Średnioprzepustowy test przesiewowy leków i radioterapii z wykorzystaniem organoidów pochodzących od pacjenta

Podsumowanie

Opisujemy szczegółowe protokoły wykorzystania organoidów pochodzących od pacjentów do średnioprzepustowych badań przesiewowych wrażliwości terapii. Testowane terapie obejmują chemioterapię, radioterapię i chemioradioterapię. Poziomy trifosforanu adenozyny są używane jako odczyt funkcjonalny.

Streszczenie

Modele organoidów pochodzących od pacjentów (PDO) pozwalają na długoterminową ekspansję i utrzymanie pierwotnych komórek nabłonkowych hodowanych w trzech wymiarach i w stanie zbliżonym do natywnego. Organoidy pochodzące z wyciętej lub biopsji tkanki nowotworowej ściśle podsumowują morfologię guza in vivo i mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi na terapię in vitro. Biobanki organoidów nowotworowych odzwierciedlają ogromną różnorodność klinicznych nowotworów i pacjentów, a zatem są bardzo obiecujące dla zastosowań przedklinicznych i klinicznych. W pracy przedstawiono metodę średnioprzepustowych badań przesiewowych leków z wykorzystaniem organoidów raka płaskonabłonkowego głowy i szyi oraz gruczolakoraka jelita grubego. Podejście to można łatwo zastosować do dowolnego modelu organoidu pochodzącego z tkanki, zarówno normalnego, jak i chorego. Opisano metody ekspozycji in vitro organoidów na chemio- i radioterapię (zarówno jako metodę pojedynczego leczenia, jak i w skojarzeniu). Przeżycie komórek po 5 dniach ekspozycji na lek ocenia się, mierząc poziom adenozynotrifosforanu (ATP). Wrażliwość na lek mierzy się za pomocą wskaźników połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC₅₀), pola pod krzywą (AUC) i szybkości wzrostu (GR). Parametry te mogą dostarczyć informacji o tym, czy hodowla organoidów jest uważana za wrażliwą lub oporną na określone leczenie.

Wprowadzenie

Modele organoidów stworzone z dorosłych komórek macierzystych i hodowane w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz specyficznym koktajlu czynników wzrostu (znanych również jako organoidy HUB) zyskują na popularności jako przedkliniczne platformy badań onkologicznych. Hodowle organoidów pochodzących od pacjentów (PDO) można uzyskać zarówno z biopsji tkanek normalnych, jak i chorych w ciągu 1-2 tygodni i można je rozszerzać na co najmniej 1-2 miesiące do nieograniczonych przedziałów czasu. Kriokonserwacja pozwala na długotrwałe użytkowanie dobrze scharakteryzowanych kultur. W przeciwieństwie do tradycyjnych dwuwymiarowych modeli linii komórkowych, które są wyprowadzone klonalnie, modele PDO ściśle podsumowują oryginalną tkankę nowotworową, zarówno fenotypowo, jak i genetycznie, i zachowują heterogeniczność guza. Średnioprzepustowe badania przesiewowe leków na PDO, testujące szeroką gamę terapii, stanowią unikalną platformę dla medycyny spersonalizowanej.

Poprzednie badania opisywały wykorzystanie modeli organoidowych do badań przesiewowych terapii, w szczególności leków i radioterapii, w modelach tworzonych na podstawie różnych typów nowotworów i pokazują potencjał predykcyjny organoidów w podejmowaniu decyzji klinicznych^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. W artykule opisano metody badań przesiewowych terapii onkologicznej z wykorzystaniem PDO o średniej przepustowości (Rysunek 1A). Protokół ten jest skonfigurowany w formacie płytki 384-dołkowej z półautomatyzacją, co pozwala na testowanie terapii dla maksymalnie ośmiu modeli organoidów, 16 związków i do ośmiu płytek 384-dołkowych. Oprócz badań przesiewowych leków złożonych, w artykule opisano również metody oznaczania wrażliwości i uczulenia na radioterapię. Ponadto omówiono zastosowanie wysokoprzepustowej robotyki w celu przeskalowania badania przesiewowego leków do pełnej automatyzacji. Co ważne, organoidy z różnych tkanek mogą wymagać różnych pożywek i innego obchodzenia się z nimi.

Tutaj opisany jest ogólny protokół badania przesiewowego leków, który może wymagać adaptacji w zależności od interesującego organoidu. W dyskusji uwzględniono punkty wyjścia i sugestie dotyczące optymalizacji, a także ogólne zalecenia dotyczące konfiguracji eksperymentalnej i praktyki organoidowej. Przykłady podano przy użyciu organoidów raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC), które zazwyczaj mają gęstą morfologię, oraz organoidów raka jelita grubego (CRC), które mogą mieć morfologię torbielowatą lub gęstą. Należy pamiętać, że metody zakładania i hodowli ekspansywnej organoidów pierwotnych nie są objęte niniejszym protokołem; Aby zapoznać się z podstawowymi technikami organoidowymi, czytelnik powinien zapoznać się z innymi protokołami (np. ¹²). Ten protokół wizualny zapewni wgląd w proces średnioprzepustowych badań przesiewowych leków przy użyciu modeli organoidowych.

Protokół

UWAGA: Przed użyciem tego protokołu, proszę upewnić się, że przestrzegane są wytyczne komisji etycznej ds. badań na ludziach. Pobieranie tkanek pacjenta i danych opisanych w niniejszym protokole zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi EUREC oraz zgodnie z prawem europejskim, krajowym i lokalnym. Wszystkie organoidy pochodzą od pacjentów, którzy wyrazili na to zgodę, a zgoda może zostać wycofana w dowolnym momencie.

