Ustanawianie stabilnych kultur binarnych symbiotycznych bakterii sacharycznych z jamy ustnej

Podsumowanie

Demonstrujemy metodę izolowania trudnych do wyhodowania członków nowego typu bakterii, Saccharibacteria, poprzez filtrowanie płytki nazębnej i wspólną hodowlę z bakteriami gospodarza.

Streszczenie

Wiele gatunków bakterii nie może być hodowanych w laboratorium przy użyciu standardowych metod, co stanowi istotną przeszkodę w badaniu większości różnorodności mikrobiologicznej na Ziemi. Potrzebne są nowatorskie podejścia do hodowli tych niehodowanych bakterii, aby badacze mogli skutecznie badać ich fizjologię i styl życia za pomocą potężnych narzędzi dostępnych w laboratorium. Promieniowanie typu kandydującego (CPR) jest jedną z największych grup niehodowanych bakterii, stanowiącą ~15% żywej różnorodności na ziemi. Pierwszym izolatem z tej grupy był przedstawiciel gromady Saccharibacteria, szczep TM7x, "Nanosynbacter lyticus". TM7x to niezwykle mała bakteria, która żyje jako symbiont w bezpośrednim kontakcie z gospodarzem bakteryjnym, Schaalia odontolytica, szczepem XH001. Wykorzystując niezwykle mały rozmiar komórek i ich styl życia jako organizmu symbiotycznego, opracowaliśmy protokół szybkiej hodowli sacharybakterii z płytki nazębnej. Protokół ten pokaże, jak przefiltrować zawiesinę płytki nazębnej przez filtr 0,2 μm, a następnie skoncentrować zebrane komórki sacharybakterii i zainfekować kulturę organizmów gospodarza. Powstała kokultura może być pasażowana, jak każda normalna kultura bakteryjna, a infekcja jest potwierdzana za pomocą PCR. Otrzymaną w ten sposób hodowlę binarną można utrzymać w laboratorium i wykorzystać do przyszłych eksperymentów. Chociaż zanieczyszczenie jest możliwe, kultura binarna może zostać oczyszczona przez dalsze filtrowanie i ponowne zakażenie gospodarza lub przez posiew kultury binarnej i badania przesiewowe w kierunku zainfekowanych kolonii. Mamy nadzieję, że protokół ten zostanie rozszerzony na inne typy próbek i środowiska, co doprowadzi do hodowli znacznie większej liczby gatunków w CPR.

Wprowadzenie

Hodowla nowych gatunków bakterii i wprowadzenie ich do laboratorium pozwala na przeprowadzenie potężnych eksperymentów, aby lepiej zrozumieć ich fizjologię i szersze interakcje w społeczności mikrobiologicznej. Chociaż istnieją metody zadawania tych pytań bez kultur (np. "metaomika"), złożone interakcje różnych populacji drobnoustrojów utrudniają wyodrębnienie pojedynczych zmiennych i wyciągnięcie znaczących wniosków. Chociaż hodowla bakterii ma wiele zalet, istnieje wiele potencjalnych barier uniemożliwiających wyizolowanie bakterii i wyhodowanie jej w czystej kulturze. Potencjalne specyficzne wymagania dotyczące wzrostu obejmują pH, ciśnienie tlenu, witaminy, czynniki wzrostu, cząsteczki sygnałowe, a nawet bezpośredni kontakt z komórkami w celu wywołania wzrostu¹. Uważa się jednak, że określone auksotrofie są głównym czynnikiem odstraszającym przed hodowlą nowych gatunków bakterii. Standardowe preparaty pożywek nie zawierają wielu składników odżywczych wymaganych przez niehodowane bakterie, takich jak określone źródła witamin lub węgla. Te brakujące cząsteczki mogą mieć kluczowe znaczenie dla fizjologii niehodowanych bakterii i zwykle są dostarczane przez inny organizm w społeczności mikrobiologicznej lub organizm gospodarza. Na przykład węglowodany złożone, takie jak mucyny, mogą być dostarczane przez gospodarzy zwierzęcych. Dodanie ich do podłoża umożliwiło hodowlę kilku bakterii z jelit zwierzęcych, w tym Akkermansia muciniphila i Mucinivorans hirudinis^2,3,4. Wiele bakterii chorobotwórczych rozwinęło zdolność do wykorzystywania żelaza związanego z heminą w komórkach zwierzęcych, w tym patogen jamy ustnej Porphyromonas gingivalis⁵. W laboratorium wzrost Porphyromonas i innych organizmów może być stymulowany przez dodanie hemin⁶.

