Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62486

⸱

5 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Streszczenie

Ponieważ pandemia COVID-19 wywołana przez koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) nadal ewoluuje, stało się oczywiste, że obecność przeciwciał neutralizujących przeciwko wirusowi może zapewnić ochronę przed przyszłą infekcją. W związku z tym, że tworzenie i tłumaczenie skutecznych szczepionek przeciwko COVID-19 postępuje w bezprecedensowym tempie, rozwój szybkich i skutecznych metod pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko SARS-CoV-2 będzie coraz ważniejszy dla określenia długoterminowej ochrony przed zakażeniem zarówno dla osób wcześniej zakażonych, jak i zaszczepionych. W artykule opisano wysokoprzepustowy protokół wykorzystujący wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) pseudotypowanego białkiem kolca SARS-CoV-2 w celu pomiaru obecności przeciwciał neutralizujących w surowicy ozdrowieńców od pacjentów, którzy niedawno wyzdrowieli z COVID-19. Zastosowanie replikującego się pseudotypizowanego wirusa eliminuje konieczność posiadania obiektu o poziomie 3 wymaganym do obsługi SARS-CoV-2, dzięki czemu protokół ten jest dostępny dla praktycznie każdego laboratorium poziomu hermetyczności 2. Zastosowanie formatu 96-dołkowego pozwala na jednoczesne badanie wielu próbek w krótkim czasie realizacji wynoszącym 24 godziny.

Wprowadzenie

W grudniu 2019 roku zidentyfikowano nowego koronawirusa, który obecnie znamy jako SARS-CoV-2, czynnik wywołujący chorobę koronawirusową 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 to betakoronawirus należący do rodziny Coronaviridae. Te wirusy otoczkowe składają się z dużego genomu RNA o dodatnim znaczeniu i są odpowiedzialne za infekcje dróg oddechowych i jelit zarówno u ludzi, jak i zwierząt2. Od maja 2021 r. na całym świecie zgłoszono ponad 157 milionów przypadków COVID-19 i ponad 3,2 miliona zgonów3. Opracowanie skutecznej szczepionki stało się głównym celem naukowców na całym świecie, z co najmniej 77 szczepionkami przedklinicznymi w trakcie badań, a 90 jest obecnie w trakcie badań klinicznych4.

Koronawirusy kodują cztery białka strukturalne, w tym białko kolca (S), nukleokapsyd (N), białko otoczki (E) i białko błonowe (M). Wejście SARS-CoV-2 wymaga interakcji domeny wiążącej receptor (RBD) S z receptorem gospodarza, ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę 2 (hACE2), a następnie fuzji błonowej po rozszczepieniu proteolitycznym przez komórkową proteazę serynową gospodarza, transbłonową proteazę seryny 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10. Immunodominacja humoralna białka S SARS-CoV została już wcześniej opisana, a teraz została wykazana również dla SARS-CoV-211,12,13. Rzeczywiście, neutralizujące odpowiedzi przeciwciał przeciwko S wykryto w surowicy ozdrowieńców od pacjentów z SARS-CoV 24 miesiące po zakażeniu14, co podkreśla ich kluczową rolę w długoterminowej odpowiedzi immunologicznej. Białko S zostało zidentyfikowane jako obiecujący cel szczepionki i tym samym stało się kluczowym składnikiem większości opracowywanych szczepionek15,16.

Chociaż szybkie wykrywanie przeciwciał neutralizujących jest kluczowym aspektem rozwoju szczepionki, może również rzucić światło na wskaźnik infekcji i nadzór seroepidemiologiczny na obszarach dotkniętych chorobą17. Kompetentny do replikacji VSV pseudotypowany glikoproteiną S SARS-CoV-2, zamiast glikoproteiny VSV typu dzikiego, do badania infekcji SARS-CoV-2 w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2 został uprzejmie podarowany przez Whelana i współpracowników18. Kolec z ekspresją VSV (VSV-S) zostanie wykorzystany do określenia odpowiedzi przeciwciała neutralizującego przeciwko białku kolca SARS-CoV-2. Ponieważ zastosowany tutaj VSV-S również ulega ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP), ogniska eGFP mogą zostać wykryte w ciągu 24 godzin w celu ilościowego określenia infekcji, podczas gdy tworzenie płytki nazębnej może zająć od 48 do 72 godzin. Poniżej przedstawiono prosty i skuteczny protokół określający zdolność surowicy rekonwalescenta do neutralizacji zakażenia VSV-S-eGFP. Metoda ta może być również łatwo zaadaptowana do badania innych potencjalnych środków terapeutycznych, które mają na celu zakłócenie interakcji gospodarz-wirus białka S SARS-CoV-2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wysiewanie komórek (Dzień 1) w celu produkcji i kwantyfikacji pseudowirusa SARS-CoV-2

