Artykuł metodologiczny

Analiza ograniczenia SAMHD1 za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich komórkach szpikowych U937

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62502

⸱

13 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1Retrovirus-Host Interactions Laboratory, The Francis Crick Institute, 2Retroviral Replication Laboratory, The Francis Crick Institute, 3Sidney Sussex College, Department of Medicine, University of Cambridge

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana tutaj jest sprawdzona metoda określania stopnia ograniczenia HIV-1 przez komórkowe białko hamujące SAMHD1. Ludzkie komórki linii szpikowej U937 są transdukowane wektorem ekspresyjnym SAMHD1 współwyrażającym YFP, różnicowane, a następnie prowokowane HIV-RFP. Poziom restrykcji określa się za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Sterylne białko 1 zawierające domenę α-motif/histydyny-asparaginianu (SAMHD1) hamuje replikację HIV-1 w spoczynkowych komórkach szpikowych. Komórki U937 są szeroko stosowane jako wygodny system komórkowy do analizy aktywności SAMHD1 ze względu na niski poziom ekspresji RNA SAMHD1, co prowadzi do niewykrywalnej endogennej ekspresji białka. Opierając się na podobnych testach opracowanych w laboratorium Stoye w celu scharakteryzowania innych retrowirusowych czynników restrykcyjnych, laboratorium Bishop opracowało dwukolorowy test restrykcyjny do analizy SAMHD1 w komórkach U937. Cząstki podobne do wirusa białaczki mysiej wyrażające SAMHD1, wraz z YFP wyrażonym przez IRES, są wykorzystywane do transdukcji komórek U937. Komórki są następnie traktowane octanem mirystynianu forbolu w celu wywołania różnicowania do fenotypu w stanie spoczynku. Po różnicowaniu komórki są zakażone cząstkami podobnymi do wirusa HIV-1 wykazującymi ekspresję fluorescencyjnego reportera. Po 48 godzinach komórki są pobierane i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Odsetek komórek zakażonych wirusem HIV w populacji wykazującej ekspresję SAMHD1 porównano z odsetkiem komórek kontroli wewnętrznej pozbawionych SAMHD1. To porównanie ujawnia współczynnik ograniczeń. Ekspresja SAMHD1 prowadzi do pięciokrotnego zmniejszenia zakażenia wirusem HIV, co odpowiada współczynnikowi restrykcji wynoszącemu 0,2. Niedawne zastąpienie pierwotnego GFP RFP genem reporterowym zakażenia wirusem HIV ułatwiło analizę metodą cytometrii przepływowej.

Ten test został z powodzeniem wykorzystany do scharakteryzowania wpływu podstawień aminokwasów na ograniczenie SAMHD1 poprzez transdukcję z wirusami kodującymi zmienione białka SAMHD1, pochodzące z mutagenezy wektora ekspresyjnego skierowanej do miejsca. Na przykład, katalityczne podstawienia miejsc HD206-7AA wykazują fenotyp restrykcyjny równy 1, co wskazuje na utratę aktywności restrykcyjnej. Równie dobrze można określić podatność różnych wirusów testowych. Test można dalej dostosowywać w celu uwzględnienia wpływu statusu różnicowania, statusu metabolicznego i modyfikatorów SAMHD1, aby lepiej zrozumieć związek między SAMHD1, stanem metabolicznym komórki i restrykcją wirusa.

Wprowadzenie

Sterylne białko 1 zawierające domenę α-motif/histydyno-asparaginianu (SAMHD1) utrudnia replikację ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) w komórkach spoczynkowych linii szpikowej. SAMHD1 blokuje replikację poprzez swoją aktywność enzymatyczną jako trifosfohydrolaza dNTP, co powoduje obniżenie poziomu wewnątrzkomórkowych dNTP. W rezultacie HIV-1 nie może skutecznie przeprowadzić procesu odwrotnej transkrypcji. W ciągu kilku lat od tej początkowej obserwacji poczyniono znaczne postępy, szczególnie w odniesieniu do udziału określonych domen i aminokwasów w aktywności przeciwwirusowej SAMHD1. Spostrzeżenia te zostały uzyskane przy użyciu testów biochemicznych, a także systemów komórkowych naśladujących fizjologicznie istotne spokojne środowisko szpikowe. Komórki U9371 są szeroko stosowane jako wygodny system komórek szpikowych do analizy aktywności SAMHD1. Wynika to z braku endogennej ekspresji SAMHD1, co uważa się za spowodowane niskim poziomem RNA w porównaniu z komórkami wykazującymi ekspresję SAMHD1 (obszar trwających badań). W tym przypadku protokół opisuje przejściową transdukcję komórek U937 z cząstkami wirusopodobnymi współeksprymującymi SAMHD1 i reporterem żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) w celu zbadania mechanizmu ograniczenia SAMHD1 HIV-1. Takie przejściowe testy dwukolorowej cytometrii przepływowej w celu zbadania ograniczeń retrowirusowych zostały po raz pierwszy opracowane w laboratorium Stoye2 i od tego czasu zostały zaadaptowane do badania innych czynników restrykcyjnych, w tym białek motywu trójdzielnego (TRIM)3. Zainspirowani tymi testami, laboratorium Bishop opracowało dwukolorowy test do analizy ograniczenia SAMHD1 w komórkach U937.