Ostatnio, wiele przełomów w hodowli nowych izolatów bakterii nastąpiło dzięki wspólnej hodowli, użyciu organizmu "żywicielskiego" w celu dostarczenia niehodowanym bakteriom określonych czynników niezbędnych do ich wzrostu. Eleganckie badanie przeprowadzone przez Vartoukiana i współpracowników wykazało, że siderofory, cząsteczki wiążące żelazo wytwarzane przez bakterie, stymulują wzrost kilku nowych doustnych izolatów. Wykazano, że pyoverdyny, rodzaj sideroforu wytwarzanego przez gatunki pseudomonady, znacznie ułatwiają wzrost nowego gatunku Prevotella ⁷. W tym samym badaniu wyhodowano pierwszy doustny izolat dla gromady Chloroflexi, również przy użyciu F. nucleatum jako pomocnika w dostarczaniu nieznanego jeszcze związku⁷. Niedawno wyizolowano bakterię z rodzaju Ruminococcaceae przy użyciu Bacteroides fragilis jako organizmu pomocniczego⁸. Później wykazano, że kwas gamma-aminomasłowy (GABA), neuroprzekaźnik hamujący, był niezbędny do wzrostu na pożywkach laboratoryjnych. Wykorzystanie organizmów żywicielskich okazało się kluczową strategią naśladowania określonych mikrośrodowisk, w których rosną niehodowane bakterie, co jest bardziej wydajne niż ciągłe przeformułowywanie pożywek wzrostowych z różnymi dodatkami w różnych stężeniach.

Jedna z największych grup niehodowanych bakterii znajduje się w "Kandydacyjna grupa promieniowania typu " (CPR), monofiletycznej grupie kilku kandydujących typów bakterii^9,10. W chwili pisania tego tekstu tylko członkowie gromady Saccharibacteria w ramach CPR zostali pomyślnie wyhodowani w laboratorium. Pierwszy izolat, szczep TM7x "Nanosynbacter lyticus", wyizolowano przy użyciu antybiotyku streptomycyny, który zgodnie z przewidywaniami wzbogacał niehodowlany TM7^11,12. Kluczowym odkryciem tej pracy było to, że nowy izolat rósł jako pasożyt rosnący w bezpośrednim kontakcie z gospodarzem bakteryjnym, Schaalia odontolytica, a mikroskopia wykazała, że pasożyty te były ultramałymi bakteriami.

Korzystając z tych wskazówek, opracowaliśmy metodę szybkiego tworzenia binarnych kokultur bakterii Saccharibacteria z ich partnerami, filtrując płytkę nazębną i inne próbki jamy ustnej przez filtr 0,2 μm, zbierając komórki w filtracie przez wirowanie i używając ich do infekowania kultur potencjalnych bakterii gospodarza. Ta metoda ma tę zaletę, że pozwala uniknąć kultur wzbogacających, które mogą zostać przytłoczone szybko rosnącymi organizmami. Pozwala również uniknąć stosowania antybiotyków, które mogłyby zatrzymać wzrost docelowych gatunków bakterii Saccharibacteria lub ich gospodarzy. Korzystając z przedstawionej tutaj metody, udało nam się wyhodować 32 izolaty z gromady Saccharibacteria.

Protokół

Podczas opracowywania tego protokołu, poproszono o zgodę IRB i zatwierdzono (#14-10) oraz uzyskano świadomą zgodę od wszystkich badanych.

