Identyfikacja RNA zaangażowanych w bezpośrednią interakcję RNA-RNA z długim niekodującym RNA

Podsumowanie

Łatwy w użyciu protokół pull-down RNA jest przeznaczony do identyfikacji RNA zaangażowanych w bezpośrednią interakcję RNA/RNA z długim, niekodującym RNA. Protokół wykorzystuje psoralen jako utrwalacz do sieciowania tylko interakcji RNA/RNA i zapewnia cały bezpośredni interaktom RNA długiego niekodującego RNA w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA.

Streszczenie

Rosnąca obecnie rola przypisywana długim niekodującym RNA (lncRNA) w fizjologii i patofizjologii sprawia, że kluczowe jest scharakteryzowanie ich interaktomii poprzez identyfikację ich molekularnych partnerów, DNA, białek i/lub RNA. Te ostatnie mogą wchodzić w interakcje z lncRNA poprzez sieci obejmujące białka, ale mogą być również zaangażowane w bezpośrednie interakcje RNA/RNA. W związku z tym opracowaliśmy łatwą w użyciu procedurę ściągania RNA, która umożliwiła identyfikację RNA zaangażowanych w bezpośrednią interakcję RNA/RNA z lncRNA za pomocą psoralenu, cząsteczki, która sieciuje tylko interakcje RNA/RNA. Bioinformatyczne modelowanie struktury drugorzędowej lncRNA pozwoliło na wybór kilku specyficznych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA o silnym powinowactwie do regionów wykazujących niskie prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad. Ponieważ specyficzne sondy, które zostały zaprojektowane, były ukierunkowane na dostępne regiony na całej długości lncRNA, strefy interakcji RNA można było wyznaczyć w sekwencji lncRNA. W połączeniu z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem RNA, protokół ten może być stosowany do całych bezpośrednich badań interaktomii RNA interesującego lncRNA.

Wprowadzenie

Długie niekodujące RNA (lncRNA) to niekodujące białek transkrypty dłuższe niż 200 nukleotydów. Ich liczba stale rośnie, ponad 58 000 u ludzi. Co więcej, ich kluczowa rola w fizjologii i patofizjologii sprawia, że konieczne jest scharakteryzowanie ich partnerów molekularnych, którzy pozwalają im realizować ich funkcje regulacyjne. W rzeczywistości jednym z podejść do zrozumienia funkcji lncRNA jest wykrycie oddziałujących partnerów molekularnych każdego lncRNA.

Molekularnymi celami lncRNA mogą być DNA, białka lub RNA, a różne techniki zostały opracowane w celu ich identyfikacji. W związku z tym identyfikacja białek oddziałujących z lncRNA jest celem różnych protokołów, w tym różnych procedur immunoprecypitacji RNA (RIP), w których przeciwciało przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania jest wykorzystywane do specyficznego obniżania lncRNA (dla przeglądu¹). Inne techniki, takie jak Analiza Hybrydyzacji Wychwytywania Celów RNA² (CHART) lub Izolacja chromatyny przez oczyszczanie RNA³ (ChIRP) pozwalają na obniżenie lncRNA wraz z powiązanymi kompleksami białkowymi. W tych ostatnich technikach lncRNA jest używany jako przynęta. CHART i ChIRP są również potężnymi technikami identyfikacji map genomowych pokazujących zajętość lncRNA^2,3. Ponadto te metody ściągania RNA umożliwiają identyfikację partnerów RNA lncRNA. Opisano procedurę, która pozwala na wychwytywanie RNA, do których dąży lncRNA. Biotynylowane sondy oligonukleotydowe Antisense DNA są zaprojektowane dla regionów o niskim prawdopodobieństwie wewnętrznego parowania zasad, określonych przez bioinformatyczne modelowanie struktury drugorzędowej lncRNA⁴. Jednak procedura ta nie rozróżnia, czy partnerzy RNA oddziałują pośrednio poprzez sieć białkową, czy bezpośrednio poprzez bezpośrednie interakcje RNA/RNA z lncRNA. Wykazano, że sieciowanie pochodnymi psoralenu jest metodą z wyboru do wyboru bezpośrednich oddziaływań RNA/RNA, w których pośredniczy parowanie zasad⁵. Pochodne psoralenu są rzeczywiście zdolne do interkalacji w dwuniciowy DNA lub RNA i kowalencyjnego łączenia pirymidyn po napromieniowaniu światłem UV (365 nm)⁶. Sprzężenie ściągania RNA w dół za pomocą biotynylowanych sond oligonukleotydowych z sieciowaniem z psoralenem jest łatwą w użyciu procedurą zaproponowaną tutaj do identyfikacji RNA zaangażowanych w bezpośrednie interakcje RNA/RNA z lncRNA. Co więcej, procedura ta może pozwolić na wyznaczenie stref interakcji RNA w sekwencji lncRNA, jeśli zastosuje się różne sondy oligonukleotydowe zaprojektowane wzdłuż długości lncRNA.