Przebieg eksperymentu jest pokazany w Rysunek 1. Do transdukcji komórek U937 wykorzystuje się cząstki podobne do wirusa białaczki mysiej (MLV) zawierające bi-cistroniczną wiadomość kodującą SAMHD1 wraz z YFP wyrażonym przez IRES. Komórki są następnie traktowane octanem mirystynianu forbolu (PMA) w celu wywołania różnicowania do fenotypu w stanie spoczynku. Komórki są następnie zakażane cząstkami podobnymi do wirusa HIV-1 wykazującymi ekspresję białka czerwonej fluorescencji (RFP). Po 48 godzinach komórki są pobierane i analizowane za pomocą dwukolorowej cytometrii przepływowej. Test ten jest również stosowany z YFP i białkiem zielonej fluorescencji (GFP), co wymaga mniej standardowych kombinacji filtrów do analizy cytometrii przepływowej. Zastosowanie HIV-RFP pozwala na prostszą kompensację, a tym samym test jest łatwiej dostępny dla mniej doświadczonych użytkowników cytometrii przepływowej i osiągalny w przypadku większości cytometrów.

Podczas analizy, proporcja komórek zakażonych wirusem HIV jest porównywana między komórkami wykazującymi ekspresję SAMHD1 a komórkami pozbawionymi SAMHD1 w tej samej studzience komórek. Zapewnia to wewnętrzną kontrolę w probówce do cytometrii studziennej/przepływowej, co jest kluczową cechą. Porównanie poziomów infekcji w komórkach transdukowanych i nietransdukowanych ujawnia współczynnik restrykcji. Współczynnik 1,0 wskazuje, że transdukowany czynnik nie ma wpływu na zakaźność. Ekspresja SAMHD1 typu dzikiego prowadzi do pięciokrotnego zmniejszenia zakażenia wirusem HIV w tym teście, co odpowiada współczynnikowi restrykcji wynoszącemu 0,2. Chociaż efekt ten jest niewielki w porównaniu z bardziej klasycznymi czynnikami restrykcyjnymi, takimi jak TRIM5, efekt ten jest jednak powtarzalny i pozwala na klasyfikację zmodyfikowanych ekspresorów SAMHD1 na te, które ograniczają się w sposób równoważny do białka typu dzikiego, te, które nie ograniczają się i te o pośrednim fenotypie.

Ten test został z powodzeniem wykorzystany do scharakteryzowania fenotypów restrykcyjnych domeny SAMHD1 i mutantów aminokwasów poprzez transdukcję z wirusami kodującymi zmutowane sekwencje SAMHD1. Na przykład katalityczne podstawienia miejscowe HD206-7AA nie są w stanie ograniczyć w tym teście. Równie dobrze można określić podatność różnych wirusów testowych. Na przykład mutanty odwrotnej transkryptazy HIV-1 są bardziej podatne na ograniczenia za pośrednictwem SAMHD1 (np. 151V4). Protokół ten przedstawia szczegóły produkcji cząstek wirusopodobnych (VLP), transdukcji U937 za pomocą wektorów ekspresyjnych SAMHD1, zakażenia wirusem HIV przenoszącym fluorescencyjny reporter i późniejszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej. W tym artykule omówiono, jakich danych można się spodziewać i jak uniknąć nieoptymalnych wyników. Na koniec przedstawiono alternatywne zastosowania testu, a także zbadano różne warianty SAMHD1 w celu dokładniejszego zrozumienia zależności między SAMHD1, poziomami dNTP i infekcją wirusową. Biorąc pod uwagę rolę SAMHD1 w centrum metabolizmu komórkowego, z dodatkowymi powiązaniami z rakiem, jest to nadal obszar intensywnego zainteresowania.

Protokół

Ten protokół nie zawiera żadnych badań z udziałem zwierząt lub ludzi przeprowadzonych przez któregokolwiek z autorów. Wszystkie etapy tego protokołu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i kodeksami postępowania instytucji, w których zostały przeprowadzone.

1. Transfekcja komórek 293T do produkcji VLP (zarówno wektory ekspresji SAMHD1, jak i testowe cząsteczki HIV)

UWAGA: Najważniejszymi czynnikami przyczyniającymi się do udanej produkcji cząsteczek wirusa są zdrowie komórek 293T producenta, konfluencja podczas transfekcji i czas zbioru. Laboratoria zazwyczaj mają preferowane odczynniki do transfekcji i protokół produkcji cząstek retrowirusowych. Poniższy protokół daje dobrej jakości cząstki zakaźne, ale równoważne protokoły byłyby również odpowiednie dla tego zastosowania. Aby utrzymać dobrą jakość komórek 293T, pasaż co najmniej trzy razy w tygodniu, aby utrzymać stałe tempo wzrostu. Komórki powinny być wysiewane w logarytmicznej fazie wzrostu, aby zapewnić efektywną transfekcję.