1. Przygotowanie

1. Podczas pracy z ludźmi należy uzyskać niezbędną zgodę IRB i świadomą zgodę.
2. Rozpocznij hodowle bakterii gospodarza z wystarczającą ilością czasu, aby wzrosnąć do wczesnej fazy stacjonarnej. Na przykład zaszczepić 2-5 ml tryptycznego bulionu sojowego z dodatkiem 0,1% ekstraktu drożdżowego (TSBY) z Arachnia propionica i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
3. Zamontuj uchwyty filtrów z wytrawioną membraną filtracyjną 0,2 μm. Owiń zespół folią i wysterylizuj w autoklawie.
4. Sterylizuj probówki wirówkowe i zespoły nakrętek.

2. Uzyskaj próbkę bakterii w jamie ustnej

UWAGA: Podczas gdy wiele próbek z jamy ustnej zawiera bakterie Saccharibacteria (np. ślina, wymazy z migdałków, zeskrobania języka), płytka nazębna rutynowo jest najbardziej skuteczna.

1. Weź zeskrobanie płytki nazębnej za pomocą sterylnego papierowego punktu, kiretki Gracey lub, jeśli pobierasz samodzielne próbkowanie, użyj sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety. Przenieść płytkę nazębną do odpowiedniego buforu, takiego jak rozcieńczalnik o maksymalnym odzysku (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% pepton) lub PBS. Jeśli próbka nie zostanie natychmiast przetworzona, należy ją przechowywać na lodzie do czasu, gdy będzie gotowa do kontynuowania.
2. Energicznie zawiesić płytkę nazębną w buforze MRD, stosując kombinację wirowania i pipetowania za pomocą małej końcówki pipety.
3. Dodać zawieszoną próbkę płytki nazębnej do dodatkowych 9 ml buforu MRD.

3. Przygotuj filtrat z próbki ustnej

1. Stosując technikę aseptyczną, rozpakuj sterylny zespół filtra. Odkręć o ćwierć obrotu i ponownie dokręć uchwyt filtra, aby upewnić się, że gwinty są prawidłowo zazębione, a urządzenie jest prawidłowo zamknięte. Za pomocą strzykawki przemyć membranę, przepuszczając 10 ml buforu MRD przez aparat. Nieprawidłowy montaż ujawnia się na tym etapie poprzez wyciek płynu z uchwytu filtra. Jeśli wystąpi wyciek, zaopatrz się w inny sterylny zespół filtra i powtórz etap mycia.
2. Nanieść próbkę na umyty filtr. Wyjąć tłok ze strzykawki i przymocować go do aparatu filtrującego. Wlej rozproszoną próbkę dentystyczną, teraz do 10 ml buforu MRD, do strzykawki i załaduj ją do filtra.
3. Umieść sterylną probówkę wirówkową pod aparatem filtrującym, aby złapać filtrat, a następnie lekko dociśnij tłok, aby przepchnąć próbkę przez filtr.
4. Powtórzyć procedurę z kolejnymi 10 ml buforu MRD w celu przepłukania membrany, zbierając przepływ do tej samej probówki, co przefiltrowana próbka. Aseptyczny korek rurki.

4. Zagęść komórki bakterii Saccharibacteria przez wirowanie

1. Zrób znak orientacyjny na probówce i nasadce, a następnie umieść probówkę w wirówce wysokoobrotowej ze znakiem na górnej stronie. Osad powstały w wyniku odwirowania jest zwykle niewidoczny. Oznakowanie pomoże określić, gdzie znajduje się osad komórek sacharybakterii po zakończeniu wirowania i wyjęciu probówki z wirówki.
2. Odwirować próbki przy 60 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Ta siła i czas są wystarczające do osadzenia wszystkich komórek sacharybakterii. Jednak komórki sacharybakterii można przynajmniej częściowo granulować przez wirowanie przez zaledwie 20 minut przy 20 000 x g.
3. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki. Wylej płyn z tuby, trzymając granulki na górnej stronie tuby.
4. Zawiesić zwykle niewidoczne osady w 1-2 ml buforu MRD przez energiczne wirowanie.