Protokół

1. Konstrukcja sondy

1. Wygeneruj drugorzędową strukturę lncRNA za pomocą specjalistycznego bezpłatnego oprogramowania serwera WWW: RNAstructure software⁷ lub Vienna RNA web suite⁸. Wybierz regiony, które wykazują niskie prawdopodobieństwo wewnętrznego parowania zasad i zaprojektuj antysensowne sondy oligonukleotydowe o długości 25 zasad dla różnych regionów tego lncRNA.
2. Sprawdź wszystkie oligonukleotydy zaprojektowane za pomocą bezpłatnego oprogramowania akademickiego AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr), aby uzyskać różne informacje na temat tych sond i wybrać te o najlepszych parametrach.
   UWAGA: Sprawdź optymalne parametry w oprogramowaniu w następujący sposób. Procent GC: od 40 do 60%, stabilność 3', złożoność, samokończący się dimer: "dobry". Temperatura topnienia (TM) nie jest ważna, ponieważ powinowactwo odbywa się w temperaturze pokojowej.
3. Korzystając z narzędzia do wyszukiwania wyrównania (tj. Blast itp.), Upewnij się, że wybrane antysensowne sondy oligonukleotydowe nie rozpoznają sekwencji nukleotydowych w żadnym innym RNA ulegającym ekspresji w wybranych komórkach.
   1. Zaprojektuj sondę oligonukleotydową o długości 25 zasad. Upewnij się, że ta sonda nie wykazuje powinowactwa do interesującego lncRNA ani żadnych innych sekwencji RNA w genomie będącym przedmiotem zainteresowania.
4. Zamów wszystkie sondy z modyfikacją biotyny dodaną do ich końca 3' wraz z przekładką trietylenoglicerolową (TEG). Przekładka ta zwiększa odległość oligobiotyny, aby uniknąć przeszkód sterycznych.
   UWAGA: Aby uzyskać optymalny wynik i ocenić swoistość wyników pull-down, zaprojektuj co najmniej dwie różne antysensowne sondy oligonukleotydowe w tym samym regionie, a następnie porównaj ich wydajność eksperymentalnie.

2. Sieciowanie

1. Hoduj komórki (np. Komórki GH4C1 użyte w tym eksperymencie) aż do zbiegu w 78,5 cm² naczyniach do hodowli komórkowych. Po usunięciu pożywki do hodowli komórkowej przepłukać warstwę komórkową 5 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem wzbogaconego o Ca²⁺ i Mg²⁺ (PBS ⁺) i dodać 3 ml roztworu cząsteczki pochodzącej z psoralenu (chlorowodorek 4′aminometylotrioksalenu) przygotowanego w PBS⁺ o stężeniu 0,1 mg/ml.
2. Umieścić płytkę do hodowli na 30 minut w inkubatorze do hodowli komórek ssaków w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ . Po 30 minutach zdejmij pokrywkę, umieść szalki hodowlane na lodzie w odległości 2,5 cm od lamp UV 365 nm w sieciowniku UV UV na 10 minut. Delikatnie potrząśnij naczyniami i przywróć ekspozycję na promieniowanie UV na dodatkowe 10 minut.
3. Wyrzuć pożywkę przez aspirację, dodaj 1 ml PBS⁺ w celu zebrania komórek za pomocą skrobaka do komórek i przenieś do mikroprobówki. Wirować w temperaturze 4 °C, 400 x g przez 5 min. Usunąć jak najwięcej supernatantu i przechowywać granulki w temperaturze -80 °C.

