Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy test aktywności sprzężony z enzymami do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1

DOI:

10.3791/62503

⸱

16 kwietnia 2021

 , 
1Science for Life Laboratory, Department of Oncology-Pathology, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SAMHD1 to trifosfohydrolaza deoksynukleozydowo-trifosforanowa, odgrywająca kluczową rolę w ludzkim zdrowiu i chorobie. Tutaj przedstawiamy wszechstronny test aktywności SAMHD1 sprzężony z enzymami, zastosowany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, który pozwala na ocenę małych cząsteczek i analogów nukleotydów jako substratów, aktywatorów i inhibitorów SAMHD1.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sterylny motyw alfa i białko zawierające domenę HD 1 (SAMHD1) jest kluczowym regulatorem wewnątrzkomórkowych pul trifosforanu deoksynukleozydu (dNTP), ponieważ enzym ten może hydrolizować dNTP do odpowiadających im nukleozydów i nieorganicznych trifosforanów. Ze względu na jego kluczową rolę w metabolizmie nukleotydów, jego związek z kilkoma patologiami oraz jego rolę w oporności na terapię, obecnie prowadzone są intensywne badania w celu lepszego zrozumienia zarówno regulacji, jak i funkcji komórkowej tego enzymu. Z tego powodu niezbędne jest opracowanie prostych i niedrogich, wysokoprzepustowych metod badania interakcji małych cząsteczek z SAMHD1, takich jak regulatory allosteryczne, substraty lub inhibitory. W tym celu test zieleni malachitowej sprzężony z enzymami jest prostym i solidnym testem kolorymetrycznym, który można zastosować w formacie płytki 384-dołkowej, umożliwiając pośredni pomiar aktywności SAMHD1. Ponieważ SAMHD1 uwalnia grupę trifosforanową z substratów nukleotydowych, możemy sprzęgnąć aktywność pirofosfatazy z tą reakcją, wytwarzając w ten sposób nieorganiczny fosforan, który można określić ilościowo za pomocą odczynnika zieleni malachitowej poprzez utworzenie zielonego kompleksu fosfomolibdenianu malachitu. W tym miejscu pokazujemy zastosowanie tej metodologii do scharakteryzowania znanych inhibitorów SAMHD1 i rozszyfrowania mechanizmów zaangażowanych w katalizę SAMHD1 niekanonicznych substratów i regulację przez aktywatory allosteryczne, czego przykładem są leki przeciwnowotworowe na bazie nukleozydów. Tak więc test zieleni malachitowej sprzężony z enzymami jest potężnym narzędziem do badania SAMHD1, a ponadto może być również wykorzystany w badaniu kilku enzymów, które uwalniają formy fosforanów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sterylny motyw alfa i białko 1 (SAMHD1) zawierające domenę histydyny i asparaginianu jest centralnym regulatorem homeostazy nukleotydów w komórkach ssaków1 pełni wiele ról w ludzkim zdrowiu i chorobie2. Enzym ten jest zdolny do hydrolizy trifosforanów deoksynukleozydów (dNTP) do ich pokrewnych cząsteczek deoksynukleozydów i nieorganicznych trifosforanów3,4, przy czym aktywność ta jest allosterycznie regulowana przez obfitość (d)NTP (przejrzane w reference5). Każdy monomer SAMHD1 zawiera dwa miejsca allosteryczne (AS1 i AS2) i jedno miejsce katalityczne, a tworzenie aktywnego enzymu wymaga uporządkowanego złożenia homotetrameru po związaniu (d)NTP. Dimeryzacja monomerów SAMHD1 jest najpierw wyzwalana przez wiązanie trifosforanu guaniny (GTP lub dGTP) z AS1, a następnie tetrameryzacja jest osiągana, gdy dodatkowa cząsteczka dNTP wiąże się z AS2, umożliwiając dostęp substratu do miejsca katalitycznego, a następnie hydrolizę.

Substraty SAMHD1 obejmują cztery kanoniczne dNTPs3,4 wraz z niektórymi nukleotydami modyfikowanymi zasadami i cukrem, w tym metabolity trifosforanowe kilku leków na bazie nukleozydów stosowanych w leczeniu infekcji wirusowych i raka, z których kilka może również służyć jako aktywatory allosteryczne6,7,8,9,10,11. W konsekwencji SAMHD1 moduluje skuteczność wielu z tych związków w modelach chorób7,8,9,10,11,12,13,14,15, a ponadto w przypadku analogu deoksycytydyny cytarabiny (ara-C), który od dziesięcioleci pozostaje standardową terapią ostrej białaczki szpikowej (AML), faktycznie decyduje o skuteczności leczenia w tej chorobie7,8,16. SAMHD1 jest zatem potencjalnym biomarkerem i celem terapeutycznym w celu poprawy skuteczności terapii opartych na nukleozydach17, w związku z czym my i inni staraliśmy się zidentyfikować strategie dezaktywacji SAMHD1 w komórkach. Zaproponowaliśmy użycie białka wirusowego X (Vpx) jako inhibitora biologicznego do ukierunkowania SAMHD1 na degradację wewnątrz komórek rakowych7, jednak podejście to ma szereg ograniczeń (omówionych w reference12), a ostatnio również opisaliśmy pośrednie podejście do tłumienia aktywności SAMHD1 poprzez hamowanie reduktazy rybonukleotydowej, które wykazaliśmy w różnych modelach AML18. Wiele badań miało na celu zidentyfikowanie małych cząsteczek zdolnych do bezpośredniego hamowania SAMHD1 i do tej pory zgłoszono kilka takich cząsteczek, jednak udokumentowano tylko hamowanie in vitro6,9,19,20,21,22. W związku z tym brak małych cząsteczek, które silnie hamują aktywność SAMHD1 w komórkach, w połączeniu ze złożonymi mechanizmami katalizy SAMHD1 w terapiach opartych na nukleozydach, podkreśla potrzebę dalszych badań. W związku z tym solidne i idealnie wysokoprzepustowe metody badania interakcji małych cząsteczek z SAMHD1 są idealne do identyfikacji substratów, regulatorów allosterycznych i inhibitorów tego klinicznie istotnego enzymu.

Dostępnych jest kilka metodologii, które bezpośrednio mierzą aktywność dNTPazy SAMHD1, takich jak chromatografia cienkowarstwowa (TLC)9,20,23 oraz wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)9,21, ale nie są one łatwo podatne na konfiguracje o wysokiej przepływności. Jednym z wyjątków jest test opisany przez Mauneya i wsp., który wykorzystuje zdolność SAMHD1 do hydrolizy fosforanu bis (4-nitrofenylu) (b4NPP) do p-nitrofenolu i fosforanu p-nitrofenylu, gdy Mn2+ jest używany jako kation aktywujący, co skutkuje zmianą kolorymetryczną, którą można łatwo zmierzyć na płytce mikrodołkowej21. Test ten został z powodzeniem wykorzystany do identyfikacji i charakterystyki inhibitorów SAMHD1, ale należy zauważyć, że hydroliza zachodzi przy braku aktywatorów (d) NTP i w obecności prawdopodobnego niefizjologicznego kationu aktywującego, przy czym oba te zastrzeżenia są ważnymi zastrzeżeniami do rozważenia. Sprawia to również, że test ten ma mniejsze zastosowanie do badania i identyfikacji regulatorów allosterycznych SAMHD1.