5. Infekuj kultury gospodarzy filtratem wzbogaconym w sacharybakterie

1. Przygotować probówki hodowlane, dzieląc 2 ml odpowiednich pożywek wzrostowych (np. TSBY, BHI itp.) do probówek.
2. Do każdej probówki dodać 200 μl nocnej hodowli organizmów gospodarza. Do każdej probówki dodać 100-200 μl przefiltrowanej próbki.
3. Inkubować połączone próbki, odpowiednie dla organizmu gospodarza (np. 37 °C, w atmosferze tlenowej dla A. propionica).
4. Pasażuj komórki co dwa do trzech dni, przenosząc 200 μl kultury binarnej do 2 ml świeżej pożywki wzrostowej w nowej probówce. Jeśli okaże się, że pasażowane kultury nie wykazują wzrostu (tj. zmętnienie/gęstość optyczna kultury nie wzrasta po przejściu do świeżej pożywki), bakterie Saccharibacteria mogą przytłaczać lub zabijać cały organizm gospodarza. Aby temu zaradzić, dodaj 200 μl niezakażonej kultury gospodarza podczas pasażowania komórek. Powtórz dla co najmniej 5 fragmentów.

6. Potwierdź infekcję za pomocą PCR

1. Po 5 przejściach potwierdź zakażenie PCR. Pięć pasaży zapewni, że jakiekolwiek nierosnące komórki sacharybakterii zostaną wyczerpane ponad granicę wykrywalności przy użyciu 25 cykli PCR.
2. Przygotuj mastermix PCR. Sugerowany przepis jest następujący, dla każdej potrzebnej probówki przygotuj 12,5 μl 2x bufor PCR, 0,75 μl 10 μM Forward primer (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 μM Reverse primer (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl₂ i 9 μL wody. Wymieszaj przez wirowanie.
3. Porcjować 24 μl mastermix do 0,2 ml probówki PCR. Dodać 1 μl kultury zakażonej sacharybakteriami do reakcji PCR. Umieść probówkę w termocyklerze i wykonaj następujący protokół: początkowa denaturacja 95 °C przez 5 minut, 25 cykli 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s, końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 minuty, a następnie końcowe zatrzymanie w temperaturze 4 °C.
4. Załaduj i uruchom produkty PCR w 1% żelu agarozowym. Pasmo ~600 zasad będzie wskazywać na obecność Saccharibacteria.

7. Sprawdź czystość i usuń organizmy skażające

1. Potwierdź czystość dodatnich kultur poprzez posiew kokultury Saccharibacteria na agarze odżywczym wystarczającym do wzrostu organizmu gospodarza. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenie kultury w sterylnym buforze (np. MRD lub PBS) i rozprowadzić 100 μl na płytce agarowej. Wykonaj rozcieńczenia tak, aby na płytce agarowej wyrosło około 20-200 kolonii.
2. Inkubować kulturę w odpowiednich warunkach wzrostu i obserwować, czy nie ma organizmów skażających.
   UWAGA: Nigdy nie zaobserwowano kolonii Axnic Saccharibacteria, więc obserwuje się tylko organizm gospodarza rosnący na tych płytkach. Więcej niż jeden typ kolonii zwykle wskazuje na zanieczyszczenie. W przypadku wystąpienia zanieczyszczenia kultura powinna zostać ponownie przefiltrowana w celu usunięcia niepożądanych zanieczyszczeń i ponownie zaszczepiona na świeżym żywicielu.
3. Czasami dochodzi do podwójnej infekcji, w której dwa gatunki Saccharibacteria infekują tego samego gospodarza. Aby oddzielić gatunki saccharibacteria, należy ponownie zawiesić poszczególne kolonie w 20 μl sterylnego PBS i użyć 1 μl zawiesiny w reakcji PCR w celu wykrycia kolonii z infekcjami Saccharibacteria.
4. Przenieś zawiesiny, które dały pozytywny wynik, na pożywkę wzrostową, aby rozpocząć hodowlę binarną. Wskaźnik sukcesu będzie zależał od miana każdego gatunku Saccharibacteria w kulturze. Może być konieczne przebadanie ponad 50 kolonii, aby znaleźć zainfekowaną do rozmnażania.

