Artykuł metodologiczny

Wspólna hodowla mikrogleju i neuronów korowych zróżnicowanych od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/62480

⸱

21 września 2021

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Chemical Biology Program, Broad Institute of MIT & Harvard, 3Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 4Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital, 5Program in Neuroscience, Harvard University, 6Program in Chemical Biology, Harvard University, 7Harvard Stem Cell Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodologię odróżniania mikrogleju od ludzkich iPSC i utrzymywania ich w równokulturze z neuronami korowymi pochodzącymi z iPSC w celu zbadania mechanistycznych podstaw interakcji neuroimmunologicznych przy użyciu ludzkich neuronów i mikrogleju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do generowania mikrogleju z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) dostarcza nowych narzędzi i możliwości do badania roli mikrogleju w zdrowiu i chorobie. Co więcej, mikroglej pochodzący z iPSC może być utrzymywany w kokulturze z neuronami korowymi pochodzącymi z iPSC, co umożliwia badanie interakcji mikrogleju-neuron, które przypuszczalnie są rozregulowane w wielu zaburzeniach neuropsychiatrycznych. Ludzkie komórki iPS zróżnicowano w celu wytworzenia mikrogleju przy użyciu dostosowanej wersji protokołu opracowanego przez grupę Fossati, a mikroglej pochodzący z iPSC poddano walidacji za pomocą analizy markerów i PCR w czasie rzeczywistym. Ludzki mikroglej wygenerowany przy użyciu tego protokołu był dodatni dla markerów CD11C, IBA1, P2RY12 i TMEM119 oraz wykazywał ekspresję genów związanych z mikroglejem AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 i TMEM119. Ludzkie neurony korowe pochodzące z iPSC, które były różnicowane przez 30 dni, zostały posiane mikroglejem i utrzymywane w kokulturze do 60 dnia, kiedy podjęto eksperymenty. Gęstość kolców dendrytycznych w neuronach korowych w kokulturze z mikroglejem określono ilościowo w warunkach wyjściowych i w obecności cytokin prozapalnych. W celu zbadania, w jaki sposób mikroglej moduluje funkcje neuronów, przeprowadzono eksperymenty obrazowania wapnia neuronów korowych przy użyciu wskaźnika wapnia Fluo-4 AM. Żywą aktywność wapniową neuronów korowych uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego, a intensywność fluorescencji określono ilościowo za pomocą ImageJ. Niniejszy raport opisuje, w jaki sposób wspólna hodowla ludzkiego mikrogleju i neuronów korowych pochodzących z iPSC zapewnia nowe podejścia do badania wpływu mikrogleju na neurony korowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ludzkim mózgu, mikroglej jest podstawową wrodzoną komórką odpornościową1. Rozwój mózgu jest regulowany przez mikroglej na dwa sposoby: uwalnianie czynników dyfuzyjnych i fagocytoza1. Dyfuzyjne czynniki pochodzące z mikrogleju wspomagają mielinizację, neurogenezę, tworzenie synaptyczne, dojrzewanie, śmierć komórki i przeżycie komórek1. Mikroglej fagocytuje również różne elementy w synapsach mózgu, aksonach oraz w żywych i martwych komórkach2,3,4,5,6,7,8. Receptory na mikrogleju rozpoznają znaczniki takie jak kalretykulina, ATP i kwas sjalowy i regulują fagocytozę komórkową9,10. W hipokampie mikroglej utrzymuje homeostazę neurogenezy poprzez swoją rolę fagocytarną11.

