Artykuł metodologiczny

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

DOI:

10.3791/62486

⸱

5 czerwca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ pandemia COVID-19 wywołana przez koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) nadal ewoluuje, stało się oczywiste, że obecność przeciwciał neutralizujących przeciwko wirusowi może zapewnić ochronę przed przyszłą infekcją. W związku z tym, że tworzenie i tłumaczenie skutecznych szczepionek przeciwko COVID-19 postępuje w bezprecedensowym tempie, rozwój szybkich i skutecznych metod pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko SARS-CoV-2 będzie coraz ważniejszy dla określenia długoterminowej ochrony przed zakażeniem zarówno dla osób wcześniej zakażonych, jak i zaszczepionych. W artykule opisano wysokoprzepustowy protokół wykorzystujący wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) pseudotypowanego białkiem kolca SARS-CoV-2 w celu pomiaru obecności przeciwciał neutralizujących w surowicy ozdrowieńców od pacjentów, którzy niedawno wyzdrowieli z COVID-19. Zastosowanie replikującego się pseudotypizowanego wirusa eliminuje konieczność posiadania obiektu o poziomie 3 wymaganym do obsługi SARS-CoV-2, dzięki czemu protokół ten jest dostępny dla praktycznie każdego laboratorium poziomu hermetyczności 2. Zastosowanie formatu 96-dołkowego pozwala na jednoczesne badanie wielu próbek w krótkim czasie realizacji wynoszącym 24 godziny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W grudniu 2019 roku zidentyfikowano nowego koronawirusa, który obecnie znamy jako SARS-CoV-2, czynnik wywołujący chorobę koronawirusową 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 to betakoronawirus należący do rodziny Coronaviridae. Te wirusy otoczkowe składają się z dużego genomu RNA o dodatnim znaczeniu i są odpowiedzialne za infekcje dróg oddechowych i jelit zarówno u ludzi, jak i zwierząt2. Od maja 2021 r. na całym świecie zgłoszono ponad 157 milionów przypadków COVID-19 i ponad 3,2 miliona zgonów3. Opracowanie skutecznej szczepionki stało się głównym celem naukowców na całym świecie, z co najmniej 77 szczepionkami przedklinicznymi w trakcie badań, a 90 jest obecnie w trakcie badań klinicznych4.

Koronawirusy kodują cztery białka strukturalne, w tym białko kolca (S), nukleokapsyd (N), białko otoczki (E) i białko błonowe (M). Wejście SARS-CoV-2 wymaga interakcji domeny wiążącej receptor (RBD) S z receptorem gospodarza, ludzkim enzymem konwertującym angiotensynę 2 (hACE2), a następnie fuzji błonowej po rozszczepieniu proteolitycznym przez komórkową proteazę serynową gospodarza, transbłonową proteazę seryny 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10. Immunodominacja humoralna białka S SARS-CoV została już wcześniej opisana, a teraz została wykazana również dla SARS-CoV-211,12,13. Rzeczywiście, neutralizujące odpowiedzi przeciwciał przeciwko S wykryto w surowicy ozdrowieńców od pacjentów z SARS-CoV 24 miesiące po zakażeniu14, co podkreśla ich kluczową rolę w długoterminowej odpowiedzi immunologicznej. Białko S zostało zidentyfikowane jako obiecujący cel szczepionki i tym samym stało się kluczowym składnikiem większości opracowywanych szczepionek15,16.

Chociaż szybkie wykrywanie przeciwciał neutralizujących jest kluczowym aspektem rozwoju szczepionki, może również rzucić światło na wskaźnik infekcji i nadzór seroepidemiologiczny na obszarach dotkniętych chorobą17. Kompetentny do replikacji VSV pseudotypowany glikoproteiną S SARS-CoV-2, zamiast glikoproteiny VSV typu dzikiego, do badania infekcji SARS-CoV-2 w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2 został uprzejmie podarowany przez Whelana i współpracowników18. Kolec z ekspresją VSV (VSV-S) zostanie wykorzystany do określenia odpowiedzi przeciwciała neutralizującego przeciwko białku kolca SARS-CoV-2. Ponieważ zastosowany tutaj VSV-S również ulega ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (eGFP), ogniska eGFP mogą zostać wykryte w ciągu 24 godzin w celu ilościowego określenia infekcji, podczas gdy tworzenie płytki nazębnej może zająć od 48 do 72 godzin. Poniżej przedstawiono prosty i skuteczny protokół określający zdolność surowicy rekonwalescenta do neutralizacji zakażenia VSV-S-eGFP. Metoda ta może być również łatwo zaadaptowana do badania innych potencjalnych środków terapeutycznych, które mają na celu zakłócenie interakcji gospodarz-wirus białka S SARS-CoV-2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Posiewanie komórek (Dzień 1) do produkcji i kwantyfikacji pseudowirusa SARS-CoV-2