W tym kontekście, podejście sprzężone z enzymem w połączeniu z odczynnikiem malachitowym zielonym, jak szczegółowo opisano w tym raporcie, może być wszechstronną metodą pośredniego pomiaru aktywności dNTPazy SAMHD1 i, ponadto, badania wpływu różnych małych cząsteczek na nią. Test zieleni malachitowej jest solidną i niezawodną techniką kolorymetryczną do wykrywania wolnego fosforanu nieorganicznego (Pi), opartą na tworzeniu kompleksu kwasu molibdofosforowego, który prowadzi do zmiany kolorymetrycznej mierzonej przy 620 nm24. Ponieważ hydroliza SAMHD1 uwalnia grupę trifosforanową z substratów nukleotydowych, konieczne jest sprzężenie tej reakcji z aktywnością (piro)fosfatazy, która wytworzy wolny nieorganiczny fosforan, przed dodaniem odczynnika zieleni malachitowej. Test zieleni malachitowej jest czuły i opłacalny i jest szeroko stosowany do identyfikacji i charakterystyki inhibitorów i substratów enzymów, które uwalniają nieorganiczne grupy fosforanowe w swoich reakcjach lub w obecności enzymu sprzęgającego. Jest szeroko stosowany w charakterystyce aktywności ATPazy helikaz25,26,27, lub w badaniu aktywności enzymatycznej CD73, która pośredniczy w degradacji AMP do adenozyny i fosforanu nieorganicznego28. Dodatkowo, po sprzężeniu, został wykorzystany do odkrycia antybiotyków ukierunkowanych na pirofosfatazę UDP-2,3-diacyloglukozaminy LpxH, niezbędny enzym w większości patogenów Gram-ujemnych29. Jeśli chodzi o badania nad rakiem, podejście sprzężone z enzymami zostało szeroko wdrożone w odniesieniu do hydrolaz NUDIX, rodziny enzymów metabolizujących nukleotydy, zarówno w charakterystyce substratów30,31,32 jak i w identyfikacji i rozwoju leków i sond chemicznych33,34,35,36.

Jeśli chodzi o dNTPase SAMHD1, to podejście zostało wykorzystane w kilku raportach. Wykorzystując egzopolifosfatazę Ppx1 z Saccharomyces cerevisiae jako enzym sprzęgający, test ten został wykorzystany do przetestowania kilku analogów nukleotydów jako substratów, aktywatorów lub inhibitorów SAMHD1 i doprowadził do identyfikacji metabolitu trifosforanowego leku przeciwbiałaczkowego klofarabiny jako aktywatora i substratu6. Dodatkowo, z nieorganiczną pirofosfatazą z Escherichia coli jako enzymem sprzęgającym, został on wykorzystany w badaniach przesiewowych biblioteki klinicznie zatwierdzonych związków przeciwko SAMHD1 w celu identyfikacji inhibitorów20. W naszych badaniach wykorzystaliśmy to podejście, aby pokazać, że ara-CTP, aktywny metabolit ara-C, jest substratem SAMHD1, ale nie aktywatorem allosterycznym7, a następnie użyliśmy tego testu, aby pokazać, że kilka małych cząsteczek, które mogą uwrażliwiać modele AML na ara-C w sposób zależny od SAMHD1, w rzeczywistości nie hamują bezpośrednio SAMHD118. W tym raporcie szczegółowo omówimy tę wszechstronną metodę i zademonstrujemy jej przydatność, w konfiguracji o wysokiej przepustowości, do identyfikacji inhibitorów, aktywatorów i substratów SAMHD1.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny przegląd poniższych metod jest przedstawiony w Rysunek 1, a szczegółowa lista materiałów i odczynników jest dostępna w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie testowych.

  1. Przygotowanie zapasowych.
    UWAGA: Ponieważ test jest wrażliwy na wykrywanie fosforanów, co może być powszechne, należy trzykrotnie spłukać szklane naczynia wodą ultraczystą lub podwójnie destylowaną, aby uniknąć zanieczyszczenia. Wszystkie mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej (RT).
    1. Przygotować 1 l roztworu podstawowego buforu reakcyjnego (RB) SAMHD1 (25 mM octanu trisu pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2) rozpuszczając 4,5 g octanu tris, 2,3 g NaCl i 0,2 g MgCl2 w około 800 ml wody przed dostosowaniem do pH 8 i końcowej objętości.
    2. Przygotować 5 ml 0,1 M roztworu podstawowego TCEP, rozcieńczając 1 ml 0,5 M TCEP w 4 ml wody.
    3. Przygotować 50 ml 11% roztworu podstawowego Tween-20, rozcieńczając 5 ml 100% Tween-20 w 44,5 ml wody.
      UWAGA: Tween-20 jest wrażliwy na światło.
    4. Przygotuj 50 ml 0,5 M roztworu zatrzymującego EDTA, rozpuszczając 9,3 g EDTA w około 40 ml wody przed dostosowaniem do pH 8 i końcowej objętości.
    5. Przygotować roztwór podstawowy zieleni malachitowej (MG) (3,2 mM zieleni malachitowej wH2SO4), powoli dodając 60 ml stężonego kwasu siarkowego do 300 ml wody w brązowej szklanej butelce. Schłodzić roztwór do temperatury suchej i rozpuścić 0,44 g zieleni malachitowej.
      ostrożność: Reakcja kwasu siarkowego z wodą jest egzotermiczna, więc butelka może się nagrzewać, powodując wzrost ciśnienia; Upewnij się, że to ciśnienie jest często uwalniane.
      UWAGA: Otrzymany pomarańczowy roztwór jest wrażliwy na światło (stąd brązowa butelka) i stabilny przez co najmniej 1 rok w temperaturze pokojowej. Osad może tworzyć się z czasem, upewnij się, że używany jest tylko supernatant.
    6. Przygotować 50 ml 7% roztworu podstawowego molibdenianu amonu, rozpuszczając 3,75 g molibdenianu amonu w 50 ml wody.
      UWAGA: Osad może tworzyć się z czasem, upewnij się, że używany jest tylko supernatant.
  2. Przygotowanie kompletnych do oznaczania
    UWAGA: Należy to zrobić w dniu eksperymentu
    1. Przygotuj kompletny SAMHD1 RB (25 mM Tris-Acetate pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20). Użyj wcześniej przygotowanych zapasów 11% Tween-20 i 0,1 M TCEP, aby dodać te składniki w końcowym stężeniu 0,005% dla Tween-20 i 0,3 mM dla TCEP do zapasów SAMHD1 RB.
    2. Przygotować roztwór zatrzymujący EDTA (25 mM octan trisu pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20, 7,9 mM EDTA). Aby ukończyć SAMHD1 RB, użyj 0,5 M roztworu podstawowego EDTA, aby dodać EDTA do końcowego stężenia 7,9 mM.
    3. Przygotować roztwór roboczy MG (2,5 mM zieleni malachitowej, 1,4% molibdenianu amonu, 0,18% Tween-20) mieszając 10 części roztworu podstawowego MG z 2,5 częściami 7% molibdenianu amonu i 0,2 części 11% Tween-20.

