Demonstrujemy metodę izolowania trudnych do wyhodowania członków nowego typu bakterii, Saccharibacteria, poprzez filtrowanie płytki nazębnej i wspólną hodowlę z bakteriami gospodarza.
Artykuł metodologiczny
Ustanawianie stabilnych kultur binarnych symbiotycznych bakterii sacharycznych z jamy ustnej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele gatunków bakterii nie może być hodowanych w laboratorium przy użyciu standardowych metod, co stanowi istotną przeszkodę w badaniu większości różnorodności mikrobiologicznej na Ziemi. Potrzebne są nowatorskie podejścia do hodowli tych niehodowanych bakterii, aby badacze mogli skutecznie badać ich fizjologię i styl życia za pomocą potężnych narzędzi dostępnych w laboratorium. Promieniowanie typu kandydującego (CPR) jest jedną z największych grup niehodowanych bakterii, stanowiącą ~15% żywej różnorodności na ziemi. Pierwszym izolatem z tej grupy był przedstawiciel gromady Saccharibacteria, szczep TM7x, "Nanosynbacter lyticus". TM7x to niezwykle mała bakteria, która żyje jako symbiont w bezpośrednim kontakcie z gospodarzem bakteryjnym, Schaalia odontolytica, szczepem XH001. Wykorzystując niezwykle mały rozmiar komórek i ich styl życia jako organizmu symbiotycznego, opracowaliśmy protokół szybkiej hodowli sacharybakterii z płytki nazębnej. Protokół ten pokaże, jak przefiltrować zawiesinę płytki nazębnej przez filtr 0,2 μm, a następnie skoncentrować zebrane komórki sacharybakterii i zainfekować kulturę organizmów gospodarza. Powstała kokultura może być pasażowana, jak każda normalna kultura bakteryjna, a infekcja jest potwierdzana za pomocą PCR. Otrzymaną w ten sposób hodowlę binarną można utrzymać w laboratorium i wykorzystać do przyszłych eksperymentów. Chociaż zanieczyszczenie jest możliwe, kultura binarna może zostać oczyszczona przez dalsze filtrowanie i ponowne zakażenie gospodarza lub przez posiew kultury binarnej i badania przesiewowe w kierunku zainfekowanych kolonii. Mamy nadzieję, że protokół ten zostanie rozszerzony na inne typy próbek i środowiska, co doprowadzi do hodowli znacznie większej liczby gatunków w CPR.
Wprowadzenie
Hodowla nowych gatunków bakterii i wprowadzenie ich do laboratorium pozwala na przeprowadzenie potężnych eksperymentów, aby lepiej zrozumieć ich fizjologię i szersze interakcje w społeczności mikrobiologicznej. Chociaż istnieją metody zadawania tych pytań bez kultur (np. "metaomika"), złożone interakcje różnych populacji drobnoustrojów utrudniają wyodrębnienie pojedynczych zmiennych i wyciągnięcie znaczących wniosków. Chociaż hodowla bakterii ma wiele zalet, istnieje wiele potencjalnych barier uniemożliwiających wyizolowanie bakterii i wyhodowanie jej w czystej kulturze. Potencjalne specyficzne wymagania dotyczące wzrostu obejmują pH, ciśnienie tlenu, witaminy, czynniki wzrostu, cząsteczki sygnałowe, a nawet bezpośredni kontakt z komórkami w celu wywołania wzrostu1. Uważa się jednak, że określone auksotrofie są głównym czynnikiem odstraszającym przed hodowlą nowych gatunków bakterii. Standardowe preparaty pożywek nie zawierają wielu składników odżywczych wymaganych przez niehodowane bakterie, takich jak określone źródła witamin lub węgla. Te brakujące cząsteczki mogą mieć kluczowe znaczenie dla fizjologii niehodowanych bakterii i zwykle są dostarczane przez inny organizm w społeczności mikrobiologicznej lub organizm gospodarza. Na przykład węglowodany złożone, takie jak mucyny, mogą być dostarczane przez gospodarzy zwierzęcych. Dodanie ich do podłoża umożliwiło hodowlę kilku bakterii z jelit zwierzęcych, w tym Akkermansia muciniphila i Mucinivorans hirudinis2,3,4. Wiele bakterii chorobotwórczych rozwinęło zdolność do wykorzystywania żelaza związanego z heminą w komórkach zwierzęcych, w tym patogen jamy ustnej Porphyromonas gingivalis5. W laboratorium wzrost Porphyromonas i innych organizmów może być stymulowany przez dodanie hemin6.