  1. Przygotowanie do hodowli tkankowej
    1. Ciepły 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS); Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (opcjonalnie); i 0,25% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do 37 °C w łaźni wodnej przez około 15 min.
    2. Zdezynfekuj kaptur do hodowli tkankowych 70% etanolem i w razie potrzeby umieść w nim szalki do hodowli tkankowych, pipety Pasteura i pipety serologiczne. Usuń PBS, DMEM i trypsynę z łaźni wodnej i zdezynfekuj 70% etanolem przed umieszczeniem w kapturze do hodowli tkankowej.
  2. Platerowanie i konserwacja komórek
    1. Hodować komórki Vero E6 w DMEM (zawierającym 10% FBS) w kolbach do hodowli tkankowych T75 lub 15 cm szalkach do hodowli tkankowych w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Przenikaj komórki w razie potrzeby, gdy komórki są zlewające się w 80-90%.
    2. Umyj komórki, dodając 10 ml 1x PBS do każdego naczynia i delikatnie kołysząc 4-5 razy; odessać PBS. Dodaj 3 ml trypsyny-EDTA do każdego naczynia, kołysz talerzem, aby upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez około 5 minut lub do momentu oderwania się komórek.
    3. Dodaj 7 ml DMEM (zawierającego 10% FBS), aby dezaktywować trypsynę i ponownie zawiesić komórki, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Odwiruj komórki, aby usunąć trypsynę za pomocą wirówki stołowej o sile 500 × g przez 5 minut, zasysaj pożywkę bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawieś komórki w 10 ml DMEM (zawierającym 10% FBS). Jeśli komórki są potrzebne do przyszłych eksperymentów, umieść 1 ml w nowym naczyniu zawierającym 15 ml świeżego DMEM (zawierającego 10% FBS).
    4. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i dodaj około 1 × 107 komórek do każdej 15 cm płytki i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do 100% zlewania się (1-2 dni).

2. Przygotowanie pseudowirusa VSV-S-EGFP

  1. Zakażać
    1. Zakażone komórki przy wielokrotności infekcji (MOI) 0,01 wirusem podstawowym VSV-S-eGFP w 12 ml DMEM bez surowicy przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z 5% CO2, od czasu do czasu kołysząc płytkami. Zastąp inokulum świeżym DMEM (zawierającym 2% FBS i 20 mM HEPES, pH 7,7) i przenieś do inkubatora ustawionego na 34 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Do namnażania VSV-S-eGFP w hodowli komórkowej wymagana jest temperatura 34 °C.
    2. Zebrać supernatanty komórkowe po zaobserwowaniu rozległego efektu cytopatycznego (CPE) i oderwania komórek, około 48 godzin po zakażeniu. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uwidocznić rozległą ekspresję eGFP przez zakażone komórki, począwszy od 24 godzin po zakażeniu.
  2. kolekcja
    1. Odwirować supernatanty za pomocą wirówki stołowej przez 5 minut w temperaturze 1 000 × g w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek. Podwielokrotnić supernatant, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Mianowanie pseudowirusa VSV-S-eGFP