  1. Dzień 1: Wysiewaj wymaganą liczbę 10 cm szalek z podziałem 1/4 z prawie zlewającej się płytki z komórkami 293T, aby uzyskać około 60% konfluencji następnego dnia (około 5 x 105 komórek/ml). Może być konieczne zasianie kilku gęstości, aby osiągnąć odpowiednią gęstość do transfekcji następnego dnia podczas pracy z nowym zasobem komórek.
  2. Dzień 2 (rano): Sprawdź, czy zbiega się około 60% za pomocą mikroskopii i delikatnie zastąp pożywkę na komórkach 10 ml świeżej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  3. Dzień 2 (po południu, co najmniej 4 godziny po zmianie podłoża): Transfekcja do produkcji VLP.
    1. Uzupełnić mieszaninę rozcieńczania DNA zawierającą po 3 μg plazmidu ekspresorowego gag-pol, plazmidu reporterowego napędzanego długokońcowym powtórzeniem (LTR) i plazmidu ekspresorowego wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej G (VSV-G) (łącznie 9 μg, patrz UWAGA) w 600 μl DMEM bez surowicy. Wirować i krótko odwirować (15 s, >500 x g).
    2. Dodać 20 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów), odwirować (nie odwirować) i inkubować w temperaturze 20 °C przez 15-20 min. Dodać mieszaninę do transfekcji kroplami na płytkę, delikatnie zamieszać do wymieszania i wrócić do inkubatora.
      UWAGA: Dla MLV VLP wyrażającego SAMHD1 użyj KB45,6 (plazmid ekspresora gag-pol), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (plazmid reporterowy sterowany LTR) i pczVSV-G7. W przypadku HIV-RFP VLP użyj p8.918,9 (plazmid ekspresora gag-pol), SCRPSY10 (plazmid reporterowy sterowany przez LTR) i pczVSV-G. Alternatywy omówiono w Tabeli materiałów. Proporcje plazmidów mogą wymagać optymalizacji dla różnych systemów plazmid/transfekcji.
  4. Dzień 3 (późny poranek): Ostrożnie usuń pożywkę z komórek za pomocą pipetowania, przemyj 5 ml świeżego DMEM i zastąp 5 ml świeżego DMEM.
  5. Dzień 4 (rano): Zbierz wirusa, zbierając supernatant z komórek i zastąp 5 ml świeżego DMEM. Przepuścić supernatant zawierający VLP przez filtr o długości fali 0,45 nm, podwielokrotność i przenieść do temperatury -70 °C w celu przechowywania. Upewnij się, że podwielokrotności mają wielkość odpowiednią do planowanych eksperymentów (250 μl jako sugestia), ponieważ powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania spowodują utratę miana wirusa.
  6. Dzień 5 (rano): Zebrać wirusa jak w ppkt 1,5, ale po zebraniu supernatantu wyrzucić płytki.

2. Mianowanie nowego VLP przed użyciem

  1. Dzień 1: Wysiew 293T w odległości 2 x 105 komórek na studzienkę 24-dołkowej płytki - 4 dołki na wirusa do miareczkowania, w tym wirus o znanej zakaźności dla każdego szkieletu. Zoptymalizuj gęstość wysiewu dla danego zasobu komórek.
  2. Dzień 2: Obserwuj tabliczkę, aby sprawdzić zbieg (najlepiej ~70%). Rozmrozić supernatant zawierający wirusa z kroków 1.5 i 1.6. Dodaj 0, 10, 25 lub 100 μl do każdego dołka.
  3. Dzień 4 (rano): Zbierz komórki do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.
    1. Usunąć pożywkę przez staranne pipetowanie lub zasysanie. Delikatnie przemyć komórki 250 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Usunąć komórki z płytki, pipetując w górę i w dół za pomocą 250 μl PBS i przenieść do probówki do mikrowirówki. Dodać 250 μl 4% paraformaldehydu (przyjmując końcowe stężenie do 2%).
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Nie należy go mieszać ze środkami dezynfekującymi na bazie chloru.
    2. Osadzać komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS lub alternatywnym buforze do cytometrii przepływowej. Przeanalizuj pod kątem zapytania ofertowego lub YFP, w zależności od potrzeb, za pomocą cytometrii przepływowej. Normalizuj zakaźność danego zasobu wirusa w stosunku do wartości dla zapasu o znanej zakaźności.
      UWAGA: VLP można również znormalizować za pomocą testu immunoenzymatycznego p24 (ELISA); jednak niekoniecznie jest to dobry wskaźnik zakaźności VLP, zwłaszcza gdy zapasy VLP są przygotowywane w różnych transfekcjach. Opublikowane metody mediany dawki zakaźnej lub wielokrotności infekcji w hodowli tkankowej (TCID50/MOI)11 mogą również dostarczyć względnej kwantyfikacji, chociaż nie są one dobrze ustalone dla MLV. Fluorescencja względna stanowi opłacalną alternatywę dla komercyjnych metod ELISA z odwrotną transkryptazą.

3. Transdukcja U937 z ekspresją VLP SAMHD1 i YFP

UWAGA: Kroki 3-6 stanowią eksperyment z ograniczeniami. Dni są ponumerowane w celu ułatwienia planowania.

  1. Dzień 1 (po południu): Rozmrozić VLP do transdukcji, w tym MLV-SAMHD1-YFP typu dzikiego (kontrola pozytywna), MLV-SAMHD1(HD206-7AA)-YFP (kontrola ujemna) i wariant MLV-SAMHD1-YFP (próbki eksperymentalne). Rozcieńczyć znormalizowany VLP do końcowej objętości 500 μl za pomocą pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) w probówce do mikrofuge, dodać 0,5 μl polibrenu (10 mg/ml) i wymieszać przez trzepanienie.
    1. Jeśli nie można wcześniej miareczkować VLP, należy w pierwszej kolejności użyć 100 μl. Stosować maksymalny stosunek VLP do RPMI 1:1, aby ograniczyć toksyczność wywołaną przez VLP. Dąż do około 30% transdukcji.
  2. Podwielokrotność 5 x 105 komórek U937 do sterylnej probówki do mikrofuge dla każdego warunku transdukcji. Osad przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut i usunąć supernatant (dołączyć dwie dodatkowe probówki jako nietransdukcyjne kontrole do cytometrii przepływowej). Zawiesić osad komórkowy w 500 μl rozcieńczonego VLP (lub RPMI dla kontroli nietransdukowanych) i przenieść do jednego dołka na 24-dołkowej płytce.
  3. Spinokkulować w wirówce stołowej o sile 800 x g przez 90 minut w temperaturze 20 °C. Dodać 1 ml obr./min o temperaturze 37 °C RPMI do studzienki i pozostawić do odzyskania w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 3 dni.