Ostatnio, wiele przełomów w hodowli nowych izolatów bakterii nastąpiło dzięki wspólnej hodowli, użyciu organizmu "żywicielskiego" w celu dostarczenia niehodowanym bakteriom określonych czynników niezbędnych do ich wzrostu. Eleganckie badanie przeprowadzone przez Vartoukiana i współpracowników wykazało, że siderofory, cząsteczki wiążące żelazo wytwarzane przez bakterie, stymulują wzrost kilku nowych doustnych izolatów. Wykazano, że pyoverdyny, rodzaj sideroforu wytwarzanego przez gatunki pseudomonady, znacznie ułatwiają wzrost nowego gatunku Prevotella 7. W tym samym badaniu wyhodowano pierwszy doustny izolat dla gromady Chloroflexi, również przy użyciu F. nucleatum jako pomocnika w dostarczaniu nieznanego jeszcze związku7. Niedawno wyizolowano bakterię z rodzaju Ruminococcaceae przy użyciu Bacteroides fragilis jako organizmu pomocniczego8. Później wykazano, że kwas gamma-aminomasłowy (GABA), neuroprzekaźnik hamujący, był niezbędny do wzrostu na pożywkach laboratoryjnych. Wykorzystanie organizmów żywicielskich okazało się kluczową strategią naśladowania określonych mikrośrodowisk, w których rosną niehodowane bakterie, co jest bardziej wydajne niż ciągłe przeformułowywanie pożywek wzrostowych z różnymi dodatkami w różnych stężeniach.
Jedna z największych grup niehodowanych bakterii znajduje się w "Kandydacyjna grupa promieniowania typu " (CPR), monofiletycznej grupie kilku kandydujących typów bakterii9,10. W chwili pisania tego tekstu tylko członkowie gromady Saccharibacteria w ramach CPR zostali pomyślnie wyhodowani w laboratorium. Pierwszy izolat, szczep TM7x "Nanosynbacter lyticus", wyizolowano przy użyciu antybiotyku streptomycyny, który zgodnie z przewidywaniami wzbogacał niehodowlany TM711,12. Kluczowym odkryciem tej pracy było to, że nowy izolat rósł jako pasożyt rosnący w bezpośrednim kontakcie z gospodarzem bakteryjnym, Schaalia odontolytica, a mikroskopia wykazała, że pasożyty te były ultramałymi bakteriami.
Korzystając z tych wskazówek, opracowaliśmy metodę szybkiego tworzenia binarnych kokultur bakterii Saccharibacteria z ich partnerami, filtrując płytkę nazębną i inne próbki jamy ustnej przez filtr 0,2 μm, zbierając komórki w filtracie przez wirowanie i używając ich do infekowania kultur potencjalnych bakterii gospodarza. Ta metoda ma tę zaletę, że pozwala uniknąć kultur wzbogacających, które mogą zostać przytłoczone szybko rosnącymi organizmami. Pozwala również uniknąć stosowania antybiotyków, które mogłyby zatrzymać wzrost docelowych gatunków bakterii Saccharibacteria lub ich gospodarzy. Korzystając z przedstawionej tutaj metody, udało nam się wyhodować 32 izolaty z gromady Saccharibacteria.
Protokół
Podczas opracowywania tego protokołu, poproszono o zgodę IRB i zatwierdzono (#14-10) oraz uzyskano świadomą zgodę od wszystkich badanych.
1. Przygotowanie
- Podczas pracy z ludźmi należy uzyskać niezbędną zgodę IRB i świadomą zgodę.