  1. Seryjne rozcieńczanie w celu określenia miana wirusa
    1. Umieścić komórki Vero E6 na płytkach 6-dołkowych przy gęstości wysiewu 6 × 105 komórek na dołek w DMEM (z 10% FBS) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Można również użyć komórek Vero, które wykazują nadekspresję TMPRSS2 i hACE2.
    2. Ustawić 10-krotną serię seryjnych rozcieńczeń wirusa VSV-S-eGFP w DMEM bez zimnej surowicy, umieszczając 900 μl pożywki w siedmiu probówkach do mikrowirówek. Oznacz probówki od 1 do 7. Dodać 100 μl wywaru wirusowego do pierwszej probówki i krótko przetoczyć wirowanie. Przenieść 100 μl rozcieńczonego wirusa z probówki 1 do probówki 2 i krótko przeprowadzić; Kontynuuj do rurki 7.
    3. Odessać pożywkę ze wszystkich dołków płytki 6-dołkowej zawierającej komórki Vero E6 i zastąpić 500 μl rozcieńczeń 10-2 do 10-7. Inkubować płytki przez 45 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , delikatnie kołysząc co 15 minut.
    4. Odessać inokulum i zastąpić nakładką zawierającą mieszaninę 1:1 2x DMEM i 6% karboksymetylocelulozy (CMC), końcowe stężenie 3% CMC, uzupełnione 10% FBS; inkubować w temperaturze 34 °C z 5% CO2 przez 48 h.
      UWAGA: Wstępnie podgrzej mieszaninę nakładki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut na etapie infekcji. Zamiast CMC można zastosować mieszaninę 1:1% agarozy z 2x DMEM uzupełnioną 10% FBS. Aby nałożyć na agarozę, zagotuj 1% agarozy (w dH2O) i wymieszaj z zimnym 2x DMEM. Upewnij się, że mieszanina ma odpowiednią temperaturę przed dodaniem do monowarstwy ogniwa (około 37-40 °C). Jeżeli do nakładki stosuje się agarozę, komórki muszą być utrwalone przez inkubację w 2 ml kwasu metanolowego i octowego w proporcji 3:1 przez co najmniej godzinę przed barwieniem.
  2. Barwienie i obliczanie miana wirusa
    1. Wizualizacja blaszek miażdżycowych poprzez barwienie fioletem krystalicznym lub bezpośrednią wizualizację eGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    2. Aby zabarwić płytki, odessać nakładkę, przemyć raz PBS, a następnie dodać 2 ml 0,1% fioletu krystalicznego (w 80% metanolu idH2O) do każdego dołka. Umieść na kołysce talerzowej na około 20 minut w temperaturze pokojowej przed odbarwieniem. Usuń fiolet krystaliczny i delikatnie umyj każdą studzienkę dwukrotnie za pomocą dH2O lub PBS.
      UWAGA: Etapy mycia i barwienia należy wykonywać delikatnie, pipetując powoli w kierunku boku każdej studzienki, aby upewnić się, że monowarstwa komórek pozostaje nienaruszona przez cały czas trwania zabiegu.
    3. Pozostaw płytki do wyschnięcia na co najmniej 1 godzinę przed policzeniem tabliczek. Upewnij się, że liczba płytek nazębnych jest uzyskiwana ze studzienek zawierających od 20 do 200 płytek. Aby obliczyć miano wirusa w jednostkach tworzących blaszkę miażdżycową (PFU) na ml, należy pomnożyć współczynnik rozcieńczenia liczonej studzienki przez objętość infekcji i podzielić tę liczbę od blaszek znajdujących się w odpowiednim dołku.
      figure-protocol-1

4. Posiewanie komórek (Dzień 1) do pomiaru neutralizacji pseudowirusa SARS-CoV-2 przez komercyjnie dostępne przeciwciała i surowicę rekonwalescenta

  1. Przygotowanie do hodowli tkankowej
    1. Przygotować pożywkę i kaptur do hodowli tkankowych zgodnie z opisem w sekcji 1. Ponadto należy przygotować niezbędną liczbę 96 płytek dołkowych, aby pomieścić co najmniej 2 kontrpróby na próbkę (tj. 1 płytka na 6 próbek); Dodać dodatkowe powtórzenia, jeśli pozwala na to objętość próbki.
  2. Platerowanie i konserwacja komórek
    1. Hoduj i utrzymuj komórki Vero E6 zgodnie z opisem w sekcji 1. Przygotować co najmniej 10 ml zawiesiny komórek na 96-dołkową płytkę o stężeniu 2 × 105 komórek na ml (płytka 1,5 × 105 komórek na ml do testów wykonywanych po 48 godzinach, jeśli jest to konieczne). Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Dobrze wymieszaj zawiesinę komórkową i delikatnie kołysz każdą płytką we wszystkich kierunkach, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.