8. Przechowywanie kultur

1. Hoduj kulturę binarną o wystarczającej objętości (10-50 ml) przez noc.
2. Komórki osadu przez odwirowanie (4 000 x g przez 10 min).
   UWAGA: Wirowanie z dużą prędkością nie jest tutaj konieczne, ponieważ komórki sacharybakterii zostaną przyłączone do większych, cięższych komórek gospodarza i będą się z nimi osadzać.
3. Ponownie zawiesić komórki w krioprotektantze. Pożywki wzrostowe uzupełnione 5% DMSO lub 20% glicerolem są zwykle wystarczające. Upewnij się, że organizm gospodarza jest kompatybilny z pożywkami krioprotekcyjnymi (np. Wzrost A. propionica jest hamowany przez glicerol, a zamrożone wywary mogą nie powrócić do życia). Przetestuj żywotność niezakażonej kultury gospodarza za pomocą krioprotektantu, aby upewnić się, że zapasy mogą przetrwać zamarznięcie.
4. Zawiesić osad komórkowy w tej samej objętości kultury (10-50 ml). Podamy 0,5 ml do znakowanych kriowialiów. Zamrozić hodowle komórkowe w temperaturze -80 °C.

Wyniki

PCR do wykrywania bakterii Saccharibacteria może wydawać się ujemny (tj. nie zaobserwowano żadnego produktu) w początkowych kulturach infekcji z powodu małej liczby symbiontów Saccharibacteria. Jednak po kilku przejściach powinien pojawić się silny produkt PCR wskazujący, że doszło do stabilnej infekcji (Rysunek 1A). I odwrotnie, niektóre infekcje początkowo będą wydawać się dodatnie po PCR, ale zmniejszają się do niewykrywalnych po 1-4 pasażach (nie pokazano). Wskazuje to, że duża ilość komórek sacharybakterii była obecna w początkowym filtracie, ale została rozcieńczona przez pasaż i żadna z nich nie była w stanie wejść w stabilną symbiozę z kulturą gospodarza. Testowanie kilku gatunków gospodarzy z tym samym filtratem Saccharibacteria z jamy ustnej zwykle będzie miało niski wskaźnik sukcesu (Rysunek 1B), ponieważ interakcja symbiont-gospodarz jest bardzo specyficzna. Badacz może również przetestować tego samego gospodarza za pomocą filtratów od kilku różnych osób. Jeśli stosuje się dobry organizm gospodarza (taki jak Arachnia propionica lub Schaalia odontolytica), można oczekiwać wskaźnika sukcesu na poziomie 50%.

Testowanie metodą PCR jest kluczowe. Doświadczeni badacze próbowali potwierdzić infekcję za pomocą mikroskopii, tylko po to, aby zgłosić fałszywie dodatnie wyniki. Komórki Saccharibacteria są małe i trudne do odróżnienia od pęcherzyków lub nieregularnych wybrzuszeń otoczki komórkowej. Sygnał PCR stabilny przez kilka przejść jest kluczem do potwierdzenia udanej infekcji.

Wraz ze wzrostem zainfekowanych kultur powinien pojawić się normalny mętny wzrost. W miarę utrwalania się symbiozy, zakażone kultury będą wydawać się mniej mętne niż kultury niezakażonych organizmów gospodarza (Rysunek 2A). W niektórych przypadkach może się wydawać, że zainfekowane kultury całkowicie przestają rosnąć i w ogóle nie stają się mętne. Może to być spowodowane infekcją, w której komórki sacharybakterii przytłaczają organizm gospodarza. Dodanie "świeżego" (niezainfekowanego) żywiciela do tych kultur powinno zapewnić wystarczającą populację żywiciela, aby wspierać ciągły wzrost pasożytów Saccharibacteria.