  1. Przygotowanie do hodowli tkankowej
    1. Podgrzać 1x fosforanowo-buforowy roztwór soli Dulbecco (DPBS), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (opcjonalnie) oraz 0,25% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) do 37 °C w kąpieli wodnej przez około 15 min.
    2. Zdezynfekować komorę do hodowli tkankowej 70% etanolem, a następnie umieścić w niej szalki do hodowli tkankowej, pipety Pasteura i pipety serologiczne w zależności od potrzeb. Wyjąć PBS, DMEM i trypsynę z kąpieli wodnej i zdezynfekować je 70% etanolem przed umieszczeniem w komorze do hodowli tkankowej.
  2. Wysiewanie i utrzymywanie komórek
    1. Hodować komórki Vero E6 w DMEM (zawierającym 10% FBS) w kolbach do hodowli tkankowej T75 lub szalkach do hodowli tkankowej o średnicy 15 cm w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2. Prowadzić pasażowanie komórek w razie potrzeby, gdy osiągną 80-90% konfluencji.
    2. Przemyć komórki, dodając 10 mL 1x PBS do każdej szalki i delikatnie kołysząc nimi 4-5 razy; odessać PBS. Dodać 3 mL trypsyny-EDTA do każdej szalki, kołysząc płytką, aby zapewnić pokrycie całej powierzchni. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez około 5 min lub do czasu odklejenia się komórek.
    3. Dodać 7 mL DMEM (zawierającego 10% FBS), aby dezaktywować trypsynę, a następnie resuspender komórki poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół. Odwirować komórki w celu usunięcia trypsyny za pomocą wirówki laboratoryjnej przy 500 × g przez 5 min, odessać pożywkę bez naruszania osadu komórkowego i resuspender komórki w 10 mL DMEM (zawierającego 10% FBS). Jeśli komórki są potrzebne do przyszłych eksperymentów, przenieść 1 mL do nowej szalki zawierającej 15 mL świeżego DMEM (zawierającego 10% FBS).
    4. Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru, nanieść około 1 × 107 komórek na każdą płytkę 15 cm i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do osiągnięcia 100% konfluencji (1-2 dni).

2. Przygotowanie pseudowirusa VSV-S-EGFP

  1. Infekcja
    1. Zainfekować komórki wirusem stokowym VSV-S-eGFP z wielokrotnością infekcji (MOI) 0,01 w 12 mL bezsurowiczego DMEM przez 1 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, okazyjnie kołysząc płytkami. Zamienić inokulum na świeże DMEM (zawierające 2% FBS i 20 mM HEPES, pH 7,7) i przenieść do inkubatora ustawionego na 34 °C przy 5% CO2.
      UWAGA: Do propagacji VSV-S-eGFP w hodowli komórkowej wymagana jest temperatura 34 °C.
    2. Zebrać nadnadkomórkowe po ok. 48 h po infekcji, po zaobserwowaniu rozległego efektu cytopatycznego (CPE) i odrywaniu się komórek. Użyć mikroskopu fluorescencyjnego, aby zwizualizować rozległą ekspresję eGFP w zainfekowanych komórkach, zaczynając od 24 h po infekcji.
  2. Zbiór
    1. Odwirować nadnadkomórkowe w wirówce laboratoryjnej przez 5 min przy 1 000 × g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych. Rozdzielić nadnadkomórkowe na alykwoaty, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Oznaczanie miana pseudowirusa VSV-S-eGFP