- Rozpocznij hodowle bakterii gospodarza z wystarczającą ilością czasu, aby wzrosnąć do wczesnej fazy stacjonarnej. Na przykład zaszczepić 2-5 ml tryptycznego bulionu sojowego z dodatkiem 0,1% ekstraktu drożdżowego (TSBY) z Arachnia propionica i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
- Zamontuj uchwyty filtrów z wytrawioną membraną filtracyjną 0,2 μm. Owiń zespół folią i wysterylizuj w autoklawie.
- Sterylizuj probówki wirówkowe i zespoły nakrętek.
2. Uzyskaj próbkę bakterii w jamie ustnej
UWAGA: Podczas gdy wiele próbek z jamy ustnej zawiera bakterie Saccharibacteria (np. ślina, wymazy z migdałków, zeskrobania języka), płytka nazębna rutynowo jest najbardziej skuteczna.
- Weź zeskrobanie płytki nazębnej za pomocą sterylnego papierowego punktu, kiretki Gracey lub, jeśli pobierasz samodzielne próbkowanie, użyj sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety. Przenieść płytkę nazębną do odpowiedniego buforu, takiego jak rozcieńczalnik o maksymalnym odzysku (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% pepton) lub PBS. Jeśli próbka nie zostanie natychmiast przetworzona, należy ją przechowywać na lodzie do czasu, gdy będzie gotowa do kontynuowania.
- Energicznie zawiesić płytkę nazębną w buforze MRD, stosując kombinację wirowania i pipetowania za pomocą małej końcówki pipety.
- Dodać zawieszoną próbkę płytki nazębnej do dodatkowych 9 ml buforu MRD.
3. Przygotuj filtrat z próbki ustnej
- Stosując technikę aseptyczną, rozpakuj sterylny zespół filtra. Odkręć o ćwierć obrotu i ponownie dokręć uchwyt filtra, aby upewnić się, że gwinty są prawidłowo zazębione, a urządzenie jest prawidłowo zamknięte. Za pomocą strzykawki przemyć membranę, przepuszczając 10 ml buforu MRD przez aparat. Nieprawidłowy montaż ujawnia się na tym etapie poprzez wyciek płynu z uchwytu filtra. Jeśli wystąpi wyciek, zaopatrz się w inny sterylny zespół filtra i powtórz etap mycia.
- Nanieść próbkę na umyty filtr. Wyjąć tłok ze strzykawki i przymocować go do aparatu filtrującego. Wlej rozproszoną próbkę dentystyczną, teraz do 10 ml buforu MRD, do strzykawki i załaduj ją do filtra.
- Umieść sterylną probówkę wirówkową pod aparatem filtrującym, aby złapać filtrat, a następnie lekko dociśnij tłok, aby przepchnąć próbkę przez filtr.
- Powtórzyć procedurę z kolejnymi 10 ml buforu MRD w celu przepłukania membrany, zbierając przepływ do tej samej probówki, co przefiltrowana próbka. Aseptyczny korek rurki.
4. Zagęść komórki bakterii Saccharibacteria przez wirowanie
- Zrób znak orientacyjny na probówce i nasadce, a następnie umieść probówkę w wirówce wysokoobrotowej ze znakiem na górnej stronie. Osad powstały w wyniku odwirowania jest zwykle niewidoczny. Oznakowanie pomoże określić, gdzie znajduje się osad komórek sacharybakterii po zakończeniu wirowania i wyjęciu probówki z wirówki.
- Odwirować próbki przy 60 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Ta siła i czas są wystarczające do osadzenia wszystkich komórek sacharybakterii. Jednak komórki sacharybakterii można przynajmniej częściowo granulować przez wirowanie przez zaledwie 20 minut przy 20 000 x g. - Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki. Wylej płyn z tuby, trzymając granulki na górnej stronie tuby.
- Zawiesić zwykle niewidoczne osady w 1-2 ml buforu MRD przez energiczne wirowanie.
5. Infekuj kultury gospodarzy filtratem wzbogaconym w sacharybakterie
- Przygotować probówki hodowlane, dzieląc 2 ml odpowiednich pożywek wzrostowych (np. TSBY, BHI itp.) do probówek.