3. Liza komórek

1. Przygotuj bufor proteinazy K, dodając 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,5% SDS i 5 μL/ml inhibitora RNazy.
2. Zawiesić osady komórkowe w tym buforze (około 200 μl na 1 x 10⁷ komórek). Dodać proteinazę K do końcowego stężenia 0,1 μg/μl i inkubować przez 45 minut w temperaturze 50 °C. Następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 95 °C w celu inaktywacji proteinazy K.

4. Sonikacja

1. Rozprowadzić 100 μl tego lizatu (co odpowiada 5,10⁶ komórek) w dwóch mikroprobówkach i dodać 200 μl buforu hybrydyzacyjnego (700 mM NaCl, 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 1,25% SDS, 5 μL/ml roztworu inhibitora RNazy i 15% formamidu) do każdej probówki.
2. Umieścić probówki w łaźni wodnej sonikatora o temperaturze 4 °C i rozpocząć sonikację od 2 serii impulsów 30 s (wysoka intensywność) oddzielonych od siebie 30 s.
3. Zebrać 20 μl próbek, które posłużą jako wejściowe próbki kontrolne i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Ta procedura sonikacji została wcześniej zoptymalizowana dla linii komórkowej GH4C1 w celu uzyskania fragmentów RNA w zakresie 2,000 nukleotydów⁹. W przypadku innych linii komórkowych procedura sonikacji musi być zoptymalizowana. Gdy technika ta jest wykonywana w celu zbadania partnerów RNA bardzo długiego, niekodującego RNA, etap sonikacji okazuje się niezbędny do uzyskania odpowiedniego odzysku lncRNA. W takim przypadku konieczne jest zatem zaprojektowanie kilku sond z miejscem wiązania umieszczonym maksymalnie co 4 000 nukleotydów na długości lncRNA. Aby odzyskać pełną długość lncRNA, użyj puli kilku określonych sond. Jeśli jednak celem jest identyfikacja regionów lncRNA zaangażowanych w wiązanie RNA-RNA, określone sondy muszą być używane oddzielnie. Ponadto, w przypadku badania partnerów RNA mniejszego lncRNA, należy przeprowadzić eksperymenty w celu ustalenia, czy wymagany jest etap sonikacji.