2. Test inhibicji SAMHD1 i oznaczanie związku IC50

UWAGA: Końcowe warunki testu są pokazane w Tabeli 1.

  1. Przygotowanie związków na płytce do oznaczania
    UWAGA: Związki o małej masie cząsteczkowej są zwykle rozpuszczane w 100% DMSO, a analogi nukleotydów w wodzie. Stężenie wyjściowe waha się od 10 do 100 mM i zależy od siły działania i rozpuszczalności związków, a także tolerancji DMSO testu. Sprawdź, czy końcowe stężenie DMSO w reakcji nie przekracza 1%, aby upewnić się, że ten rozpuszczalnik nie ma wpływu na aktywność enzymów. Dobrą praktyką jest zbadanie tolerancji testu na rozpuszczalnik przed rozpoczęciem doświadczenia.
    1. Przygotować seryjnie rozcieńczone związki testowe o 100-krotnym stężeniu końcowym w odpowiednim rozpuszczalniku (np. 100% DMSO dla małych cząsteczek lub woda dla analogów nukleotydów) na przezroczystej, okrągłodennej 96-dołkowej płytce polipropylenowej za pomocą wielokanałowej pipety lub zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy.
      UWAGA: W zależności od stabilności związku, płytki rozcieńczające mogą być przygotowane z wyprzedzeniem, szczelnie zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 °C. Poczekaj, aż płytki zrównoważą się do RT przed kontynuowaniem protokołu.
    2. Używając kompletnego SAMHD1 RB, rozcieńczyć związki do 25-krotnego stężenia końcowego (aby utrzymać końcowe stężenie rozpuszczalnika poniżej 1%) i przenieść 5 μl do odpowiednich studzienek na przezroczystej, 384-dołkowej, płaskodennej płytce testowej. Powtórzyć procedurę z próbkami kontrolnymi zawierającymi tylko rozpuszczalnik.
  2. Przygotowanie składników reakcji
    UWAGA: Należy to zrobić w dniu testu. Rekombinowane podwielokrotności ludzkiej pirofosfatazy SAMHD1 i E. coli (PPazy) są przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C, rozcieńczone odpowiednio w stężeniu 9,1 mg/ml i 23,0 mg/ml w buforze do przechowywania (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10% glicerolu, 2 mM TCEP). Po rozmrożeniu podwielokrotności są przechowywane przez krótki czas w temperaturze -20 °C.
    1. Przygotować główną mieszankę enzymów (SAMHD1/PPazy) poprzez rozcieńczenie rekombinowanego ludzkiego białka SAMHD1 i rekombinowanej PPazy w pełnym SAMHD1 RB do 4x pożądanego stężenia końcowego, a więc 1,4 μM SAMHD1 i 50 U/ml PPazy.
    2. Przygotować aktywator/substrat dGTP, rozcieńczając materiał dGTP (zwykle 10 lub 100 mM w wodzie) w pełnym SAMHD1 RB do 2x końcowego stężenia, a więc 50 μM dGTP.
  3. Wykonaj test<br /> UWAGA: Wszystkie składniki testu powinny być zrównoważone z RT. Dodawanie cieczy można wykonać za pomocą pipety wielokanałowej lub dozownika płynu z odczynnikiem luzem.
    1. Na 384-dołkową płytkę testową zawierającą rozcieńczenia związków i kontrole zawierające tylko rozpuszczalnik, dozować 5 μl głównej mieszanki SAMHD1/PPazy. Do braku studzienek kontroli enzymów należy dozować 5 μl kompletnego SAMHD1 RB. Wstępnie inkubować enzymy i związki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Do wszystkich studzienek należy dozować 10 μl 2x roztworu dGTP, aby rozpocząć reakcję.
    3. Inkubować reakcję przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Zatrzymaj reakcję, dozując 20 μl roztworu zatrzymującego EDTA do wszystkich studzienek.
      UWAGA: W razie potrzeby eksperyment można w tym miejscu wstrzymać.
    5. Dodać 10 μl MG roztworu roboczego do wszystkich studzienek.
      ostrożność: Roztwór roboczy MG zawiera kwas siarkowy.
    6. Zapewnić wymieszanie zawartości studzienki za pomocą orbitalnej wytrząsarki mikrodołkowej i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min.
    7. Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Odczytaj absorpcję przy długości fali 630 nm w czytniku płytek mikrodołkowych.
  4. Wizualizacja i analiza danych
    1. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe studzienek kontroli dodatniej i ujemnej (dodatnia, pełna reakcja z rozpuszczalnikiem; ujemna, dGTP sama z rozpuszczalnikiem). Oblicz współczynnik Z37 jako wskaźnik jakości testu.
    2. Znormalizować każdą wartość absorbancji do średnich wartości kontroli dodatniej i ujemnej, ustawiając kontrolę dodatnią na 100% aktywność SAMHD1, a kontrolę ujemną na 0% aktywność SAMHD1.
    3. Wykreślić aktywność SAMHD1 (%) w funkcji stężenia związku i dopasować czteroparametrową krzywą nachylenia dawka-odpowiedź, co pozwala na określenie IC50 związku.

3. Aktywator SAMHD1 i ekran podłoża

UWAGA: Końcowe warunki testu są pokazane w Tabeli 2. Rekombinowane podwielokrotności SAMHD1 i PPazy są przechowywane przez długi czas w temperaturze -80 °C, rozcieńczone odpowiednio w stężeniu 9,1 mg/ml i 23,0 mg/ml w buforze do przechowywania (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10% glicerolu, 2 mM TCEP) w temperaturze -80 °C. Po rozmrożeniu podwielokrotności są przechowywane przez krótki czas w temperaturze -20 °C.