Wykazano, że fagocytoza synaptyczna w grzbietowo-bocznym jądrze kolankowatym (dLGN) mózgu gryzonia jest regulowana przez mikroglej1. U gryzoni wykazano, że w trakcie rozwoju występują dwa okresy, w których obserwuje się intensywną fagocytozę synaptyczną mikrogleju. Pierwszy okres występuje podczas początkowego tworzenia synaps, a drugi okres, gdy połączenia są dostrajane i przycinane12. Inne czynniki, które biorą udział w przycinaniu synaptycznym to białka zapalne i główny kompleks zgodności tkankowej klasy I (MHC1, H2-Kb i Db)13,14. Zasugerowano, że C1q (składnik dopełniacza 1q) w mikrogleju kolokalizuje się z MHC1, co wyzwala przycinanie synaptyczne15. Co więcej, badania na myszach pokazują, że interleukina-33 (IL-33) wydzielana przez astrocyty reguluje homeostazę synaps we wzgórzu i rdzeniu kręgowym poprzez swój wpływ na mikroglej, chociaż nie zostało to jeszcze zbadane u ludzi13. Mikroglej wydziela różne cytokiny, które pomagają w utrzymaniu zdrowia neuronów, takie jak czynnik martwicy nowotworu α (TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 i interferon-γ (IFN-γ), a cytokiny te mogą modulować tworzenie kolców dendrytycznych i synaps16,17,18. Istnieją znaczne luki w naszej wiedzy na temat interakcji neuron-mikroglej podczas rozwoju ludzkiego mózgu. Większość naszej wiedzy pochodzi z badań na modelach gryzoni, podczas gdy brakuje informacji na temat czasowych i mechanistycznych aspektów przycinania synaps w ludzkiej korze mózgowej. Mikroglej wspomaga przetrwanie neuronów w korze nowej, a inne typy komórek również się do tego przyczyniają1. Nie jest jasne, w jaki sposób mikroglej przyczynia się do tego zachowania i jakie są wzajemne zależności między mikroglejem a innymi typami komórek. Mikroglej uwalnia kilka cytokin, które wpływają na rozwój neuronów i synapty, ale mechanistyczne podstawy ich działania tych cytokin w neuronach są w dużej mierze nieznane19,20. Aby lepiej zrozumieć funkcję mikrogleju w ludzkim mózgu, konieczne jest zbadanie jego interakcji z różnymi typami komórek występującymi w ludzkim mózgu. W niniejszym raporcie opisano metodę wspólnej hodowli ludzkich neuronów pochodzących z iPSC i mikrogleju wygenerowanych od tego samego osobnika. Opracowanie tej metodologii umożliwi przeprowadzenie dobrze zdefiniowanych badań w celu zbadania natury interakcji mikrogleju i neuronów oraz opracowanie solidnych modeli komórkowych in vitro w celu zbadania dysfunkcji neuroimmunologicznej w kontekście różnych zaburzeń neurorozwojowych i neuropsychiatrycznych.

Rola mikrogleju w schizofrenii
Przycinanie synaptyczne to główny proces neurorozwojowy, który zachodzi w mózgu nastolatka21,22. Wiele dowodów sugeruje, że przycinanie synaps w tym krytycznym okresie jest nieprawidłowe w schizofrenii (SCZ)23,24,25,26. SCZ jest przewlekłym, wyniszczającym zaburzeniem psychicznym charakteryzującym się halucynacjami, urojeniami, zaburzonymi procesami myślowymi i deficytami poznawczymi23,24. Mikroglej, makrofagi rezydujące w mózgu, odgrywają kluczową rolę w przycinaniu synaptycznym25,26. Badania pośmiertne i pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) wykazują dowody na dysfunkcyjną aktywność mikrogleju w SCZ25,26,27,28,29,30,31,32. Pośmiertne mózgi SCZ wykazują dobrze zreplikowane, ale subtelne różnice w mózgu - neurony piramidowe w warstwie korowej III wykazują zmniejszoną gęstość kolców dendrytycznych i mniej synaps33,34,35. Przycinanie synaptyczne to proces, w którym zbędne pobudzające połączenia synaptyczne są eliminowane przez mikroglej w okresie dojrzewania, kiedy pacjenci z SCZ zwykle mają pierwsze załamanie psychotyczne22,36. Badania pośmiertne wykazują związek między SCZ a aktywacją mikrogleju, ze zwiększoną gęstością mikrogleju w mózgach SCZ, a także zwiększoną ekspresją genów prozapalnych27. Ponadto badania PET ludzkich mózgów wykorzystujących radioligandy do aktywacji mikrogleju wykazują podwyższony poziom aktywowanego mikrogleju w korze mózgowej25,26,27,28. Ostatnie badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) pokazują, że najsilniejsze powiązanie genetyczne dla SCZ znajduje się w locus głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), a związek ten wynika z alleli Geny składnika dopełniacza 4 (C4), które biorą udział w pośredniczeniu w poporodowym przycinaniu synaps u gryzoni37. Związek ten dostarczył dodatkowego wsparcia dla hipotezy, że nieprawidłowe przycinanie przez mikroglej może skutkować zmniejszoną gęstością kolców dendrytycznych obserwowaną w mózgach pośmiertnych SCZ. Badania nad udziałem mikrogleju w przycinaniu synaps w SCZ były do tej pory ograniczone do pośrednich badań z obrazowaniem PET lub wniosków z badań pośmiertnych mózgów.