1. Przed seansem

1. Potwierdź tożsamość nowo utworzonych modeli (np. za pomocą histologii i/lub sekwencjonowania DNA^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}), aby wykluczyć możliwość normalnego przerostu komórek i upewnić się, że badanie przesiewowe leku jest wykonywane na kulturach organoidów nowotworowych (zobacz przykład w Rysunek 2D).
2. Zaprojektuj eksperymentalną konfigurację płyty, korzystając z ogólnych zaleceń podanych w sekcji dyskusji (patrz przykład na rysunku uzupełniającym S1).
3. Obliczyć wymaganą liczbę organoidów i przygotować wystarczającą ilość organoidów gotowych do podziału w dniu 0 (użyć tabeli 1 jako odniesienia).
   UWAGA: W zależności od GR typu i modelu organoidu, na każdą pełną 384-dołkową płytkę przesiewową wymagane są około 1-2 pełne płytki 6-dołkowe. Jako wskazówkę, jedna pełna studzienka na 6-dołkowej płytce zawiera ±20 000 organoidów torbielowatych lub do 50 000 gęstych/podobnych do winogron organoidów.
4. Sprawdź, czy dozownik komórek jest skalibrowany przy użyciu barwnika reporterowego i w razie potrzeby skalibruj zgodnie z protokołem producenta.

2. Przygotowanie odczynnika

1. Przygotuj podłoże podstawowe: zaawansowany DMEM/F12+++ (aDF+++). Dodaj po 5 ml 1x podstawień L-glutaminy (v / v), 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyny etanosulfonowej (HEPES) i 100 U / ml penicyliny / streptomycyny do 500 ml butelki zaawansowanego DMEM / F12. Przechowywać aDF+++ w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
2. Przygotuj odpowiednią pożywkę do ekspandowania organoidów (tj. wzrostu) dla typu używanego organoidu^9,10.
3. Przygotuj pożywkę przesiewową, która może różnić się od pożywki ekspansywnej w zależności od konfiguracji eksperymentalnej. Aby wspomóc regenerację po dozowaniu organoidów, dodaj 5 μM inhibitora kinazy Rho (ROCK) (Y-27632) do podłoża przesiewowego.
4. Przygotować 100 mg/ml roztwór dypazy II w aDF+++.
   UWAGA: 100-krotny roztwór dypazy jest stabilny w temperaturze -20 °C przez 2 miesiące.

3. Dzień 0: Przygotowanie organoidów

UWAGA: Objętości wskazane poniżej zaczynają się od pełnej, dobrze wyrośniętej 6-dołkowej płytki organoidów, co odpowiada 1200 μL organoidów/ECM (200 μL organoidów/ECM na studzienkę).

1. Sprawdź organoidy za pomocą mikroskopu jasnego pola pod kątem możliwej infekcji, gęstości i ogólnego wyglądu; zrób zdjęcia wszystkich modeli w celach informacyjnych przed pasażem.
2. Przejść przez organoidy i nasiona zgodnie z poniższymi krokami. Wykonaj te czynności w temperaturze pokojowej, aby zmniejszyć wahania temperatury organoidów. Za każdym razem, gdy masz do czynienia z zawiesinami organoidów, używaj końcówek o niskiej retencji lub wstępnie zwilżonych pipet i tworzyw sztucznych, aby zapobiec utracie organoidów.
   1. W przypadku stosowania większych objętości ECM/organoidów (>1200 μL ECM) należy rozważyć roztwarzanie ECM z dyspazą w następujący sposób, aby ułatwić usuwanie organoidów z ECM.
      UWAGA: Rozpad powoduje rozpad ECM, ale nie wpływa na organoidy. >
      1. Opcjonalnie: Dodać 1 mg/ml dypazy do każdego dołka i inkubować organoidy w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut przed pasażowaniem jak zwykle.
         UWAGA: Ponieważ dypaza nie jest inaktywowana przez składniki pożywki, należy ją zmyć (za pomocą aDF+++) dodając co najmniej 20-krotność objętości dypazy.
   2. Zebrać organoidy do trzech probówek o pojemności 15 ml (do 400 μl ECM na probówkę). Uzupełnić do 12 ml roztworem aDF+++ i odwirować przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy 85 × g. Jeśli supernatant jest prawidłowo granulowany, należy go zassać. Jeśli organoidy nie są wyraźnie granulowane, należy odwirować z większą prędkością (do 450 × g; w zależności od rodzaju i wielkości organoidu) przez dodatkowe 5 minut. Ponownie zawiesić granulkę i powtórzyć pranie.
      UWAGA: Warstwa przypominająca szkło nad osadem wskazuje na obecność ECM. Sprawdzić, czy żadne organoidy nie są uwięzione w ECM za pomocą mikroskopu jasnego pola (dopuszczalna może być mała liczba uwięzionych organoidów) i ostrożnie usunąć pozostały ECM za pomocą pipety p1000. Jeżeli w ECM znajduje się (zbyt) wiele organoidów, należy powtórzyć etap dysocjacji dypazy lub umyć osad i odwirować z większą prędkością (maksymalnie 450 × g).
   3. Na każdą probówkę o pojemności 15 ml należy ponownie zawiesić osad organoidowy w 1 ml aDF+++ i ostrożnie oddzielić organoidy, aż osiągną odpowiedni rozmiar. Należy zastosować metodę dysocjacji, która jest stosowana do regularnego podziału, w zależności od typu/morfologii (Tabela 1).
      1. W przypadku organoidów torbielowatych i winogronopodobnych, należy je mechanicznie rozbić, ścinając na małe fragmenty (<100 μm) poprzez pipetowanie w górę i w dół za pomocą p1000 z końcówką p2 na górze lub za pomocą wstępnie zwilżonej pipety Pasteura zatkanej szkłem, której końcówka została zwężona w płomieniu.
         UWAGA: Potwierdź rozerwanie organoidów za pomocą mikroskopu jasnego pola po pipetowaniu w górę i w dół co 5 razy, dążąc do tego, aby organoidy były mniejsze lub mieściły się w zakresie wielkości ekranu (Tabela 1).
      2. W przypadku gęstych organoidów dodać 1 ml 50% v/v roztworu TrypLE w aDF+++ w celu ponownego zawieszenia osadu komórkowego i inkubować przez co najmniej 2 minuty w temperaturze 37 °C. Następnie energicznie potrząśnij rurką w górę iw dół i sprawdź pod mikroskopem jasnego pola. Stosując to samo podejście, co powyżej, mechanicznie rozbij organoidy za pomocą pipety, stale sprawdzając pod mikroskopem przez cały proces. W przypadku organoidów HNSCC inkubować w 100% roztworze TrypLE przez 5 min.
         UWAGA: W zależności od rodzaju hodowli, należy dążyć do uzyskania małych grup komórek (np. organoidów CRC, >20 μm) lub pojedynczych komórek (np. Organoidy HNSCC). Upewnij się, że inkubacja proteolityczna nie przekracza 15 minut, ponieważ może to wpłynąć na żywotność organoidów.
   4. Umyj organoidy 10 ml aDF+++. Obracać organoidy z masą 85 × g przez 5 minut; Odessać supernatant, jeśli jest prawidłowo granulowany. Alternatywnie, jeśli organoidy są trudne do granulowania, odwirować do 450 × g przez 5 minut.
   5. Organoidy nasienne o dużej gęstości w pożywce 50% ekspandacyjnej/50% ECM (umożliwiające łatwe usunięcie z ECM w sekcji 4). Dąż do przybliżonej podwójnej gęstości w porównaniu ze zwykłym podziałem, co często prowadzi do podziału 1:1 (zobacz przykłady w Rysunek 1). Organoidy nasienne w 10 μl kropelkach (łącznie 200 μl na studzienkę) wstępnie podgrzanej 6-dołkowej płytki.
      UWAGA: Wstępnie ogrzane płytki należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc lub w piekarniku o temperaturze 60 °C przez co najmniej 1 godzinę, aby zapewnić szybkie zestalenie ECM, zapobiegając rozprzestrzenianiu się ECM, a tym samym zapewniając prawidłowe tworzenie kopuły półkuli.
   6. Odwrócić płytkę i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut, aby umożliwić ustawienie ECM. Po 30-60 minutach delikatnie dodaj pożywkę rozprężną (o temperaturze pokojowej) do studzienek.