  1. Przygotowanie analogów nukleotydów na płytce testowej
    1. Rozcieńczyć analogi nukleotydów (zwykle 10 lub 100 mM w wodzie) do 4x końcowego stężenia w kompletnym SAMHD1 RB, w naszym przypadku analogu nukleotydu 800 μM, i przenieść 5 μL do odpowiednich studzienek 384-dołkowej płytki testowej.
  2. Przygotowanie składników reakcji
    UWAGA: Należy to zrobić w dniu testu
    1. Przygotować główną mieszankę enzymów (SAMHD1/PPazy) poprzez rozcieńczenie rekombinowanego ludzkiego białka SAMHD1 i rekombinowanej PPazy E. coli w pełnym SAMHD1 RB do 2x pożądanego stężenia końcowego, a więc 0,7 μM SAMHD1 i 25 U/ml PPazy.
    2. Przygotować roztwór samej PPazy, rozcieńczając rekombinowaną PPazę E. coli w pełnym SAMHD1 RB do 2x pożądanego stężenia końcowego, a więc 25 U/ml PPazy.
    3. Przygotować aktywatory GTP (AS1) i dGTPαS (AS1 i AS2) rozcieńczające (zwykle 10 lub 100 mM w wodzie) w pełnym SAMHD1 RB do 4-krotnego stężenia końcowego, a więc 50 μM GTP lub dGTPαS.
  3. Wykonaj test<br /> UWAGA: Wszystkie składniki testu powinny być zrównoważone z RT. Dodawanie cieczy można wykonać za pomocą pipety wielokanałowej lub dozownika płynu z odczynnikiem luzem.
    1. Do 384-dołkowej płytki testowej zawierającej analogi nukleotydów dozować 5 μl aktywatora (GTP lub dGTPαS) lub pełnego SAMHD1 RB do odpowiednich studzienek.
    2. Rozpocznij reakcję od dozowania 10 μl głównej mieszanki SAMHD1/PPazy, samej PPazy lub całego SAMHD1 RB do odpowiednich studzienek.
    3. Inkubować reakcję przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Zatrzymaj reakcję, dozując 20 μl roztworu zatrzymującego EDTA do wszystkich studzienek.
      UWAGA: W razie potrzeby eksperyment można w tym miejscu wstrzymać.
    5. Dodać 10 μl MG roztworu roboczego do wszystkich studzienek.
      ostrożność: Roztwór roboczy MG zawiera kwas siarkowy.
    6. Zapewnić wymieszanie zawartości studzienki za pomocą orbitalnej wytrząsarki mikrodołkowej i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min.
    7. Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Odczytaj absorpcję przy długości fali 630 nm w czytniku płytek mikrodołkowych.
  4. Wizualizacja i analiza danych
    1. Obliczyć średnie wartości absorbancji dla studzienek reakcyjnych tylko dla PPazy (kontrola ujemna lub sygnał tła).
      UWAGA: Jako pozytywna kontrola aktywatora allosterycznego SAMHD1 i substratu, dGTP może być zawarty w płytce. W takim przypadku można użyć tego warunku do obliczenia współczynnika Z jako wskaźnika jakości testu.
    2. Odejmij wartość tła od odpowiednich studzienek w reakcjach SAMHD1/PPase.
    3. Wykreślić skorygowane wartości absorbancji dla każdego analogu nukleotydu z warunkami buforu, GTP i dGTPαS.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w Rysunek 1 opisuje podstawowy proces wykorzystania testu zielonego malachitu sprzężonego z enzymem do badania interakcji małych cząsteczek z dNTPazą SAMHD1 i może być dostosowany na wiele sposobów do badania różnych pytań biochemicznych. W reprezentatywnych wynikach omówionych w poniższych akapitach ilustrujemy przykłady zastosowania tego testu do określenia właściwości hamujących małych cząsteczek w stosunku do SAMHD1 oraz do sprawdzenia, czy różne analogi nukleotydów są substratami i/lub aktywatorami tego enzymu.

Wyniki pokazane w Rysunek 2 ilustruje kilka podstawowych zasad tego testu. Odczynnik zieleni malachitowej umożliwia kolorymetryczne wykrywanie nieorganicznego fosforanu poprzez tworzenie kompleksu zieleni fosfomolibdenianowej malachitu, a zatem podejście to można zastosować do badania reakcji enzymatycznych, których produktem jest fosforan. Aby zademonstrować czułość tej metody do wykrywania wolnego fosforanu nieorganicznego, Rysunek 2A pokazuje wartości absorbancji uzyskane przy rosnących stężeniach Na3PO4 po 20 minutowej inkubacji z zielonym odczynnikiem malachitowym. Podczas gdy sygnał osiąga nasycenie przy 0,25 mM Na3PO4, liniowy zakres wykrywania fosforanu jest widoczny od 0,004 do 0,03 mM (Rysunek 2A, prawy panel), zgodnie z innymi badaniami, które wykazały liniowy zakres fosforanów do 10-20 μM przy użyciu testu zieleni malachitowej38.

SAMHD1 to dNTPaza, która uwalnia nieorganiczny trifosforan podczas hydrolizy cząsteczki dNTP, a więc aby wytworzyć wolny nieorganiczny fosforan do wykrycia przez zieleń malachitową, wymagany jest enzym sprzęgający. Wykazano, że nieorganiczna pirofosfataza (PPaza) z E. coli jest przydatna do tego celu, zarówno w odniesieniu do SAMHD17,20, ale także innych enzymów metabolizujących nukleotydy30,33,35. Dodatkowo, SAMHD1 jest aktywną dNTPazą, gdy jest homotetramerem, a to wymaga allosterycznej aktywacji przez (d) NTP, w szczególności trifosforan guaniny (GTP lub dGTP) w AS1 i dowolny dNTP w AS2. Następnie miejsce katalityczne staje się dostępne do wiązania substratu i zachodzi reakcja enzymatyczna. Ponieważ dGTP spełnia wymagania dotyczące wiązania z AS1 i AS2 i jest substratem, zastosowanie tego nukleotydu w teście inhibicji znacznie upraszcza przepływ pracy. Rysunek 2B ilustruje wymagania różnych składników testu, aby osiągnąć mierzalną aktywność SAMHD1, na co wskazuje wzrost absorbancji przy 630 nm. Ani sam SAMHD1, ani PPaza nie są zdolne do wytwarzania nieorganicznego fosforanu w obecności dGTP, co jest zgodne z udokumentowaną aktywnością tych enzymów. Jednak w stanie, w którym obecne są wszystkie składniki testu (SAMHD1, PPaza i aktywator/substrat dGTP) obserwujemy wzrost sygnału. Współczynnik Z37 w przedstawionym tutaj przykładzie (przyjmując brak enzymów + dGTP jako kontrolę ujemną i SAMHD1/PPazę + dGTP jako kontrolę pozytywną) wynosił 0,74, co wskazuje na solidny test.

Jednym z potencjalnych zastosowań testu aktywności SAMHD1 sprzężonego z enzymami jest identyfikacja inhibitorów za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS). Dlatego w tym raporcie walidujemy wykrycie hamowania SAMHD1 w tym teście przy użyciu różnorodnego zestawu związków już opisanych w literaturze. Seamon i wsp. ocenili zależne od dawki hamowanie kanonicznych nukleozydów w kierunku SAMHD1 przy użyciu podobnego testu, jak pokazano tutaj, i stwierdzili, że deoksyguanozyna (dGuo) była jedynym kanonicznym nukleozydem zdolnym do znacznego hamowania SAMHD1, z wartością IC50 wynoszącą 488 μM20. HTS leków zatwierdzonych przez FDA przeprowadzonych za pomocą bezpośredniego testu b4NPP ujawnił kilka trafień, które hamowały aktywność SAMHD1 przy stężeniach mikromolowych, z których lomofungina była cząsteczką, która najsilniej hamowała aktywność dNTPazy SAMHD1 in vitro, wykazując IC50 20,1 μM po określeniu w obecności dGTP jako substratu21. Ponadto cztery analogi α,β-imido-dNTP zostały również zidentyfikowane jako konkurencyjne inhibitory SAMHD1 przy użyciu czujnika MDCC-PBP i SAMHD1 sprzężonego z aktywnością Ppx, co wykazało, że stałe hamujące analogów dNMPNPP mieściły się w zakresie niskich mikromolowych / wysokich nanomolowych6,22. W związku z tym, aby wykazać, że test aktywności SAMHD1 sprzężony z enzymami można wykorzystać do identyfikacji inhibitorów SAMHD1, do walidacji techniki wykorzystano dGuo, lomofunginę i trifosforan 2'-deoksytymidyno-5'-[(α,β)-imido]trifosforan (dTMPNPP). Rysunek 3A ilustruje krzywe dawka-odpowiedź uzyskane dla tych związków, pokazując, że zwiększenie stężenia skutecznie hamuje aktywność SAMHD1. Średnie wartości IC50 uzyskane dla tych cząsteczek z trzech niezależnych eksperymentów (± odchylenie standardowe) były następujące: dGuo = 361,9 ± 72,8 μM, lomofungina 6,78 ± 3,9 μM, a dTMPNPP = 2,10 ± 0,9 μM. Jako przykład wyniku ujemnego określono również wpływ hydroksymocznika (HU) na aktywność SAMHD1. HU jest inhibitorem reduktazy rybonukleotydowej i chociaż ogranicza aktywność ara-CTPazy SAMHD1 w różnych modelach AML, wykazano, że wpływ HU na SAMHD1 jest pośredni i polega na zaburzeniu allosterycznej regulacji SAMHD118. Krzywa odpowiedzi na dawkę HU jest pokazana w Rysunek 3B, i nie zaobserwowano żadnych zmian w aktywności SAMHD1 wraz ze wzrostem dawek HU, co pokazuje, że HU nie hamuje aktywności SAMHD1 in vitro.

