarte rurki.
   1. Przygotować roztwory podstawowe Tris-Cl (pH 8,0), ditiotreitolu, MgCl₂, spermidyny i NTPs/GMP (niebuforowane). Wymieszać odczynniki, jak pokazano w Tabeli 1. Przygotuj główną mieszankę tych odczynników z wyprzedzeniem, przed dodaniem enzymów lub kwasów nukleinowych.
      UWAGA: Jeśli używasz zamrożonych odczynników, dokładnie je wymieszaj po rozmrożeniu. Odczynniki mogą się wytrącać, jeśli zostaną zmieszane w zbyt wysokich stężeniach, dlatego zdecydowanie zaleca się przestrzeganie kolejności podanej w Tabeli 1.
   2. Dodaj w następującej kolejności: plazmid, przewodnik rozszczepienia, fosfataza nieorganiczna (IPPaza), RNaza H, T7RNAP. Ponieważ aktywność enzymów może się różnić w przypadku enzymów produkowanych we własnym zakresie, przed wyborem najlepszego należy przetestować kilka stężeń.
      UWAGA: Uwzględnij negatywną kontrolę reakcji rozszczepienia, np. bez RNazy H, aby przypisać brakujące prążki docelowe wadliwemu rozszczepieniu RNazy H, a nie nieudanej transkrypcji.
   3. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i potwierdzić reakcję na elektroforezie w żelu poliakrylamidowym denaturującym (PAGE) (Rysunek 3A). Rozcieńczyć próbkę 10-krotnie w roztworze nasycającym i obciążyć 1 μl na żel.
      UWAGA: Mieszanina żelowa: 8 M mocznik, 20% akryloamid (19:1 akrylamid: bisakrylamid) w 1x TBE. Roztwór ładujący: 5 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 300 μM błękit bromofenolowy w formamidzie. Nie można oczekiwać, że reakcje rozszczepienia RNazy H zakończą się po 1 godzinie, ponieważ nowe RNA jest wytwarzane w sposób ciągły. W tym momencie zwróć uwagę na wyraźne pasmo docelowe i brak gatunku o podobnej masie cząsteczkowej (np. produkty nukleotydowe ±3 (nt)).

cyfrowa (

Odczynnik	Koncentracja zapasów	Ilość mała skala (μL)
H2O	-	24
Tris	1 mln	5
MgCl2	1 mln	0,5
Naziemna telewizja	1 mln	0,5
spermidyna	250 mM	5
Zasady GMP (Ogólna T	100 mM	Rozdział 2.5
Atp	100 mM	1,5
GTP (GTP)	100 mM	1,5
Utp	100 mM	1,5
Informacja o zgodności z umową	100 mM	1,5
Plazmid	20 ng/μl	5
Przewodnik po dekolcie	100 μM	10
IPPase (iPPaza)	10 mg/ml	0,5
RNaza H	10 μg/ml	cyfra arabska
Polimeraza RNA T7	5 mg/ml	cyfra arabska

Tabela 1: Tabela odczynników do tandemowego rozszczepienia IVT i jednoczesnego rozszczepienia RNazy H. Koncentracje zapasów mogą być dostosowane do wygody użytkownika. Jeśli rozszczepienie RNazy H musi być wykonane po T7 IVT, dodaj prowadnik rozszczepienia i RNazę H po inaktywacji termicznej T7RNAP. Użyte ilości skalują się liniowo ze skalą reakcji. Skróty: T7RNAP = polimeraza RNA T7; IVT = transkrypcja in vitro.

2. Przygotowanie próbki NMR

1. Zwiększ reakcję do żądanej objętości (zwykle 10 ml) i przeprowadź reakcję przez noc. Przetestuj zakończenie reakcji następnego dnia za pomocą denaturującego żelu PAGE (Rysunek 3A).
   UWAGA: Niepełna reakcja rozszczepienia jest pokazana przez gatunki o wyższej masie cząsteczkowej powyżej pasma docelowego.
   1. Jeśli rozszczepienie nie powiodło się lub nie było całkowite, RNA i rozszczepienie prowadzą się w naczyniu reakcyjnym, podgrzewając roztwór w konwencjonalnej kuchence mikrofalowej o mocy 450 W przez 15 s.
   2. Powoli schładzać roztwór do temperatury 37 °C przez 40 minut. Do objętości poniżej 1 ml należy użyć bloku grzewczego. Zwróć uwagę na tworzenie się nowego osadu.
   3. Dodać więcej IPPazy i RNazy H i inkubować przez kolejne 1-3 godziny w temperaturze 37 °C. Potwierdzić zakończenie reakcji rozszczepienia za pomocą denaturacji PAGE.
   4. Po zakończeniu reakcji rozszczepienia RNazy H, wygasić reakcję, dodając EDTA do końcowego stężenia 50 mM i dokładnie odwirować.
      UWAGA: Potencjalne wytrącanie się pirofosforanu rozpuści się i utworzy się nowy osad białkowy.
   5. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i stężyć do objętości nadającej się do wstrzyknięcia do systemu HPLC, w zależności od wielkości pętli iniekcyjnej.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu poprzez zamrożenie próbki w temperaturze -20 °C.
2. Oczyszczanie HPLC na dużą skalę
   1. Przygotować jonowymienne A i B w ciągu tygodnia od użycia. Przefiltruj i odgazuj.
      UWAGA: Bufor A: 20 mM octan sodu; 20 mM nadchloran sodu, pH 6,5. Bufor B: 20 mM octan sodu; 600 mM nadchloran sodu, pH 6,5.
   2. Zrównoważyć kolumnę 100% buforem B, a następnie 100% buforem A dla co najmniej 2 objętości kolumn w temperaturze 75 °C.
   3. Przygotuj sekwencję HPLC (Rysunek 3B) przy natężeniu przepływu 5,5 ml / min. Użyj następującej sekwencji do oczyszczania RNA o wielkości od 20 do 30 nt: 0-7 min: 0% B; 7-16 min: gradient 0-20% B; 16-46 min: elucja, zwykle o gradinie 20-30% B (optymalizuj w zależności od potrzeb); 46-62 min: 100% B; 62-73 min: 0% B.
      UWAGA: Zmiana natężenia przepływu z 5,5 do 8 ml/min nie wpłynęła na separację w tym protokole.
   4. Zoptymalizuj gradient elucji, wstrzykując jednorazowo równoważnik 1 ml reakcji transkrypcyjnej (nieznakowanej).
      UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji i dyskusji, zapoznaj się z Karlsson et al.³¹ i Feyrer et al.²¹.
   5. Przetestuj zebrane frakcje na denaturującej STRONIE. Jeśli główny pik elucji jest dobrze odizolowany i zawiera czysty docelowy RNA, należy zwiększyć oczyszczanie do odpowiednika 10 ml reakcji transkrypcji.
   6. Zbierz interesujące Cię frakcje, skoncentruj i zamień bufor na bufor NMR. Użyj ultraodśrodkowego zespołu filtrującego (patrz tabela materiałów) dla objętości powyżej 50 ml.
      UWAGA: Bufor NMR: 15 mM fosforan sodu; 25 mM chlorek sodu; 0,1 mM EDTA, pH 6,5. Aby zminimalizować straty spowodowane przywieraniem RNA do plastikowych ścianek probówki, umyj wszystkie probówki zbiorcze 1 ml wody, swiruj i odwiruj, aby zebrać cały płyn.
   7. Określić stężenie za pomocą spektroskopii ultrafioletowej. Oblicz wydajność reakcji zgodnie z Feyrer et al²¹.
      UWAGA: Stężenie próbki NMR do eksperymentów RD nie powinno być niższe niż 130 nmol, co odpowiada 500 μM w objętości próbki 250 μL przy użyciu probówek NMR (Tabela materiałów).
3. Składanie próbki RNA
   1. Rozcieńczyć i podwielokrotnić próbkę o objętości ~10 ml do 1 ml na probówkę.
   2. Podgrzewać podwielokrotności RNA do temperatury 95 °C przez 5 minut.
   3. Próbki należy schłodzić błyskawicznie, umieszczając je na lodzie lub w mieszaninie wody, lodu i soli, i inkubować przez 30 minut.
   4. Pobrać próbki i stężyć do ~250 μl w filtrze odśrodkowym o pojemności 2 ml.
4. Napełnianie probówki NMR
   1. Wyczyść probówkę NMR w środku do czyszczenia probówek NMR, spłukując ją dużą ilością wody, odczynnikiem do odkażania RNazy, wodą, 95% etanolem (EtOH) i ponownie wodą. Pozostaw do wyschnięcia.
   2. Wyczyść tłok, spłukując go wodą i przecierając odczynnikiem do odkażania RNazy i 95% EtOH za pomocą niestrzępiącej się ściereczki. Pozostaw do wyschnięcia.
   3. Dodać 10% (v/v) D₂O do próbki NMR.
   4. Wlej próbkę RNA do probówki NMR za pomocą dużej końcówki pipety. Pozwól, aby ciecz przepływała wzdłuż boku ścianki rury.
   5. Włożyć tłok i usunąć pęcherzyki powietrza, popychając tłok w dół szybkim ruchem obrotowym.
   6. Powoli pociągnąć tłok do góry, nie tworząc nowych pęcherzyków powietrza, i przymocować go folią z wosku parafinowego.
5. Potwierdź składanie za pomocą NMR.
   UWAGA: W tym momencie konieczne jest wykonanie przynajmniej częściowego przypisania rezonansu w celu potwierdzenia drugorzędowej struktury próbki RNA i zidentyfikowania obszarów zainteresowania do badania dynamiki konformacyjnej. Wyczerpujący opis przypisywania rezonansu RNA wykraczałby poza ten protokół, dlatego w tym momencie odwołujemy się do dobrze ugruntowanej literatury^19,37,38. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) może być pomocnym wskaźnikiem fałdowania RNA i służyć jako dane uzupełniające w eksperymentach NMR.
   1. Porównaj następujące widma próbki, dla której przeprowadza się eksperymenty ¹H R_1ρ RD z prawidłowo złożoną próbką referencyjną (Rysunek 4): ¹H 1D, zwłaszcza obszar imino 10–15 ppm; aromatyczny ^{1 H,13}C-HSQC; ^1H,1H-SELOPE (opcjonalnie).
      UWAGA: Aromatyczny odcisk palca jest również konieczny, nawet w przypadku zgodności między sygnałami imino, ponieważ tworzenie dimerów często pokazuje takie same lub podobne sygnały imino jak spinka do włosów RNA. Eksperyment SELOPE może zastąpić ^{1 H,13}C-HSQC do aromatycznego odcisku palca, ponieważ eksperymenty heterojądrowe na nieznakowanych próbkach są bardzo czasochłonne.
   2. Użyj pętli UUCG jako odniesienia do odcisku palca (jeśli jest dostępna).
   3. Wykonaj to porównanie za każdym razem przed zarejestrowaniem eksperymentów ¹H R_1ρ RD.