- Do każdej probówki dodać 200 μl nocnej hodowli organizmów gospodarza. Do każdej probówki dodać 100-200 μl przefiltrowanej próbki.
- Inkubować połączone próbki, odpowiednie dla organizmu gospodarza (np. 37 °C, w atmosferze tlenowej dla A. propionica).
- Pasażuj komórki co dwa do trzech dni, przenosząc 200 μl kultury binarnej do 2 ml świeżej pożywki wzrostowej w nowej probówce. Jeśli okaże się, że pasażowane kultury nie wykazują wzrostu (tj. zmętnienie/gęstość optyczna kultury nie wzrasta po przejściu do świeżej pożywki), bakterie Saccharibacteria mogą przytłaczać lub zabijać cały organizm gospodarza. Aby temu zaradzić, dodaj 200 μl niezakażonej kultury gospodarza podczas pasażowania komórek. Powtórz dla co najmniej 5 fragmentów.
6. Potwierdź infekcję za pomocą PCR
- Po 5 przejściach potwierdź zakażenie PCR. Pięć pasaży zapewni, że jakiekolwiek nierosnące komórki sacharybakterii zostaną wyczerpane ponad granicę wykrywalności przy użyciu 25 cykli PCR.
- Przygotuj mastermix PCR. Sugerowany przepis jest następujący, dla każdej potrzebnej probówki przygotuj 12,5 μl 2x bufor PCR, 0,75 μl 10 μM Forward primer (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM Reverse primer (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 i 9 μL wody. Wymieszaj przez wirowanie.
- Porcjować 24 μl mastermix do 0,2 ml probówki PCR. Dodać 1 μl kultury zakażonej sacharybakteriami do reakcji PCR. Umieść probówkę w termocyklerze i wykonaj następujący protokół: początkowa denaturacja 95 °C przez 5 minut, 25 cykli 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s, końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 minuty, a następnie końcowe zatrzymanie w temperaturze 4 °C.
- Załaduj i uruchom produkty PCR w 1% żelu agarozowym. Pasmo ~600 zasad będzie wskazywać na obecność Saccharibacteria.
7. Sprawdź czystość i usuń organizmy skażające
- Potwierdź czystość dodatnich kultur poprzez posiew kokultury Saccharibacteria na agarze odżywczym wystarczającym do wzrostu organizmu gospodarza. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenie kultury w sterylnym buforze (np. MRD lub PBS) i rozprowadzić 100 μl na płytce agarowej. Wykonaj rozcieńczenia tak, aby na płytce agarowej wyrosło około 20-200 kolonii.
- Inkubować kulturę w odpowiednich warunkach wzrostu i obserwować, czy nie ma organizmów skażających.
UWAGA: Nigdy nie zaobserwowano kolonii Axnic Saccharibacteria, więc obserwuje się tylko organizm gospodarza rosnący na tych płytkach. Więcej niż jeden typ kolonii zwykle wskazuje na zanieczyszczenie. W przypadku wystąpienia zanieczyszczenia kultura powinna zostać ponownie przefiltrowana w celu usunięcia niepożądanych zanieczyszczeń i ponownie zaszczepiona na świeżym żywicielu. - Czasami dochodzi do podwójnej infekcji, w której dwa gatunki Saccharibacteria infekują tego samego gospodarza. Aby oddzielić gatunki saccharibacteria, należy ponownie zawiesić poszczególne kolonie w 20 μl sterylnego PBS i użyć 1 μl zawiesiny w reakcji PCR w celu wykrycia kolonii z infekcjami Saccharibacteria.
- Przenieś zawiesiny, które dały pozytywny wynik, na pożywkę wzrostową, aby rozpocząć hodowlę binarną. Wskaźnik sukcesu będzie zależał od miana każdego gatunku Saccharibacteria w kulturze. Może być konieczne przebadanie ponad 50 kolonii, aby znaleźć zainfekowaną do rozmnażania.
8. Przechowywanie kultur
- Hoduj kulturę binarną o wystarczającej objętości (10-50 ml) przez noc.