  1. Rozcieńczenia seryjne w celu oznaczenia miana wirusa
    1. Wysiać komórki Vero E6 na płytki 6-dołkowe z gęstością 6 × 105 komórek na dołek w pożywce DMEM (z 10% FBS) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
      UWAGA: Można również zastosować komórki Vero z nadekspresją TMPRSS2 i hACE2.
    2. Przygotować serię 10-krotnych rozcieńczeń wirusa VSV-S-eGFP w schłodzonej, bezzsierkowej pożywce DMEM, nalewając 900 µL medium do siedmiu probówek do mikrocentryfugi. Probówki należy ponumerować od 1 do 7. Do pierwszej probówki dodać 100 µL stoku wirusa i krótko wymieszać na wortexie. Przenieść 100 µL rozcieńczonego wirusa z probówki 1 do probówki 2 i krótko wymieszać na wortexie; powtarzać czynność aż do probówki 7.
    3. Odssać medium ze wszystkich dołków płytki 6-dołkowej z komórkami Vero E6 i zastąpić je 500 µL rozcieńczeń od 10-2 do 10-7. Inkubować płytki przez 45 min w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, delikatnie kołysząc płytką co 15 min.
    4. Odssać inokulum i zastąpić je warstwą przykrywną zawierającą mieszaninę 1:1 z 2x DMEM i 6% karboksymetylocelulozy (CMC), co daje końcowe stężenie 3% CMC, uzupełnioną o 10% FBS; inkubować w temperaturze 34 °C przy 5% CO2 przez 48 h.
      UWAGA: Podczas etapu infekcji należy wstępnie podgrzać mieszaninę przykrywną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 min. Zamiast CMC można zastosować mieszaninę 1:1 z 1% agarozy i 2x DMEM uzupełnionej o 10% FBS. Aby przygotować warstwę agarozy, należy zagotować 1% agarozę (w dH2O) i zmieszać ją ze schłodzonym 2x DMEM. Przed dodaniem do monowarstwy komórek należy upewnić się, że mieszanina ma odpowiednią temperaturę (około 37-40 °C). Jeśli do przykrycia użyto agarozy, komórki muszą zostać utrwalone poprzez inkubację w 2 mL mieszaniny metanolu i kwasu octowego w stosunku 3:1 przez co najmniej jedną godzinę przed barwieniem.
  2. Barwienie i obliczanie miana wirusa
    1. Wizualizować plaquesy poprzez barwienie fioletem krystalicznym lub bezpośrednią wizualizację eGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    2. Aby zbarwić płytki, odssać warstwę przykrywną, przepłukać raz PBS, a następnie do każdego dołka dodać 2 mL 0,1% fioletu krystalicznego (w 80% metanolu i dH2O). Umieścić na kołysarce do płytek na około 20 min w temperaturze pokojowej przed odbarwieniem. Usunąć fiolet krystaliczny i delikatnie przepłukać każdy dołek dwukrotnie za pomocą dH2O lub PBS.
      UWAGA: Kroki płukania i barwienia należy wykonywać delikatnie, pipetując powoli w stronę ścianki każdego dołka, aby upewnić się, że monowarstwa komórek pozostanie nienaruszona przez całą procedurę.
    3. Pozostawić płytki do wyschnięcia na co najmniej 1 h przed liczeniem plaquesów. Należy upewnić się, że liczba plaquesów w dołkach mieści się w zakresie od 20 do 200. Aby obliczyć miano wirusa w jednostkach tworzących plaquesy (PFU) na mL, należy pomnożyć czynnik rozcieńczenia dołka, w którym dokonano obliczeń, przez objętość inokulum, a następnie podzielić tę liczbę przez liczbę plaquesów obecnych w odpowiednim dołku.
      Wzór na obliczanie miana wirusa; równanie testu plaques dla analizy kwantyfikacji wirusa.

4. Wysiew komórek (Dzień 1) w celu pomiaru neutralizacji pseudowirusa SARS-CoV-2 przez dostępne komercyjnie przeciwciała oraz surowicę pacjentów w okresie rekonwalescencji

  1. Przygotowanie do hodowli tkankowej
    1. Przygotować pożywkę oraz komorę do hodowli tkankowej zgodnie z opisem w sekcji 1. Dodatkowo przygotować odpowiednią liczbę płytek 96-dołkowych, aby pomieścić minimum 2 powtórzenia na próbkę (tj. 1 płytkę na 6 próbek); dodać kolejne powtórzenia, jeżeli pozwala na to objętość próbki.
  2. Wysiewanie i utrzymywanie komórek
    1. Hodować i utrzymywać komórki Vero E6 zgodnie z opisem w sekcji 1. Przygotować co najmniej 10 mL zawiesiny komórek na płytkę 96-dołkową w stężeniu 2 × 105 komórek na mL (w przypadku analiz przeprowadzanych po 48 h, jeśli jest to konieczne, wysiać 1.5 × 105 komórek na mL). Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodać 100 µL zawiesiny komórek za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 24 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
      UWAGA: Dokładnie wymieszać zawiesinę komórek i delikatnie poruszać każdą płytką we wszystkich kierunkach, aby zapewnić równomierny rozkład komórek.