4. Dzień 2 (zakres: dni 1 - 3): Dozowanie organoidów

UWAGA: W zależności od GR organoidu, może to również wystąpić w dniu 1 lub 3. Przez cały okres badania przesiewowego leku organoidy są utrzymywane w zawiesinie. W tym celu dozuje się je w niskim stężeniu ECM (5-10%), przy którym utrzymuje się wzrost organoidów, ale nie dochodzi do krzepnięcia ECM. Pozwala to na zautomatyzowane dozowanie, optymalną interakcję organoid-związek i powtarzalną lizę komórek, ale także ogranicza możliwość zmiany pożywki.

1. Obliczyć stężenie i ilość zawiesiny organoidów wymaganej do badania przesiewowego leku.
   1. W zależności od używanego dozownika komórek, podczas obliczeń należy wziąć pod uwagę objętość martwą.
      UWAGA: Przy dozowaniu 40 μl zawiesiny organoidowej na studzienkę, jedna płytka 384 wymaga całkowitej objętości 15,4 ml. Średnio każda rurka dozująca Multidrop ma martwą objętość ~1 ml, co daje 8 ml martwej objętości przy użyciu wszystkich dysz. Daje to w sumie 23,4 ml dla każdego modelu organoidu na całą płytkę 384-dołkową. Przygotowanie 25 ml zawiesiny organoidowej zapewnia zatem wystarczającą ilość organoidów do dozowania oraz opcjonalną analizę kontrolną (polimorfizm pojedynczego nukleotydu, SNP) (patrz 4.4.7).
2. Przygotowanie do pobrania organoidów
   1. Aby przygotować bufor do przemywania należy dodać inhibitor ROCK (Y-27632) do aDF+++ do końcowego stężenia 10 μM. (±100 ml jest wymagane dla każdej hodowli organoidów, która będzie badana przesiewowo).
   2. Zbadaj organoidy we wszystkich studzienkach za pomocą mikroskopu jasnego pola, aby ocenić regenerację organoidów po pasażowaniu i wykluczyć potencjalne infekcje. Sprawdzić, czy organoidy mają odpowiednią wielkość, wykonując obraz mikroskopowy i mierząc organoidy za pomocą cyfrowej skali (Tabela 1).
      UWAGA: Jeśli organoidy nie mają odpowiedniej wielkości (są zbyt duże lub zbyt małe), zostaną utracone w procesie filtrowania i może nie być wystarczającej ilości materiału do przeprowadzenia badania przesiewowego leku. W takim przypadku zaleca się odroczenie badania przesiewowego na obecność narkotyków.
   3. Dodać 1 mg/ml dypazy do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 30-60 minut (maksymalnie do 120 minut) w celu roztrawienia ECM. Sprawdź postęp dysocjacji ECM pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy krople ECM unoszą się. Jeśli nie, odpipetować zawartość studzienki na kropelki ECM, które powinny łatwo zejść po zakończeniu trawienia.
3. Przygotować organoidy do dozowania na płytkę 384-dołkową zgodnie z poniższymi krokami. Wykonaj te czynności w temperaturze pokojowej (w tym wirowanie), aby zmniejszyć wahania temperatury organoidów.
   1. Pobrać zawiesinę organoidów z płytki hodowlanej za pomocą pipety p1000.
   2. W zależności od wymaganych kroków filtrowania (w zależności od typu organoidu, patrz Tabela 1), postępuj zgodnie z odpowiednim krokiem.
      UWAGA: Filtry wstępne zwilżające z buforem płuczącym są niezbędne, aby zapobiec przywieraniu organoidów do filtra.
      1. Przeprowadzić pojedynczą filtrację, gdy obejmuje ona wszystkie małe fragmenty i pojedyncze komórki, np. w przypadku organoidów nowotworowych HNSCC, filtr dla organoidów < 70 μm. Zebrane organoidy należy zebrać w probówce o pojemności 15 ml i przemyć je dwukrotnie 12 ml buforu do przemywania wodą. Przefiltrować organoidy przez wstępnie zwilżony filtr 70 μm do probówki o pojemności 50 ml, umyć filtr 3 x 4 ml aDF+++ i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml. Jeśli objętość jest zbyt duża, wirować z prędkością 85 × g przez 5 minut i przenieść osad w 12 ml aDF+++ do probówki o pojemności 15 ml; Przejdź do punktu 4.3.3.
      2. Przeprowadzić podwójną filtrację w celu usunięcia zanieczyszczeń i dużych organoidów, np. w przypadku organoidów nowotworowych CRC, odfiltrować organoidy >100 μm i <20 μm. Zebrane organoidy należy natychmiast przefiltrować przez wstępnie zwilżony filtr 100/70/40 μm (tabela 1) do probówki o pojemności 50 ml i przemyć filtr 2 x 10 ml buforu do przemywania wodą. Użyj jednego wstępnie zwilżonego filtra 20 μm na trzy dołki z 6-dołkowej płytki organoidów. Przefiltrować organoidy <100 μm na filtrach 20 μm i przemyć filtr 2 x 10 ml buforu do płukania. Odzyskaj organoidy z filtra, odwracając go na wierzchu czystej probówki o pojemności 50 ml i przemłukując 3 x 4 ml aDF+++. Przenieść zawiesinę organoidu do probówki o pojemności 15 ml; jeśli objętość wynosi >15 ml (ponieważ może być wymagane dalsze mycie filtra), wirować z prędkością 85 × g przez 5 minut i przenieść osad w 12 ml aDF+++ do probówki o pojemności 15 ml.
         UWAGA: Organoidy, które zostaną uwięzione w filtrze, można odzyskać do późniejszego wykorzystania (pasażowanie); W kolejnym kroku stosuje się organoidy < 100 μm. Komórki i zanieczyszczenia, które przeszły przez filtr, zostaną odrzucone, organoidy złapane w filtrze (>20 μm, <100 μm) są używane do badań przesiewowych.