4. Różnicowanie transdukowanego U937

  1. Dzień 4 (rano): Ponownie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie i przenieść 350 μl do każdego z 4 dołków 12-dołkowej płytki. Do każdej studzienki dodać 700 μl 37 °C RPMI zawierającej 150 nM PMA, uzyskując końcowe stężenie 100 nM i pozostawić do rozróżnienia na 3 dni.
    UWAGA: PMA jest kupowany w postaci proszku i powinien być ponownie zawieszony do 1 mM w DMSO i przechowywany w ciemności. Zapas roboczy o wielkości 100 μM należy przygotować poprzez rozcieńczenie 1/10 z zapasu 1 mM za pomocą DMSO.

5. Zakażenie zróżnicowanego U937 wykazującego ekspresję SAMHD1 wirusem HIV-RFP

  1. Dzień 7: Obserwuj komórki pod mikroskopem. Upewnij się, że komórki przylegają. Odessać pożywkę ze wszystkich studzienek, dodać 1 ml RPMI do studzienki 1 z każdego zestawu 4 sztuk, co pozwala na nietransdukowaną, niezainfekowaną kontrolę, a także kontrolę pojedynczego koloru. Dodaj z powrotem 0,5 ml RPMI zawierającego około 10 μl HIV-1-RFP (około 10 ng p24 jako przewodnik) do wszystkich innych studzienek. Celuj w około 50% infekcji.
  2. Dzień 8 (rano): Dodaj 0,5 ml RPMI do każdej z zainfekowanych studzienek.

6. Analiza cytometrii przepływowej

UWAGA: Dobrą praktyką jest umieszczanie żywej martwej plamy w rurociągach cytometrii przepływowej. Jeśli jednak ogniwa U937 są dobrej jakości, ten krok można pominąć bez negatywnych konsekwencji dla dalszej analizy. Delikatne pipetowanie trypsynizowanych komórek powinno z łatwością doprowadzić do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

  1. Dzień 10 (rano): Odessać pożywkę z dołków i przemyć raz PBS. Dodaj 300 μl enzymu dysocjacji komórek (lub trypsyny) przez 5-10 min. Dodać dodatkowe 300 μl PBS, dokładnie zawiesić, upewniając się, że wszystkie komórki odpadły od płytki, i przenieść do probówek do cytometrii przepływowej.
  2. Dodać 300 μl 4% paraformaldehydu (doprowadzając końcowe stężenie do 2%). Osadzać komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS lub alternatywnym buforze do cytometrii przepływowej. Analiza metodą cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Poniższe kroki dotyczą analizatora Fortessa, ale równoważną analizę można uzyskać przy użyciu dowolnego analizatora zdolnego do odczytu fluorescencji RFP i YFP. Skonsultuj się z lokalnym wsparciem cytometrii przepływowej lub innym doświadczonym badaczem przed skonfigurowaniem jakiejkolwiek analizy cytometrii przepływowej. W przypadku gdy wiele próbek musi być przesiewanych w tym samym czasie, odpowiedni może być próbnik o wysokiej przepustowości. W takim przypadku zalecana jest większa liczba komórek i objętość.

7. Analiza cytometrii przepływowej

  1. Włącz cytometr 10 minut przed jego potrzebowaniem i włącz komputer. Sprawdź, czy odpływ jest pusty i czy zbiornik osłony jest pełny.
  2. Zaloguj się do urządzenia i otwórz oprogramowanie analityczne.
  3. Przesuń ramię na bok, zdejmij rurkę wodną, ustaw natężenie przepływu na wysokie i naciśnij Prime. Poczekaj, aż światło zgaśnie i powtórz jeszcze trzy razy.
  4. Ponownie włącz wodę i pracuj na wysokich obrotach przez 3 minuty, a następnie przełącz się na niski i naciskaj tryb gotowości, aż przejdziesz do akwizycji.
  5. W międzyczasie skonfiguruj eksperyment w oprogramowaniu:
    1. Wybierz pozycję Eksperyment/Nowy eksperyment (nazwa zgodnie z lokalnymi wytycznymi). W inspektorze usuń niepotrzebne fluorochromy, pozostawiając Blue Laser 530/30 i Yellow Laser 610/20 lub zalecane kombinacje lasera i filtrów dla YFP i RFP dla maszyny.
    2. Kliknij eksperyment prawym przyciskiem myszy i wybierz Ustawienia cytometru/Ustawienia aplikacji/Utwórz arkusz. W arkuszu utwórz plamę punktową obszaru rozproszenia z przodu (FSC-A)/obszar rozproszenia bocznego (FSC-A) i histogram YFP, histogram RFP i plamę punktową GFP/YFP, klikając odpowiednią ikonę i zmieniając osie, klikając etykietę osi.
    3. Kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy Eksperyment i dodaj nową próbkę. Zmień nazwę zgodnie z potrzebami. Otwórz próbkę, klikając znak plus, aby odsłonić nową probówkę.
  6. Otwórz pulpit nawigacyjny pobierania z Widoku, załaduj niezainfekowany, nietransdukowany element sterujący i naciśnij Pobierz. Dostosuj napięcia FSC i SSC na desce rozdzielczej, aby ustawić komórki w lewym dolnym kwadrancie (brak komórek na osiach). Brama wokół tej populacji P1. Kliknij prawym przyciskiem myszy na inne wykresy i wybierz pokaż P1, aby usunąć zanieczyszczenia z późniejszej analizy.
  7. Załaduj jednokolorowy formant dla YFP (tylko SAMHD1 typu dzikiego) i pobierz. Dostosuj napięcie YFP na desce rozdzielczej tak, aby jak najwięcej komórek fluorescencyjnych znajdowało się w zasięgu detektora (nie na krawędzi osi). Powtórz te czynności dla jednokolorowego formantu RFP.
  8. Uruchom automatyczną kompensację przy użyciu nietransdukcyjnych, niezainfekowanych i jednokolorowych elementów sterujących.
    1. Wybierz z menu opcję Eksperymentuj > konfigurację wynagrodzeń > Utwórz kontrolki wynagrodzenia, aby przełączyć się na normalny arkusz. Wybierz nieskalany normalny arkusz, naciśnij Uruchom i pobierz dla niezabarwionej kontrolki.
    2. Narysuj bramkę wokół nienaruszonych komórek (P1) i zapisz. Wyjmij rurkę i przełącz maszynę w tryb czuwania. Kliknij prawym przyciskiem myszy P1, a następnie kliknij Zastosuj do wszystkich elementów sterujących kompensacją.
    3. Przełącz się do normalnego arkusza RFP i naciśnij przycisk Uruchom. Nagraj jednokolorową kontrolkę RFP i przełącz urządzenie w tryb gotowości. Oprogramowanie powinno automatycznie wybrać populację dodatnią.
    4. Powtórz te czynności dla kontrolki pojedynczego koloru YFP. Wybierz opcję Eksperymentuj > konfigurację wynagrodzenia > Oblicz wynagrodzenie > Połącz i zapisz.
  9. Przełącz się do arkusza globalnego. Zdobądź komórki transdukowane dzikim typem SAMHD1, zakażonym HIV-RFP i sprawdź, czy w rogach kwadrantów można zobaczyć cztery odrębne populacje, które są wyrównane pionowo i poziomo odpowiednio dla YFP i RFP. Wyjmij rurkę i naciśnij przycisk Standby.
  10. Załaduj ponownie nietransdukowaną, niezainfekowaną próbkę, naciśnij przycisk Uruchom i zarejestruj 30 000 zdarzeń z P1 jako bramką zatrzymującą. Powtórzyć te czynności dla pozostałych próbek (łącznie z innymi próbkami kontrolnymi). Zmienianie nazw próbek podczas uruchamiania lub post hoc. Po wyeksportowaniu plików nie można zmienić ich nazw.
  11. Wyeksportuj dane jako pliki .fcs i wyczyść fluidics zgodnie z lokalnymi instrukcjami.