3. ¹H R_1ρ Dyspersja relaksacyjna - rezonans (oznaczona jako wersja 1D)

UWAGA: Poniższe kroki opisują konfigurację eksperymentów RD dla znakowanej próbki przy użyciu wersji 1D sekwencji impulsów RD opartej na HSQC. Wykonaj te same kroki dla sekwencji 1D opartej na SELOPE dla próbek nieznakowanych. Przegląd nazw parametrów i ustawień dla obu przypadków przedstawiono w tabeli 2. Skupienie się na wersjach 1D wynika z tego, że są one bardziej praktyczne do pomiarów poza rezonansem, a konfiguracja wersji 2D eksperymentów opartych na SELOPE i HSQC została szczegółowo omówiona odpowiednio przez Schlagnitweit et al.²⁰ i Steiner et al.¹⁰.

1. Określ moc ¹H dla twardego impulsu 90° (P1).
   1. Opcja A: Użyj polecenia pulsacyjnego Bruker.
   2. Opcja B: W eksperymencie zg określ impuls 360°, mierząc krzywą nutacji na poziomie mocy twardego impulsu protonu na piku wodnym.
      UWAGA: Długość impulsu 90° to jedna czwarta czasu, w którym obserwowany jest sygnał zerowy (jeśli mierzona jest pełna krzywa nutacji, to jest to drugie zero; jednak w praktyce próbkowany jest tylko obszar wokół oczekiwanej wartości dla 360°).
2. Uruchom 1 H 1D spectrum zgesgp.f2f3dec, używając długości impulsu określonej w kroku 3.1, aby potwierdzić fałdowanie RNA przed każdym pomiarem R_1ρ.
   UWAGA^{: Jeśli}eksperymenty 1 H SL są przeprowadzane po raz pierwszy, sprawdź, czy obliczona moc SL odpowiada mocy dostarczanej do próbki, kalibrując moc SL dla każdej żądanej szerokości pasma. Szczegółowe kroki kalibracji są opisane w Steiner et al.¹⁰.
3. Utwórz ¹H R_1ρ dla zestawu danych oznaczonych etykietami i ustaw kluczowe parametry.
   1. Utwórz nowy zestaw danych; najlepiej w oparciu o zestaw danych ^{1 H-13}C aromatyczny HSQC, używany do w pełni znakowanych próbek RNA w celu przypisania RNA.
      UWAGA: Zapewni to, że zasilanie ¹³C oraz ¹⁵N i moc odsprzęgania są już ustawione.
   2. Ustaw parametry ogólne zgodnie z pierwszą częścią tabeli 2.
   3. Ustaw parametry specyficzne dla RD zgodnie z drugą częścią tabeli 2.
   4. Ustaw moc ¹H SL na najniższą wartość (1.2 kHz) w celu przetestowania.
   5. Wygeneruj testową listę vd z tylko jednym wpisem, 0 ms (aby zoptymalizować listę vd, zgodnie z opisem w kroku 3.4), ustaw TDF1 na 1 i zaktualizuj D30.
   6. Uruchom widmo testowe z tymi ustawieniami.
4. Zoptymalizuj listę vd (lista długości SL, które mają być używane).
   1. Uruchom eksperyment z testową listą vd (np. sześć pozycji: 0 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 40 m; zaszyfruj te wartości, aby uniknąć błędów systematycznych spowodowanych ogrzewaniem).
   2. Zaktualizuj odpowiednio D30 i TDF1 (w tym przykładzie D30 = 42 m i TDF1 = 6).
   3. Intensywność wykresu szczytu w funkcji długości SL. Zidentyfikuj długość SL, przy której intensywność pierwotnego piku zmniejsza się do 1/3.
   4. Utwórz ostateczną listę vd do użycia w eksperymencie, biorąc pod uwagę następujące kwestie: określ najdłuższą długość SL zgodnie z opisem w poprzednim kroku; unikaj używania listy w porządku malejącym lub rosnącym; i dodaj kilka duplikatów do badań statystycznych. Pamiętaj, aby aktualizować D30 i TDF1 za każdym razem, gdy nastąpią jakiekolwiek zmiany w liście vd.
      UWAGA: Eksperyment jest uruchamiany z różnymi długościami SL, jak podano na liście vd w sposób pseudo-2D.
   5. Wybierz liczbę skanowań tak, aby najsłabszy pik na liście miał stosunek sygnału do szumu (SINO) co najmniej 10,
      UWAGA: Chociaż lista vd została zoptymalizowana pod kątem niskiej mocy SL (1.2 kHz), ta lista vd powinna być również testowana przy najwyższej mocy SL, jaka ma być używana (np. 15 kHz). Dzieje się tak, ponieważ zanik będzie znacznie wolniejszy przy wysokiej mocy SL dla szczytów ze znaczącym udziałem k_EX. W związku z tym należy również zweryfikować wystarczający zanik przy wysokiej mocy SL.