Generowanie ludzkiego mikrogleju w laboratorium
Hodowlany pierwotny mikroglej myszy był często używany w badaniu mikrogleju, chociaż istnieje kilka przesłanek, że mikroglej gryzoni może nie być reprezentatywny dla ludzkiej anatomii mikrogleju i ekspresji genów (Tabela 1)38. W kilku badaniach zróżnicowano również mikroglej bezpośrednio od monocytów krwi poprzez transróżnicowanie39,40,41,42. Komórki mikrogleju pochodzące z monocytów krwi wykazują znaczne różnice w stosunku do ludzkiego mikrogleju w profilach ekspresji genów i białek w odpowiedziach prozapalnych i wydają się być bardziej podobne do makrofagów w swojej biologii43. Najnowsze postępy metodologiczne umożliwiają obecnie generowanie mikrogleju z ludzkich komórek iPS, co daje możliwość badania żywego mikrogleju, który dokładniej przypomina biologię mikrogleju znajdującego się w ludzkim mózgu (Tabela 2). Wykazano, że te komórki mikrogleju pochodzące z iPSC podsumowują fenotyp, profile ekspresji genów i właściwości funkcjonalne pierwotnego ludzkiego mikrogleju44,45,46,47,48. W artykule przedstawiono metodę wspólnej hodowli ludzkich neuronów pochodzących z iPSC i mikrogleju generowanych od tego samego osobnika w celu opracowania spersonalizowanych modeli in vitro interakcji neuron-mikroglej. Do tego modelu kohodowli in vitro dostosowano protokół różnicowania mikrogleju z grupy Fossati (Tabela 3) i połączono go z dostosowaną wersją protokołu generowania neuronów korowych z grupy Liveseya (Tabela 4)49,50.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie iPSC użyte w tym badaniu zostały przeprogramowane z fibroblastów, które uzyskano za zgodą zdrowych osób z grupy kontrolnej, za zgodą instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB). Przeprogramowanie i charakterystyka iPSC użytych w tym badaniu (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) zostały opisane we wcześniejszym badaniu51.

1. Konserwacja iPSC

  1. Przygotować rozcieńczenie 1:50 matrycy błony podstawnej zredukowanego czynnika wzrostu w DMEM/F12 bez czerwieni fenolowej i wstępnie pokryć 6-dołkową płytkę 1 ml rozcieńczonego roztworu przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C przed rozmrożeniem zapasów komórkowych.
  2. Rozmrażać kriokonserwowane zapasy iPSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Dodać komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml DMEM/F12. Wiruj komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut.
  3. Usunąć roztwór powlekający z wstępnie pokrytej płytki macierzystej błony podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu wolnej od LDEV i dodać 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi (SCM) z inhibitorem skał 10 μM (Y-27632).
  4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w SCM za pomocą 10 μM Y-27632 i dodać do wstępnie pokrytej płytki, aby uzyskać ostateczną objętość 2 ml SCM plus Y-27632. Hodowle komórek iPSC należy utrzymywać w tym podłożu przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  5. Zastąp pożywkę 2 ml świeżego SCM bez Y-27632 24 godziny po rozmrożeniu.
  6. Po osiągnięciu przez iPSC 80-90% konfluencji, należy je przenieść na kolby o pojemności 75 ml pokryte matrycą błony podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu wolnej od LDEV.
    1. Komórki pasażować, najpierw przepłukując je HBSS i usuwając po odstawieniu na 30 sekund. Dodać 1 ml nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek i inkubować przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Przygotować płytkę z SCM zawierającą 10 μM Y-27632.
    2. Odessać nieenzymatyczny odczynnik do dysocjacji komórek i dodać 1 ml SCM + 10 μM Y-27632 do każdego dołka. Delikatnie zeskrobać studzienkę za pomocą podnośnika do komórek i uzyskać komórki za pomocą pipety o pojemności 1000 μl.
    3. Umieścić komórki w kolbie o średnicy 75 mm z membraną podstawną o obniżonym współczynniku wzrostu, wolnej od LDEV, w łącznej objętości 8 ml SCM + Y-27632.

2. Różnicowanie mikrogleju

UWAGA: Schemat przedstawiający protokół różnicowania mikrogleju jest przedstawiony w Rysunek 1A. Przed użyciem pożywkę podgrzano do temperatury pokojowej.