8. Analiza danych

UWAGA: Następujące kroki odpowiadają analizie w FlowJo v10; jednak podobne kroki można łatwo wykonać w innym oprogramowaniu do analizy.

  1. Otwórz oprogramowanie i przeciągnij wszystkie pliki .fcs na pulpit nawigacyjny. Wybierz elementy sterujące kompensacją i przeciągnij je do podfolderu wynagrodzenia. Otwórz plik dla nietransdukowanej, niezainfekowanej probówki, klikając dwukrotnie, co spowoduje wyświetlenie wykresu FSC-A/SSC-A.
  2. Wybierz narzędzie wielokąta i bramkę na nienaruszonej populacji komórek, z wyłączeniem zanieczyszczeń w lewym dolnym rogu. Nazwij to komórki. Przeciągnij tę bramkę na całą populację probówek na pasku Wszystkie próbki. Przewiń każdą pojedynczą próbkę za pomocą poziomych przycisków strzałek, aby upewnić się, że bramkowanie jest odpowiednie dla każdej probówki.
  3. Kliknij dwukrotnie populację komórek dla nietransdukowanej, niezainfekowanej próbki i dostosuj osie do wysokości FSC (H) i obszaru FSC (A). Wybierz pojedynczą dużą populację za pomocą prostokątnej bramy, aby wykluczyć dublety. Oprogramowanie automatycznie zasugeruje nazwanie tych pojedynczych komórek.
  4. Przeciągnij tę bramkę na wszystkie populacje komórek i ponownie sprawdź, czy bramkowanie jest odpowiednie dla wszystkich próbek. Wybierz populację pojedynczych komórek dla niezainfekowanej, niewyuczonej próbki, zmień osie na skompensowany niebieski laser (y, YFP) lub skompensowany żółty laser (x, RFP). Naciśnij T na osi i wybierz opcję Skala dwuwykładnicza dla x i y.
  5. Wybierz narzędzie do bramkowania kwadrantowego i kliknij w prawym górnym rogu ujemnej populacji komórek. Zastosuj to wstępne bramkowanie do wszystkich populacji pojedynczych komórek, przeciągając je na pasek Wszystkie próbki. Tam, gdzie bramki kwadrantowe nie rozdzielają populacji w zadowalający sposób, może być konieczne bramkowanie poszczególnych kwadrantów za pomocą narzędzia wielokątów, jak w Rysunek 2.
  6. Przewiń do próbki SAMHD1 tylko typu dzikiego (tylko YFP) i sprawdź, czy bramkowanie między nietrandukowanym (YFP ujemnym) a dodatnim YFP jest poprawne. Pomocne może być przełączenie się na widok konturowy, aby odróżnić ujemne od przyciemnionych komórek YFP. Jeśli najwyższe komórki YFP + ve są szeroko rozmieszczone, dostosuj górną bramkę pionową w prawo.
  7. Przewiń wszystkie próbki i sprawdź bramkowanie pod kątem pozytywności YFP. Użyj najlepszego podziału między ujemnym i dodatnim YFP, który jest prawidłowy dla wszystkich próbek.
    UWAGA: Kompensacja zostanie obliczona na podstawie poziomu wyrażenia SAMHD1 YFP typu dzikiego. Jeśli poziomy infekcji są bardzo różne między różnymi komórkami transdukowanymi SAMHD1-YFP, może być konieczne dostosowanie kompensacji. Dlatego zaleca się, aby YFP VLP zostały znormalizowane przed użyciem.
  8. Przewiń do nietransdukowanej, zakażonej wirusem HIV-RFP probówki i sprawdź, czy bramkowanie między niezakażonym RFP negatywnym a zainfekowanym RFP pozytywnym jest prawidłowe. Dostosuj w razie potrzeby, korzystając z widoku konturu, jeśli to konieczne, i przewiń pozostałe próbki, aby sprawdzić, czy bramkowanie jest prawidłowe dla wszystkich próbek.
  9. Każda próbka wymaga podwójnie ujemnych wyników (Q4: lewy dolny, nietransdukowany, niezakażony), dodatni YFP (Q1: lewy górny, ekspresja SAMHD1, niezakażony), RFP-dodatni (Q3: prawy dolny róg, nietransdukowany, zakażony wirusem HIV) i podwójnie dodatni (Q2: prawy górny róg, SAMHD1 wyrażający zakażenie wirusem HIV). Otwórz edytor tabel, klikając ikonę i przeciągnij cztery bramki kwadrantowe na pulpit nawigacyjny. Wybierz Eksport Excela i kliknij Utwórz tabelę. Zapisz wygenerowany arkusz kalkulacyjny zgodnie z lokalnymi konwencjami nazewnictwa plików.
  10. Aby wyeksportować reprezentacje działek i strategii bramkowania, kliknij ikonę Edytora układu. Wybierz każdą populację i przeciągnij ją do edytora z wymaganymi osiami, etykietami i odstępami.
  11. Aby utworzyć układ z tymi samymi wykresami pokazanymi dla wszystkich próbek, wybierz jedną kolumnę i naciśnij Partia. Naciśnij Skaluj do szerokości, a następnie Unikaj podziałów stron. Zapisz w wymaganym formacie pliku.
  12. W wyeksportowanym arkuszu kalkulacyjnym oblicz współczynnik ograniczeń, generując kolumny procentowego zapytania ofertowego YFP-ves (RFP+ve / (podwójnie ujemne + RFP+ve)) i procentowego RFP YFP+ves (podwójnie dodatnie / (podwójnie dodatnie + YFP+ve)), a następnie końcową kolumnę (%RFP YFP+ve / %RFP YFP-ve), patrz Rysunek 1. Uśrednij dane repliki dla każdej konstrukcji SAMHD1 i oblicz, czy wartości restrykcji dla testowanych wariantów SAMHD1 różnią się znacząco od wariantów typu dzikiego i/lub 206-7AA za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.

