Modelowanie wpływu stresu hemodynamicznego na krążące komórki nowotworowe za pomocą strzykawki i igły

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy metodę przykładania naprężeń ścinających płyn do komórek rakowych w zawiesinie, aby modelować wpływ stresu hemodynamicznego na krążące komórki nowotworowe.

Streszczenie

Podczas przerzutów, komórki rakowe z tkanek litych, w tym nabłonka, uzyskują dostęp do krążenia limfatycznego i krwiopochodnego, gdzie są narażone na obciążenia mechaniczne spowodowane przepływem hemodynamicznym. Jednym z tych naprężeń, których doświadczają krążące komórki nowotworowe (CTC), jest naprężenie ścinające płynu (FSS). Podczas gdy komórki rakowe mogą doświadczać niskiego poziomu FSS w guzie z powodu przepływu śródmiąższowego, CTC są narażone, bez przyłączenia macierzy zewnątrzkomórkowej, na znacznie wyższe poziomy FSS. Fizjologicznie FSS waha się ponad 3-4 rzędy wielkości, przy czym niskie poziomy występują w układzie limfatycznym (<1 dyn/^cm2), a najwyższe poziomy występują krótko, gdy komórki przechodzą przez serce i wokół zastawek serca (>500 dyn/^cm2). Istnieje kilka modeli in vitro zaprojektowanych do modelowania różnych zakresów fizjologicznych naprężeń ścinających w różnych ramach czasowych. W artykule opisano model do badania konsekwencji krótkich (milisekundowych) impulsów FSS wysokiego poziomu na biologię komórek nowotworowych przy użyciu prostego systemu strzykawki i igły.

Wprowadzenie

Przerzuty, czyli rozprzestrzenianie się raka poza początkowe miejsce guza, jest głównym czynnikiem powodującym śmiertelność z powodu raka¹. Podczas przerzutów komórki rakowe wykorzystują układ krążenia jako autostradę do rozprzestrzeniania się do odległych miejsc w całym ciele^2,3. W drodze do tych miejsc krążące komórki nowotworowe (CTC) istnieją w dynamicznym mikrośrodowisku płynu, w przeciwieństwie do ich pierwotnego guza pierwotnego^3,4,5. Zaproponowano, że to płynne mikrośrodowisko jest jedną z wielu barier dla przerzutów⁴. Istnieje powszechna zgoda co do koncepcji nieefektywności przerzutowej, tj. że większość CTC wchodzących do krążenia albo ginie, albo nie tworzy produktywnych kolonii przerzutowych^6,7,8. Jednak to, dlaczego przerzuty są nieefektywne z perspektywy pojedynczego CTC, jest mniej pewne i pozostaje aktywnym obszarem badań. CTC są odłączane od macierzy zewnątrzkomórkowej, pozbawione rozpuszczalnych czynników wzrostu i przeżycia, które mogą być obecne w guzie pierwotnym, oraz wystawione na działanie układu odpornościowego i sił hemodynamicznych w zupełnie inny sposób niż w guzie pierwotnym⁴. Każdy z tych czynników może przyczyniać się do słabej przeżywalności CTC, ale ich względny udział jest niejasny. W artykule podjęto próbę odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób siły hemodynamiczne wpływają na CTC.

Badanie wpływu sił hemodynamicznych na CTC jest dość trudne. Obecnie nie ma systemów inżynierii in vitro, które mogłyby odtworzyć całą dynamikę czasoprzestrzenną (od serca do naczyń włosowatych) i właściwości reologiczne ludzkiego układu naczyniowego. Co więcej, sposób, w jaki CTC doświadczają układu krążenia, nie jest do końca jasny. Dowody eksperymentalne wskazują, że większość komórek rakowych nie krąży w sposób ciągły, tak jak komórki krwi. Raczej, ze względu na ich stosunkowo duży rozmiar (10-20 μm średnicy), większość CTC zostaje uwięziona w złożach kapilarnych (6-8 μm średnicy) na różne długości czasu (od s do dni), gdzie mogą umrzeć, wynaczynić lub zostać przemieszczone do następnego złoża kapilarnego^8,9,10,11. Istnieją jednak pewne dowody na to, że rozmiar CTC może być bardziej niejednorodny in vivo i że mniejsze CTC są wykrywalne¹². Dlatego, w oparciu o odległość i prędkość przepływu krwi, CTC mogą swobodnie krążyć tylko przez kilka sekund między tymi okresami uwięzienia, chociaż brakuje ilościowego opisu tego zachowania¹³.