   3. Wirować przy 450 × g przez 3 minuty i ostrożnie zassać supernatant. Ponownie zawiesić osad ostrożnie w 1 ml pożywki przesiewającej, uzupełnić kolejną pożywką o pojemności 1-9 ml (w zależności od wielkości osadu; dążyć do uzyskania ~75-150 organoidów/10 μl) i ponownie zawiesić, pipetując w górę iw dół za pomocą wstępnie zwilżonej pipety serologicznej.
      UWAGA: Zaleca się dodanie 5 μM inhibitora ROCK do podłoża przesiewowego.
   4. Dokładnie wymieszać zawiesinę organoidów, pipetując w górę i w dół za pomocą wstępnie zwilżonej pipety serologicznej 5x, a następnie policzyć liczbę organoidów w 10 μl zawiesiny, pipetując linię na szalce Petriego i licząc je pod mikroskopem. W przypadku mniejszych organoidów (<70 μm) dodać 10 μl zawiesiny organoidów do 10-komorowego szkiełka z siatką hemocytometru i policzyć liczbę organoidów. Obliczyć liczbę organoidów/ml zgodnie z instrukcjami producenta.
   5. Przygotuj wymaganą ilość pożywki dozującej, dodając 5% (v/v) ECM do lodowatego podłoża przesiewającego (np. na 25 ml pożywki dozującej dodaj 1,25 ml ECM do 23,75 ml lodowatej pożywki przesiewowej). Dodawaj ECM tylko do lodowatego podłoża, aby zapobiec zestaleniu się ECM. W przypadku badań przesiewowych wielu modeli organoidów należy przygotować pożywkę dozującą luzem, aby zapewnić spójność % ECM we wszystkich modelach.
   6. Dodać wymaganą liczbę organoidów (patrz Tabela 1 w celu uzyskania wytycznych i omówienia w celu zapoznania się z uwagami) do nowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 450 × g przez 3 minuty. Odessać ostrożnie, nie naruszając osadu, i dokładnie zawiesić osad ponownie w 100 μl pożywki sitowej za pomocą pipety p200. Upewnij się, że osad jest jednorodny i całkowicie zawieszony, bez żadnych grudek organoidów. Następnie uzupełnić zawiesinę wymaganą ilością lodowatego medium dozującego i odtąd utrzymywać zawiesinę organoidową na lodzie.
4. Dozować organoidy do 384-dołkowych płytek za pomocą dozownika komórek (np. Multidrop).
   1. Ustaw dozownik komórek tak, aby dozował 40 μl zawiesiny komórek na studzienkę.
      1. Menu główne | wybierz typ płyty | Zgadzam się | 384 standardowy | Ok
      2. Kaseta standardowa kaseta z rurką (prawa strona) | wybierz objętość za pomocą strzałek w górę i w dół (40 μL).
      3. Wybierz opcję Pełna blacha lub Słupy, w zależności od układu blachy.
   2. Umyj rurkę 70% etanolem (EtOH), a następnie sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS); użyj >15 ml na pranie. Wpuść trochę powietrza między każdy płyn, aby uwidocznić początek i koniec każdego prania. Sprawdź, czy wszystkie głowice dozujące dozują "prosto" i umyj ponownie, jeśli tak nie jest.
   3. W menu Ustawienia wybierz dozowanie wstępne i ustaw na 60 μl, aby wstępnie dozować zawiesinę organoidową po przygotowaniu i przed dozowaniem.
   4. Zalać dozownik zawiesiną organoidową, trzymając zawiesinę na lodzie. Zawiesić przez ciągłe pipetowanie pipetą p1000. Należy uważać, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w roztworze. Po zalaniu i umieszczeniu płytki na swoim miejscu, dozować organoidy, naciskając Start.
      UWAGA: Ten krok jest łatwiejszy do wykonania w przypadku dwóch osób: jedna osoba ponownie zawiesza, a druga obsługuje dozownik.
   5. W razie potrzeby, dla każdego modelu organoidu zawartego w sicie, należy dozować co najmniej 5 dodatkowych studzienek na dodatkowej płytce przesiewającej.
      UWAGA: Pozwoli to na odczyt T=0 później tego dnia (patrz sekcja 7 i dyskusja). W razie potrzeby dozowanie można również wykonać ręcznie.
   6. Natychmiast załóż pokrywkę na płytę, aby uniknąć zanieczyszczenia studzienek. Upewnij się pod mikroskopem, że wszystkie studzienki zostały prawidłowo wypełnione i czy organoidy są równomiernie rozmieszczone na całej płytce.
   7. W razie potrzeby, po zakończeniu posiewu, wyjmij zawiesinę organoidów z rurki (kliknij Opróżnij) i odkręć pozostałe organoidy w dół. Przenieś do probówki o pojemności 1,5 ml i zamroź błyskawicznie w celu późniejszej analizy SNP.
      UWAGA: Jeśli powietrze dostało się do rurki podczas dozowania, a niektóre studzienki nie zostały prawidłowo napełnione, napełnij studzienki ręcznie, dodając 40 μl na studzienkę.
   8. Jeśli dozowanych jest wiele modeli organoidów, przepłucz rurki PBS, EtOH i PBS i powtórz kroki 4.4.4-4.4.8 dla każdego modelu.
   9. Przenieść płytki do atmosfery 5% CO₂ w inkubatorze o temperaturze 37 °C do momentu, gdy będą gotowe do dozowania leku. Aby wyeliminować różnice w wymianie powietrza między różnymi płytkami, należy unikać układania płytek w inkubatorze.
   10. Wyczyść rurkę tak szybko, jak to możliwe, za pomocą PBS, a następnie EtOH. Upewnij się, że całkowicie wysuszyłeś rurkę, przepuszczając powietrze przez system.