5. Rozcieńczenia przeciwciał lub surowicy oraz infekcje (Dzień 2)

UWAGA: Niniejszy protokół można zastosować do pomiaru neutralizacji VSV-S-eGFP zarówno za pomocą przeciwciał dostępnych komercyjnie, jak i surowicy pacjentów, a także surowicy pobranej od zwierząt na potrzeby przedklinicznych badań nad rozwojem szczepionek. *Należy zwrócić uwagę na dodatkowe kroki wymienione przy obchodzeniu się z próbkami surowicy pacjentów/zwierząt.

  1. Seria rozcieńczeń szeregowych
    1. Przed rozcieńczeniem próbek surowicy należy poddać każdą próbkę inaktywacji termicznej w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C przez 30 min w celu inaktywacji dopełniacza. Należy przestrzegać niezbędnych środków ostrożności podczas pracy z próbkami pacjentów; pojemniki z próbkami należy otwierać wyłącznie w komorze do hodowli tkanek i upewnić się, że stosowany jest odpowiedni zestaw środków ochrony indywidualnej dla poziomu bezpieczeństwa 2.
    2. Przygotować serię rozcieńczeń w pustej płytce 96-dołkowej (Płytka 1).
    3. Wszystkie rozcieńczenia w rzędzie A płytki 96-dołkowej rozpocząć od objętości 80 µL. *W przypadku próbek pacjentów serię rozcieńczeń rozpocząć od stosunku 1:10, przenosząc 8 µL surowicy do 72 µL DMEM bez surowicy (z 1% penicyliną/streptomycyną).
      UWAGA: Stężenie użytego przeciwciała neutralizującego będzie zależeć od aktywności przewidzianej przez producenta. Dla przeciwciała neutralizującego białko Spike SARS-CoV-2 użytego w tej procedurze (patrz Tabela materiałów), należy zacząć od 5 µg/mL, aby zaobserwować co najmniej 50% neutralizacji.
    4. Do rzędów od B do G dodać 40 µL DMEM bez surowicy (z 1% penicyliną/streptomycyną), a do rzędu H dodać 80 µL. Do rzędu H nie dodawać wirusa, ponieważ służy on jako kontrola samych komórek.
    5. Używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej, wymieszać i przenieść 40 µL rozcieńczonej surowicy lub przeciwciała z rzędu A do rzędu B. Mieszać i powtarzać czynność aż do rzędu F, a następnie odrzucić 40 µL z rzędu F. Do rzędu G nie dodawać surowicy, ponieważ stanowi on rząd kontroli samego wirusa.
  2. Infekcja i nakładka
    1. Przygotować odpowiednią objętość rozcieńczonego VSV-S-eGFP, aby zaszczepić każdy dołek przy MOI 0,05 (lub 2000 pfu). (Wykonując to obliczenie, należy pamiętać, że na komórki zostanie przeniesione tylko 60 µL z całkowitej objętości 80 µL; dlatego należy pomnożyć objętość wirusa przez 1,33, aby zachować 2000 pfu).
      UWAGA: Ponieważ VSV-S-eGFP jest wrażliwy na temperaturę, należy upewnić się, że zapasy wirusa pozostają w lodzie, gdy nie są używane, i unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ miana będą się różnić po wielokrotnym zamrażaniu.
    2. Do każdego dołka w rzędach od A do G Płytki 1 dodać 40 µL rozcieńczonego wirusa i wymieszać, pipetując w górę i w dół 4-5 razy. Inkubować płytkę przez 1 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
    3. Wyjąć z inkubatora płytkę zawierającą komórki (Płytka 2) i ostrożnie odessać medium ze wszystkich dołków. Przenieść 60 µL mieszaniny przeciwciał/wirusa z Płytki 1 na Płytkę 2 i inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, kołysząc płytką co 20 min.
    4. Uzupełnić każdy dołek 140 µL nakładki zawierającej CMC w DMEM do końcowego stężenia 3% CMC (z 10% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną). Umieścić Płytkę 2 w inkubatorze ustawionym na 34 °C przy 5% CO2 na około 24 h przed obrazowaniem.
      ​UWAGA: Podczas etapu infekcji należy podgrzać mieszaninę nakładki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 min.