5. Ściąganie RNA

1. Dzień 1 - Etap hybrydyzacji
   1. Dodać 150 pmol (1,5 μl 100 μM roztworu podstawowego) biotynylowanej specyficznej lub niespecyficznej sondy do każdej probówki z próbką. Inkubować przez 4 godziny pod mieszaniem na rotatorze rurowym w temperaturze pokojowej (RT) (około 30 obr./min).
   2. Weź niezbędną objętość kulek magnetycznych (tj. 40 μl kulek na 150 pmol reakcji hybrydyzacji sond). Użyj wspornika magnetycznego, aby oddzielić koraliki od nośników komercyjnych. Odrzucić supernatant i przemyć kulki 900 μl buforu hybrydyzacyjnego. Po zakończeniu ponownie zawiesić kulki magnetyczne w tej samej objętości bufora hybrydyzacji.
   3. Dodaj kulki magnetyczne do każdej probówki z próbką (40 μl kulek na 150 pmol reakcji hybrydyzacji sond). Inkubować przez noc pod mieszaniem na rotatorze rurowym w temperaturze pokojowej (około 30 obr./min).
2. Dzień 2 - etap izolacji RNA
   1. Oddziel kulki od lizatu komórkowego za pomocą wspornika magnetycznego (2-3 min). Odrzucić supernatant i przemyć kulki 900 μl buforu do przemywania (0,5% SDS, 2x SSC) przez 5 minut inkubacji pod mieszaniem na rotatorze w temperaturze pokojowej. Powtórzyć płukanie 5 razy.
   2. Po usunięciu ostatniego płukania dodaj 95 μl buforu Proteinazy K na kulki. Rozmrozić próbki wejściowe i dodać 75 μl buforu proteinazy K. Dodać 5 μl proteinazy K do końcowego stężenia 1 μg/μl we wszystkich probówkach (próbkach i próbkach wejściowych). Inkubować w temperaturze 45 °C przez 45 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
   3. Próbkę należy przechowywać na lodzie. Użyj wsparcia magnetycznego, aby oddzielić kulki od RNA obecnych w supernatancie. Oczyść RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA, który zawiera etap trawienia DNazy. Oczyszczone RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Elucjowany RNA można poddać RT-qPCR lub wysokoprzepustowemu sekwencjonowaniu RNA w celu wykrycia wzbogaconych transkryptów. W przypadku analizy sekwencjonowania RNA, odczyty można następnie wyrównać z genomem będącym przedmiotem zainteresowania za pomocą bezpłatnego oprogramowania, takiego jak STAR¹⁰ lub HISAT2¹¹, a kwantyfikację można przeprowadzić za pomocą FeatureCounts¹² lub HTSeq count¹³.

Wyniki

Wyjaśnienie interaktomii lncRNA, tj. składników komórkowych, które oddziałują z lncRNA, białkami, RNA i DNA, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji lncRNA. Opracowano różne techniki charakteryzujące interaktomizm lncRNA, w tym RIP, CHART, ChIRP i pull-down. Chociaż wykazano, że ten ostatni jest skuteczny w identyfikacji celów RNA lncRNA, procedury te nie wskazują, czy partnerzy RNA oddziałują pośrednio poprzez sieć białkową, czy bezpośrednio poprzez bezpośrednie interakcje RNA / RNA. Jednak obecnie uważa się, że m...

Dyskusja

Wiele lncRNA spełnia swoją funkcję poprzez komplementarne parowanie zasad z mRNA. Dlatego ważne jest opracowanie procedur, które pozwolą scharakteryzować bezpośredni interaktom RNA lncRNA. W związku z tym opracowano procedurę, która łączy zastosowanie psoralenu jako odczynnika sieciującego z techniką ściągania RNA.

W opisanym protokole pull-down RNA projekt i wybór sond oligonukleotydowych biotynylowanych antysensownych DNA opiera się na bioinformatycznym modelowaniu struktury drugorzędowej ln...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorowodorek 4&-aminometylotrioksalenu	Sigma	A4330	Odczynnik sieciujący
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Sondy biotynilowane	IDT		Sondy oligonukleotydowe
CFX96 System czasu rzeczywistego	BioRad	4351107	aparat qPCR
Olignukleotydy DNA	IDT		Startery do qPCR
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Magnetyczne kulki streptawidyny
Formamid	Thermo-Fisher	15515-026	Formamid
iTaq Uniwersalny SYBR Green Supermix	Odczynnik		1725124 qPCR
Proteinaza K	Sigma	P2308	Proteinaza K
RNA do DNA	Thermo-Fisher	4387405	Zestaw do odwrotnej transkrypcji
Zestaw do oczyszczania RNA XS Zestaw do oczyszczania RNA	Macherey-Nagel	740902	Zestaw do oczyszczania
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	Inhibitor RNAzy
Tube Rotator	Stuart	SB2	Eppendorf Rotator
UV Stratalinker 1800	Stratagene	#400072	UV Crosslinker