Innym zastosowaniem testu aktywności SAMHD1 sprzężonego z enzymem jest sprawdzenie, czy nukleotydy i ich analogi są substratami i/lub aktywatorami allosterycznymi tego enzymu, co jest zilustrowane w Rysunek 4. W tym eksperymencie badano kanoniczne nukleotydy, a także aktywne metabolity kilku przeciwnowotworowych analogów nukleozydów, takich jak cytarabina (ara-CTP), klofarabina (Cl-F-ara-ATP) i gemcytabina (dF-dCTP), jako substraty i aktywatory SAMHD1. Ze względu na złożoną regulację allosteryczną SAMHD1, reakcja przebiega w obecności GTP jako aktywatora AS1 lub niehydrolizowanego analogu dGTP 2'-deoksyguanozyno-5'-(α-tio)-trifosforanu (dGTPαS), który może zajmować AS1 i AS2. Aktywność SAMHD1 w obecności badanego analogu nukleotydu i GTP wskazuje, że nukleotyd jest w stanie związać się z wtórnym miejscem allosterycznym i miejscem katalitycznym (tj. aktywatorem AS2 i substratem), podczas gdy aktywność SAMHD1 z analogiem nukleotydu i dGTPαS wskazuje, że nukleotyd może zajmować tylko miejsce katalityczne (tj. tylko substrat). Jeśli nukleotyd jest w stanie związać się zarówno z miejscami allosterycznymi AS1, jak i AS2 oraz z miejscem katalitycznym, SAMHD1 będzie aktywny w obecności samego nukleotydu, jak pokazano w przypadku dGTP. Wyniki pokazują, że wszystkie kanoniczne dNTP są w stanie wiązać się z miejscem AS2 i z miejscem katalitycznym. W przypadku analogów nukleotydów trifosforan klofarabiny jest aktywatorem AS2 i substratem, podczas gdy trifosforan cytarabiny jest w stanie zająć tylko miejsce katalityczne. Z drugiej strony, nie zaobserwowano żadnej aktywności trifosforanu gemcytabiny, co sugeruje, że w badanych warunkach trifosforan gemcytabiny nie jest w stanie działać jako efektor allosteryczny ani substrat. Chociaż wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi przewidywaniami9, późniejsze badania krystalizacji i kinetykiki10 ujawniły, że trifosforan gemcytabiny jest w stanie związać kieszeń katalityczną SAMHD1 i że jest to rzeczywiście substrat enzymu. Jednak w tym ostatnim badaniu10, autorzy wykazali, że szybkość hydrolizy jest znacznie niższa w porównaniu z innymi zgłoszonymi substratami, takimi jak trifosforan cytarabiny, co wyjaśnia, dlaczego nie byliśmy w stanie zaobserwować tego za pomocą tej konfiguracji przesiewowej.

Łącznie, te reprezentatywne wyniki potwierdzają użycie testu aktywności SAMHD1 sprzężonego z enzymem jako solidnej techniki do identyfikacji i charakterystyki inhibitorów SAMHD1, regulatorów allosterycznych i substratów. Jednak, podobnie jak w przypadku wszystkich podejść eksperymentalnych, metoda ta ma swoje zastrzeżenia, a zatem testy ortogonalne (np. przy użyciu innej technologii testowania) powinny być stosowane w celu dalszej walidacji wyników.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu opisanego w tym artykule. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Test aktywności SAMHD1 sprzężony z enzymem. (A) Na3PO4 krzywa standardowa w teście zieleni malachitowej. Na3PO4 seryjne rozcieńczenie (2-krotne) przygotowywano od 1 mM do 0,004 mM w trzech powtórzeniach i inkubowano z odczynnikiem malachitowym przez 20 min. Wartości absorbancji surowej w pełnym zakresie badanych stężeń są pokazane w lewym panelu, a zakres liniowy w prawym panelu. Pokazano przedstawiciela dwóch niezależnych eksperymentów. (B) Walidacja testu aktywności sprzężonej z enzymami. SAMHD1 (0,35 μM) i/lub PPaza (12,5 U/ml) w obecności lub braku aktywatora/substratu dGTP (25 μM) inkubowano przez 20 minut w teście aktywności sprzężonej z enzymami. Czworaczki z reprezentatywnego dla dwóch niezależnych eksperymentów pokazane z wykreślonymi wartościami absorbancji surowej, słupkami i słupkami błędu wskazują średnią i SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ocena związków pod kątem inhibicji SAMHD1 w teście aktywności sprzężonej z enzymami. Odpowiedź na dawkę lomofunginy (0,78-100 μM), 2'-deoksytymidyno-5'-[(α,β)-imido]trifosforanu (dTMPNPP, 0,01-100 μM) i deoksyguanozyny (dGuo, 10-1,500 μM) (A) lub hydroksymocznika (HU) (0,78-100 μM) (B) w teście aktywności SAMHD1 sprzężonym z enzymem z dGTP (25 μM) jako aktywatorem/substratem. Procentowa aktywność w stosunku do kontroli reakcji z poszczególnych kontrprób wykreślona na wykresie (DMSO + SAMHD1/PPaza + dGTP = 100% aktywności, DMSO + dGTP = 0% aktywności) z pokazanym przedstawicielem trzech eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ocena analogów nukleotydów jako allosterycznych aktywatorów i substratów SAMHD1 w teście aktywności sprzężonej z enzymami. Nukleotydy kanoniczne i wybrane metabolity trifosforanowe leków przeciwnowotworowych cytarabiny (ara-CTP), klofarabiny (Cl-F-ara-ATP) i gemcytabiny (dF-dCTP) badano przy 200 μM w teście aktywności SAMHD1 sprzężonym z enzymami w obecności lub bez GTP lub niehydrolizowanego analogu dGTP dGTPαS (12,5 μM). Wskazane są znormalizowane wartości absorbancji z poszczególnych kontrprób doświadczalnych, wykreślone średnie i SD. Przedstawiciel dwóch pokazanych niezależnych eksperymentów, zaadaptowany z naszego poprzedniego badania7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział
krokOdczynnikDozowana objętość (μL)Końcowa objętość reakcyjna (μL)Dozowane stężenieRozcieńczenie krotne w reakcjiKońcowe stężenie w reakcji
1inhibitor5200,4 mM40,1 mM
cyfra arabskaSAMHD1+PPaza mieszana51,4 μM SAMHD1, 50 U/ml PPazy40,35 μM SAMHD1, 12,5 U/ml Ppazy
3Napęd dGTP1050 μMcyfra arabska25 μM
4Inkubacja przez 20 minut
5Roztwór EDTA20Rozdział 407,9 mMcyfra arabska3,95 mln
6Odczynnik MG10502,5 mM zieleń malachitowa, 64,4 mM Molibdenian amonu, 0,18% Tween-2050,5 mM zieleń malachitowa, 12,9 mM Molibdenian amonu, 0,036% Tween-20
7Inkubacja przez 20 minut
8Czytaj @ 630 nm