5. Rozcieńczenia przeciwciał lub surowicy a infekcje (Dzień 2)

UWAGA: Ten protokół może być stosowany do pomiaru neutralizacji VSV-S-eGFP zarówno przez komercyjnie dostępne przeciwciała i surowicę pacjenta, jak również surowicę pobraną od zwierząt do przedklinicznych badań nad szczepionką. *Zwróć uwagę na dodatkowe kroki wymienione podczas pracy z próbkami surowicy pacjenta/zwierzęcia.

  1. Seria rozcieńczeń seryjnych
    1. Przed rozcieńczeniem próbek surowicy należy inaktywować termicznie każdą próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C przez 30 minut w celu dezaktywacji dopełniacza. Upewnij się, że podjęto niezbędne środki ostrożności podczas obchodzenia się z próbkami pacjentów; Pojemniki na próbki należy otwierać wyłącznie w kapturze do hodowli tkankowych i upewnić się, że noszone są odpowiednie środki ochrony indywidualnej na poziomie hermetyczności 2.
    2. Ustawić serię rozcieńczeń na pustej płytce 96-dołkowej (płytka 1).
    3. Rozpocznij wszystkie rozcieńczenia w rzędzie A płytki 96-dołkowej w 80 μl. *W przypadku próbek pobranych od pacjenta serię rozcieńczeń należy rozpocząć w stosunku 1 do 10, umieszczając 8 μl surowicy w 72 μl DMEM bez surowicy (z 1% penicyliną/streptomycyną).
      UWAGA: Stężenie zastosowanego przeciwciała neutralizującego będzie zależało od aktywności przewidywanej przez producenta. W przypadku zastosowanego tutaj przeciwciała neutralizującego SARS-CoV-2 Spike (patrz tabela materiałów) zacznij od 5 μg/ml, aby zaobserwować co najmniej 50% neutralizację.
    4. Dodać 40 μl DMEM bez surowicy (z 1% penicyliną/streptomycyną) do rzędów od B do G i 80 μl do rzędu H. Nie dodawaj wirusa do wiersza H, ponieważ służy on jako kontrolka tylko dla komórek.
    5. Za pomocą 12-dołkowej pipety wielokanałowej wymieszać i przenieść 40 μl rozcieńczonej surowicy lub przeciwciała z rzędu A do rzędu B. Wymieszać i powtórzyć do rzędu F, wyrzucić 40 μl z rzędu F. Nie dodawaj surowicy do wiersza G, ponieważ reprezentuje on wiersz kontrolny zawierający tylko wirusa.
  2. Infekcja i nakładka
    1. Przygotować odpowiednią objętość rozcieńczonego VSV-S-eGFP do traktowania każdego dołka przy MOI 0,05 (lub 2000 pfu). (Wykonując te obliczenia, należy pamiętać, że tylko 60 μL z całkowitej objętości 80 μL zostanie przeniesione na komórki; dlatego należy pomnożyć objętość wirusa przez 1,33, aby utrzymać 2000 pfu).
      UWAGA: Ponieważ VSV-S-eGFP jest wrażliwy na temperaturę, upewnij się, że zapasy wirusów pozostają na lodzie, gdy nie są używane, i unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ miana będą się różnić po wielokrotnym zamrażaniu.
    2. Dodać 40 μl rozcieńczonego wirusa do każdej studzienki w rzędach od A do G płytki 1 i mieszać pipetując w górę i w dół 4-5 razy. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    3. Wyjąć płytkę zawierającą komórki z inkubatora (płytka 2) i ostrożnie zassać pożywkę ze wszystkich studzienek. Przenieść 60 μl mieszaniny przeciwciała/wirusa z płytki 1 na płytkę 2 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , kołysząc płytką co 20 minut.
    4. Uzupełnij każdą studzienkę 140 μl nakładki zawierającej CMC w DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie 3% CMC (z 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny). Umieścić płytkę 2 w inkubatorze nastawionym na 34 °C z 5% CO2 na około 24 godziny przed obrazowaniem.
      UWAGA: Wstępnie podgrzej mieszaninę nakładki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut na etapie infekcji.