- Komórki osadu przez odwirowanie (4 000 x g przez 10 min).
UWAGA: Wirowanie z dużą prędkością nie jest tutaj konieczne, ponieważ komórki sacharybakterii zostaną przyłączone do większych, cięższych komórek gospodarza i będą się z nimi osadzać. - Ponownie zawiesić komórki w krioprotektantze. Pożywki wzrostowe uzupełnione 5% DMSO lub 20% glicerolem są zwykle wystarczające. Upewnij się, że organizm gospodarza jest kompatybilny z pożywkami krioprotekcyjnymi (np. Wzrost A. propionica jest hamowany przez glicerol, a zamrożone wywary mogą nie powrócić do życia). Przetestuj żywotność niezakażonej kultury gospodarza za pomocą krioprotektantu, aby upewnić się, że zapasy mogą przetrwać zamarznięcie.
- Zawiesić osad komórkowy w tej samej objętości kultury (10-50 ml). Podamy 0,5 ml do znakowanych kriowialiów. Zamrozić hodowle komórkowe w temperaturze -80 °C.
Wyniki
PCR w celu wykrycia Saccharibacteria może dać wynik negatywny (t. j. brak widocznego produktu) w kulturach z początkowej infekcji ze względu na niską liczbę symbiontów Saccharibacteria. Jednak po kilku pasażach powinien pojawić się silny produkt PCR, wykazujący, że doszło do stabilnej infekcji (Rysunek 1A). Z kolei niektóre infekcje początkowo będą wydawać się pozytywne w badaniu PCR, ale po 1-4 pasażach spadną do poziomu niewykrywalnego (nie pokazano). Wskazuje to na obecność dużej liczby komórek Saccharibacteria w początkowym filtracie, które zostały rozcieńczone podczas pasażowania i żadna z nich nie była w stanie wejść w stabilną symbiozę z kulturą gospodarza. Testowanie kilku gatunków gospodarzy z tym samym filtratem Saccharibacteria z jamy ustnej zazwyczaj wiąże się z niskim wskaźnikiem sukcesu (Rysunek 1B), ponieważ interakcja symbiont-gospodarz jest bardzo specyficzna. Badacz może również testować ten sam organizm gospodarza z filtrami pochodzącymi od kilku różnych osobników. W przypadku zastosowania odpowiedniego organizmu gospodarza (takiego jak Arachnia propionica lub Schaalia odontolytica), można oczekiwać wskaźnika sukcesu na poziomie 50%.
Badanie metodą PCR jest kluczowe. Doświadczeni badacze próbowali potwierdzić infekcję za pomocą mikroskopii, jednak odnotowano wyniki fałszywie dodatnie. Komórki Saccharibacteria są małe, co utrudnia odróżnienie ich od pęcherzyków lub nieregularnych wybrzuszeń otoczki komórkowej. Stabilny sygnał PCR w wielu kolejnych pasażach jest kluczowy dla potwierdzenia udanej infekcji.
W miarę wzrostu zainfekowanych kultur powinien pojawić się typowy mętny wzrost. Wraz z ustanowieniem się symbiozy zainfekowane kultury będą wydawać się mniej mętne niż kultury niezinfekowanych organizmów gospodarzy (Rysunek 2A). W niektórych przypadkach może odnieść wrażenie, że zainfekowane kultury całkowicie przestały rosnąć i w ogóle nie stały się mętne. Może to wynikać z infekcji, w której komórki Saccharibacteria dominują nad organizmem gospodarza. Dodanie „świeżego” (niezinfekowanego) gospodarza do tych kultur powinno zapewnić wystarczającą populację gospodarzy, aby wspierać dalszy wzrost pasożytów z rodzaju Saccharibacteria.