Wyniki

Wyniki powyższej analizy powinny wykazać stosunek restrykcji wynoszący 0,25 lub mniej dla pozytywnej kontroli SAMHD1 typu dzikiego oraz 1,0 dla kontroli negatywnej. Jeśli te dwie kontrole jakości są poprawne, należy ocenić istotność statystyczną wyników. Warianty SAMHD1, które nie wykazują istotnej różnicy w stosunku do typu dzikiego, niosą zatem substytucje, które nie wpływają na restrykcję SAMHD1 w tym kontekście. Te, które różnią się istotnie od typu dzikiego, wykazują upośledzoną restrykcję. Jeśli nie różnią się one istotnie od kontroli negatywnej, oznacza to brak zdolności do restrykcji w tym kontekście (Rycina 4, panele lewe).

Jeśli wartość restrykcji dla SAMHD1 typu dzikiego jest większa niż 0,3, wyniki dla wirusów testowych mogą być wskazujące, ale nie mogą być uznane za wiarygodne. Nieefektywna restrykcja białka typu dzikiego może wynikać z użycia komórek U937 zbyt wcześnie po regeneracji z rekonstrukcji (w ciągu 2 tygodni) lub gdy są one zbyt stare (>2-3 miesiące). Parametry te mogą wymagać empirycznego ustalenia dla danej partii komórek. Zazwyczaj im niższy numer pasażu, tym bardziej niezawodnie komórki ulegają różnicowaniu, a co za tym idzie, zapewniają odpowiednie środowisko dla restrykcji SAMHD1. Nieodpowiedni poziom infekcji w przypadku SAMHD1-YFP lub HIV-RFP może również prowadzić do trudności zarówno w kompensacji, jak i w późniejszym określeniu współczynnika restrykcji. Przykład przedstawiono na prawych panelach Rysunku 4.

Jeśli kontrola negatywna odbiega od wartości 1,0 (wykracza poza zakres 0,9-1,2), może to wskazywać na problem z analizą; na wynik badania może wpływać proporcja zakażonych komórek, strategia bramkowania lub stan zdrowotny komórek. Należy odnieść się do powyższych UWAG.