6. Obrazowanie i kwantyfikacja (Dzień 3)

  1. Płyty pamięciowe z wykorzystaniem automatycznego urządzenia do obrazowania fluorescencyjnego (przy użyciu filtra izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) lub filtra alternatywnego o długości fali wzbudzenia 488 nm). Określ ilościowo infekcję wirusową, tworząc protokół, który automatycznie identyfikuje i zlicza poszczególne ogniska eGFP. Jeśli funkcja automatycznego liczenia nie jest dostępna, użyj oprogramowania ImageJ, aby określić ilościowo liczbę ognisk eGFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko białku SARS-CoV-2 S poprzez hamowanie infekcji pseudowirusem VSV-S-eGFP (mierzalne przez wykryte ogniska eGFP). Schematyczne przedstawienie protokołu jest przedstawione w Rysunek 1. Zaleca się, aby dostępne w handlu przeciwciało było stosowane jako kontrola pozytywna za każdym razem, gdy test jest przeprowadzany, w celu zapewnienia spójności testu. W tym miejscu pokazujemy krzywą rozcieńczani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda może być dostosowana do różnych środowisk laboratoryjnych i zasobów w zależności od potrzeb. Co ważne, głównym ograniczeniem tego protokołu jest konieczność posiadania przestrzeni herekcyjnej poziomu 2 i kaptura do hodowli tkankowych. Zastosowanie replikującego się wirusa RNA z pseudotypem kolca SARS-CoV-2, takiego jak VSV-S-eGFP, jest potężną alternatywą dla wirusa SARS-CoV-2, który wymaga obszaru roboczego na poziomie 3 izolacji, ale może pozostać ograniczeniem dla niektórych grup. Wszystkie inne k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych związanych z niniejszą publikacją.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować laboratorium Whelan za hojne dostarczenie wirusa VSV-S-eGFP użytego w tym protokole (opisanego w Case et al. 2020). Dziękujemy również doktorom Billowi Cameronowi i Juthaporn Cowan (i zespołowi) za pobranie próbek krwi pacjenta (identyfikator protokołu REB 20200371-01H). Autorzy ujawniają otrzymanie następującego wsparcia finansowego na badania, autorstwo i/lub publikację tego artykułu: Ta praca została sfinansowana dzięki hojnemu wsparciu Fundacji Szpitala w Ottawie oraz grantowi z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (#448323) i Fast Grant od fundacji Thistledown na rzecz nauki o COVID-19 dla C.S.I. T.R.J. jest finansowany ze stypendium dla absolwentów Ontario i stypendium Mitacs. JP jest finansowany przez stypendium klastra Mitacs. T.A. jest finansowany przez CIHR Banting Fellowship. Chcielibyśmy również podziękować wszystkim osobom, które wzięły udział i oddały swoje próbki krwi do tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
(Gibco)Fisher scientific10-013-CV
's medium (Powder) (Gibco)Thermo Fisher Scientific12-800-017
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
Kontrola izotypu IgG (mysz)Thermo Fisher Scientific31903
Penicylina/streptomycynaThermo Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Przeciwciało neutralizujące kolce, mysi MabSinoBiological40592-MM57
Ogniwa Vero E6ATCC  CRL-1586
ArrayScan VTI HCS Thermo Fisher Scientific Zautomatyzowany obrazownik fluorescencyjny karboksymetyloceluloza Sigma C5678 Zmodyfikowane podłoże Eagle's firmy Dulbecco Zmodyfikowany Orzeł firmy Dulbecco powiedział:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215(2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299(2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237(2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455(2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462(2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

SARS CoV 2 Neutralizing AntibodiesPseudovirus Neutralization AssayHigh Throughput ImagingFluorescent ImagingVero E6 CellsSpike Protein PseudovirusConvalescent SerumPlaque AssayCrystal Violet StainingAntibody Quantification

Powiązane artykuły