6. Obrazowanie i kwantyfikacja (Dzień 3)

  1. Obrazuj płytki za pomocą automatycznego skanera fluorescencyjnego (stosując filtr izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) lub alternatywny filtr o długości fali wzbudzenia 488 nm). Ilościowo określ stopień infekcji wirusowej, tworząc protokół, który automatycznie identyfikuje i zlicza poszczególne ogniska eGFP. Jeśli funkcja automatycznego zliczania jest niedostępna, użyj oprogramowania ImageJ do ilościowego określenia liczby ognisk eGFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje szybką i skuteczną metodę wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko białku S SARS-CoV-2 poprzez hamowanie infekcji pseudowirusem VSV-S-eGFP (mierzalną na podstawie utraty wykrywalnych ognisk eGFP). Schematyczna reprezentacja protokołu przedstawiona jest na Rysunku 1. Zaleca się, aby przy każdym przeprowadzeniu testu używać dostępnego komercyjnie przeciwciała jako kontroli pozytywnej w celu zapewnienia spójności analizy. W niniejszej pracy prezentujemy krzyw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda może być dostosowana do różnych środowisk laboratoryjnych i zasobów w zależności od potrzeb. Co ważne, głównym ograniczeniem tego protokołu jest konieczność posiadania przestrzeni herekcyjnej poziomu 2 i kaptura do hodowli tkankowych. Zastosowanie replikującego się wirusa RNA z pseudotypem kolca SARS-CoV-2, takiego jak VSV-S-eGFP, jest potężną alternatywą dla wirusa SARS-CoV-2, który wymaga obszaru roboczego na poziomie 3 izolacji, ale może pozostać ograniczeniem dla niektórych grup. Wszystkie inne k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych związanych z niniejszą publikacją.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować laboratorium Whelan za hojne dostarczenie wirusa VSV-S-eGFP użytego w tym protokole (opisanego w Case et al. 2020). Dziękujemy również doktorom Billowi Cameronowi i Juthaporn Cowan (i zespołowi) za pobranie próbek krwi pacjenta (identyfikator protokołu REB 20200371-01H). Autorzy ujawniają otrzymanie następującego wsparcia finansowego na badania, autorstwo i/lub publikację tego artykułu: Ta praca została sfinansowana dzięki hojnemu wsparciu Fundacji Szpitala w Ottawie oraz grantowi z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (#448323) i Fast Grant od fundacji Thistledown na rzecz nauki o COVID-19 dla C.S.I. T.R.J. jest finansowany ze stypendium dla absolwentów Ontario i stypendium Mitacs. JP jest finansowany przez stypendium klastra Mitacs. T.A. jest finansowany przez CIHR Banting Fellowship. Chcielibyśmy również podziękować wszystkim osobom, które wzięły udział i oddały swoje próbki krwi do tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
(Gibco)Fisher scientific10-013-CV
's medium (Powder) (Gibco)Thermo Fisher Scientific12-800-017
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
Kontrola izotypu IgG (mysz)Thermo Fisher Scientific31903
Penicylina/streptomycynaThermo Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Przeciwciało neutralizujące kolce, mysi MabSinoBiological40592-MM57
Ogniwa Vero E6ATCC  CRL-1586
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Zautomatyzowany obrazownik fluorescencyjny karboksymetyloceluloza Sigma C5678 Zmodyfikowane podłoże Eagle's firmy Dulbecco Zmodyfikowany Orzeł firmy Dulbecco powiedział:

Bibliografia

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215(2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299(2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237(2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455(2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462(2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza neutralizacji pseudowirusówobrazowanie wysokoprzepustowekomórki Vero E6pseudowirus z białkiem Spikesurowica rekonwalescentówmetoda plackowabarwienie fioletem kryształowymilościowe oznaczanie przeciwciał
Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.