5. Dzień 2 (zakres: dni 1 - 3): Dozowanie leków za pomocą dozownika leków (np. D300e)

UWAGA: . W zależności od pytania badawczego, drukowanie leków można również wykonać jeden dzień po wysiewie.

1. Konfiguracja dozownika leków
   1. Uruchom oprogramowanie dozownika i wybierz żądany format płyty używany na ekranie, podświetlając Płytę 1 i wybierając narzędzie ołówka, aby wyświetlić edytor płyt
   .
   2. Wybierz rodzaj płytki i ustaw dodatkową objętość każdej studzienki (objętość płynu (zawiesiny organoidowej) już na płytce). W przypadku formatu 384-dołkowego należy użyć 40 μl/basenik.
   3. Na pasku po lewej stronie użyj symbolu +, aby dodać każdy roztwór leku, który zostanie użyty na ekranie.
   4. Edytuj każdy płyn, wybierając narzędzie ołówka. Edytuj nazwę leku, klasę leku (np. na bazie DMSO lub wodny (np. woda, PBS)) oraz stężenie podstawowe leku.
      UWAGA: Nie należy przekraczać 10 mM stężenia podstawowego każdego leku. Idealnie, maksymalne stężenie rozpuszczalnika powinno wynosić 0,8% dla DMSO i 3% dla PBS/0,3% detergentu (np. Tween) (patrz normalizacja poniżej i dyskusja).
   5. Gdy wszystkie leki zostaną dodane do programu, wybierz studzienki do dodania leków, podświetlając studzienkę na układzie płytki i przeciągając ją w poprzek. Kliknij prawym przyciskiem myszy wybrane studzienki i dodaj stężenie.
      1. Ustaw wartość, aby określić żądane stężenie każdego leku (μM).
      2. W przypadku miareczkowania należy zdefiniować żądane najwyższe i najniższe stężenie każdego leku (μM), rozkład (logarytmiczny lub liniowy), powtórzenia na poziom (np. 3) oraz wzorzec miareczkowania.
      3. W przypadku miareczkowania celowanego należy zdefiniować najwyższe i najniższe stężenie każdego leku, rozkład (logarytmiczny lub liniowy), stężenie docelowe (μM), region docelowy (poziomy), zakres docelowy (log), powtórzenia na poziomie (np. 3) oraz wzorzec miareczkowania.
   6. Znormalizować wszystkie studzienki z lekiem do odpowiedniego rozpuszczalnika (np. DMSO lub wodnego + Tween-20). W przypadku leków rozpuszczonych w roztworach wodnych należy dodać Tween-20 (końcowe stężenie 0,3% w leczynce), aby zapewnić odpowiednie napięcie powierzchniowe roztworu leku do dozowania przy użyciu D300e (patrz 5.2.6). Zaznacz wszystkie studnie, w tym te bez leku (kontrola negatywna), kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz Normalizacja, a następnie Normalizuj. Wybierz odpowiedni rozpuszczalnik i wybierz opcję Normalizuj do najwyższej objętości, aby znormalizować do najwyższego stężenia wybranego leku.
      UWAGA: Czarne trójkąty pojawiają się teraz w lewym dolnym rogu każdej studzienki, aby potwierdzić normalizację. Należy dążyć do posiadania co najmniej 6 (najlepiej >9) studzienek kontroli ujemnej dla każdego użytego rozpuszczalnika narkotykowego.
   7. Należy wybrać co najmniej 3 dołki (najlepiej >6), aby użyć znanych odczynników cytotoksycznych, takich jak staurosporyna, jako kontroli dodatnich (1-5 μM) w zależności od kultur. Jeżeli stężenie cytotoksyczne kontroli dodatniej jest nieznane, należy zdecydować się na wysokie stężenie, aby zabić wszystkie organoidy w studzienkach kontroli pozytywnej.
      UWAGA: Alternatywnie, Navitoclax (20 μM) może być stosowany w celu zapewnienia obumarcia organoidów podczas badania przesiewowego leku.
   8. Po zakończeniu układania płyt wybierz opcję Uruchom (jeśli maszyna jest włączona) w lewym górnym rogu. Zapisz protokół, aby kontynuować.
      UWAGA: Program obliczył teraz wymaganą objętość każdego leku do dozowania. Ponieważ obejmuje to błąd pipetowania, jest to dokładna ilość leku potrzebna do wypełnienia całego protokołu. Opcjonalnie: Wybranie opcji Symuluj spowoduje symulację całego protokołu (bez dodawania leków) w celu obserwowania, jak protokół będzie działał. Zarówno w trybie uruchamiania, jak i symulacji generowany jest raport, który będzie dokumentował czas, kolejność i ilości leków dodanych do każdego dołka. Może to być przydatne, aby upewnić się, że protokół jest poprawny oraz określić dokładną objętość i liczbę kaset, które będą wymagane przed przystąpieniem do eksperymentu.
2. Przygotowywanie i drukowanie leków
   1. Dodać 0,3% (v/v) Tween-20 do wodnych (np. wody lub PBS) zapasów leków, aby zapewnić odpowiednie napięcie powierzchniowe roztworu leku do dozowania za pomocą D300e. Upewnij się, że stężenie Tween-20 nie przekracza 3% PBS/0.3% Tween-20 (v/v) i utrzymuj końcowe stężenie Tween-20 poniżej 0.01%.