Produkcja i analiza VLP; schemat cytometrii przepływowej; proces infekcji HIV; wykres analizy danych.
Rysunek 1: Schemat przedstawiający protokół. VLP, cząstki wirusopodobne, PMA, octan mirystianu forbolu. Ponumerowane etapy odpowiadają etapom w protokole. Rysunek wykonany przy użyciu BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat wektorów do edycji genów; promotory CMV IE, geny gagpol, montaż wektora PCR.
Rycina 2: Schemat plazmidów retrowirusowych. (A) Wektory pakujące (B) Wektory transferowe (C) Ekspresor otoczki VSV-G. Przedstawiono kluczowe elementy kodujące i regulacyjne. Szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów. CMV IE: promotor wczesny CMV (cytomegalovirus immediate-early), BGH: hormon wzrostu bydlęcego (bovine growth hormone), pA: polyA, RRE: element odpowiedzi Rev (Rev Response Element), CMV-LTR: kompozytowy promotor CMV-HIV-1 LTR, Psi: sygnał pakowania HIV-1, cPPT/CTS: centralny trakt polipurynowy/centralna sekwencja terminacji (central polypurine tract/central termination sequence), SV40: wirus wakulizujący małp 40 (simian vacuolating virus 40). Rycina wykonana przy użyciu BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza danych z cytometrii przepływowej; kompensacja fluorescencji; wykresy kropkowe; kanały YFP i RFP.
Rysunek 3: Strategia bramkowania dla analizy cytometrii przepływowej. (A) Kontrole kompensacji: panel lewy przedstawia bramkowanie FSC-A/SSC-A na nienaruszonych komórkach dla kontroli nietransdukowanej i niezainfekowanej. Panele środkowy i prawy przedstawiają zrzuty ekranu z kontroli kompensacji dla pojedynczych barwników YFP (środek) i RFP (prawo), gdzie dane niekompensowane zaznaczono kolorem czarnym, a skompensowane kolorem niebieskim. (B) Odpowiadająca im macierz kompensacyjna oraz wykresy dla powyższych kontroli kompensacji. (C) Strategia bramkowania. Detrytus jest eliminowany poprzez analizę wszystkich komórek za pomocą FSC-A/SSC-A (panel lewy). Dublety są wykluczane poprzez bramkowanie wysokości FSC względem powierzchni (panel środkowy). Panel prawy przedstawia przykład restrykcji HIV-1 przez SAMHD1 typu dzikiego. Osie pokazują skompensowaną fluorescencję laserów niebieskiego i żółtego, odpowiadającą odpowiednio komórkom pozytywnym dla YFP (SAMHD1) i RFP (HIV). Bramki kwadrantowe zostały wyznaczone poprzez porównanie kontroli negatywnych i jednobarwnych dla RFP i YFP. Liczby wskazują procent populacji macierzystej. Wartości kompensacji dla YFP względem GFP będą znacznie wyższe, ale możliwe do rozróżnienia przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza restrykcji HIV metodą cytometrii przepływowej, wykres punktowy i wykres słupkowy, SAMHD1, porównanie danych.
Rysunek 4: Oczekiwane wyniki: dane idealne w porównaniu z nieoptymalnymi. (A) Reprezentatywne wykresy YFP/RFP dla danych optymalnych (lewo) i nieoptymalnych (prawo). Liczby wskazują procent populacji rodzicielskiej. Na prawym panelu zakażenie HIV jest zbyt niskie, co powoduje trudności z kompensacją i bramkowaniem. Współczynnik restrykcji jest wyższy od oczekiwanego i wynosi 0,5. (B>) Wykresy współczynnika restrykcji dla wariantów SAMHD1 w stosunku do typu dzikiego (WT, czerwony) lub kontroli negatywnej (HD206-7AA, czarny) wygenerowane przy użyciu oprogramowania statystycznego. Każdy punkt reprezentuje wartość z powtórzenia. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe. Sparowane testy t pomiędzy każdą grupą były istotne we wszystkich przypadkach, z wyjątkiem wskazanych. Lewo: Dane idealne – WT wykazuje oczekiwaną restrykcję na poziomie około 0,2, kontrola negatywna wykazuje 1,0. Wariant R372D (szary) różni się istotnie od WT, ale nie różni się istotnie od kontroli negatywnej, a zatem utracił zdolność do restrykcji. Prawo: Dane nieoptymalne. Tutaj kontrola negatywna zachowuje się zgodnie z oczekiwaniami, ale we wszystkich sześciu powtórzeniach WT wykazuje współczynnik restrykcji jedynie 0,5 ze względu na niski poziom zakażenia. Niska wariancja wewnątrz grup sprawia, że R143H wykazuje fenotyp pośredni, statystycznie różny od WT i kontroli negatywnej, natomiast G209S nie wykazuje restrykcji; jednak badanie to powinno zostać powtórzone z użyciem świeżych komórek, ponieważ kontrola pozytywna nie dała oczekiwanego współczynnika restrykcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Jak omówiono w powyższych uwagach, krytyczne aspekty protokołu koncentrują się na utrzymaniu prawidłowego fenotypu komórki do produkcji VLP i stworzeniu odpowiedniego środowiska do obserwacji ograniczenia SAMHD1. Po pierwsze, dokładna analiza restrykcji za pomocą dwukolorowej cytometrii przepływowej polega na osiągnięciu odpowiednich proporcji transdukowanych i zakażonych komórek, tak aby w każdym obszarze wykresu znajdowała się wystarczająca liczba komórek do analizy. W związku z tym badacz powinien dążyć do osiągnięcia MOI mniejszego niż 1 (patrz Protokół). Wskaźniki transdukcji i infekcji, które są zbyt wysokie lub zbyt niskie, prowadzą do problemów z analizą z powodu braku niezakażonych lub podwójnie zainfekowanych komórek. Podobnie, podobna szybkość transdukcji dla wektorów SAMHD1, które mają być porównywane, jest kluczem do umożliwienia zastosowania tej samej macierzy kompensacji i bramkowania w całym eksperymencie, zwiększając zaufanie do późniejszej analizy.

Po drugie, wiek użytych komórek U937 jest kluczowym czynnikiem decydującym o tym, czy skutecznie się różnicują. Skuteczne różnicowanie można monitorować poprzez obserwację przylegania, zmniejszone zakwaszenie pożywek w czasie po różnicowaniu oraz odpowiednie ograniczenie przez kontrolę pozytywną typu dzikiego w teście. Różnicowanie do 5 dni zakończyło się sukcesem.