  1. Dzień 0: Wykonaj całkowitą zmianę pożywki za pomocą pożywki SCM uzupełnionej 80 ng / ml BMP-4. Wykonuj codzienne zmiany pożywki tym samym podłożem w dniach 1-3, bez mycia między zmianami pożywki.
  2. Dzień 4: Przygotuj pożywkę z dnia 4-5: Pożywka krwiotwórcza (HM), uzupełniona 25 ng/ml FGF, 100 ng/ml SCF i 80 ng/ml VEGF. Usuń pożywkę i zastąp ją pożywką dnia 4-5 zawierającą 5 μM Y-27632.
    UWAGA: W tym momencie komórki zaczynają unosić się w powietrzu - około połowa komórek unosi się, a połowa przylega
    3. .
  3. Dzień 6: Przygotuj pożywkę dnia 6-13: HM uzupełniony 50 ng/ml SCF, 50 ng/ml IL-3, 5 ng/ml TPO, 50 ng/ml m-CSF i 50 ng/ml Flt3-L. Zebrać supernatant, dodać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 8 minut przy 300 x g. Zawiesić osad w kolbie z 8 ml pożywki dnia 6-13 uzupełnionej 5 μM Y-27632.
  4. Dzień 10: Dodaj 8 ml pożywki dnia 6-13 na wierzch istniejącej pożywki.
  5. Dzień 14: Przygotuj pożywkę dnia 14+: HM uzupełniony o 50 ng/ml m-CSF, 50 ng/ml Flt3-L, 50 ng/mL GM-CSF. Zebrać supernatant, dodać do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 8 minut w stężeniu 300 x g. Zawiesić osad w 8 ml pożywki dnia 14+ zawierającej 5 μM Y-27632 i kontynuować hodowlę w tym podłożu.
  6. Dzień 18: Dodaj 8 ml pożywki Day14+.
  7. Dzień 22: Dodaj 8 ml świeżej pożywki Day14+ bez usuwania istniejącej pożywki.
  8. Dzień 25: Przenieś komórki do kroku 2.9 lub kontynuuj utrzymywanie w pożywce dnia 14+ do 50 dnia różnicowania.
  9. Po 25 dniu zebrać supernatant do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 8 minut w temperaturze 300 x g.
    1. Przygotuj pożywkę adhezyjną: RPMI uzupełnioną 1% z 200 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy w 0,85% roztworze NaCl, 25 ng/mL GM-SCF i 100 ng/ml IL-34.
    2. Zawiesić osad w pożywce przylegającej zawierającej 5 μM Y-27632.
    3. Komórki płytkowe o gęstości 50 000 komórek nacm2 na płytkach 24-dołkowych do różnych eksperymentów: płytki pokryte matrycą błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu wolne od LDEV do monokultury mikrogleju, płytki obrazowe ze szkła poli-L-ornitycznego o grubości 10 μg/ml i 10 μg/ml ze szkła pokrytego lamininą do eksperymentów obrazowych.
    4. Rozcieńczyć poli-L-ornitynę i lamininę w DPBS i dodać 250 μl/basenik na 24-dołkową płytkę obrazową.
      UWAGA: Komórki w kulturze są teraz przylegające w naturze (Rysunek 1C).
  10. Utrzymuj komórki w hodowli przez co najmniej 14 dni, ze zmianami pożywki co dwa tygodnie. Po 14 dniu po adherencji komórki osiągnęły dojrzałość i mogą być wykorzystane do eksperymentów.

3. Różnicowanie neuronów korowych

UWAGA: Schemat przedstawiający protokół różnicowania neuronów korowych jest przedstawiony w Rysunek 1G.