      UWAGA: Tween-20 należy dodawać do zapasów leków tylko tuż przed dodaniem go do kasety z drukarką leków, ponieważ wysokie stężenie Tween-20 w zapasie potencjalnie dezaktywuje leki (na bazie białka) (np. leki na bazie przeciwciał). Ten etap nie jest wymagany w przypadku leków rozpuszczonych w DMSO; należy jednak upewnić się, że ostateczny procent DMSO w każdym dołku nie przekracza 0,8-1%.
   2. Przygotuj kasety D8+ o małej objętości i D4+ o dużej objętości. Zaznacz opcję Użyj kaset o dużej objętości w programie w przypadku korzystania z dużych ilości płynu normalizacyjnego.
   3. Uruchom protokół, aby rozpocząć wydawanie leków.
      UWAGA: Program uruchomi protokół krok po kroku i wskaże, kiedy i ile każdego związku należy dodać. Używaj końcówek filtrujących do pracy z wysokimi stężeniami leków. Zachowaj ostrożność, aby pozbyć się odpadów chemicznych i zużytych wskazówek zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
   4. Po zakończeniu protokołu należy użyć samoprzylepnych uszczelek przepuszczających powietrze i ciecz (np. poliuretanowe uszczelki płytowe klasy medycznej; Tabela materiałów) przykryć płytki i przywrócić je do temperatury 37 °C, 5% CO₂,
      UWAGA: Stosowanie tych uszczelek zapobiega parowaniu "efektu krawędzi" (patrz dyskusja). Jeśli uszczelki nie są używane, należy upewnić się, że zewnętrzne krawędzie płytki nie są używane w siatce leku. Nie układaj płytek jedna na drugiej i upewnij się, że płytki są trzymane z tyłu inkubatora lub używaj inkubatora, który nie jest otwierany (często), aby uniknąć wahań temperatury.
   5. Jeśli radioterapia jest połączona z lekami drukowanymi, przejdź do punktu 6. Jeśli nie, pozostaw płytki w inkubatorze na 5 dni.
      UWAGA: W zależności od rodzaju organoidu i rodzaju leku, niektóre eksperymenty mogą trwać dłużej niż 5 dni. W przypadku eksperymentów trwających >7 dni należy ostrożnie zmienić pożywkę i związki w połowie procedury eksperymentalnej (np. poprzez zastąpienie 50% pożywki świeżą pożywką przesiewową), aby uniknąć rozległej śmierci komórek w studzienkach kontroli ujemnej.

6. Dzień 2 (zakres: dni 2 - 4): Leczenie organoidów za pomocą promieniowania wiązką fotonów

UWAGA: Poniższe kroki opisują napromienianie organoidów. Aby ocenić radiouczulające działanie związków leczniczych, napromienianie wykonuje się 24 godziny po wystawieniu organoidów na chemioterapię. Ten sam protokół stosuje się do oceny skutków samego napromieniania, w którym organoidy są wysiewane i napromieniane 24 godziny po wysianiu. Może to wymagać pewnej optymalizacji w zależności od hipotezy i kultur organoidów. Poniższe kroki opisują proces stosowany do napromieniania organoidów przy użyciu specjalnie wygenerowanych wiązek fotonów 6 MV (tabela materiałów). Ta maszyna jest zoptymalizowana pod kątem zastosowań klinicznych, a zatem odzwierciedla rzeczywistą praktykę kliniczną. Różne maszyny mogą wymagać innej konfiguracji, a także mogą wymagać optymalizacji dozowania, ponieważ wydajna dawka może różnić się od wybranej.

1. Wyjąć płytki z inkubatora w temperaturze 37 °C i założyć pokrywki na każdą płytkę znajdującą się na wierzchu uszczelek; nie usuwać uszczelek. Weź ze sobą płytkę 0 Gy w tym procesie, aby upewnić się, że płytka kontrolna została poddana identycznym warunkom.
2. Transportować organoidy do promiennika. Ustaw urządzenie do napromieniania, napełniając plastikowe pudełko letnią wodą z kranu i zamocuj w uchwycie płytki, aby zapobiec unoszeniu się płytki.
3. Zanurz płytkę w wodzie tak, aby woda znajdowała się na poziomie górnej powierzchni talerza. Zamocuj płytkę na miejscu za pomocą urządzenia, które nie pozwala na unoszenie się płytki (jak pokazano na filmie). Opuścić pomieszczenie i napromienić płytki w coraz większych dawkach (np. 1, 2, 4, 6, 8 i 10 Gy). Naświetlać tylko jedną płytkę na raz, ponieważ stos płytek nie pozwala na równomierne rozproszenie promieniowania.
   UWAGA: Upewnij się, że odpowiednie dawki napromieniania zostały dobrane w celu uzyskania krzywej dawka-odpowiedź.
4. Po napromienieniu chusteczkami dokładnie osuszyć płytki i założyć twardą pokrywkę. Przetransportuj płytki z powrotem do pomieszczenia hodowlanego. Zdejmij twardą pokrywę i wytrzyj zewnętrzną część każdej płytki lekko spryskanymi chusteczkami EtOH. Nie usuwaj oddychających uszczelek.
5. Umieść płytki z tyłu inkubatora, aby uniknąć wahań temperatury spowodowanych otwieraniem drzwi; nie układaj płytek jeden na drugim.