Nadmierny wzrost lub zbyt mętne kultury mogą wskazywać na zanieczyszczenie contaminantem laboratoryjnym lub inną małą bakterią jamy ustnej, która była w stanie przejść przez filtr 0.2 µm. Gatunki Campylobacter i Capnocytophaga są typowymi zanieczyszczeniami jamy ustnej w tego rodzaju eksperymentach. Można to potwierdzić poprzez wysianie kultury i poszukiwanie kolonii nietypowych dla organizmu gospodarza, a następnie wykonanie sekwencjonowania 16S rRNA. W przypadku stwierdzenia zanieczyszczenia, przefiltrowanie tych kultur przez filtr 0.2 µm jest zazwyczaj wystarczające do usunięcia contaminantów. Komórki Saccharibacteria w filtracie można skoncentrować poprzez wirowanie i wykorzystać do ponownego zakażenia czystej kultury gospodarza.
Inną metodą oczyszczania zanieczyszczonej hodowli jest wybiór zainfekowanych kolonii po wysianiu zainfekowanej kultury. Kolonie zainfekowanych gospodarzy można czasami zidentyfikować po nieregularnym kształcie w porównaniu z koloniami niezainfekowanymi (Rysunek 2B-D). Występowanie tych nieregularnych kolonii zależy od miana Saccharibacteria w kulturze binarnej; przy niskim mianie mniejsza proporcja kolonii będzie miała nieregularny kształt. Może to ułatwić identyfikację zainfekowanych kolonii, które można wybić i wykorzystać do rozpoczęcia czystej kultury binarnej. Jeśli po wysianiu zainfekowanej kultury Saccharibacteria nie zaobserwowano nieregularnych kolonii, możliwe jest, że symbiont występuje przy niskim mianie lub nie powoduje on powstawania kolonii o nieregularnym kształcie. W takim przypadku przesiewanie metodą PCR kolonii o normalnym wyglądzie może wykazać infekcję Saccharibacteria, lecz z niską częstotliwością (2-10% wszystkich kolonii).
Rycina 1: Typowe wyniki PCR infekcji kultur gospodarzy przez Saccharibacteria. (A) Produkt PCR wskazujący na obecność Saccharibacteria może nie pojawić się przy początkowej infekcji, lecz może wystąpić i stać się bardziej wyraźny w kolejnych pasażach w miarę stabilizacji się kokultury. (B) Większość gospodarzy zainfekowanych filtratem wzbogaconym w Saccharibacteria nie będzie wspierać ich wzrostu ze względu na specyficzność symbiozy. W tym przykładzie pomyślnie zainfekowano jedynie A. propionica. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Charakterystyka wzrostu kultur zakażonych Saccharibacteria. (A) Krzywe wzrostu kultur zakażonych i niezakażonych A. propionica wykazujące, że kultura zakażona nie osiągnie tej samej gęstości co niezakażona kontrola i będzie mniej mętna. (B-D) Wysiew kokultur może prowadzić do powstania nieregularnych kolonii wywołanych infekcjami Saccharibacteria. Proporcja nieregularnych kolonii będzie spadać wraz ze spadkiem miana Saccharibacteria w kokulturze. (B) Gospodarz z wysokim poziomem Saccharibacteria. (C) 10-krotne rozcieńczenie Saccharibacteria (D) Niezakażona kultura gospodarza. Białe strzałki wskazują przykłady nieregularnych kolonii. Pasek skali = 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Nasza metoda filtrowania płytki nazębnej i stosowania jej do czystych kultur organizmów gospodarzy opiera się w dużej mierze na wcześniejszych obserwacjach pierwszych hodowanych bakterii Saccharibacteria, szczepu "Nanosynbacter lyticus" TM7x 11,14,15. Biorąc pod uwagę mały rozmiar komórek, wywnioskowaliśmy, że można je oddzielić od płytki nazębnej za pomocą filtra i zagęścić za pomocą wirowania. Po drugie, ponieważ organizmy te żyją jako pasożyty, zapewnienie tym komórkom czystych kultur gospodarzy pozwoliłoby im wejść w symbiozę i rosnąć jako kultury binarne.