Przerost lub nadmiernie mętne kultury mogą wskazywać na zanieczyszczenie albo laboratoryjnym zanieczyszczeniem, albo inną małą bakterią doustną, która była w stanie przejść przez filtr 0,2 μm. Campylobacter i Capnocytophaga spp. są typowymi zanieczyszczeniami doustnymi w tych eksperymentach. Można to potwierdzić poprzez posiew kultury i poszukiwanie kolonii, które są nietypowe dla organizmu gospodarza, a następnie sekwencjonowanie 16S rRNA. Jeśli widoczne jest zanieczyszczenie, przefiltrowanie tych kultur przez filtr 0,2 μm jest zwykle wystarczające do usunięcia zanieczyszczeń. Komórki sacharybakterii w filtracie mogą być zagęszczane przez wirowanie i wykorzystywane do ponownego zakażenia czystej kultury gospodarza.

Innym sposobem na oczyszczenie skażonej kultury jest wybranie zainfekowanych kolonii z posiewu zainfekowanej kultury. Kolonie zakażonych gospodarzy można czasami zidentyfikować na podstawie nieregularnego kształtu kolonii w porównaniu z koloniami niezainfekowanymi (Rysunek 2B-D). Te nieregularne kolonie są zależne od miana bakterii Saccharibacteria w kulturze binarnej, a mniejszy odsetek kolonii będzie wyglądał nieregularnie, jeśli miano jest niskie. Może to ułatwić identyfikację zainfekowanych kolonii, które można zebrać i wykorzystać do rozpoczęcia czystej kultury binarnej. Jeśli na posiewie z kultury zakażonej bakteriami Saccharibacteria nie widać nieregularnych kolonii, możliwe, że symbiont ma niskie miano lub nie powoduje kolonii o nieregularnych kształtach. W takim przypadku kolonie przesiewowe PCR o normalnym wyglądzie mogą wykazywać zakażenie bakteriami Saccharibacteria, ale w niewielkim stopniu (2-10% wszystkich kolonii).

Rysunek 1: Typowe wyniki PCR infekcji bakteriami Saccharibacteria w kulturach gospodarza. (A) Produkt PCR wskazujący na obecność bakterii Saccharibacteria może nie pojawić się przy początkowej infekcji, ale może pojawić się i stać się silniejszy w kolejnych przejściach, gdy kokultura się utrwali. (B) Większość gospodarzy zakażonych filtratem wzbogaconym w sacharybakterie nie będzie wspierać ich wzrostu ze względu na specyfikę symbiozy. W tym przykładzie tylko A. propionica została pomyślnie zainfekowana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Charakterystyka wzrostu kultur zakażonych bakteriami Saccharibacteria. (A) Krzywe wzrostu zakażonych i niezakażonych kultur A. propionica pokazujące zakażoną kulturę nie osiągną tej samej gęstości co niezainfekowana kontrola i będą wydawać się mniej mętne. (B-D) Posiewanie kokultur może prowadzić do powstawania nieregularnych kolonii, spowodowanych infekcjami Saccharibateria. Nieregularne kolonie będą się zmniejszać proporcjonalnie do miana Saccharibacteria w kokulturze. (B) Żywiciel o wysokim poziomie bakterii Saccharibacteria. (C) 10-krotnie rozcieńczone bakterie Saccharibacteria (D) Niezakażona kultura gospodarza. Białe strzałki wskazują przykłady nieregularnych kolonii. Podziałka = 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Nasza metoda filtrowania płytki nazębnej i stosowania jej do czystych kultur organizmów gospodarzy opiera się w dużej mierze na wcześniejszych obserwacjach pierwszych hodowanych bakterii Saccharibacteria, szczepu "Nanosynbacter lyticus" TM7x 11,14,15. Biorąc pod uwagę mały rozmiar komórek, wywnioskowaliśmy, że można je oddzielić od płytki nazębnej za pomocą filtra i zagęścić za pomocą wirowania. Po drugie, ponieważ organizmy te żyją jako pasożyty, zapewnienie tym komórkom czystych kultur gospodarzy pozwoliłoby im wejść w symbiozę i rosnąć jako kultury binarne.