  1. Dzień 0:
    1. Gdy iPSC zlewają się na płytki pokryte membraną podstawną o obniżonym współczynniku wzrostu, wolne od LDEV, należy przejść z SCM na mieszankę 50/50 pożywki N2/B27 uzupełnioną 10 μM SB431542, 1 μM dorsomorfiną, 100 nM LDN193189,
      UWAGA: Pożywka N2 składa się z podłoża podstawowego uzupełnionego 1% suplementem N-2, 1% 200 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy w 0,85% roztworze NaCl, 1% pióra/paciorkowca. Pożywka B27 składa się z DMEM/F12 uzupełnionego 2% suplementem B-27, 1% 200 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy w 0,85% roztworze NaCl, 1% wstrzykiwacza/paciorkowca.
    2. Zmieniaj podłoże z powyższymi suplementami dodawanymi codziennie przez 7 dni.
  2. Dzień 7:
    1. Płytki należy wstępnie powlekać matrycą membrany podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu wolnym od LDEV przez co najmniej 2 godziny.
    2. Przejście komórek 1:1 na wstępnie powlekane płyty. Wypłucz komórki 1 ml / studzienkę HBSS i wyjmij po pozostawieniu na 30 sekund. Dodać 1 ml/studzienkę pożywki oddzielającej komórki (np. Accutazy) i inkubować przez 4-5 minut w temperaturze 37 °C. Podczas inkubacji przygotuj stożkowe probówki o pojemności 15 ml z 5 ml DMEM.
    3. Delikatnie odpipetować enzymatyczny środek dysocjacyjny, aby usunąć komórki z płytki za pomocą pipetora P1000. Zebrać enzymatyczny środek dysocjacyjny i mieszaninę komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml DMEM.
    4. Wirować probówki przez 5 minut przy 300 x g. Zawiesić osad w 1 ml pożywki N2/B27 zawierającej 10 μM Y-27632. Kontynuuj codzienne karmienie pożywką N2/B27 bez żadnych suplementów.
  3. Dzień 12: Przejście komórek 1:1 przy użyciu metod opisanych w 3.2.2. Kontynuuj codzienne karmienie pożywką N2/B27.
  4. Dzień 15/16: Pasaż komórek 1:2 przy użyciu metod opisanych w ppkt 3.2.2. Kontynuuj codzienne karmienie pożywką N2/B27.
  5. Dzień 18/19: Przejście komórek 1:3 przy użyciu metod opisanych w ppkt 3.2.2. Kontynuuj codzienne karmienie pożywką N2/B27 do 25 dnia.
  6. Dzień 25: Komórki karmione pożywką N2/B27 uzupełnione 10 μM DAPT.
  7. Dzień 28: Nakarmić komórki świeżą, nieprzetworzoną pożywką N2/B27.
  8. Dzień 30: Przejście komórek metodami opisanymi w ppkt 3.2 na płytki hodowlane mikrogleju i utrzymanie w pożywce BrainPhys uzupełnionej 1% suplementem witaminy B-27.

4. Współkultury mikrogleju i neuronów

  1. Dzień płytki: 30 neuronów korowych na wierzchu kultur mikrogleju o gęstości 50 000 komórek na cm2. Uzupełnij pożywkę lamininą 1 μg/ml, aby poprawić przyleganie komórek.
  2. Utrzymuj kultury w mieszance 50% pożywki adherentnej i 50% pożywki Brainohys uzupełnionej 1% suplementem B-27. Wykonuj połowę średniej zmiany co dwa tygodnie, aż do eksperymentów.
  3. Wykonuj eksperymenty po osiągnięciu przez neurony 60 dnia.

5. Leczenie interferonem γ

  1. Przygotować świeżą pożywkę uzupełnioną 100 ng/ml IFN-γ. Dodaj pożywkę i pozwól mu inkubować przez 24 godziny. Usuń pożywkę i przystąp do eksperymentowania.

6. Immunocytochemia

  1. Utrwalić komórki w naczyniu hodowlanym za pomocą 100 μl 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  2. Wypłucz komórki w 1 ml PBS trzykrotnie przez 5 minut każda.
  3. Dodaj 1 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X) przez 10 min.
  4. Dodaj bufor blokujący: 1 ml PBS plus 5% koziej surowicy przez 1 godzinę.
  5. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w 100 μl PBS + 1% surowicy koziej - przez noc w temperaturze 4 °C. Odpowiednio zoptymalizować wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe.
  6. Wypłucz komórki w 1 ml PBS trzykrotnie przez 5 minut każda.
  7. Dodać przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczone w 100 μl PBS plus 1% surowicy koziej - przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

7. Analiza kręgosłupa

  1. Uzyskaj obrazy pod mikroskopem konfokalnym w powiększeniu 60x.
  2. Użyj funkcji ImageJ NeuronJ52 do analizy obrazów.
  3. Uzyskaj pomiary długości neurytów, długości kręgosłupa i liczby kręgosłupów za pomocą NeuronJ.