7. Dzień 2. Opcjonalnie: Płytka pomiarowa CellTiter-Glo 3D do badania żywotności komórek (CTG) T=0 (wymagana do analizy GR)

1. Jeśli chcesz obliczyć wskaźniki GR (patrz 11.3.5 i dyskusja), zmierz wartości CTG na tabliczce T=0, wykonując kroki 9.1-10.4.

8. Dzień przed badaniem przesiewowym na obecność narkotyków odczyt: przygotowanie

1. Oblicz całkowitą wymaganą objętość KTG. W przypadku płytki 384-dołkowej należy użyć 40 μl KTG na dołek (dodać KTG 1:1 zgodnie z zaleceniem producenta). Należy wziąć pod uwagę objętość martwą do dozowania wielokroplowego (1 ml na probówkę). Rozmrażanie CTG przez noc w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
2. Sprawdź, czy dozownik wymaga kalibracji.

9. Dzień 7 (zakres: dni 7 - 14): Odczyt przesiewowy na obecność narkotyków: Test KTG

1. Pozwól, aby KTG osiągnęło temperaturę pokojową. Przed odczytem należy sprawdzić wzrokowo wszystkie studzienki płytki 384-dołkowej, odnotować, czy wystąpiły jakiekolwiek infekcje.
2. Zobrazuj odpowiednie studzienki pod mikroskopem jasnego pola. Uwzględnij kontrole pozytywne (staurosporyna), kontrole ujemne (studzienki normalizacyjne) i najwyższe stężenie każdego leku.
3. Umyj i zalej maszynę wielokroplową zgodnie z krokami opisanymi w rozdziale 4.4. Dozuj 40 μl KTG do każdej studzienki, zgodnie z ustawieniem płytki. Wstrząsać za pomocą wytrząsarki płytkowej dozownika wielokroplowego (wstrząsać) przez 5 minut i inkubować w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez 25 min.
   UWAGA: Reakcja KTG jest reakcją enzymatyczną, a zatem ma na nią wpływ temperatura i czas inkubacji. Sygnał jest podobno stabilny przez 30-60 minut; jednak użycie tego samego czasu inkubacji dla wszystkich płytek, zwłaszcza przy obliczaniu wskaźników GR, zwiększa dokładność.

10. Pomiary bioluminescencji KTG

1. Włącz czytnik płytek bioluminescencyjnych o pojemności 384 dołków i komputer. W tym przypadku zastosowano czytnik płytek Spark.
2. Otwórz oprogramowanie edytora metod Spark (patrz tabela materiałów). Wybierz format płyty: COS384fb-Corning 384 flat black | bez pokrywy | bez kasety z wilgocią; Wybierz studzienki, które mają zostać zmierzone.
3. W menu w lewym dolnym rogu wybierz Wykrywanie | Luminescencja i przeciągnij pod płytą. Typ: tłumienie, drugie menu: brak. Ustaw czas integracji [ms]: 500.
4. Umieść tabliczkę, wybierz ją i uruchom metodę, klikając Start. Zapisz wyeksportowany arkusz kalkulacyjny.