Jedną z zalet tej metody jest to, że nie wymaga hodowli wzbogacającej ani selektywnego nacisku. Szczep TM7x "Nanosynbacter lyticus" wyhodowano z hodowli wzbogacającej przy użyciu streptomycyny jako środka selektywnego, który według sekwencjonowania może być skuteczny w wzbogacaniu bakterii Saccharibacteria. Na szczęście wiadomo, że gospodarz "Nanosynbacter lyticus" Schaalia odontolytica jest oporny na streptomycynę¹⁶. Stosowanie antybiotyków jako środka selektywnego mogłoby również zapobiec wzrostowi organizmu gospodarza, co z kolei uniemożliwiłoby rozwój bakterii Saccharibacteria.

Większym problemem związanym ze stosowaniem kultur wzbogacających jest to, że szybko rosnące organizmy szybko wypierają organizmy będące przedmiotem zainteresowania. Na przykład w jamie ustnej gatunki Streptococcus mogą szybko rosnąć i, jeśli cukier jest obecny w pożywce, wytwarzać wystarczającą ilość kwasu, aby zakwasić pożywkę, co dodatkowo selekcjonuje przeciwko organizmom będącym przedmiotem zainteresowania. Unikając hodowli wzbogacającej i selektywnych antybiotyków, nasza metoda zapewnia ogólne podejście, które można zastosować do szerszego zakresu bakterii Saccharibacteria i potencjalnych gospodarzy bez powikłań związanych z tymi innymi metodami.

Istnieją pewne przeszkody w przedstawionej tutaj metodzie. Po pierwsze, metoda ta zakłada, że bakterie Saccharibacteria żyją w kulturze binarnej. Nie testowaliśmy kombinacji kultur trójskładnikowych lub trójskładnikowych, aby ocenić ich skuteczność, ale prawdopodobnie istnieją bakterie Saccharibacteria, które wymagają czynników wzrostu, których pojedynczy organizm gospodarza nie może dostarczyć. Testowanie ogromnych kombinacji bakterii w jamie ustnej, które mogłyby wspierać wzrost bakterii Saccharibacteria, byłoby trudnym zadaniem. Po drugie, metoda zakłada, że wszystkie bakterie Saccharibacteria są wystarczająco małe, aby przejść przez filtr 0,2 μm. Możliwe, że inne bakterie Saccharibacteria są większe niż sądzono, a filtr selekcjonuje przeciwko tym organizmom. Można zastosować filtr o większym rozmiarze porów, ale wiąże się to z ryzykiem wpuszczenia większej ilości niepożądanych bakterii jamy ustnej do zakażonej kokultury. Wreszcie, bardzo trudno jest znaleźć gatunki żywicieli poza tymi, które zostały już opublikowane. Do tej pory jedynymi udanymi żywicielami są gatunki z rodzajów Actinomyces, Schaalia, Arachnia i Cellulosimicrobium, wszystkie należące do gromady Actinobacteria 15,17,18. Jednak ci gospodarze wspierają wzrost tylko określonych bakterii Saccharibacteria. Aby wyhodować więcej gatunków Saccharibacteria, należy zbadać o wiele więcej żywicieli.