powiedział: powiedział:

Opis parametru	Nazwa parametru w sekwencji impulsów
	Z etykietą 1D	1D SELOPE
program impulsowy dla rezonansu 1Ds	1HR1rho_HCP_onres1D.es	1HR1r_HH_onres1D.js
1H częstotliwości nośne (ppm)	O1P = rezonans wody w ppm	O1P = chemiczne przesunięcie piku zainteresowania (ppm)
	CNST28 = chemiczne przesunięcie szczytu zainteresowania (ppm)	CNST29 = rezonans wody w ppm
1H twardy impuls 90º	P1 @ PL1 (skalibrowany w 3.1.1)	P1 @ PL1 (skalibrowany w 3.1.1)
Kształtne impulsy i moce do tłumienia wody	P25 = 1000 us @ sp3	P12 = 2000 us @ sp1
	(Afera Watergate)	(wzbudzenie rzeźbienia)
Częstotliwość nośna 13C, rezonans z 13C przesunięciem chemicznym piku zainteresowania	O2P (O2P)	–
Częstotliwość nośna 15N, średnie przesunięcie chemiczne 15N w celu odsprzęgnięcia (jak w aromatycznych HSQC)	O3P (O3P)	–
13C/15N odsprzęganie (ustawione jak w HSQC)	PCPD2, CPD2	–
	PCPD3, CPD3
Transfer HCP (np. p=1/J @ 100 Hz)		–
Polecenia Pulse i Pulsef2 mogą być używane do określania mocy na podstawie impulsów twardych
Czas trwania (ustawiony na 1/J(1 H-13C) szczytu zainteresowania)	Zobacz materiał P11
Moc 1h i moc włączona 13C	Dodatki SP1, SP12
Transfer SELOPE (d = 1/4J(H5-H6))	–	Zobacz materiał D5
Impuls selektywny (np. obszar aromatyczny) dla SELOPE (4000 us, Eburp)	–	P13 i SP4
Parametry specyficzne dla SL / RD:
1H mocy SL, uzyskanej ze skalibrowanego twardego impulsu (np. za pomocą polecenia impulsowego).	Pl25 i CNST12 (1,2 – 15 kHz)	Pl24 (50 Hz – 15 kHz)
Lista zmiennych opóźnień dla czasu trwania SL (początkowo 1 wpis, 0, optymalizacja opisana w 3.1.3)	VDLIST (~ 0 – 40 ms)	vdlist (~ 0 – 150 ms ze względu na niskie R2 w próbkach nieoznakowanych)
TDF1 liczba pozycji na liście vd (początkowo 1)	TDF1	TDF1
Kompensacja ciepła:
D30 = największa wartość na liście vd + 2ms	Zobacz materiał D30	Zobacz materiał D30
Dodatkowa kompensacja ciepła dla bardzo szerokiej gamy SL		Zobacz materiał PL25
Parametry specyficzne dla rezonansu:
program impulsowy dla rezonansu off-resonance 1Ds	1HR1rho_HCP_offres1D.es	1HR1r_HH_offres1D.js
Przesunięcie dla eksperymentów off-rezonansowych	CNST30	CNST30

Tabela 2: Przegląd parametrów do konfiguracji eksperymentów ^1DHCP i 1D-SELOPE opartych na 1 H R_1ρ. Skróty: 1D = jednowymiarowy; HCP = heterojądrowa polaryzacja krzyżowa; SELOPE = SELective Zoptymalizowany Eksperyment Protonowy; ppm = części na milion; HSQC = heterojądrowa korelacja kwantowa spinu; SL = blokada wirowania; RD = dyspersja relaksacyjna

5. Przygotowanie i akwizycja eksperymentów rezonansowych ¹H R_1ρ
   1. Skopiuj eksperyment z sekcji 3.4 do nowego folderu w Topspin.
   2. W tym folderze skonfiguruj eksperymenty o różnej sile SL, za każdym razem zmieniając PL25 i CNST12. Określ prawidłowy poziom mocy dla każdej siły SL za pomocą polecenia impulsowego. Użyj mocy SL w zakresie od 1,2 do 15 kHz, z gęstszym próbkowaniem dla niższych mocy SL (zobacz Rysunek 5G dla wybranych mocy SL). Dodaj kopie niektórych eksperymentów, aby uzyskać duplikaty dla niektórych mocnych stron SL.
   3. Przeprowadź te eksperymenty.

6. Analiza eksperymentów on-sonancyjnych ¹H R_1ρ
   1. W TopSpin przetwarzaj każdy wycinek każdego zestawu danych pseudo-2D przy użyciu tych samych parametrów przetwarzania (np. poszerzenie linii, faza) za pomocą polecenia xf2 i podziel zestaw danych na 1Ds za pomocą programu Bruker AU split2D.
   2. Uzyskaj intensywność i głośność sygnału dla każdego wycinka 1D.
      UWAGA: W praktyce lepiej jest zdekonwolucjonizować widma, aby pozbyć się wkładów z potencjalnie nakładających się pików i pozwala na użycie programu Bruker AU multidcon, który w wygodny sposób podsumowuje intensywności lub obszary pików wszystkich wycinków w jednym eksperymencie w pliku tekstowym decall.txt, który następnie można łatwo odczytać za pomocą innych programów (użyto tutaj skryptów Pythona napisanych wewnętrznie, zgodnie z opisem Steiner et al.¹⁰) w krokach 3.6.3 i 3.6.4.
   3. Dopasuj mono rozkład wykładniczy dla każdej siły SL, aby uzyskać wartość R_1ρ (lub rezonansu, R₂ + R_EX).
   4. Wykreśl te wartości R₂ + R_EX (y) w porównaniu. Siła SL (x) (Rysunek 5F,G).
      UWAGA: Jeśli wartości są znacznie wyższe dla niskich mocy SL i maleją wraz z wyższą mocą SL (jak pokazano na Rysunek 5G), to badany pik wykazuje dyspersję i może być interesujące przeprowadzenie dodatkowych eksperymentów (poza rezonansem) w celu uzyskania informacji o różnicy populacji i przesunięcia chemicznego stanu wzbudzonego w stosunku do stanu wzbudzonego. stan podstawowy.