Jedną z zalet tej metody jest to, że nie wymaga hodowli wzbogacającej ani selektywnego nacisku. Szczep TM7x "Nanosynbacter lyticus" wyhodowano z hodowli wzbogacającej przy użyciu streptomycyny jako środka selektywnego, który według sekwencjonowania może być skuteczny w wzbogacaniu bakterii Saccharibacteria. Na szczęście wiadomo, że gospodarz "Nanosynbacter lyticus" Schaalia odontolytica jest oporny na streptomycynę16. Stosowanie antybiotyków jako środka selektywnego mogłoby również zapobiec wzrostowi organizmu gospodarza, co z kolei uniemożliwiłoby rozwój bakterii Saccharibacteria.
Większym problemem związanym ze stosowaniem kultur wzbogacających jest to, że szybko rosnące organizmy szybko wypierają organizmy będące przedmiotem zainteresowania. Na przykład w jamie ustnej gatunki Streptococcus mogą szybko rosnąć i, jeśli cukier jest obecny w pożywce, wytwarzać wystarczającą ilość kwasu, aby zakwasić pożywkę, co dodatkowo selekcjonuje przeciwko organizmom będącym przedmiotem zainteresowania. Unikając hodowli wzbogacającej i selektywnych antybiotyków, nasza metoda zapewnia ogólne podejście, które można zastosować do szerszego zakresu bakterii Saccharibacteria i potencjalnych gospodarzy bez powikłań związanych z tymi innymi metodami.
Istnieją pewne przeszkody w przedstawionej tutaj metodzie. Po pierwsze, metoda ta zakłada, że bakterie Saccharibacteria żyją w kulturze binarnej. Nie testowaliśmy kombinacji kultur trójskładnikowych lub trójskładnikowych, aby ocenić ich skuteczność, ale prawdopodobnie istnieją bakterie Saccharibacteria, które wymagają czynników wzrostu, których pojedynczy organizm gospodarza nie może dostarczyć. Testowanie ogromnych kombinacji bakterii w jamie ustnej, które mogłyby wspierać wzrost bakterii Saccharibacteria, byłoby trudnym zadaniem. Po drugie, metoda zakłada, że wszystkie bakterie Saccharibacteria są wystarczająco małe, aby przejść przez filtr 0,2 μm. Możliwe, że inne bakterie Saccharibacteria są większe niż sądzono, a filtr selekcjonuje przeciwko tym organizmom. Można zastosować filtr o większym rozmiarze porów, ale wiąże się to z ryzykiem wpuszczenia większej ilości niepożądanych bakterii jamy ustnej do zakażonej kokultury. Wreszcie, bardzo trudno jest znaleźć gatunki żywicieli poza tymi, które zostały już opublikowane. Do tej pory jedynymi udanymi żywicielami są gatunki z rodzajów Actinomyces, Schaalia, Arachnia i Cellulosimicrobium, wszystkie należące do gromady Actinobacteria 15,17,18. Jednak ci gospodarze wspierają wzrost tylko określonych bakterii Saccharibacteria. Aby wyhodować więcej gatunków Saccharibacteria, należy zbadać o wiele więcej żywicieli.