Jedną z kluczowych zalet tego testu jest jego elastyczność. Różne zmodyfikowane wersje SAMHD1 (domeny, aminokwasy, sekwencje gatunków) mogą być testowane poprzez prostą mutagenezę wektora ukierunkowaną na miejsce lub klonowanie. Równie dobrze można badać warianty wirusa testera. Test był używany wcześniej w celu wykazania, że mutanty odwrotnej transkryptazy HIV-1 o zmniejszonej zdolności do wiązania dNTP są bardziej wrażliwe na ograniczenie SAMHD1. Tę samą zasadę można zastosować do testowania ograniczeń innych wirusów przez SAMHD1. Co więcej, różne warunki różnicowania lub sztuczna manipulacja wewnątrzkomórkowymi stężeniami dNTP mogą być wykorzystane do dalszego badania interakcji między warunkami wewnątrzkomórkowymi a aktywnością SAMHD1, co jest obszarem aktywnych badań w laboratorium Bishopa. Opisano również interakcję SAMHD1 z różnymi nukleozydowymi inhibitorami odwrotnej transkryptazy, a wpływ SAMHD1 pokazano za pomocą tego testu zmodyfikowanego do stosowania w komórkach pierwotnych 12,13,14,15.

Adaptacja protokołu do stosowania w komórkach pierwotnych pozwala przezwyciężyć ograniczenia związane z badaniem fenotypów metabolicznych w przekształconych komórkach. Istniejący format pozwala jednak na zastosowanie wygodnego i mniej wymagającego technicznie protokołu do analizy wysokoprzepustowej, zwłaszcza przy użyciu cytometru przepływowego z próbnikiem o wysokiej przepustowości. Podczas dostosowywania protokołu należy wziąć pod uwagę podatność komórek nieindukowanych wewnętrznie na efekty postronne (np. sygnalizację immunologiczną).

Podobnie jak w przypadku wielu aspektów biologii komórki, ważne jest, aby takie testy były stosowane jako część holistycznego podejścia do zrozumienia danego zjawiska. Równoległe stosowanie testów biochemicznych dla aktywności SAMHD116, kwantyfikacja wewnątrzkomórkowych pul dNTP oraz obserwacja zmutowanych fenotypów SAMHD1 u ludzi, ex vivo i w modelach zwierzęcych (przeprowadzane przez laboratoria na całym świecie, niektóre opisane w tym wydaniu) są kluczowe dla rozwijającego się zrozumienia tego złożonego białka.

Oświadczenia

Na potrzeby otwartego dostępu autorzy zastosowali publiczną licencję praw autorskich CC BY do każdej wersji manuskryptu zaakceptowanej przez autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia. Wyrażone poglądy są poglądami autora (autorów), a niekoniecznie poglądami NIHR lub Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Francis Crick Institute, który otrzymuje swoje główne fundusze od Cancer Research UK (FC001042 i FC001162), UK Medical Research Council (FC001042 i FC001162) oraz Wellcome Trust Trust (FC001042 i FC001162) oraz przez Wellcome Trust Investigator Award dla JPS (108012/Z/15/Z). Prace na Uniwersytecie Cambridge były współfinansowane przez NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) oraz UK Medical Research Council (MR/S009752/1). Ta ostatnia nagroda, finansowana przez Wielką Brytanię, jest częścią programu EDCTP2 wspieranego przez Unię Europejską.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki 293TATCCCRL-3216
0,45 i mikro; m Filtry strzykawkoweSartoriusFCT122
10 cm NaczyniaCorning430167preparaty wirusa można zwiększyć poprzez transfekcję na płytkach/kolbach o większej pojemności - patrz wskazówki dotyczące odczynników do transfekcji
Płytki 12-dołkoweGreiner665180
Płytki 24-dołkoweGreiner662160
BD LSRFortessa analizator komórekBD Bioscience649225można stosować alternatywne analizatory, o ile mogą odczytywać fluorescencję RFP i YFP
DMEMSigmaD6429ATCC zaleca, aby zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zostało zmodyfikowane tak, aby zawierało 4 mM L-glutaminy, 4500 mg/L glukozy, 1 mM pirogronianu sodu i 1500 mg/L wodorowęglanu sodu.
DMSOFisherBP-231-100
płodowa surowica bydlęcaGibco10500064
FlowjoBD Bioscience-alternatywne oprogramowanie analityczne może być używane
świetlny-dowolny mikroskop światła jasnego pola
p8.91-HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)
paraformaldehyd (4 % w PBS)Alfa AesarJ61889
PBSSigmaD8537
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)ThermoFisher15140122
12-mirystynian 13-octan (PMA)SigmaP8139
polibrenSigmaTR-1003
pKB4-Mysia białaczka Ekspresor wirusa GagPol (PMID: 23035841)
pLGatewaySAMHD1eYFP-MLV pakuje plazmid kodujący sekwencję ludzką typu dzikiego. Szczegóły i procedury klonowania Arnold i in., 2015 (Ref 1).
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY
FP		-Jak wyżej, koduje substytucje aminokwasów w kluczowych miejscach aktywnych reszt
PrismGraphpad-https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/Inne oprogramowanie do prezentacji danych są również odpowiednie
pVSV-G--VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternatywnie: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)
RPMIThermoFisher21875034
rurki z nakrętkąStarLabE1415-2231
SCRPSY-HIV pakowanie kodowania plazmidów RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/
stripettes 10 mlCorning10084450
stripettes 5 mlCorning10420201
TrypLE expressGibco12604021Trypsin również będą odpowiednie
TurbofectThermoFisherR0531dobrze sprawdzą się również alternatywne odczynniki do transfekcji
Ogniwa U937ATCCCRL-1593.2
mikroskop -

Bibliografia

  1. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  2. Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
  3. Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
  4. Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194(2015).
  5. Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10(2010).
  6. Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
  7. Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
  8. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  9. Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
  10. Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
  11. Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, Clifton, N.J. 27-35 (2009).
  12. Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824(2017).
  13. Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
  14. Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
  15. Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
  16. Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

zakażenie HIVrestrykcja retrowirusowatest restrykcji wirusowejreporter YFPreporter RFPróżnicowanie komórekmutageneza celowana
Analiza ograniczenia SAMHD1 za pomocą cytometrii przepływowej w ludzkich komórkach szpikowych U937
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.