4. ¹H R_1ρ Dyspersja relaksacyjna - rezonans off-sonans (oznaczona jako wersja 1D)

1. Przygotowanie i akwizycja eksperymentów off-rezonansowych ¹H R_1ρ
   1. W nowym folderze topspinowym ustaw eksperymenty przy określonej sile SL (zwykle najpierw przy najniższej sile SL, ponieważ udział R_EX jest tam najwyższy, zobacz Rysunek 5G dla reprezentatywnego wyboru SL off-resonance), ale z różnymi przesunięciami, za każdym razem zmieniając CNST30.
   2. Używaj przesunięć do ± (3 lub 4)*SL, z gęstszym próbkowaniem około przesunięcia 0, jak można zobaczyć na Rysunek 5H,I.
   3. Przeprowadź te eksperymenty.
2. Analiza eksperymentów offrezonansowych ¹H R_1ρ
   1. Zastosować tę samą strategię przetwarzania, jak w ppkt 3.6.1–3.6.3, aby określić wartość R_1ρ dla każdego przesunięcia.
   2. Wykreśl te wartości w funkcji przesunięcia (Rysunek 5G).
      UWAGA: Asymetria na tej krzywej może już wskazywać, że można uzyskać informacje o przesunięciu chemicznym dla stanu wzbudzonego. Aby uzyskać informacje na temat k_EX, p_ES, a także Δω^10,20 (Rysunek 5G). Przykładowe zestawy danych, programy impulsowe i makra dla obu eksperymentów 1D można znaleźć w repozytorium Github Petzold Lab (https://github.com/PetzoldLab). Przegląd parametrów przedstawiono w tabeli 2.

Wyniki

Protokół produkcji RNA ułatwia oczyszczanie poprzez generowanie transkryptów o wysokiej czystości. Rysunek 3A pokazuje wyniki kilku reakcji rozszczepienia transkryptów tandemowych, dostarczając zarówno udanych, jak i nieudanych reakcji. Tor 1 pokazuje optymalny przypadek w pełni rozszczepionego transkryptu z jedynie słabymi śladami produktów ubocznych. Tor 2a wykazuje niepełne rozszczepienie, które można rozwiązać poprzez ponowne wyżarzanie i dodanie większej ilości RNazy H (tor 2b, krok 2.1.2). Konstrukty RNA linii 1, 2a i 2b są takie same. Próbka na pasie 3 pokazuje nieudane rozszczepienie. Rozwiązywanie problemów z tą reakcją obejmowałoby sprawdzenie sekwencji prowadzącej rozszczepienie, czystości matrycy DNA i temperatur wyżarzania. Potencjalnie rozszczepienie RNazy H będzie musiało zostać przeprowadzone po T7 IVT, jak pokazano dla próbki 2.

Próbka na torze 4 pokazuje znaczną ilość produktów ubocznych rozszczepienia, które są trudne do usunięcia za pomocą wymiany jonowej HPLC. Rozwiązywanie problemów z taką próbką może obejmować (a) obniżenie temperatury, ilości RNazy H lub czasu reakcji, (b) zmniejszenie gradientu elucji i objętości iniekcji oraz próbę oddzielenia frakcji docelowych od produktów ubocznych. Więcej informacji na temat tego, jak zwiększyć rozdzielczość w oczyszczaniu HPLC metodą wymiany jonowej, zostało omówione przez Karlsson et al.³¹. HPLC oddziela docelowe RNA od dłuższych lub krótszych kwasów nukleinowych oraz zanieczyszczeń białkowych lub małocząsteczkowych. Rysunek 3B pokazuje optymalny wynik dla jonowymiennego oczyszczania HPLC. Gradient elucji powinien być tak dobrany, aby docelowy gatunek RNA wymywał co najmniej jedną objętość kolumny (w tym przykładzie: 35 ml) po następnym mniejszym gatunku i objętość jednej kolumny przed następnym większym gatunkiem.

Mniejsze gatunki w tej metodzie obejmują pojedyncze nukleotydy, produkty nieudane (8-12 nt), sekwencje dystansowe 3' i 5' (5-14 nt) oraz przewodnik rozszczepienia (12 nt chimeryczny kwas nukleinowy), podczas gdy dłuższe sekwencje to potencjalnie nieutwardzone powtórzenia tandemowe i plazmid. Po osiągnięciu dobrze oddzielonego piku elucji, oczyszczanie można zwiększyć do odpowiednika ~20 ml reakcji IVT na wstrzyknięcie. Prawidłowe fałdowanie próbki RNA ma kluczowe znaczenie dla eksperymentów RD i musi być potwierdzone przed każdym pomiarem. Rysunek 4 pokazuje 22-merowe RNA znakowane A przed zastosowaniem protokołu składania w kroku 2.4 (niebieski) i tę samą próbkę po osiągnięciu prawidłowego fałdowania (czerwony). Przewidywanie struktury drugorzędowej Mc-Fold (Rysunek 4C) proponuje przedstawioną strukturę spinki do włosów z 4 parami zasad, co daje 5 sygnałów imino.

Oba widma w Rysunek 4A potwierdza te przewidywane sygnały, aczkolwiek z nieco inną względną intensywnością, co wskazuje, że niektóre nieprawidłowo sfałdowane struktury (tutaj, dimer) mogą być problematyczne do oceny za pomocą widm ^1H1D. Aromatyczne widmo ^{1 H,13}C-HSQC (Rysunek 4B), pokazuje jednak tylko 3 sygnały aromatyczne dla próbki przed protokołem składania (niebieski), ale wszystkie 4 sygnały dla próbki, która została złożona zgodnie z krokiem 2.4 (czerwony). Próbka pokazana na niebiesko prawdopodobnie utworzyła homodimer (struktura proponowana w Rysunek 4D), który skutkowałby tymi samymi sygnałami imino, co spinka do włosów. Sygnał A13H2 wydaje się być poszerzony o wymianę. Wyniki te pomagają podkreślić znaczenie potwierdzania składania zarówno za pomocą eksperymentów z imino, jak i aromatycznymi odciskami palców przed każdym eksperymentem RD. Sekwencje impulsów ¹H R_1ρ opisane w tym protokole pozwalają na wykrycie dynamiki w pośrednim reżimie wymiany. Początkowo rejestrowana jest krzywa rezonansowa, a jeśli występuje dynamika dla określonej pozostałości, w uzyskanych wartościach R₂ + R_EX widoczna jest dyspersja, podczas gdy krzywa ta jest płaska dla pozostałości bez wymiany.

Rysunek 5 pokazuje reprezentatywne krzywe rezonansowe uzyskane dla dwóch różnych atomów H8 w syntetycznym RNA hairpina (Rysunek 5A), w którym G6H8 wymienia doświadczenia (Rysunek 5C), podczas gdy A4H8 nie (Rysunek 5B). Ponieważ wymiana w tej próbce jest stosunkowo powolna (k_EX = 292 ± 40 Hz), wykorzystano przewagę eksperymentu SELOPE w celu uzyskania niskich mocy SL, a dwie krzywe rezonansowe zarejestrowano przy użyciu wersji 1D sekwencji impulsów. Ta sama sekwencja impulsów została następnie wykorzystana do uzyskania danych off-rezonansowych dla pozostałości wykazującej dyspersję w profilu rezonansowym. Rysunek 5D pokazuje uzyskane wartości R_1ρ w porównaniu z przesunięciem, gdzie niewielka asymetria krzywej wskazuje już na znak Δω.

Staje się to jeszcze bardziej widoczne na wykresie R₂+R_EX, gdzie wkład R₁ jest usunięty (Rysunek 5E). Prawa kolumna tego samego rysunku pokazuje reprezentatywne krzywe rezonansowe uzyskane dla dwóch różnych atomów H8 w nieco innej syntetycznej spince do włosów RNA z szybszą wymianą, w której G6H8 doświadcza wymiany ( Rysunek 5G), podczas gdy A4H8 nie (Rysunek 5F). Szybszy kurs wymiany (k_EX = 43 502 ± 38 478 Hz) pozwolił na jednoczesny zapis RD wszystkich protonów aromatycznych przy użyciu wersji SELOPE 2D w celu uzyskania danych zarówno rezonansowych, jak i pozarezonansowych (dane G6H8 pokazane na rysunku 5H,I).