Mamy nadzieję, że przedstawiona tutaj metoda pomoże w przyszłych badaniach nad bakteriami Saccharibacteria i innymi organizmami odpowiedzialnymi za resuscytację krążeniowo-oddechową. Sekwencjonowanie metagenomiczne sugeruje, że organizmy te mają również małe genomy i podejrzewa się, że są symbiontami lub polegają na lokalnej społeczności drobnoustrojów w dostarczaniu metabolitów i innych czynników krytycznych dla ich przetrwania. Podobną strategię filtrowania można zastosować do wyizolowania tych organizmów, pod warunkiem, że są one wystarczająco małe i że ich organizmy gospodarza mogą być hodowane. Opisane tutaj metody są pierwszym krokiem do wprowadzenia potężnych narzędzi hodowli laboratoryjnej do tej dużej i zróżnicowanej grupy bakterii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100
Alphaimager	Cell Biosciences	FluorChem HD2	Lub równoważny system obrazowania żelem UV
Folia aluminiowa	Fisher Scientific	01-213-101
Rosół z naparu z mózgu serca (odwodniony proszek)	Becton-Dickinson	211059	Lub inne podłoża wzrostowe odpowiednie dla organizmów docelowych
Wirnik wirówki 70-Ti	Beckman Coulter	337922
Cryovials	Fisher Scientific	12-567-500
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
Zasilacz do elektroforezy	Bio-Rad	1645052
Urządzenie do elektroforezy	Bio-Rad	1704467
Kleszcze filtracyjne	Millipore Sigma	XX6200006P	Nie jest to konieczne, pomaga zapewnić, że filtry nie zostaną przebite podczas obsługi
Glicerol	Fisher Scientific	G33-500
GoTaq Green Mastermix	Promega	M7122
Mastercycler Pro Termocykler	Eppendorf	950040025	Lub równoważny termocykler do PCR
Roztwór MgCl2 25mM	Promega	A3513
Woda klasy biologii molekularnej	Fisher Scientific	BP2819100
O2 Control InVitro Schowek	rękawiczki Coy Laoratories	031615	W razie potrzeby dla organizmów mikrotlenowych
Wirówka szybkoobrotowa Optima L-100 XP	Beckman Coulter	8043-30-1124
Mikropipeta P-10	Gilson	F144802
Mikropipeta P-1000	Gilson	F123601G
Mikropipeta P-2	Mikropipeta Gilson	F144801
Mikropipeta P-20 Mikropipeta	Gilson	F123600
P-200	Probówki do	F123602G
PBS	Fisher Scientific	BP399500
0,2 ml	Fisher Scientific	14-230-205
Peptone	Fisher Scientific	BP1420-500
Końcówki do pipet - 10 μ L	Fisher Scientific	02-717-157
Końcówki do pipet - 1000 μ L	Fisher Scientific	02-717-166
Końcówki do pipet - 20 μ L	Fisher Scientific	02-717-161
Końcówki do pipet - 200 μ L	Fisher Scientific	02-717-165
Filtry poliwęglanowe - 47mm, 0,2 μ m wielkość porów	Millipore	GTTP04700
Zakręcane stożkowe probówki wirówkowe 15 ml	Falcon	352096	Lub inna probówka odpowiednia do hodowli bakteryjnej
Chlorek sodu	Fisher Scientific	BP358-1
Filtr Swin-Lok  - 47mm	Whatman	4200400
SYBR Bezpieczna plama żelowa DNA	ThermoFisher Scientific	S33102
Strzykawki - 20 ml	Fisher Scientific	14-955-460
TAE Bufor (50x) koncentrat	Fisher Scientific	P1332500
Grubościenne probówki wirówkowe z poliwęglanu 25 x 89 mm (pojemność 26,3 mL) z nasadkami	Beckman Coulter	355618
Tryptic Soy Blood Agar Plates	Northeast Laboratory Services	P1100	Lub inna płytka agarowa wystarczająca do wzrostu organizmy żywicielskie
Tryptyczny bulion sojowy (odwodniony proszek)	Becton-Dickinson	211825	Lub inne podłoża wzrostowe odpowiednie dla organizmów docelowych
Winylowa komora anaerobowa	Coy Laboratories	032714	W razie potrzeby dla organizmów beztlenowych
Mieszalnik wirowy	Scientific Industries	SI-0236
Ekstrakt drożdżowy	Fisher Scientific	BP1422-500