Tabela 1: Podsumowanie końcowych warunków w teście sprzężonym z enzymami do badań przesiewowych inhibitorów.

Rozdział
krokOdczynnikDozowana objętość (μL)Końcowa objętość reakcyjna (μL)Dozowane stężenieRozcieńczenie krotne w reakcjiKońcowe stężenie w reakcji
1Regulator allosteryczny520800 μM4200 μM
cyfra arabskaGTP lub dGTPαS550 μM412,5 μM
3SAMHD1 i/lub PPaza100,7 μM SAMHD1, 25 U/ml PPazycyfra arabska0,35 μM SAMHD1, 12,5 U/ml PPazy
4Inkubacja przez 20 minut
5Roztwór EDTA20Rozdział 407,9 mMcyfra arabska3,95 mln
6Odczynnik MG10502,5 mM zieleń malachitowa, 64,4 mM Molibdenian amonu, 0,18% Tween-2050,5 mM zieleń malachitowa, 12,9 mM Molibdenian amonu, 0,036% Tween-20
7Inkubacja przez 20 minut
8Czytaj @ 630 nm

Tabela 2: Podsumowanie końcowych warunków w teście sprzężonym z enzymami dla badań przesiewowych regulatorów allosterycznych

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj test aktywności sprzężonej z enzymami jest testem kolorymetrycznym o wysokiej przepustowości, umożliwiającym pośredni pomiar hydrolizy dNTP przez SAMHD1. Metoda ta wykorzystuje zdolność nieorganicznej PPazy z E. coli, która po włączeniu do mieszaniny reakcyjnej w nadmiarze przekształca każdy nieorganiczny trifosforan wygenerowany przez SAMHD1 w trzy pojedyncze wolne fosforany, które można określić ilościowo za pomocą prostego i ekonomicznego odczynnika zieleni malachitowej. Dostarczamy ten test w formacie płytki mikrodołkowej 384, która jest idealna do badań przesiewowych bibliotek związków i pokazujemy zastosowanie i wszechstronność tej techniki w identyfikacji i charakterystyce inhibitorów, aktywatorów i substratów SAMHD1.

Podobnie jak w przypadku wszystkich biochemicznych testów przesiewowych in vitro , istnieje szereg krytycznych etapów i ważnych kwestii, a wiele z nich zostało szczegółowo omówionych w ogólnodostępnym Podręczniku wytycznych dotyczących testów39. Integralność oczyszczonych rekombinowanych enzymów, zarówno SAMHD1, jak i sprzężonego enzymu nieorganicznej PPazy, jest niezwykle ważna i powinna zostać potwierdzona przed ustaleniem testu. W związku z tym każde nowe oczyszczanie tych enzymów powinno podlegać pewnemu poziomowi testów seriowych, ponieważ zmienność między partiami może wprowadzać niespójności w wynikach. Idealnie byłoby, gdyby zastosowanie ortogonalnego testu bezpośredniego, takiego jak HPLC, który umożliwia wykrycie zarówno substratu, jak i produktu reakcji, było stosowane w celu sprawdzenia aktywności trifosfohydrolazy dNTP w stosowanym rekombinowanym SAMHD1.

Jeśli chodzi o ograniczenia tego testu, zasadniczą zasadą jest to, że mierzy on aktywność dNTPazy SAMHD1 w sposób pośredni, wykorzystując aktywność nieorganicznej PPazy, co ma szereg implikacji. Ważne jest, aby potwierdzić, że PPaza ma niewielką lub żadną aktywność w stosunku do nukleotydów użytych w teście, a także, że zidentyfikowane małe cząsteczki hamujące nie wykazują żadnej aktywności w stosunku do PPazy. Tak więc, jeśli chodzi o badania przesiewowe, ważnym czynnikiem może być przeciwdziałanie PPazie. Obecność PPazy w reakcji sprawia również, że kluczowe znaczenie ma użycie testu ortogonalnego w celu potwierdzenia wyników. Jeśli chodzi o testy aktywności bezpośredniej, do tej pory zgłoszono wiele z nich, w tym TLC 9,20,23 i HPLC 9,21, które dokładnie wykrywają wyczerpanie substratu i tworzenie produktu. Ponadto test b4NPP21, który jest również wysokoprzepustowy, może być wykorzystany do testowania potencjalnych inhibitorów; Nie jest to jednak idealne rozwiązanie do testowania substratów lub aktywatorów allosterycznych. Testy biofizyczne, takie jak różnicowa fluorymetria skaningowa (DSF), które wcześniej opisywaliśmy w przypadku SAMHD118, mogą być również szczególnie skuteczne w identyfikacji i charakterystyce ligandów. Innym ograniczeniem testu, w szczególności pokazanym w konfiguracji do identyfikacji substratów i aktywatorów, jest użycie niehydrolizowanego analogu dGTP dGTPαS jako aktywatora AS1 i AS2. Chociaż pozwala to na aktywację SAMHD1 bez obserwowalnej aktywności w teście, dGTPαS jest konkurencyjnym inhibitorem SAMHD1, a zatem zastosowanie wysokich stężeń spowoduje dezaktywację enzymu. Wraz z postępem w zrozumieniu SAMHD1, przyszłe badania mogą wykorzystywać cząsteczki, które zajmują wyłącznie każde miejsce SAMHD1, negując w ten sposób ten potencjalny problem.