Ogólne identyfikatory dla pozytywnych i negatywnych wyników
Pozytywne wyniki w tandemowym rozszczepieniu IVT i RNazy H można zidentyfikować w następujący sposób: 1) Pasma docelowe jest najsilniejszym pasmem w denaturującym żelu PAGE. 2) Nie ma żadnych lub są tylko słabe pasma wokół głównego pasma. 3) Nie ma lub występują tylko słabe gatunki o większej masie cząsteczkowej. 4) Chromatogram HPLC pokazuje dobrze oddzielony pik docelowego RNA. 5) Podczas próbkowania głównego piku na denaturującym żelu PAGE pojawia się tylko jedno pasmo.

Negatywne wyniki w tandemowym rozszczepieniu IVT i RNazy H prezentują się następująco: 1) Brak lub tylko słabe pasmo główne jest widoczne na denaturującym żelu PAGE. 2) Widoczny jest wzór gatunków o dużej masie cząsteczkowej z powtórzeń tandemowych RNA. 3) Chociaż pasmo główne jest obecne, pasma o podobnym natężeniu znajdują się powyżej lub poniżej pasma głównego w ciągu ± 3 nt.

Dobrze złożoną próbkę można zidentyfikować w następujący sposób: 1) Liczba obserwowanych protonów imino odpowiada liczbie protonów imino oczekiwanej na podstawie symulacji struktury drugorzędowej (np. Mc-Fold³⁹, Rysunek 4A). 2) Para chwiejnych zasad syn G-U w pętli UUCG (jeśli występuje) jest widoczna przy ~9,5 ppm, czasami widoczna tylko w niższej temperaturze. Dalsze pobieranie odcisków palców pętli UUCG zostało opisane przez Fürtiga i współpracowników⁴⁰. 3) Aromatyczny odcisk palca zgadza się z wcześniej przypisaną próbką, która została potwierdzona pod kątem prawidłowego złożenia (Rysunek 4C).

Nieprawidłowo sfałdowaną lub zdegradowaną próbkę można zidentyfikować w następujący sposób: 1) Jest więcej sygnałów imino niż przewiduje symulacja struktury drugorzędowej (UWAGA: mniej sygnałów imino niekoniecznie oznacza nieprawidłowe fałdowanie, ponieważ zamykające się pary zasad często nie są widoczne, a wymiana konformacyjna poszerza linie). 2) Brak sygnałów imino. 3) Wąskie sygnały o dużej intensywności w regionie aromatycznym, wskazujące na produkty degradacji pojedynczego nukleotydu. 4) Rozbieżność między sygnałami imino lub aromatycznymi do próbki referencyjnej o potwierdzonym fałdowaniu (Rysunek 4C).

Atom nie wykazujący wymiany w wykrywalnej skali czasowej można zidentyfikować w następujący sposób: 1) z płaskiego profilu RD (ze względu na brak udziału R_EX zmieniający się w zależności od przyłożonej mocy SL) (Rysunek 5B i Rysunek 5F). 2) Należy zachować ostrożność w przypadku powolnej wymiany pośredniej, gdy k_EX i Δω mają tę samą wielkość. W takim przypadku wkład rezonansowy może być bardzo mały, co można zobaczyć na Rysunek 5C (w tym przypadku dopasowane parametry to k_EX = 292 ± 40 Hz i Δω = 112 ± 4 Hz). W razie wątpliwości można zarejestrować niską krzywą rezonansową SL w celu weryfikacji.

Atom wykazujący wymianę w pośredniej skali czasowej można zidentyfikować 1) na podstawie niepłaskiego profilu dyspersji relaksacyjnej w eksperymencie RD na rezonansie (Rysunek 5B i Rysunek 5F); 2) szersza szerokość linii w eksperymencie HSQC lub SELOPE może być również wskaźnikiem wymiany.

Dobrze dobrane wartości mocy SL dla krzywych off-rezonansowych (Rysunek 5E,F): 1) mają znaczny udział k_EX w krzywej rezonansowej (wybrane wartości mocy SL są wskazane w Rysunek 5C i Rysunek 5G). 2) Ponieważ krzywe offrezonansowe są mierzone dla co najmniej 3 wartości mocy SL, wybrane wartości mocy SL powinny być rozłożone w obszarze krzywej rezonansowej z udziałem k_EX. 3) Doprowadzić do niepłaskich krzywych R₂ + R_EX po dopasowaniu Laguerre'a (np. Rysunek 5D: Mocne SL 25, 50 i 75 Hz; Rysunek 5E).  

Źle dobrane wartości mocy SL dla krzywych off-rezonansowych (Rysunek 5E,F) prowadzą do płaskich krzywych R₂+R_EX po dopasowaniu Laguerre'a. Przykład jest pokazany w Rysunek 5E, gdzie krzywa rezonansowa 100 Hz jest bardzo płaska i dlatego nie dostarcza istotnych informacji na temat Δω.

Wskazania dla artefaktów jądrowego efektu Overhausera (ROE) z obrotową ramą: 1) Δω uzyskane z krzywych rezonansowych odpowiadają przesunięciom chemicznym protonów w pobliżu przestrzennym / protonów, które wykazują pik krzyżowy z pikiem zainteresowania w widmie jądrowej spektroskopii efektu Overhausera (NOESY). (np. Rysunek 5I pokazuje szerokie krzywe off-rezonansowe, zgodnie z oczekiwaniami dla wymiany szybkiej-pośredniej, ale krzywe mają również ostrzejsze cechy, np. przy -3000 Hz i +1500 Hz. Jest bardzo prawdopodobne, że są one spowodowane artefaktem ROE, a nie przesunięciem chemicznym dla tego H8 w innym konformerze). 2) Dopasowanie Laguerre'a działa, ale nie działa dobrze (daje wysokie błędy lub fizycznie niemożliwe wartości) dla rezonansu i co najmniej 3 krzywych rezonansowych, mimo że wykładniki uzyskano z eksperymentów z wysokim SINO (>20) (np. k_EX = 43 502 ± 38 478 Hz). Często każdy SL dobrze pasuje indywidualnie, ale dopasowanie ich do siebie daje znacznie większy błąd; Odwrotne zachowanie jest oczekiwane dla prawdziwego stanu wzbudzenia.

Wskazania dla "prawdziwej" wymiany Δω: 1) Δω uzyskane z krzywych offrezonansowych nie pasują do chemicznych przesunięć protonów w otoczeniu przestrzennym/protonów, które wykazują pik krzyżowy z pikiem będącym przedmiotem zainteresowania w widmie NOESY (np. Rysunek 5E). 2) Dopasowanie Laguerre'a daje niskie błędy dla rezonansu i co najmniej 3 krzywych rezonansowych (np. Rysunek 5E vs. Rysunek 5I, zobacz podpis, aby zobaczyć wyniki dopasowania).