Ponadto, w zależności od tego, gdzie CTC dostają się do krążenia, mogą przejść przez wiele naczyń włosowatych w płucach i innych miejscach peryferyjnych oraz zarówno przez prawe, jak i lewe serce, zanim dotrą do miejsca docelowego. Po drodze CTC są narażone na różne naprężenia hemodynamiczne, w tym naprężenia ścinające płynu (FSS), siły ściskające podczas ich uwięzienia w mikrokrążeniu i potencjalnie siły trakcyjne w warunkach, w których mogą wykazywać leukocyty podobne do toczenia się po ścianach naczyń krwionośnych¹⁴. W związku z tym zarówno możliwość modelowania krążenia, jak i zrozumienie zachowania CTC, które ma być modelowane, jest ograniczone. Ze względu na tę niepewność, wszelkie wyniki z systemów modelowych in vitro powinny zostać zweryfikowane w eksperymentalnym organizmie kręgowców, a ostatecznie u pacjentów z rakiem.

Z wyżej wymienionymi zastrzeżeniami, ten artykuł demonstruje stosunkowo prosty model zastosowania FSS do komórek w zawiesinie, aby zbadać wpływ FSS na CTC, po raz pierwszy opisany w 2012 roku¹⁵. FSS wynika z tarcia przepływu krwi o ścianę naczynia, co powoduje powstanie parabolicznego gradientu prędkości w warunkach przepływu laminarnego w większych naczyniach. Komórki doświadczają wyższych poziomów FSS w pobliżu ścian naczyń i niższych poziomów w pobliżu środka naczynia krwionośnego. Lepkość płynu, natężenie przepływu i wymiary przewodu, przez który następuje przepływ, wpływają na FSS, zgodnie z równaniem Hagena-Poiseuille'a. Dotyczy to przepływów krwi zachowujących się jak płyny newtonowskie, ale nie dotyczy mikrokrążenia. Fizjologiczny FSS waha się nad kilkoma rzędami wielkości, przy czym najniższe poziomy występują w układzie limfatycznym (<1 dyn/^cm2), a najwyższe w regionach wokół zastawek serca i blaszek miażdżycowych (>500 dyn/cm²)⁵. Średnie naprężenie ścinające ściany w tętnicach wynosi 10-70 dyn/cm² i 1-6 dyn/cm² w żyłach^16,17.

W sercu komórki mogą być narażone na turbulentne przepływy wokół płatków zastawek, gdzie mogą wystąpić bardzo wysokie, ale bardzo krótkotrwałe FSS^18,19. Chociaż dziedzina bioprzetwarzania od dawna bada wpływ FSS na komórki ssaków w zawiesinie, informacje te mogą mieć ograniczoną wartość dla zrozumienia wpływu FSS na CTC, ponieważ generalnie koncentrują się na znacznie niższych poziomach FSS stosowanych przez długi czas²⁰. Jak opisano poniżej, za pomocą strzykawki i igły można nakładać stosunkowo wysoki (dziesiątki do tysięcy dyn/^cm2) FSS przez stosunkowo krótki czas (milisekundy) do zawiesiny komórek. Od czasu początkowego opisu tego modelu¹⁵, inni wykorzystali go do badania wpływu FSS na komórki rakowe^21,22,23. Wiele "impulsów" FSS można zastosować do zawiesin komórek w krótkim czasie, aby ułatwić dalsze analizy eksperymentalne. Na przykład model ten można wykorzystać do pomiaru zdolności komórek do opierania się mechanicznemu zniszczeniu przez FSS poprzez pomiar żywotności ogniw w funkcji liczby zastosowanych impulsów. Alternatywnie, wpływ ekspozycji na FSS na biologię komórek nowotworowych można zbadać, zbierając komórki do różnych dalszych analiz. Co ważne, część zawiesiny komórek jest zarezerwowana jako kontrola statyczna w celu porównania skutków FSS z tymi, które mogą być związane z oderwaniem komórek i czasem przebywania w zawieszeniu.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Uwolnij komórki z naczynia do hodowli tkankowej, gdy zlewają się w 70-90%, postępując zgodnie z zalecanymi wytycznymi dla używanej linii komórkowej.
   1. Na przykład odessać pożywkę wzrostową dla komórek PC-3 i umyć 10-centymetrowe naczynie komórek 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami bez wapnia i magnezu (PBS).
   2. Odessać PBS przed dodaniem 1 ml 0,25% trypsyny zgodnie z protokołem producenta.
   3. Po zaobserwowaniu oderwania komórek pod odwróconym mikroskopem, dodaj 5 ml pożywki DMEM:F12 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu zahamowania trypsyny.
2. Umieść zawiesinę komórek w stożkowej probówce.
3. Określ stężenie komórek i całkowitą liczbę komórek.
4. Osad komórek przez odwirowanie (300 × g przez 3 min), odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce do hodowli tkankowej bez surowicy do 5 × 10⁵ komórek/ml.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby pożywka testowa zawierała co najmniej 1,17 mM Ca⁺⁺, ponieważ wykazano, że zewnątrzkomórkowy Ca⁺⁺ jest wymagany do odporności komórkowej na FSS¹⁵.