Jak wykazaliśmy tutaj, metoda ta jest wszechstronna i może być stosowana do rozwiązywania wielu pytań biochemicznych. Opisaliśmy dwie wersje tego testu, jedną do identyfikacji regulatorów allosterycznych i substratów SAMHD1, a drugą do charakterystyki inhibitorów, ale można dokonać dalszych adaptacji. Jeśli chodzi o potencjalne inhibitory, test ten, oparty na płytce mikrodołkowej, dobrze nadaje się do dalszych badań nad mechanizmem działania39,40. Podobnie, w celu dalszej charakterystyki substratów i regulatorów allosterycznych, technika ta może być wykorzystana do określenia parametrów kinetycznych katalizy, tak jak to zrobiliśmy dla aktywnego metabolitu cytarabiny i klofarabiny7. Jednak jedną wadą jest to, że opisany tutaj test sprzężony z enzymami jest testem końcowym, a więc, chociaż dobrze nadaje się do badań przesiewowych, test ciągły byłby lepiej odpowiedni dla niektórych badań mechanistycznych. Arnold i in. opisali ciągły test sprzężony z enzymami, który wykorzystuje bioczujnik MDCC-PBP6, który opiera się na użyciu peryplazmatycznego białka wiążącego fosforan (PBP) znakowanego fluoroforem maleimidu kumaryny (MDCC), który może wiązać się z wolną grupą fosforanową. MDCC-PBP jest bardzo czuły i umożliwia ilościowe określanie bardzo niskich stężeń fosforanów, przy czym czas reakcji czujnika mieści się w skali od milisekundy do sekundy.