Rysunek 3: Produkcja próbki przez tandemową reakcję rozszczepienia IVT i RNazy H. (A) Denaturacja STRONY pozytywnych i negatywnych wyników tandemowego rozszczepienia IVT i RNazy H. Wysokość drabiny odnosi się do odniesień do RNA, 12* odnosi się do chimerycznego przewodnika rozszczepienia. Tor 1: Pomyślne wygenerowanie docelowego RNA o stężeniu 20 nt. Występuje niewiele krótszych i dłuższych produktów. Tor 2a: Niepełne rozszczepienie transkryptu tandemowego. Chociaż oczyszczanie metodą HPLC jest możliwe, zmarnowano by dużo materiału. Tor 2b: Dalsze rozszczepienie RNazy H na torze 2 daje czystą próbkę gotową do wstrzyknięcia HPLC (identyczną z linią 1). Tor 4: Rozszczepienie RNazy H było w dużej mierze nieudane i nie wyprodukowano żadnego pasma docelowego. Pełnometrażowy transkrypt tandemowy jest nadal widoczny w odległości 600 nt. Tor 5: Wyprodukowano pasmo docelowe, ale obecne jest silne pasmo -1. Chociaż HPLC można wykonać, konieczne jest ostrożne usunięcie produktu ubocznego. (B) Przykład udanego wstrzyknięcia HPLC. Pik po 38 minutach zawiera czyste RNA o docelowej długości, podczas gdy dłuższe i krótsze produkty są dobrze oddzielone od docelowego RNA. Panel B został zmodyfikowany z ²¹. Skróty: IVT = transkrypcja in vitro; HPLC = wysokosprawna chromatografia cieczowa; nt = nukleotydy; AU = dowolne jednostki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przykład spinki do włosów RNA przed (niebieski) i po (czerwonym) etapie składania 2.4 (patrz protokół) w NMR. (A) Region Imino widma ¹H-1D 22-merowego RNA znakowanego A. Oczekiwane obszary dla tożsamości par zasad sygnałów imino są oznaczone kolorem szarym poniżej. (B) ^{Widmo 1 H,13}C-HSQC rezonansów aromatycznych RNA z panelu A. Próbka po złożeniu (czerwona) pokazuje 4 sygnały zgodnie z oczekiwaniami, podczas gdy próbka przed złożeniem (niebieska) pokazuje tylko 3 sygnały. (C) Przewidywanie Mc-Fold 22-merowego RNA jako spinki do włosów. Po tej drugorzędowej strukturze należy spodziewać się pięciu sygnałów imino, które można znaleźć w obu próbkach w panelu A. (D) Proponowana struktura homodimeru utworzonego przez 22-merowy RNA, w wyniku czego powstaje tych samych 5 par zasad, co struktura spinki do włosów. Skróty: NMR = magnetyczny rezonans jądrowy; 1D = jednowymiarowy; HSQC = heterojądrowa pojedyncza korelacja kwantowa; ppm = części na milion. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek. 5: ¹H R_1ρ RD reprezentatywne wyniki dla dwóch różnych konstruktów opartych na spince RNA. (A) Lewa kolumna pokazuje wyniki uzyskane na RNA z parą zasad C-G powyżej wybrzuszonego U, podczas gdy prawa kolumna pokazuje wyniki uzyskane na próbce, w której para zasad została przełączona na GC. (B) i (F) pokazują płaskie profile dyspersji uzyskane dla A4H8 dla tych dwóch konstrukcji, co wskazuje na brak wymiany konformacyjnej. (C-E) pokazują dane o rezonansie, rezonansie wyłączonym i dopasowaniu uzyskane dla G6 w konstrukcji (G-C). Dopasowanie Laguerre'a prowadzi do następującego wyniku: R₁ = 2,87 ± 0,01 Hz, R₂ = 7,76 ± 0,03 Hz, k_EX =292 ± 40 Hz, p_ES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) pokazują rezonans, rezonans off-rezonansowy i dopasowane dane uzyskane dla G6 w konstrukcji (G-C). Dopasowanie Laguerre'a prowadzi do następującego wyniku: R₁ = 1,93 ± 0,02 Hz, R₂ = 6,71 ± 0,86 Hz, k_EX = 43,502 ± 38,478 Hz, p_ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Ten rysunek został zmodyfikowany z ²⁰. Skrót: SL = spin lock. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiony w nim protokół jest syntezą kilku protokołów opublikowanych wcześniej w formie artykułów naukowych 10,20,21,31. W związku z tym segmenty protokołu mogą być stosowane, podczas gdy inne mogą być wymieniane zgodnie z preferencjami czytelnika. Na przykład pomiary R_1ρ można przeprowadzić na próbce RNA wytworzonej dowolną metodą, pod warunkiem, że założy się fałdowanie i jednorodność długości. Co więcej, protokół nie zawiera informacji na temat rezonansowego przypisania sekwencji RNA - kroku wymaganego w eksperymentach RD - ponieważ zostało to obszernie omówione w poprzedniej literaturze 19,37,38. Częściowe, segmentowe lub specyficzne dla miejsca schematy znakowania 36,41,42,43,44 są podejściami ułatwiającymi przypisywanie rezonansów lub zmniejszającymi nakładanie się rezonansów, które są przedmiotem zainteresowania w eksperymentach RD i zostały szczegółowo opisane w literaturze. Metoda ta pozwala na zastosowanie jednolitego znakowania dowolnej tożsamości nukleotydowej, co już teraz może znacznie uprościć przypisywanie rezonansu.

Przedstawiona tutaj metoda IVT przezwycięża znane problemy z sekwencjami i etykietowaniem, zwiększa wydajność oraz zmniejsza koszty i czas pracy w porównaniu z innymi metodami. Zastosowanie sekwencji inicjacji wirusa zmniejsza potrzebę optymalizacji reakcji, co jest znanym problemem w tej dziedzinie, którego wykonanie może być czasochłonne i daje tylko kilka kopii transkryptu w przypadku inicjacji bez przeciążenia. Rozszczepienie T7 IVT i RNazy H transkryptu tandemowego można przeprowadzić jednocześnie w tym samym naczyniu. Wzór multimerycznych powtórzeń tandemowych można zaobserwować na denaturującym żelu PAGE podczas reakcji, który łączy się w pojedyncze pasmo na docelowym RNA po zakończeniu reakcji RNazy H (Figura 3A, pasy 1 i 2b). Typowe plony przy użyciu tej metody wahają się od 30 do 70 nmol RNA na 1 ml IVT. Jednak metoda oparta na rozszczepieniu RNazy H powtórzeń tandemowych nie jest pozbawiona pewnych problemów. Reakcja rozszczepienia RNazy H często nie przechodzi do zakończenia, gdy jest prowadzona jednocześnie z transkrypcją T7 (Figura 3A, ścieżka 2a).

Separację jednostek tandemowych można sfinalizować poprzez wyżarzanie prowadnicy rozszczepienia do transkryptu i dodanie większej ilości RNazy H (Rysunek 3A, pas 2b, krok 2.1.2). Ponieważ podgrzewanie dużych objętości jest powolne i prowadzi do katalizowanej Mg²⁺ hydrolizy RNA, zastosowano konwencjonalną kuchenkę mikrofalową, która podgrzewa próbkę do >95 °C w ciągu 10-15 s. Dotychczas nie zaobserwowano niekorzystnego wpływu na wyprodukowane próbki. Niektóre konstrukty pokazują małe drugie pasmo, którego nie można było wyeliminować przez optymalizację warunków reakcji (rysunek 3A, tor 4). Zazwyczaj są one dość wyraźnie widoczne jako ramię na chromatogramie HPLC, jeśli stosuje się dobrze zoptymalizowany gradient elucji, i mogą być usunięte (krok 2.2.5). Poniższa dyskusja ma na celu podkreślenie krytycznych etapów w protokole, w szczególności w odniesieniu do uzyskania wysokiej jakości danych, które pozwalają na interpretację dynamiki konformacyjnej.