2. Ekspozycja na naprężenia ścinające płynu

1. Przed wystawieniem komórek na działanie FSS należy wyciąć okrągłodenną rurkę z polistyrenu o pojemności 14 ml na linii 7 ml. Wymieszać zawiesinę komórek, umieścić 5 ml zawiesiny w wyciętej probówce i zebrać statyczne próbki kontrolne.
   UWAGA: Objętość potrzebna do pobrania próbki statycznej zależy od zastosowanego testu żywotności (patrz krok 3).
2. Pobrać zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 5 ml i założyć igłę 30 G 1/2". Odkręcić igłę, umieścić strzykawkę na pompie strzykawkowej, zabezpieczyć strzykawkę i ustawić natężenie przepływu, aby osiągnąć żądany poziom FSS.
   UWAGA: Tabela 1 przedstawia maksymalne naprężenia ścinające ścianki dla różnych igieł i natężeń przepływu, a także minimalny poziom FSS w zależności od wielkości komórki (10, 15 i 20 μm). Przed użyciem należy sprawdzić igłę, aby upewnić się, że nie jest wygięta; W razie wątpliwości wymień igłę na nową. Integralność igły może mieć znaczący wpływ na poziom zastosowanego FSS.
3. Uruchom pompę strzykawkową i zbierz ściętą próbkę do przeciętej rurki pod kątem około 45°, aby zmniejszyć pienienie. Pobrać próbkę w zależności od rodzaju testu żywotności lub potrzeb w zakresie dalszego testu.
   1. Ostrożnie wyjąć strzykawkę i igłę z pompy strzykawkowej i za pomocą szczypiec wyjąć igłę ze strzykawki, uważając, aby nie dotknąć igły.
      UWAGA: Igły bez fazowania mogą być używane zamiennie z igłami ze skośnym środkiem bezpieczeństwa.
4. Wciągnąć ściętą zawiesinę z powrotem do strzykawki, ostrożnie ponownie założyć igłę za pomocą szczypiec i umieścić ją z powrotem w pompie strzykawkowej.
5. Powtarzać kroki 2.3 i 2.4, aż zawiesina komórek zostanie wystawiona na działanie żądanej liczby impulsów FSS.
   UWAGA: Aby ocenić zdolność komórek do opierania się mechanicznemu zniszczeniu w wyniku ekspozycji na FSS, zawiesina komórek jest zwykle poddawana 10 impulsom FSS. Wykazano jednak, że komórki zaczynają ulegać adaptacjom biologicznym w odpowiedzi na FSS po 2 impulsach²⁴.

3. Pomiar żywotności

UWAGA: Żywotność można ocenić za pomocą testów enzymatycznych (lucyferaza, resazuryna i WST-1), licząc nienaruszone komórki, cytometrii przepływowej lub za pomocą testów klonogennych.