8. Obrazowanie wapnia

  1. Przygotować świeżą pożywkę z 3 μM barwnikiem Fluo-4AM. Inkubować kokultury w tym podłożu przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie przepłucz komórki PBS, dodaj do komórek roztwór do obrazowania żywych komórek i przystąp do obrazowania.
  2. Używając mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obrazowanie żywych komórek, uzyskaj obrazy poklatkowe z 40x przez 2 min. Aktywność można rejestrować na początku badania, z ekspozycją na 15 mM glutaminianu lub w warunkach depolaryzacji z 5 mM chlorku potasu.
  3. Za pomocą ImageJ zmierz intensywność fluorescencji w czasie dla poszczególnych ciał komórek. Za pomocą narzędzia do zaznaczania zaznacz pojedynczy obszar zainteresowania (ROI) otaczający każdą bryłę komórki. Otwórz Menedżera ROI i naciśnij Dodaj, aby wybrać. Kontynuuj dodawanie nowych wyborów do menedżera ROI.
  4. Użyj narzędzia Ustaw miary, aby zmierzyć średni szary obszar. Po dodaniu liczby żądanych obiektów komórek do menedżera ROI zaznacz je wszystkie, a następnie użyj narzędzia Multi-Measure. Zapewni to odczyt średniego szarego obszaru dla każdego w czasie pliku wideo. Eksportowane dane dadzą średnią intensywność fluorescencji dla obszaru zainteresowania dla każdej klatki.
  5. Określ współczynnik intensywności fluorescencji, F/F0, gdzie F jest intensywnością fluorescencji w danym czasie, a F0 jest początkową intensywnością fluorescencji. F/F0 można przedstawić na wykresie w czasie w celu zbadania spontanicznej aktywności neuronów lub zbadać przy maksymalnej intensywności fluorescencji w warunkach stymulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Walidacja protokołu
Mikroglej pochodzący z iPSC wygenerowano z siedmiu linii iPSC w trzech różnych rundach różnicowania. Wykorzystano linie kontrolne iPSC ML27, ML56, ML292 i ML364 oraz linie iPSC schizofrenii ML40, ML141 i ML250. Charakterystyka tych linii iPSC została opisana wcześniej51. Te mikroglej pochodzące z iPSC poddano walidacji za pomocą ICC i qPCR. Mikroglej wygenerowany na podstawie dostosowanego protokołu wykazywał typową rozgałęzioną morfologię mikrogleju (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój metod różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych wzdłuż różnych trajektorii otworzył wiele możliwości badania funkcji mózgu i procesów chorobowych 53,54,55. Początkowe badania koncentrowały się na rozwoju określonych typów komórek nerwowych, które przypuszczalnie są ważne w określonych zaburzeniach mózgu 56,57. Ostatnio organoidy mózgowe dostarczyły rów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (dla R.K.), National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (dla R.K.), Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (dla R.K.), Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (dla R.K.), Jeanne Marie Lee-Osterhaus Family Foundation oraz NARSAD Young Investigator Award od Brain & Behavior Research Foundation (dla A.K.), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (dla R.K.), Harvard Stem Cell Institute (dla R.K.) oraz przez Steve'a Willisa i Elissę Freud (dla R.K.). Chcielibyśmy podziękować dr Bruce'owi M. Cohenowi i dr Donnie McPhie z Harvard Medical School i McLean Hospital za dostarczenie nam fibroblastów użytych w badaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 suplementGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
Przeciwciało CD11CBiolegend337207Rozcieńczenie 1:200
Płytki do hodowli komórkowych Costar z płaskim dnemCorning07-200-83
Przeciwciało Ctip2Abcamab18465
Przeciwciało monoklonalne CUTL1AbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, bez czerwieni fenolowejGibco21041025
dorsomorphinSigma-AldrichP5499
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask Kolby do hodowli komórkowychNunc156499
Podnośniki komórkowe FisherbrandFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigandPeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 MLThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
Koza Anty Kurczak - IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Rozcieńczenie 1:1000
Koza Anty Mysz - IgG H& L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004Rozcieńczenie 1:1000
Kozioł Anti Rat- IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670Rozcieńczenie 1:1000
Koza Anty-Świnka morska IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678Rozcieńczenie 1:1000
Surowica koziaSigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
IBA1przeciwciało Abcamab5076Rozcieńczenie 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart SYBR Zielone PodkładySigma-AldrichKSPQ12012
LamininSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
Roztwór do obrazowania żywych komórekInvitrogenA14291DJ
Przeciwciało MAP2Systemy synaptyczne188 004
M-CSFPeprotech300-25
Suplement N-2Gibco17502001
Neurobaseal mediumLife Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MediumBiological Industries01-0005
Przeciwciało P2RY12Biolegend848002
Paraformaldehyd 16%Fisher Scientific50-980-488
Penicylina-streptomycynaGibco15140122
Poli-L-OrthinineSigma-AldrichP3655
Przeciwciało SATB2Abcamab51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24-dołkowa płytka ze szklanym dnemGreiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
TMEM119 przeciwciałoAbcamab185333Rozcieńczenie 1:1000
TPO Peprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Dichlorowodorek Y-27632 (inhibitor ROCK)Tocris1254