Zanieczyszczenie RNazą
Zewnątrzkomórkowe RNazy są wszechobecne, wysoce stabilne i stanowią największe zagrożenie dla długoterminowej stabilności próbek NMR. Dlatego tak ważne jest, aby pracować w środowisku wolnym od RNaz i utrzymywać wszystkie odczynniki i wyroby z tworzyw sztucznych wolne od RNaz. Zaleca się stosowanie końcówek filtrujących, a może nawet masek na twarz. Jest to szczególnie ważne po oczyszczeniu metodą HPLC. Próbki NMR zanieczyszczone RNazami zwykle wykazują wąskie piki widoczne w widmach ¹H-1D po dniach lub tygodniach z powodu produktów degradacji pojedynczych nukleotydów. Taka próbka nie nadaje się do pomiarów R_1ρ.

Próbka NMR
Ze względu na swój wysoce naładowany charakter, RNA może być stosowany w wysokich stężeniach bez wytrącania w porównaniu z większością białek. Zastosowanie probówek Shigemi NMR (patrz Tabela Materiałów) jest korzystne, ponieważ umożliwiają one wyśrodkowanie wysoce skoncentrowanej próbki w środku cewki, zapewniając jednocześnie idealne warunki podkładkowania i blokowania dzięki dopasowanemu do podatności szklanemu dnu i tłokowi. W ten sposób zmniejsza się niejednorodność B1, co prowadzi do powstania węższych linii. Typowa objętość próbki w probówce NMR wynosi 250 μl, a typowe stężenie to 1-2 mM. Próbki poniżej 500 μM nie są zalecane do eksperymentów RD, ponieważ eksperyment trwałby zbyt długo i dobrze by się nabrał. Podobnie, objętość próbki poniżej 200 μl nie jest zalecana, ponieważ wymagana jest dobra podkładka podporowa i stabilność w terenie (blokada). Podczas wkładania tłoka ważne jest, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w próbce (krok 2.4.5). Jeśli nie zostanie prawidłowo zamocowany, tłok może wsunąć się do próbki, zmniejszając wykrywalną objętość. Ponadto gwałtowne zmiany temperatury mogą prowadzić do powstawania nowych pęcherzyków w próbce. W związku z tym należy zachować ostrożność podczas transportu próbki oraz przy zmianie temperatury sondy w spektrometrze NMR. Sprawdź próbkę pod kątem pęcherzyków powietrza podczas ponownego pomiaru po dłuższym czasie.

Fałdowanie RNA
Dynamiczne cząsteczki RNA mogą istnieć w wielu konformacjach, gdy nie są prawidłowo złożone. Mimo że temperatury topnienia struktur wtórnych mogą być tylko nieznacznie wyższe od temperatury pokojowej, przed pomiarem zaleca się dokładną procedurę ogrzewania i chłodzenia zatrzaskowego. Wysoce skoncentrowane próbki spinki do włosów składające się pod kontrolą kinetyczną (ogrzewanie i chłodzenie błyskawiczne) mogą z czasem tworzyć homodimery, co wymaga rygorystycznej kontroli fałdowania RNA przed każdym pomiarem NMR. Jeśli zmierzone RNA nie jest strukturą typu hairspin, ale duplex RNA, należy zastosować powolne fałdowanie pod kontrolą termodynamiczną.

W takim przypadku proces chłodzenia po podgrzaniu powinien odbywać się w zakresie godzin, podczas gdy RNA jest wykorzystywane w swojej końcowej objętości i stężeniu w próbce NMR. Wstępne zliczanie oczekiwanych rezonansów imino i aromatycznych może dostarczyć informacji na temat jednorodności próbki. Jeśli próbka nie wygląda zgodnie z oczekiwaniami, należy ją ponownie złożyć. Mg²⁺ (dodany jako sól chlorkowa) może pomóc w fałdowaniu struktur RNA⁴⁵. W praktyce kontrola składania służy jako porównanie z próbką, która została wykorzystana do przynajmniej częściowego przypisania rezonansów NMR i eksperymentalnego rozwiązania struktury drugorzędowej.

Zagadnienia dotyczące mocy blokady wirowania i ogrzewania
W przypadku przeprowadzania eksperymentów ¹H R_1ρ RD jako eksperymentów przeglądowych 2D, moc SL nie powinna być mniejsza niż 1,2 kHz. Częstotliwość nadajnika częstotliwości radiowej powinna być umieszczona w środku obszaru ppm pików będących przedmiotem zainteresowania (np. 7,5 ppm dla protonów aromatycznych). Szerokość pasma 1,2 kHz będzie wtedy wystarczająco duża, aby zablokować te protony bez żadnych większych efektów rezonansowych. Takie efekty można zidentyfikować w profilu RD. Jeśli wystąpią, wartości R₂ + R_EX rosną zamiast maleć wraz ze wzrostem wartości mocy SL, szczególnie w przypadku niskiej mocy SL. Sprawdź, czy obliczone wartości mocy SL odpowiadają mocy dostarczonej do próbki. W praktyce obliczona moc SL może być użyta, jeśli twardy impuls ¹H 90° został starannie skalibrowany na nowszych spektrometrach; można to jednak sprawdzić, kalibrując moc SL dla każdej żądanej szerokości pasma.

Zakres mocy SL, która może być wykorzystana w eksperymentach ¹H R_1ρ RD jest bardzo szeroki, co prowadzi do różnego nagrzewania próbki (od 1,2 kHz do 15 kHz dla HSQC dla sekwencji opartych na HCP i od 50 Hz do 15 kHz dla eksperymentów SELOPE). Nierównomierne nagrzewanie próbki można wykryć jako niewielką zmianę przesunięcia chemicznego, porównując 1D uzyskane dla SL małej mocy vs. SL o dużej mocy. Efekt ten zwykle nie jest brany pod uwagę w kompensacji ciepła w doświadczeniach R_1ρ na heterojądrach. Kompensacja ciepła w tych eksperymentach jest zwykle ustawiana tak, aby korygować różne nagrzewanie ze względu na różne czasy trwania blokady wirowania określone na liście vd każdej serii mocy blokady wirowania. Szczególnie w eksperymencie SELOPE należy zastosować drugą kompensację ciepła dla wszystkich zastosowanych mocy SL, jak opisano w²⁰.

Zagadnienia dotyczące listy VD
Jak wspomniano wcześniej, lista vd powinna zawierać punkt czasowy wystarczająco długi, aby uzyskać znaczny zanik intensywności (najlepiej do 30% początkowego sygnału lub tak niski, jak to możliwe, jeśli nie jest możliwe osiągnięcie 70% zaniku w specyfikacji sondy). Chociaż lista vd została zoptymalizowana pod kątem niskiej mocy SL (1,2 kHz), ta lista vd powinna być również testowana przy najwyższej mocy SL, jaka ma być używana (np. 15 kHz). Wynika to z faktu, że dla szczytów ze znacznym udziałem R_EX , zanik będzie znacznie wolniejszy przy wysokiej mocy SL. Tak więc wystarczający rozpad powinien być również zweryfikowany przy wysokiej mocy SL. To samo należy wziąć pod uwagę w przypadku rozpadów przy dużych przesunięciach w eksperymentach z rezonansem. Idealny maksymalny punkt czasowy listy vd może być znacząco różny dla różnych regionów eksperymentu dyspersyjnego. W takim przypadku więcej punktów może zostać uwzględnionych na liście vd, a dłuższe punkty z listy vd dla wyższej mocy SL lub wyższych przesunięć podczas analizy, w oparciu o niskie SINO, do którego doprowadzą, mogą zostać odrzucone. Ogólnie rzecz biorąc, należy wziąć pod uwagę 5-8 punktów listy vd, aby móc dostrzec potencjalne artefakty prowadzące do rozpadów niewykładniczych, takich jak sprzężenie J (patrz poniżej).