1. W przypadku wszystkich pomiarów żywotności należy pobrać próbkę przed wystawieniem komórek na działanie FSS.
   1. Do testów enzymatycznych należy pobrać zduplikowane podwielokrotności 100 μl i umieścić je w 96-dołkowej płytce.
   2. Do cytometrii przepływowej weź jedną porcję o pojemności 500 μl i umieść ją w probówce o pojemności 1,5 ml.
   3. Do testu klonogennego należy pobrać 100 μl podwielokrotności.
2. Test enzymatyczny
   1. Zebrać 100 μl próbek po 1, 2, 4, 6, 8 i 10 impulsach ekspozycji na FSS i umieścić je na 96-dołkowej płytce.
   2. Dodaj żądany substrat i postępuj zgodnie z protokołem dla zastosowanego testu:
      1. W przypadku rezazuryny dodać 20 μl roztworu 0,15 mg/ml do każdej studzienki. Dodać 20 μl 0,15 mg/ml roztworu rezazuryny do studzienek zawierających 100 μl samej pożywki. Inkubować przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C. Zmierzyć absorbancję za pomocą czytnika płytek zdolnego do odczytu fluorescencji (wzbudzenie 579 / emisja 584).
      2. W przypadku komórek wykazujących ekspresję lucyferazy dodać 100 μl 15 mg/ml D-lucyferyny do 5 ml pożywki. Dodać 100 μl tego roztworu do każdej studzienki zawierającej komórki. Odczekaj 5 minut, a następnie odczytaj płytkę za pomocą czytnika kompatybilnego z luminescencją.
      3. W przypadku WST-1 dodać 10 μl WST-1 do każdego dołka, w tym do studzienek zawierających tylko pożywkę. Inkubować przez 4 godziny, a następnie odczytać absorbancję między 420 a 480 nm za pomocą czytnika płytek.
   3. Porównaj uśredniony sygnał z każdej z próbek wystawionych na działanie FSS z uśrednioną statyczną próbką kontrolną, aby uzyskać procent żywotnych komórek.
3. Cytometria przepływowa²⁴
   1. Zbierz 500 μl próbek i umieść je w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml po 1, 2, 5 i 10 impulsach FSS.
   2. Odwirować próbki (500 × g przez 3 minuty) i odrzucić supernatanty.
   3. Zawiesić granulki w 1 ml PBS wolnego od wapnia i magnezu i odwirować próbki (300 × g przez 3 minuty).
   4. Zawiesić granulki za pomocą 500 μl buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (PBS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej i 0,1% azydkiem sodu) z kulkami do liczenia i barwnikami nieprzepuszczalnymi dla błony lub żywotnymi, takimi jak jodek propidyny (1,75 μg/ml).
   5. Określ żywotność, porównując stosunek żywotnych komórek, znormalizowanych do liczenia kulek, w ściętych próbkach do próbki statycznej.
4. Test klonogenny
   1. Pobrać 100 μl próbki statycznej i dodać 900 μl pożywki wzrostowej w celu uzyskania rozcieńczenia w stosunku 1:10.
   2. Pobrać 100 μl próbki rozcieńczonej w stosunku 1:10 i dodać 900 μl pożywki wzrostowej, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie w stosunku 1:100.
   3. Dodać 100 μl próbki o rozcieńczeniu 1:100 do każdego z 3 dołków 6-dołkowego naczynia zawierającego 2 ml pożywki wzrostowej.
   4. Powtórzyć kroki 3.4.1-3.4.3 z próbkami, które poddano 10 impulsom FSS.
   5. Pozwól komórkom rosnąć przez 7-10 dni bez zmiany pożywki i sprawdź, czy nie tworzy się kolonia. Po uformowaniu się kolonii ≥50 komórek odessać pożywkę wzrostową, przepłukać każdą studzienkę 1 ml PBS, odessać PBS i utrwalić na 5 minut przy użyciu 1 ml lodowatego 70% etanolu (EtOH). Co ważne, należy jednocześnie naprawić zarówno ścięte, jak i statyczne próbki
   6. Po utrwaleniu próbek odessać EtOH i dodać 1 do 2 ml roztworu fioletu krystalicznego (0,1% fioletu krystalicznego w 90% H₂O, 10% EtOH) przez 5 minut.
   7. Spłucz nadmiarem wody i pozostaw talerz do wyschnięcia
   8. Policz kolonie (skupiska ≥50 komórek) zarówno dla próbek statycznych, jak i ścinanych. Porównaj stosunek średniej liczby kolonii ze ściętej próbki do średniej liczby kolonii z próbki statycznej, aby określić żywotność.

Wyniki

Wcześniej wykazano, że podwyższona odporność na mechaniczne zniszczenie wywołane przez FSS jest zachowanym fenotypem w wielu liniach komórek rakowych i komórkach rakowych świeżo wyizolowanych z guzów w porównaniu z nieprzekształconymi komparatorami komórek nabłonkowych^15,24. W tym przypadku przetestowano dodatkowe linie komórek nowotworowych o różnym pochodzeniu tkankowym (Tabela 2), aby wykazać, że większość tych komórek wykazuje żywotność ≥ 20%...

Dyskusja

W pracy przedstawiono zastosowanie FSS do komórek nowotworowych w zawiesinie za pomocą strzykawki i igły. Korzystając z tego modelu, wykazano, że komórki rakowe są bardziej odporne na krótkie impulsy FSS wysokiego poziomu w porównaniu z nieprzekształconymi komórkami nabłonkowymi 15,22,24. Co więcej, ekspozycja na FSS przy użyciu tego modelu powoduje szybki wzrost sztywności komórek, aktywację RhoA i zwiększoną kurczliwość korową...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,25% Trypsyna	Gibco	25200-056
14 ml probówki z okrągłym dnem	Falcon - Corning	352059
30 G Igła 1/2" BD		305106
5 mL strzykawka	BD	309646
96-dołkowa płyta dolna	Costar - Detektor	3915
	AMI	AMI HTX
BSA, frakcja V	Sigma	10735086001
miano komórek Niebieski	Promega	G8081
krystaliczny fiolet	Sigma	C0775
D-lucyferyna	GoldBio	D-LUCK
DMEM	Gibco	11965-092
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Gibco	10010023
BioTek		Synergy HT
Azydek sodu (NaN3)	Sigma	S2002
Pompa strzykawkowa	Aparat Harvard	70-3005