SAMHD1 pełni szereg ważnych funkcji w zdrowiu i chorobie człowieka2 , z których wiele można powiązać z jego centralną rolą w utrzymaniu wewnątrzkomórkowego poziomu dNTP1. Tak więc identyfikacja wysokiej jakości sondy chemicznej w kierunku aktywności dNTPazy SAMHD1 byłaby potężnym narzędziem w definiowaniu tych powiązań, a opisany tutaj test sprzężony z enzymami może być łatwo wykorzystany do identyfikacji takich sond. Ponadto, ponieważ leki na bazie nukleozydów, z których wiele jest modulowanych przez SAMHD1, stanowią zróżnicowaną i ważną grupę terapeutyczną41; Sondy chemiczne mogą być dalej rozwijane w celu opracowania leków ukierunkowanych na SAMHD1 w warunkach klinicznych, w celu zwiększenia skuteczności tych terapii. Kluczowe znaczenie ma również zrozumienie pełnego zakresu interakcji tych związków na bazie nukleozydów z SAMHD1, na które pytanie można odpowiedzieć również za pomocą tego testu sprzężonego z enzymami. Podsumowując, sprzężony z enzymami test aktywności SAMHD1, opisany tutaj, jest tanim, wszechstronnym i wysokoprzepustowym testem, który można wykorzystać do pogłębienia naszego zrozumienia tego ważnego enzymu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Thomasowi Lundbäckowi i członkom laboratorium Thomasa Helledaya za rady i wsparcie. Część tych prac została ułatwiona przez Zakład Badań nad Białkami w Karolinska Institutet/SciLifeLab (http://ki.se/psf), a my dziękujemy Narodowemu Instytutowi Raka (NCI), Wydziałowi Leczenia i Diagnostyki Nowotworów (DCTD) oraz Programowi Terapii Rozwojowej (DTP) (http://dtp.cancer.gov) za dostarczenie związku. Finansowanie zostało zapewnione dzięki grantom przyznanym S.G.R. przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (2018-02114), Szwedzkie Towarzystwo Onkologiczne (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), Szwedzki Fundusz Walki z Rakiem Dziecięcym (PR2019-0014) oraz Karolinska Institutet.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2'-deoksyadenozyno-5'-trifosforan (dATP)Jena bioscienceNU-1001Związek testowany w teście aktywatora/substratu SAMHD1
'-deoksycytydyno-5'-trifosforan (dCTP)Jena bioscienceNU-1002Związek testowany w teście aktywatora/substratu SAMHD1
'-deoksyguanozyno-5'-(alfa;-tio)-trifosforan (dGTPα S)Jena bioscienceNU-424Niehydrolizowalny analog dGTP do testu aktywatora/substratu SAMHD1
2'-deoksyguanozyno-5'-trifosforan (dGTP)GE Healthcare27-1870-04Aktywator allosteryczny i substrat SAMHD1 stosowany w teście inhibicji i teście aktywator/substrat
2'-Deoksytymidyno-5'-[(&alfa;,β)-imido]trifosforan (dTMPNPP)Jena bioscienceNU-907-1Związek testowany w teście hamowania SAMHD1
2'-deoksytymidyno-5'-trifosforan (dTTP)Jena bioscienceNU-1004Związek testowany w teście aktywatora/substratu SAMHD1
2'Deoksyguanozyna mohohydrat (dGuo)Sigma-AldrichD0901Związek testowany w teście hamowania SAMHD1
384 dobrze czysty płaskie dno  mikropłytkaThermo Fisher Scientific262160Płytka testowa
96 dobrze przezroczysta polipropylen w kształcie litery U  mikropłytkaThermo Fisher Scientific267245Płytka do rozcieńczania związków
Tetrahydrat heptamolibdenianu amonuSigma-AldrichA1343Odczynnik wymagany do odczynnika roboczego malachit
green ara-Cytidine-5'-trifosforan (ara-CTP)Jena biologiaNU-1170Związek testowany w teście aktywatora/substratu SAMHD1
Klofarabina-5'-trifosforan (Cl-F-ara-ATP)Jena bioscienceNU-874Związek testowany w teście aktywatora/substratu SAMHD1
Sulfoxide dimetylu (DMSO)VWR23486.297Rozpuszczalnik
Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuwodian (EDTA)Sigma-AldrichE5134EDTA stop składnik roztworu
Gemcytabina-5'-trifosforan (dF-dCTP)Jena bioscienceNU-1607Związek testowany w teście aktywator/substrat SAMHD1
GraphPadPrism Oprogramowanie GraphPadPrism 8Analiza i wizualizacja danych
Hydrat soli sodowej 5′-trifosforanu guanozyny (GTP)Sigma-AldrichG8877Aktywator allosteryczny do testu aktywatora/substratu SAMHD1
Nieorganiczna pirofosfataza E. coli  (PPaza)Generowane w domu przy użyciu Protein Science Facility, KarolinskaPPase białko, hydrolizuje nieorganiczny trifosforan i pirofosforan do ortofosforanu, dzięki czemu może tworzyć kompleks z zielonym malachitem
His-tagged ludzki SAMHD1Wygenerowany w domu przy użyciu Protein Science Facility, Karolinska Institutet-RecombinantSAMHD1, hydrolizuje dNTP do odpowiadającego mu nukleozydu i nieorganicznego
trifosforanuHydroksymocznikSigma-AldrichH8627Związek testowany w teście hamowania SAMHD1
LomofunginNational Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP)NSC106995Związek testowany w teście hamowania SAMHD1
Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM2670bufor reakcyjny SAMHD1 składnik
Zieleń malachitowa Chlorowodorek karbinoluSigma-Aldrich213020Zielony malachit składnik wyjściowy
Czytnik mikropłytekHidexHidex Sense Czytnik mikropłytekAkwizycja danych, absorpcja odczytana przy długości fali 630 nm
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-Aldrich31434SAMHD1 składnik buforowy reakcyjny
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-Aldrich567530Składnik bufora reakcyjnego SAMHD1
Fosforan sodu (Na3PO4)Sigma-Aldrich342483Wymagany dla krzywej wzorcowej fosforanu
Kwas siarkowy 95-97%Sigma-Aldrich84720Zielony składnik masowy malachitu
Sól tris-octanowaSigma-AldrichT1258Składnik bufora reakcyjnego SAMHD1
Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)Sigma-AldrichC4706Składnik buforu reakcyjnego SAMHD1
Tween-20Sigma-AldrichP1379SAMHD1 i składnik odczynnika roboczego w kolorze zieleni malachitowej
2 2 Institutet-Recombinant Bufor reakcyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franzolin, E., et al. The deoxynucleotide triphosphohydrolase SAMHD1 is a major regulator of DNA precursor pools in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14272-14277 (2013).
  2. Coggins, S. A., Mahboubi, B., Schinazi, R. F., Kim, B. SAMHD1 functions and human diseases. Viruses. 12 (4), 382(2020).
  3. Goldstone, D. C., et al. HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase. Nature. 480 (7377), 379-382 (2011).
  4. Powell, R. D., Holland, P. J., Hollis, T., Perrino, F. W. Aicardi-Goutieres syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase. The Journal of Biological Chemistry. 286 (51), 43596-43600 (2011).
  5. Morris, E. R., Taylor, I. A. The missing link: Allostery and catalysis in the anti-viral protein SAMHD1. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1013-1027 (2019).
  6. Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2015).
  7. Herold, N., et al. Targeting SAMHD1 with the Vpx protein to improve cytarabine therapy for hematological malignancies. Nature Medicine. 23 (2), 256-263 (2017).
  8. Schneider, C., et al. SAMHD1 is a biomarker for cytarabine response and a therapeutic target in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 23 (2), 250-255 (2017).
  9. Hollenbaugh, J. A., et al. Substrates and inhibitors of SAMHD1. PloS One. 12 (1), 0169052(2017).
  10. Knecht, K. M., et al. The structural basis for cancer drug interactions with the catalytic and allosteric sites of SAMHD1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10022-10031 (2018).
  11. Oellerich, T., et al. Selective inactivation of hypomethylating agents by SAMHD1 provides a rationale for therapeutic stratification in AML. Nature Communications. 10 (1), 3475(2019).
  12. Herold, N., et al. SAMHD1 protects cancer cells from various nucleoside-based antimetabolites. Cell Cycle. 16 (11), 1029-1038 (2017).
  13. Rothenburger, T., et al. SAMHD1 is a key regulator of the lineage-specific response of acute lymphoblastic leukaemias to nelarabine. Communications Biology. 3 (1), 324(2020).
  14. Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside- analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824(2017).
  15. Castellví, M., et al. Pharmacological modulation of SAMHD1 activity by CDK4/6 inhibitors improves anticancer therapy. Cancers. 12 (3), 713-719 (2020).
  16. Rassidakis, G. Z., et al. Low-level expression of SAMHD1 in acute myeloid leukemia (AML) blasts correlates with improved outcome upon consolidation chemotherapy with high-dose cytarabine-based regimens. Blood Cancer Journal. 8 (11), 98(2018).
  17. Rudd, S. G., Schaller, T., Herold, N. SAMHD1 is a barrier to antimetabolite-based cancer therapies. Molecular & Cellular Oncology. 4 (2), 1287554(2017).
  18. Rudd, S. G., et al. Ribonucleotide reductase inhibitors suppress SAMHD1 ara-CTPase activity enhancing cytarabine efficacy. EMBO Molecular Medicine. 41, 10419(2020).
  19. Seamon, K. J., et al. Small molecule inhibition of SAMHD1 dNTPase by tetramer destabilization. Journal of the American Chemical Society. 136 (28), 9822-9825 (2014).
  20. Seamon, K. J., Stivers, J. T. A high-throughput enzyme-coupled assay for SAMHD1 dNTPase. Journal of Biomolecular Screening. 20 (6), 801-809 (2015).
  21. Mauney, C. H., Perrino, F. W., Hollis, T. Identification of inhibitors of the dNTP triphosphohydrolase SAMHD1 using a novel and direct high-throughput assay. Biochemistry. 57 (47), 6624-6636 (2018).
  22. Morris, E. R., et al. Crystal structures of SAMHD1 inhibitor complexes reveal the mechanism of water-mediated dNTP hydrolysis. Nature Communications. 11 (1), 3165(2020).
  23. Hansen, E. C., Seamon, K. J., Cravens, S. L., Stivers, J. T. GTP activator and dNTP substrates of HIV-1 restriction factor SAMHD1 generate a long-lived activated state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (18), 1843-1851 (2014).
  24. Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).
  25. Hyun, M., Bohr, V. A., Ahn, B. Biochemical characterization of the WRN-1 RecQ helicase of Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 47 (28), 7583-7593 (2008).
  26. Lin, H. -H., Huang, C. -Y. Characterization of flavonol inhibition of DnaB helicase: real-time monitoring, structural modeling, and proposed mechanism. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012 (4), 735368(2012).
  27. Yang, M., Wang, G. ATPase activity measurement of DNA replicative helicase from Bacillus stearothermophilus by malachite green method. Analytical Biochemistry. 509, 46-49 (2016).
  28. Allard, B., Cousineau, I., Spring, K., Stagg, J. Measurement of CD73 enzymatic activity using luminescence-based and colorimetric assays. Methods in Enzymology. 629, 269-289 (2019).
  29. Lee, M., et al. Structure-activity relationship of sulfonyl piperazine LpxH inhibitors analyzed by an LpxE-coupled malachite green assay. ACS Infectious Diseases. 5 (4), 641-651 (2019).
  30. Carreras-Puigvert, J., et al. A comprehensive structural, biochemical and biological profiling of the human NUDIX hydrolase family. Nature Communications. 8 (1), 1541(2017).
  31. Valerie, N. C. K., et al. NUDT15 hydrolyzes 6-thio-deoxyGTP to mediate the anticancer efficacy of 6-thioguanine. Cancer Research. 76 (18), 5501-5511 (2016).
  32. Carter, M., et al. Human NUDT22 Is a UDP-glucose/galactose hydrolase exhibiting a unique structural fold. Structure. 26 (2), 295-303 (2018).
  33. Gad, H., et al. MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool. Nature. 508 (7495), 215-221 (2014).
  34. Page, B. D. G., et al. Targeted NUDT5 inhibitors block hormone signaling in breast cancer cells. Nature Communications. 9 (1), 250(2018).
  35. Zhang, S. M., et al. Development of a chemical probe against NUDT15. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1120-1128 (2020).
  36. Michel, M., et al. In silico druggability assessment of the NUDIX hydrolase protein family as a workflow for target prioritization. Frontiers in Chemistry. 8, 443(2020).
  37. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67(1999).
  38. Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).
  39. Markossian, S., et al. Assay guidance manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , Bethesda (MD). (2004).
  40. Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
  41. Tsesmetzis, N., Paulin, C. B. J., Rudd, S. G., Herold, N. Nucleobase and nucleoside analogues: resistance and re-sensitisation at the level of pharmacokinetics, pharmacodynamics and metabolism. Cancers. 10 (7), 240(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywno SAMHD1test sprz ony enzymatycznietest z malachitem zielonymhydroliza dNTPwysokoprzepustowe przesiewaniesprz ganie z pirofosfatazanalogi nukleotyd wregulacja allosterycznakrzywa zale no ci dawka odpowied

Powiązane artykuły