Zagadnienia dotyczące selektywności 1D-HCP
Należy zachować szczególną ostrożność podczas uruchamiania wersji 1D opartej na HCP, jeśli występuje inny pik pokrywający się z pikiem zainteresowania w wymiarze ¹H eksperymentu opartego na HSQC 2D. Transfery oparte na HCP są bardzo, ale nigdy w 100% selektywne, a zatem może się zdarzyć, że kolejny pik przyczynia się do intensywności i zaniku interesującego go piku w 1D. Wskazówką do tego byłaby różnica w wartościach rezonansowych R_1ρ uzyskanych przy użyciu wersji 1D i 2D znakowanego eksperymentu.

Rozważania dotyczące ROE:
Dla krzywych rezonansowych atomów z powolną wymianą pośrednią, artefakty ROE można zidentyfikować na podstawie porównania otrzymanego Δω z widmem NOESY lub ROESY. Jeśli pik krzyżowy można zidentyfikować przy różnicy przesunięć chemicznych odpowiadającej Δω, to obserwowany stan wzbudzony może być w rzeczywistości artefaktem ROE (np. ROE znaleziono między aromatycznymi protonami, które znajdują się w tym samym zakresie przesunięcia chemicznego, a zatem są objęte tymi krzywymi rezonansowymi²⁰). Z doświadczenia wiem, że zawsze prowadziło to również do słabego pasowania z dużymi błędami, prawdopodobnie z powodu tego, że ROE nie podążało za tym samym wzorcem co R_EX ze wzrostem mocy SL. Sytuacja staje się trudniejsza w przypadku wymiany średnio szybkiej. Podczas gdy krzywa rezonansowa jest (z porównania z danymi ¹³C uzyskanymi na sąsiednim jądrze) nadal reprezentatywna dla procesu wymiany między GS i ES, na krzywą rezonansową wpływa wiele artefaktów ROE.

W takim przypadku moc SL do wykrywania procesu wymiany jest większa (>1,5 kHz) i dlatego obejmuje większą liczbę protonów, ponieważ krzywe offrezonansowe obejmują różnice przesunięć chemicznych różnych kandydatów na ROE (dla H8 byłyby to: protony aminowe przy ok. ±1000 Hz, H5/H1 przy ok. -1200 Hz, imino protonów o częstotliwości ok. 3500 Hz). Do tej pory nie znaleziono żadnej metody tłumienia tych artefaktów ROE (innej niż użycie częściowo deuterowanych nukleotydów⁴⁶), a dane off-rezonansowe nie powinny być rejestrowane w przypadku szybkiej wymiany pośredniej, ponieważ za pomocą tej metody nie można uzyskać wiarygodnych informacji na temat rzeczywistego Δω, jeśli nie można wykluczyć udziału NOE/ROE za pomocą widm NOESY.

Uwagi dotyczące sprzęgła J (Hartmann-Hahn)
Chociaż krzywe rezonansowe dla homojądrowych protonów sprzężonych z literą J, takich jak H6, udało się zarejestrować^10,20, należy zachować szczególną ostrożność przy pomiarach poza rezonansem, zwłaszcza dla niskiej mocy SL, ponieważ warunki dopasowania Hartmanna-Hahna mogą obejmować szeroki zakres badanych przesunięć. Artefakty Hartmanna-Hahna można zidentyfikować jako oscylacje na rozpadzie wykładniczym lub rosnące wartości R₂ + R_EX wraz ze wzrostem siły SL na rezonansowych wykresach RD²⁰.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
40% roztwór akryloamidu/bis	Bio-Rad	161-0144
Kompetencja 5-alfa  E. coli	NEB	C2987I
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	49199
Acetonitryl&	nbsp; Sigma-Aldrich	34851
AFC-3000, Zbieracz frakcji HPLC	Thermo Scientific	5702.1
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9414
Amersham ImageQuant 800 UV	GE Healthcare	29399482	LAS-4000 lub równoważnego
Amicon	Sigma-Aldrich
Nadsiarczan amonu	Sigma-Aldrich	A3678
Ampicylina	Sigma-Aldrich	A9518
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
ATP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645702
enzym restrykcyjny BamHI	NEB	R0136L
Filtr butelkowy	Firma VWR	514-1019
Błękit bromofenolowy	Sigma-Aldrich	1081220005
Prowadnica dekoltu	IDT	N/A	lub równoważna
CTP	Sigma-Aldrich	C1506
CTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645699
D2O	System UHPLC Sigma-Aldrich	151882
Dionex Ultimate 3000	Thermo Scientific	N/A
DL-Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
DNAPac PA200 22x250 Kolumna półprzygotowawcza	Kolumna ochronna Thermo Scientific	SP6734
DNAPac PA200 22x50	Thermo Scientific	SP6731
RNaza E.coli H	NEB	M0297L	lub wykonane we własnym zakresie Uniprot ref. P0A7Y4
EDTA&	nbsp; Sigma-Aldrich	E6758
Wirówka Eppendorf, wirnik: A-4-44	Eppendorf	5804R
Etanol 95%	Fisher scientific	11574139
Etanol 95% denaturowany	VWR	85829.29
Formamid	Sigma-Aldrich	47671
GelRed	VWR	41003
Linijka GeneLiner 1kbp Plus	Fisher Naukowy	SM1333	Opcjonalna
GMP	Sigma-Aldrich	G8377
GMP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	650684
GTP	Sigma-Aldrich	G8877
GTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645680
Kwas solny	Sigma-Aldrich	H1758
Pirofosfataza nieorganiczna	Sigma-Aldrich	I1643-100UN&	nbsp; lub wykonane we własnym zakresie Uniprot ref. P0A7A9
Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer	Sigma-Aldrich	T4415
Julabo TW8 Łaźnia wodna	VWR	461-3117
kuroGEL Midi 13 Pozioma elektroforeza żelowa	VWR	700-0056	lub porównywalny
bulion LB (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB bulion z agarem (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
Drabinka ssRNA niskiego zasięgu	NEB	N0364S	Opcjonalna
pompa LPG-3400RS	Thermo Scientific	5040.0036
Chlorek magnezu sześciowodny	Marker mikroRNA Sigma-Aldrich	63068
	NEB	N2102S Kuchenka mikrofalowa
	Samsung
Sprzęt do elektroforezy Mini-PROTEAN	Bio-Rad	1658004
NucleoBond Xtra Maxi	Maszyny-Nagel	740414.10M
plazmid pUC19 zawierający wkładkę tandemową	Genscript	Nie dotyczy	lub równoważny
RNaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020
Rurka Shigemi 5mm	Sigma-Aldrich	Z529427
Strzykawka jednorazowa, końcówka Luer lock	VWR	613-2008
Octan sodu	Sigma-Aldrich	S2889
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	730-1470
Nadchloran sodu	Sigma-Aldrich	71853
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	S3264
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	S3139
Trichlorowodorek spermidyny	Sigma-Aldrich	85578
SYBR Złoto	ThermoFisher	S11494
Filtry strzykawkowe	VWR	514-0061
Polimeraza RNA T7	Sigma-Aldrich	10881767001	lub wykonane we własnym zakresie Uniprot ref. P00573
TCC-3000RS Termostat kolumnowy	Thermo Scientific	5730
Tetrametyloetylenodiamina	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Podstawa	Fisher Scientific	10103203
UMP	Sigma-Aldrich	U6375
UMP-13C9/15N2	Sigma-Aldrich	651370
Mocznik	Sigma-Aldrich	U5378
UTP	Sigma-Aldrich	U6625
UTP-13C10/15N5	Detektor Sigma-Aldrich	645672
VWD-3100	Thermo Scientific	5074.0005