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and beyond: Innate immune cells as regulators of brain development and behavioral function. Frontiers in Immunology. 9, 698(2018).
  2. Hoshiko, M., Arnoux, I., Avignone, E., Yamamoto, N., Audinat, E. Deficiency of the microglial receptor CX3CR1 impairs postnatal functional development of thalamocortical synapses in the barrel cortex. Journal of Neuroscience. 32 (43), 15106-15111 (2012).
  3. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  4. Hagemeyer, N., et al. Microglia contribute to normal myelinogenesis and to oligodendrocyte progenitor maintenance during adulthood. Acta Neuropathologica. 134 (3), 441-458 (2017).
  5. Lenz, K. M., Nugent, B. M., Haliyur, R., McCarthy, M. M. Microglia are essential to masculinization of brain and behavior. Journal of Neuroscience. 33 (7), 2761-2772 (2013).
  6. Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7 (1), 1-12 (2016).
  7. Pont-Lezica, L., et al. Microglia shape corpus callosum axon tract fasciculation: Functional impact of prenatal inflammation. European Journal of Neuroscience. 39 (10), 1551-1557 (2014).
  8. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  9. Hornik, T. C., Vilalta, A., Brown, G. C. Activated microglia cause reversible apoptosis of pheochromocytoma cells, inducing their cell death by phagocytosis. Journal of Cell Science. 129 (1), 65-79 (2016).
  10. Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
  11. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7 (4), 483-495 (2010).
  12. Schafer, D. P., et al. Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression. Elife. 5, 15224(2016).
  13. Vainchtein, I. D., et al. Astrocyte-derived interleukin-33 promotes microglial synapse engulfment and neural circuit development. Science. 359 (6381), 1269-1273 (2018).
  14. Datwani, A., et al. Classical MHCI molecules regulate retinogeniculate refinement and limit ocular dominance plasticity. Neuron. 64 (4), 463-470 (2009).
  15. Färber, K., et al. C1q, the recognition subcomponent of the classical pathway of complement, drives microglial activation. Journal of Neuroscience Research. 87 (3), 644-652 (2009).
  16. Wlodarczyk, A., et al. A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain. The EMBO Journal. 36 (22), 3292-3308 (2017).
  17. Lim, S. -H., et al. Neuronal synapse formation induced by microglia and interleukin 10. PloS One. 8 (11), 81218(2013).
  18. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  19. Shin, W. H., et al. Microglia expressing interleukin-13 undergo cell death and contribute to neuronal survival in vivo. Glia. 46 (2), 142-152 (2004).
  20. Giulian, D., Li, J., Leara, B., Keenen, C. Phagocytic microglia release cytokines and cytotoxins that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture. Neurochemistry International. 25 (3), 227-233 (1994).
  21. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  22. Giedd, J. N., et al. Brain development during childhood and adolescence: A longitudinal MRI study. Nature Neuroscience. 2 (10), 861-863 (1999).
  23. Lewis, D. A., Lieberman, J. A. Catching up on schizophrenia: Natural history and neurobiology. Neuron. 28 (2), 325-334 (2000).
  24. Jablensky, A. Epidemiology of schizophrenia: The global burden of disease and disability. European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience. 250 (6), 274-285 (2000).
  25. Van Berckel, B. N., et al. Microglia activation in recent-onset schizophrenia: A quantitative (R)-[11C] PK11195 positron emission tomography study. Biological Psychiatry. 64 (9), 820-822 (2008).
  26. Doorduin, J., et al. Neuroinflammation in schizophrenia-related psychosis: a PET study. Journal of Nuclear Medicine. 50 (11), 1801-1807 (2009).
  27. Van Kesteren, C., et al. Immune involvement in the pathogenesis of schizophrenia: a meta-analysis on postmortem brain studies. Translational Psychiatry. 7 (3), 1075(2017).
  28. Bloomfield, P. S., et al. Microglial activity in people at ultra high risk of psychosis and in schizophrenia: An [11C] PBR28 PET brain imaging study. American Journal of Psychiatry. 173 (1), 44-52 (2016).
  29. Fillman, S., et al. Increased inflammatory markers identified in the dorsolateral prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Molecular Psychiatry. 18 (2), 206-214 (2013).
  30. Radewicz, K., Garey, L. J., Gentleman, S. M., Reynolds, R. Increase in HLA-DR immunoreactive microglia in frontal and temporal cortex of chronic schizophrenics. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 59 (2), 137-150 (2000).