Mamy nadzieję, że przedstawiona tutaj metoda pomoże w przyszłych badaniach nad bakteriami Saccharibacteria i innymi organizmami odpowiedzialnymi za resuscytację krążeniowo-oddechową. Sekwencjonowanie metagenomiczne sugeruje, że organizmy te mają również małe genomy i podejrzewa się, że są symbiontami lub polegają na lokalnej społeczności drobnoustrojów w dostarczaniu metabolitów i innych czynników krytycznych dla ich przetrwania. Podobną strategię filtrowania można zastosować do wyizolowania tych organizmów, pod warunkiem, że są one wystarczająco małe i że ich organizmy gospodarza mogą być hodowane. Opisane tutaj metody są pierwszym krokiem do wprowadzenia potężnych narzędzi hodowli laboratoryjnej do tej dużej i zróżnicowanej grupy bakterii.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Anne Tanner, Bruce'owi Pasterowi, Heike Boisvert, Xuesong He i Batbileg Bor za pomocne dyskusje i dostarczenie szczepów bakteryjnych. Dziękujemy Susan Yost i Jessice Woods za mikrobiologiczną pomoc techniczną. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez The National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health pod numerami nagród R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) i T32 DE007327 (AJC). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Lub równoważny system obrazowania żelem UV |
| Folia aluminiowa | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Rosół z naparu z mózgu serca (odwodniony proszek) | Becton-Dickinson | 211059 | Lub inne podłoża wzrostowe odpowiednie dla organizmów docelowych |
| Wirnik wirówki 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
| Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Zasilacz do elektroforezy | Bio-Rad | 1645052 | |
| Urządzenie do elektroforezy | Bio-Rad | 1704467 | |
| Kleszcze filtracyjne | Millipore Sigma | XX6200006P | Nie jest to konieczne, pomaga zapewnić, że filtry nie zostaną przebite podczas obsługi |
| Glicerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
| Mastercycler Pro Termocykler | Eppendorf | 950040025 | Lub równoważny termocykler do PCR |
| Roztwór MgCl2 25mM | Promega | A3513 | |
| Woda klasy biologii molekularnej | Fisher Scientific | BP2819100 | |
| O2 Control InVitro Schowek | rękawiczki Coy Laoratories | 031615 | W razie potrzeby dla organizmów mikrotlenowych |
| Wirówka szybkoobrotowa Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
| Mikropipeta P-10 | Gilson | F144802 | |
| Mikropipeta P-1000 | Gilson | F123601G | |
| Mikropipeta P-2 | Mikropipeta Gilson | F144801 | |
| Mikropipeta P-20 Mikropipeta | Gilson | F123600 | |
| P-200 | Probówki do | F123602G | |
| PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 0,2 ml | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Końcówki do pipet - 10 μ L | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
| Końcówki do pipet - 1000 μ L | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
| Końcówki do pipet - 20 μ L | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
| Końcówki do pipet - 200 μ L | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
| Filtry poliwęglanowe - 47mm, 0,2 μ m wielkość porów | Millipore | GTTP04700 | |
| Zakręcane stożkowe probówki wirówkowe 15 ml | Falcon | 352096 | Lub inna probówka odpowiednia do hodowli bakteryjnej |
| Chlorek sodu | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Filtr Swin-Lok - 47mm | Whatman | 4200400 | |
| SYBR Bezpieczna plama żelowa DNA | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Strzykawki - 20 ml | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| TAE Bufor (50x) koncentrat | Fisher Scientific | P1332500 | |
| Grubościenne probówki wirówkowe z poliwęglanu 25 x 89 mm (pojemność 26,3 mL) z nasadkami | Beckman Coulter | 355618 | |
| Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Lub inna płytka agarowa wystarczająca do wzrostu organizmy żywicielskie |
| Tryptyczny bulion sojowy (odwodniony proszek) | Becton-Dickinson | 211825 | Lub inne podłoża wzrostowe odpowiednie dla organizmów docelowych |
| Winylowa komora anaerobowa | Coy Laboratories | 032714 | W razie potrzeby dla organizmów beztlenowych |
| Mieszalnik wirowy | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Ekstrakt drożdżowy | Fisher Scientific | BP1422-500 |
Bibliografia
- Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), 00012(2011).
- Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, Pt 5 1469-1476 (2004).
- Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, Pt 3 990-995 (2015).
- Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis. PLoS One. 8 (9), 0073351(2013).
- Martin, B., et al. New growth media for oral bacteria. Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).
- Vartoukian, S. R., et al. In vitro cultivation of 'unculturable' oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores. Plos One. 11 (1), 0146926(2016).
- Strandwitz, P., et al. GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota. Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).
- Hug, L. A., et al. A new view of the tree of life. Nature Microbiology. 1, 16048(2016).
- Castelle, C. J., Banfield, J. F. Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life. Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).
- He, X., et al. Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).
- Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives. Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).
- Brinig, M., Lepp, P. Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease. Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).
- Bor, B., et al. Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts. Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).
- Bor, B., et al. Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces. Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).
- Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. Dental plaque development on defined streptococcal surfaces. Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).
- Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts. Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666(2020).
- Cross, K. L., et al. Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics. Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).
- Kantor, R., et al. Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla. MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).
Przedruki i uprawnienia