11. Analiza danych

1. Oblicz współczynnik Z (Z'), aby ocenić jakość ekranu.
   1. Oblicz średnią (Av) i odchylenia standardowe (SD) zarówno ujemnych (Ctrl^neg, np. DMSO), jak i dodatnich (Ctrl^pos, np. Staurosporine) kontroli.
   2. Oblicz współczynnik Z = 1 - (3 × SD[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl^pos]/średnia[Ctrl^neg] -średnia[Ctrl^pos]).
      UWAGA: Z' wyraża zmienność w obrębie kontroli dodatniej i ujemnej oraz przestrzeń ratiometryczną, a zatem jest miarą zakresu dynamicznego testu¹³. Wyklucz wyniki badań przesiewowych narkotyków z Z' niższym niż 0,3; Zaleca się używanie danych o wartości Z' > 0,5. Średnia wartość Z' na ogół waha się od 0,5 do 0,7 (w zależności od zastosowanych modeli organoidów). Aby Z' miało charakter informacyjny, wszystkie organoidy w studzienkach kontroli pozytywnej powinny były umrzeć.
2. Oblicz względną żywotność organoidów dla każdej studzienki, ustawiając Ctrl^neg na 100% i Ctrl^pos na 0% żywotności.
   1. Użyj tego wzoru, aby obliczyć żywotność organoidów.
      Żywotność organoidów = 100% × (wartość dołka eksperymentalnego - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. Dla napromieniowanych organoidów należy obliczyć wartość procentową.
         Procentowa żywotność organoidów = 100% × (wartość dołka doświadczalnego x GY) / (Av Ctrl^{wartość dołka neg} 0 GY)
   2. Wizualizacja danych w oprogramowaniu do analizy danych poprzez skopiowanie danych dotyczących żywotności do tabeli xy, wybór odpowiedniej liczby powtórzeń na stężenie.
   3. W przypadku logarytmicznych stężeń leków przekształć stężenia leków i skopiować te wartości do pierwszej kolumny tabeli.
   4. Aby sformatować wykres, wybierz typ wykresu (XY), wybierz błąd standardowy średniej (SEM) i ustaw początek układu współrzędnych w lewym dolnym rogu.
3. Określ względne IC₅₀, pole pod krzywą (AUC) i metryki GR.
   1. W przypadku regresji nieliniowej na karcie Analiza wybierz opcję Dopasuj krzywą z regresją nieliniową. Wybierz opcję log (inhibitor) vs. znormalizowana odpowiedź - zmienne nachylenie, aby utworzyć krzywą zabijania.
   2. Kliknij na zakładkę Wyniki, aby wyświetlić względną IC₅₀ dla każdego leku.
      UWAGA: Jest to stężenie leku, które daje odpowiedź w połowie drogi między dolną a górną krawędzią krzywej. Dół i góra to płaskowyże w jednostkach osi y.
   3. W polu Obszar pod krzywą (AUC) na karcie Analiza wybierz opcję Obszar pod krzywą, użyj wstępnie zdefiniowanych ustawień i wybierz przycisk OK.
   4. Kliknij na zakładkę Wyniki, aby wyświetlić AUC (obszar całkowity) dla każdego leku.
      UWAGA: AUC jest zintegrowanym pomiarem mierzalnego efektu, który jest używany jako skumulowany pomiar efektu leku. W przypadku niektórych cząsteczek, takich jak przeciwciała, krzywa dawka-odpowiedź nie ma kształtu sigmoidalnego, a wartości IC₅₀ są trudne do interpretacji. W takiej sytuacji wartości AUC mogą dostarczyć więcej informacji jako metryki do porównania różnic między liniami organoidów.
   5. Alternatywnie, jeśli pomiary KTG są wykonywane w dniu 2 (opcjonalne kroki 4.4.5 i sekcja 7), należy obliczyć wskaźniki GR. Analizuj wskaźniki GR za pomocą internetowego kalkulatora GR¹⁴, biorąc pod uwagę różnice w tempie proliferacji między modelami organoidów podczas badania przesiewowego leków, aby zapewnić bardziej powtarzalne i czułe pomiary.

Wyniki

Celem tego eksperymentu było zbadanie wrażliwości organoidów HNSCC na chemioterapię i radioterapię jako pojedyncze środki. Przetestowaliśmy również odtwarzalność wyników, wykonując eksperyment wiele razy w odstępie tygodniowym, co dało wynik kilku powtórzeń biologicznych (eksperymenty 1-3) (Rysunek 2). Zgodnie z protokołem, w dniu 0, ChNP HNSCC zebrano z 6 dołków na 6-dołkowej płytce i enzymatycznie i mechanicznie ścięto do pojedynczych komórek (lub małych organoidów < 70 μm) i ponownie posiano w 8...

Dyskusja

W tym artykule i filmie opisano, jak przeprowadzać średnioprzepustowe badania przesiewowe leków przy użyciu PDO. Protokół ten może, po optymalizacji, zostać przyjęty do badań przesiewowych organoidów pochodzących z różnych typów tkanek niż te opisane tutaj. Określenie idealnych ram czasowych pasażu przed badaniem przesiewowym jest ważne, ponieważ będzie się on różnił w zależności od poszczególnych kultur organoidów i zależał od typu tkanki. Gęstość i rozmiar organoidów wysiewanych w każdym dołku jest ważnym czynnikiem do...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wymagane wyposażenie
384-dołkowy bioluminescencyjny czytnik płytek; np. Tecan Spark 10M Mikroskop	Tecan
Brightfield z soczewką o dużym polu widzenia (2,5x)
Dozownik cyfrowy; np. Tecan D300e	Tecan		Dozowanie leków
6 MV promiennik	wiązki fotonówElekta model Synergy, Elekta Sweden
Ładowarka do cieczy z dużą dyszą (" rura standardowa") Kasety;
np. Dozownik odczynników Multidrop Combi	Thermo Scientific
Plastikowy pojemnik z wkładką do uchwytu na płytkę do radioterapii	Domowe
oprogramowanie
Standardowy sprzęt do hodowli tkanek (szafka LAF, inkubator, wirówka, łaźnia wodna itp.)
Wymagane materiały
1,5 ml probówki
plastikowe 15 i 50 ml Sterylne
pipety plastikowe 5, 10 i 25 ml 6-dołkowe
			hodowli komórkowych
384-dołkowa płytka z przezroczystym dnem o bardzo niskim mocowaniu; np. Corning 384 płaski	Corning	4588
Oddychaj  membrana uszczelniająca	Wstępnie przycięta membrana poliuretanowa klasy medycznej Merck
Szkiełko			10-komorowe z siatką hemocytometru
Dozownik odczynnika Multidrop Combi Standardowa kaseta dozująca probówkę	Thermo Scientific
Plugged Pasteur' s pipeta, której końcówka została dokręcona płomieniem
Odwracalny 20/40/70/100 &mikro; m filtry: PluriStrainer	Pluriselect	np. 43-50020-03
Sterylne końcówki do pipet P1000, P200, P20 i P2 oraz końcówki filtrujące o niskiej retencji (np. końcówki szafirowe)	Kasety Greiner	750266
T8 Plus i D4 Plus	HP/Tecan
Wymagane odczynniki
100 x L-glutamina Glutamax			substytut
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 rozcieńczony w PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3D Promega		G9681
Związki do badania przesiewowego, w tym Staurosporyna lub inna kontrola pozytywna
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM dla CRC: Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu, bez fenolu	Corning	356231
ECM dla chNP HNSCC: BM, Cultrex RGF Ekstrakt z błony podstawnej, typ	R1 R& D Systems	3433-005-R1
Pożywka wzrostowa ekspansywna (specyficzna dla każdego typu organoidu)
Czynniki wzrostu organoidów (specyficzne dla każdego typu organoidu)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
Inhibitor ROCK: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Wymagane pakiety oprogramowania:
GraphPad Prism
Microsoft Excel