  31. Steiner, J., et al. Distribution of HLA-DR-positive microglia in schizophrenia reflects impaired cerebral lateralization. Acta Neuropathologica. 112 (3), 305-316 (2006).
  32. De Picker, L. J., Morrens, M., Chance, S. A., Boche, D. Microglia and brain plasticity in acute psychosis and schizophrenia illness course: a meta-review. Frontiers in Psychiatry. 8, 238(2017).
  33. Garey, L., et al. Reduced dendritic spine density on cerebral cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 65 (4), 446-453 (1998).
  34. Glantz, L. A., Lewis, D. A. Decreased dendritic spine density on prefrontal cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 57 (1), 65-73 (2000).
  35. Konopaske, G. T., Lange, N., Coyle, J. T., Benes, F. M. Prefrontal cortical dendritic spine pathology in schizophrenia and bipolar disorder. JAMA Psychiatry. 71 (12), 1323-1331 (2014).
  36. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  37. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  38. Landry, R. P., Jacobs, V. L., Romero-Sandoval, E. A., DeLeo, J. A. Propentofylline, a CNS glial modulator does not decrease pain in post-herpetic neuralgia patients: In vitro evidence for differential responses in human and rodent microglia and macrophages. Experimental Neurology. 234 (2), 340-350 (2012).
  39. Sievers, J., Parwaresch, R., Wottge, H. U. Blood monocytes and spleen macrophages differentiate into microglia-like cells on monolayers of astrocytes: morphology. Glia. 12 (4), 245-258 (1994).
  40. Simard, A. R., Rivest, S. Bone marrow stem cells have the ability to populate the entire central nervous system into fully differentiated parenchymal microglia. The FASEB Journal. 18 (9), 998-1000 (2004).
  41. Asheuer, M., et al. Human CD34+ cells differentiate into microglia and express recombinant therapeutic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (10), 3557-3562 (2004).
  42. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: Dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Scientific Reports. 4 (1), 1-7 (2014).
  43. Melief, J., et al. Characterizing primary human microglia: A comparative study with myeloid subsets and culture models: Characterizing primary human microglia. Glia. 64 (11), 1857-1868 (2016).
  44. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  45. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  46. Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  47. Pocock, J. M., Piers, T. M. Modelling microglial function with induced pluripotent stem cells: an update. Nature Reviews Neuroscience. 19 (8), 445-452 (2018).
  48. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  49. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  50. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  51. Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  52. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry Part A: The journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  53. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  54. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neurosciences. 73, 1(2016).
  55. Karmacharya, R., Kieling, C., Mondelli, V. Integrating stem cell-based experiments in clinical research. European Psychiatry. 63 (1), (2020).
  56. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9 (1), 1-13 (2019).
  57. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18 (5), 471-479 (2017).
  58. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 1-16 (2020).
  59. Kathuria, A., Lopez-Lengowski, K., Watmuff, B., Karmacharya, R. Comparative transcriptomic analysis of cerebral organoids and cortical neuron cultures derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 29 (21), 1370-1381 (2020).
  60. Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem Cells. Journal of Visualized Experiments: Jove. (165), e61629(2020).
  61. Pong, S., Karmacharya, R., Sofman, M., Bishop, J. R., Lizano, P. The Role of Brain Microvascular Endothelial Cell and Blood-Brain Barrier Dysfunction in Schizophrenia. Complex Psychiatry. 6 (1-2), 30-46 (2020).
  62. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  63. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-Culture of Neurons and Microglia. Current Protocols in Toxicology. 74 (1), 11-17 (2017).
  64. Warre-Cornish, K., et al. Interferon-γ signaling in human iPSC-derived neurons recapitulates neurodevelopmental disorder phenotypes. Science Advances. 6 (34), (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kokultura mikrogleju i neuron wludzkie iPSCr nicowanie mikroglejuanaliza marker wPCR w czasie rzeczywistymobrazowanie wapniamikroskopia konfokalnag sto kolc w dendrytycznychcytokiny prozapalne
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły