Method Article

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

DOI:

10.3791/62514

⸱

May 13th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Bejing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 2Department of Cardiology, Bejing Chuiyangliu Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojedynczy kardiomiocyt jest niezbędnym narzędziem w badaniach biologii i chorób serca na poziomie komórkowym i subkomórkowym jako podstawowa jednostka skurczu i aktywności elektrycznej. Dlatego wyizolowanie żywotnych, wysokiej jakości kardiomiocytów z serca jest początkowym i najważniejszym krokiem eksperymentalnym. Porównując różne protokoły izolowania kardiomiocytów dorosłych myszy, retrogradacja perfuzji Langendorffa jest najbardziej skuteczną i powtarzalną metodą opisaną w literaturze, zwłaszcza w przypadku izolowania miocytów komorowych. Jednak wyizolowanie wysokiej jakości miocytów przedsionkowych z perfundowanego serca pozostaje wyzwaniem i dostępnych jest niewiele raportów z udanej izolacji. Rozwiązanie tego skomplikowanego problemu jest niezwykle ważne, ponieważ oprócz chorób komorowych, choroby przedsionków stanowią dużą część chorób serca. Dlatego uzasadnione są dalsze badania na poziomie komórkowym w celu ujawnienia mechanizmów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół oparty na metodzie perfuzji wstecznej Langendorffa oraz jednocześnie dokonano pewnych modyfikacji głębokości kaniulacji aorty i etapów, które mogą wpływać na proces trawienia w celu wyizolowania miocytów przedsionkowych i komorowych. Ponadto potwierdzono, że izolowane kardiomiocyty są podatne na badanie klamry.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba serca jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności na świecie1. Aby poradzić sobie z tym obciążeniem systemu opieki zdrowotnej, niezbędne jest dogłębne zrozumienie fizjologii i patologii serca. Oprócz preparatu całego zwierzęcia i nienaruszonego serca, przygotowanie komórkowe jest kolejnym niezbędnym narzędziem do badania funkcjonalnego i chorobowego2. Stosując klamrę plastrową, obrazowanie wapnia, biologię molekularną i inne zaawansowane technologie, naukowcy mogą uzyskać więcej informacji na temat właściwości elektrofizjologicznych, homeostazy wapnia, szlaków sygnałowych, stanów metabolicznych i transkrypcji genów w pojedynczym kardiomiocycie (CM). Jest to niezwykle pomocne w odkrywaniu fizjologicznych i patologicznych mechanizmów procesu chorobowego serca3,4,5,6,7. Do badań na zwierzętach można wykorzystać gatunki od małych (np. myszy, szczury i świnki morskie) do dużych (np. króliki i psy). Zazwyczaj preferowane są małe zwierzęta, zwłaszcza myszy, ponieważ są one podatne na manipulacje modelami genetycznymi i chorobami8,9,10.

Techniki ściśle izolowanych CM przeszły długi okres rozwoju i wciąż ewoluują11. Perfuzja wsteczna Langendorffa jest najbardziej skuteczną i powtarzalną metodą izolacji CM stosowaną u szczurów i myszy, szczególnie do izolowania miocytów komorowych (VMs)12,13,14,15. Jednak doniesienia o pomyślnie wyizolowanych miocytach przedsionków (AM) są rzadkie16,17,18. Dalsze badania zarówno na poziomie całego narządu/układu oraz komórkowego/subkomórkowego w celu ujawnienia mechanizmów i zbadania nowych podejść terapeutycznych są uzasadnione, ponieważ migotanie przedsionków (AF), najczęstszy rodzaj arytmii, staje się coraz bardziej rozpowszechnione na całym świecie, a obecne metody leczenia zarówno w terapiach farmakologicznych, jak i ablacji serca pozostają nieskuteczne u około 40%-50% pacjentów z migotaniem przedsionków19. Udana izolacja CM dorosłych myszy jest pierwszym krokiem do badania komórkowego. Można zastosować dwie podstawowe metody izolacji: metodę chunk i metodę Langendorffa. W metodzie perfuzji Langendorffa trawienie tkanek zależy od roztworu enzymu dostarczanego przez tętnice wieńcowe i ich odgałęzienia do łożysk naczyń włosowatych. Właściwa głębokość kaniulacji aorty, która pozwala uniknąć penetracji zastawek aortalnych i blokowania ujścia tętnicy wieńcowej, jest warunkiem uzyskania takiego wzorca perfuzji, który jest również niezbędnym krokiem do wydajnego trawienia i idealnej wydajności VM. W związku z tym rozsądnie jest założyć, że głębokość kaniulacji aorty może w podobny sposób wpływać na perfuzję naczynia przedsionka i ostatecznie wpływać na wydajność AM. Aby przetestować tę hipotezę, przeprowadzono kaniulację aorty na różnych głębokościach i porównano odpowiadającą jej wydajność AM. Dane wykazały, że głębokość kaniulacji aorty ma bezpośredni wpływ na wydajność AM. W tym miejscu wprowadzono protokół do jednoczesnego izolowania AM i VM.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorosłe samce myszy C57BL/6 o wadze 20-30 g, w wieku 8-10 tygodni zostały zakupione w Centrum Zwierząt Stołecznego Uniwersytetu Medycznego w Pekinie, Chiny. Wszystkie procedury doświadczalne zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Stołecznego Uniwersytetu Medycznego i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych zaproponowanym przez Instytut Zasobów Zwierzęcych i opublikowanym przez Narodowe Instytuty Zdrowia. Do pozyskiwania i analizy danych wykorzystano Excel i Origin 8.5. Dane przedstawiono jako średnie ± SD, do oceny statystycznej zastosowano test t Studenta, a P < 0,05 uznano za statystycznie istotne.

1. Przygotowanie roztworu i aparatu do perfuzji

  1. Zmontuj aparat Langendorffa o stałym przepływie (dostępny na rynku lub własnej produkcji). Rysunek 1 przedstawia prosty schemat.
  2. Przygotować roztwory zgodnie z odczynnikami podanymi w Tabeli 1 i Tabeli 2.
  3. Włącz łaźnię z krążącą wodą i wyreguluj odpowiednią temperaturę wejściową (42,7 °C w naszym laboratorium), aby upewnić się, że odpływ systemu cyrkulacji perfuzyjnej z kaniuli osiągnie 37 °C.
  4. Oczyść system perfuzyjny, cyrkulując wodę dejonizowaną. Jeśli wymagany jest stan sterylny, przepuść 75% etanolu przez system perfuzyjny przez 15 minut, a następnie wodę dejonizowaną (co najmniej 10 cykli, aby uniknąć wpływu toksyczności alkoholu na serce).
  5. Zmierz czas i objętość dla jednego cyklu systemu cyrkulacji perfuzacji, aby określić, ile mililitrów natlenionego roztworu Tyrode'a należy załadować w następnym kroku perfuzji.
  6. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w żądany sposób.
  7. Ustawić natężenie przepływu systemu perfuzyjnego na 4 ml/min.
  8. Przygotować dwie czyste szalki Petriego o średnicy 35 mm – jedną zawierającą roztwór Tyrode'a (szalka Petriego 1), drugą zawierającą roztwór 1 (szalka Petriego 2).
  9. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną roztworem 1 i stalową igłą kaniulową o sile 20 G z wycięciem w miejscu, w którym odległość wynosi 1 mm od końcówki. Przygotuj luźny węzeł z szwem 3-0 do trzonu kaniuli. Wyreguluj pole widzenia mikroskopu stereoskopowego i upewnij się, że końcówka kaniuli znajduje się poniżej powierzchni cieczy szalki Petriego 2.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Podawać heparynę (stężenie 1,000 j.m./ml; 0,2 ml/mysz) dootrzewnowo myszom, aby uniknąć zakrzepów krwi. Po 10 minutach znieczulij myszy pentobarbitalem sodu (50 mg / kg, wstrzyknięcie dożylne) i upewnij się, że myszy przestaną reagować na szczypanie ogona/palca. Zwichnięcie szyjki macicy należy wykonać 20 minut po podaniu heparyny.
  2. Przenieś myszy na platformę chirurgiczną, unieruchom myszy w pozycji leżącej, wysterylizuj klatkę piersiową 75% etanolem i osusz ją gazą lub serwetką.

3. Wycięcie serca i kaniulacja aorty

  1. Podnieś skórę mieczykowatej za pomocą kleszczy tkankowych i wykonaj niewielkie boczne nacięcie przez skórę nożyczkami do tkanek. Wykonaj rozwarstwienie między skórą a powięzią i rozszerz nacięcie skóry w kształcie litery V w kierunku pach po obu stronach.
    1. Kontynuuj ten sam ślad nacięcia przez klatkę piersiową, a następnie odchyl klatkę piersiową w górę, zaciskając mostek kleszczami tkankowymi, aby całkowicie odsłonić serce i płuca.
  2. Oderwij osierdzie za pomocą zakrzywionych kleszczy. Rozerwij grasicę w obie strony za pomocą dwóch zakrzywionych kleszczy, jeśli zakrywa duże naczynia. Delikatnie pociągnij podstawę serca w kierunku ogona za pomocą zakrzywionych kleszczy, aż zobaczysz naczynie krwionośne w kształcie litery "Y" (aortę i jej tętnice rozgałęzione).
  3. Aby zarezerwować różne długości aorty do kaniulacji i porównania, należy przeciąć aortę na lewej tętnicy szyjnej wspólnej (zielona linia w Ryc. 2) i przeciąć tętnicę ramienno-głowową w tym samym czasie u niektórych myszy. Transekt na aorcie wstępującej u innych myszy (linia w Rysunek 2).
    UWAGA: Dla tych, którzy są nowicjuszami w tej procedurze, ten krok można również wykonać pod mikroskopem stereoskopowym.
  4. Wyciąć serce i natychmiast zanurzyć w szalce Petriego 1, aby umyć i wypompować pozostałą krew.
  5. Przenieś serce na szalkę Petriego 2 i w razie potrzeby przytnij nadmiar tkanki za pomocą cienkich nożyczek do tęczówki. Dla tych, którzy są nowicjuszami w tej procedurze, wykonaj ten krok pod mikroskopem stereoskopowym, aby uniknąć błędnego przecięcia aorty lub innych struktur serca.
  6. Wcisnąć strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza przed kaniulacją aorty. Wykonaj kaniulację aorty wstecznej za pomocą dwóch prostych kleszczy wiążących (gładkich szczęk) pod mikroskopem stereoskopowym. Upewnij się, że cały proces kaniulacji znajduje się pod powierzchnią cieczy.
  7. Unikaj penetracji zastawek aortalnych i dostosuj głębokość odpowiednio do aorty wstępującej (myszy, przez którą aorta została przecięta w lewej tętnicy szyjnej wspólnej) i korzenia aorty (myszy, u której aorta została przecięta przez aortę wstępującą).
    UWAGA: Głębokość kaniulacji aorty (określana po prostu jako głębokość) jest tutaj definiowana jako pozycja, w której końcówka kaniuli znajduje się w aorcie lub w której aorta jest podwiązana.
  8. Podwiązać aortę za pomocą szwu 3-0 przed węzłem do wcięcia kaniuli. Delikatnie docisnąć zawartość strzykawki, aby wypłukać resztki krwi.
    UWAGA: Krew opuści tętnice wieńcowe i wypłynie z żył grzbietowych, jeśli głębokość zostanie prawidłowo ustawiona. Serce i przydatki przedsionkowe rozszerzą się i staną się blade.
  9. Wyjmij i podłącz kaniulę do aparatu Langendorffa. Jeszcze raz należy uważać, aby pęcherzyki powietrza nie dostały się do serca.
    UWAGA: Należy pamiętać, że czas od torakotomii do początkowej perfuzji nie powinien przekraczać 5 minut.

4. Perfuzja serca

  1. Najpierw zalej i perflej natleniony roztwór Tyrode'a przez około 10 s (objętość cieczy trwająca 10 s w systemie używanym w tym protokole wynosi około 0,7 ml), jeśli w przedsionkach znajduje się resztkowa krew, a następnie zmień na roztwór 1. Jednak wystarczy wykonać perfuzję z roztworem 1, jeśli w przedsionkach nie ma resztkowej krwi. Płucz serce przez około 2 minuty.
  2. Przejdź do rozwiązania 3. Odessać około 2,5 ml roztworu 3 za pomocą sterylnej pipety polietylenowej jednorazowego użytku i podgrzać ją w łaźni wodnej do późniejszego użycia, a pozostałą część użyć do perfuzji przez około 11-12 minut. Wyrzuć roztwór 3 perfundowany w ciągu pierwszych 2 minut. Resztę należy zawrócić do zbiorników perfuzatu za pomocą pompy perystaltycznej w celu ponownego użycia do czasu zakończenia trawienia.
  3. Zakończ trawienie, gdy serce stanie się spuchnięte i stanie się lekko blade i wiotkie (gąbczasta tekstura) lub pojawi się odcisk, jeśli mięsień sercowy zostanie delikatnie ściśnięty za pomocą ząbkowanych kleszczy.

5. Izolacja komórek i reintrodukcja wapnia

  1. Usuń komory i przedsionki za pomocą kleszczy i umieść je na różnych szalkach Petriego. Dodaj podgrzany roztwór 3 do szalek Petriego.
  2. Rozetrzyj tkankę do mętnej tekstury za pomocą kleszczy i delikatnie pipetuj tkankę, aby uzyskać równomierne trawienie. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza.
  3. Przenieś mętną, strawioną tkankę za pomocą pipety do roztworu 4, aby zatrzymać pozostałą aktywność enzymu, a następnie wirować przez 20 s w temperaturze 192×g. Usunąć supernatant i dodać roztwór 5 do osadu komórkowego i pipety, aby równomiernie rozproszyć komórki.
  4. Ponownie wprowadzaj wapń stopniowo, aby uniknąć paradoksu wapnia i przeciążenia wapniem. Stopniowo dodawać w sumie 50 μL 100 mM/L CaCl2 (w odstępach co 5 μL, odpowiednio 10 μL, 15 μL i 20 μL) do zawiesiny komórek.

6. Przechowywanie komórek

  1. W celu badania zacisku krosowego przechowuj komórki w roztworze Tyrode'a. W przypadku innych badań komórkowych należy przechowywać komórki w roztworze 6.
  2. Aby zapewnić dokładność wyników badań nad ostrą czynnością (np. iskry Ca2+, fale Ca2+, uwolnienie Ca2+, wyciek Ca2+ i zapisy patch clamp), zakończ tego rodzaju eksperymenty funkcjonalne w ciągu najbliższych 6 godzin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten papier, gdzie końcówka kaniuli jest umieszczona w aorcie, która jest zdefiniowana jako głębokość kaniulacji aorty (określana po prostu jako głębokość), reprezentuje również miejsce, w którym aorta jest podwiązana. AM i VM wyizolowane z serca, które zostało kaniulowane i podwiązane w aorcie wstępującej, są reprezentowane odpowiednio jako AMAA i VMAA. Co więcej, AM i VM wyizolowane z serca, które zostało kaniulowane i podwiązane w korzeniu aorty, są reprezentowane odpowiednio jako AMAR i VMAR. Rysunek 2 pokazuje przegląd pozycji aorty i przecięcia. Również Rysunek 3 pokazuje głębokości i miejsca podwiązania, które odpowiadają położeniom przecięcia aorty. Głębokość była związana z perfuzją przedsionków i przydatków przedsionków. Oba przydatki przedsionków są napompowane, gdy końcówka kaniuli znajduje się na aorcie wstępującej, co wskazuje na wystarczającą perfuzję przedsionków. Jednak w korzeniu aorty perfuzja przedsionków jest niewystarczająca i oba przydatki przedsionkowe są wydrążone (Ryc. 4). Morfologia i żywotność CM, które są izolowane z kaniulowanych serc na różnych głębokościach po ponownym wprowadzeniu wapnia (Ryc. 5). Morfologie komórek AMAA, AMAR, VMAA i VMAR są pod mikroskopem konfokalnym przed i po reintrodukcji wapnia. AM mają kształt wrzeciona, podczas gdy maszyny wirtualne mają kształt pręta z prostokątnymi końcami. Co więcej, AM i VM mają nienaruszone błony, wyraźne kontury, wyraźne prążkowane sarkomery i gładkie powierzchnie (Rysunek 6). Żywotność komórek oceniano za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Normalne komórki z nienaruszonymi błonami mogą wykluczyć błękit trypanowy i nie zostaną wybarwione, podczas gdy utrata aktywności komórek szybko akumulacji błękitu trypanowego będzie szybko akumulować się wewnątrzkomórkowo (Rysunek 7). AM i VM zostały umieszczone na różnych slajdach obiektów w celu przeprowadzenia zliczania komórek. Całkowitą wydajność AM i procent żywotnych wrzecionowatych CM (wskaźnik przeżycia) określono poprzez przeniesienie 10 μl zawiesiny komórek na szkiełko obiektowe i zliczono pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym w 4 × 10 polach widzenia. Ta sama metoda została użyta do określenia całkowitej wydajności maszyn wirtualnych (w kształcie pręta) i procentu opłacalnych maszyn wirtualnych. Ta metoda jest preferowana w stosunku do stosowania hemocytometru, ponieważ CM nie rozprowadzały się łatwo w obszarze zliczania hemocytometru ze względu na ich rozmiar i kształt. Wykres słupkowy (ryc. 8) pokazuje wskaźniki przeżycia AMAA, AMAR, VMAA i VMAR przed i po ponownym wprowadzeniu wapnia. Każda wartość reprezentuje średnią ± SD z 10 myszy. Przed ponownym wprowadzeniem wapnia wskaźniki przeżycia AMAA są znacznie wyższe niż w przypadku AMAR (odpowiednio 70,9% ± 2,8% i 41,0% ± 5,2%; p < 0,01). Po ponownym wprowadzeniu wapnia wskaźniki przeżycia AMAA są znacznie wyższe niż w przypadku AMAR (odpowiednio 69,4% ± 3,0% i 37,7% ± 4,9%; p < 0,01).

Wskaźniki przeżycia VMAA nie różniły się od tych z VMAR (odpowiednio 89,5% ± 2,7% vs 88,1% ± 2,6%; p > 0,05) przed ponownym wprowadzeniem wapnia. Podobnie, wskaźniki przeżycia VMAA nie różniły się od wskaźników VMAR (odpowiednio 82,2% ± 1,9% vs 82,9% ± 1,6%; p > 0,05) po ponownym wprowadzeniu wapnia.

Serce kaniulowane na głębokości, jak zalecał ten protokół (w aorcie wstępującej), żywotne VMs i AMs dają odpowiednio około 4,1 miliona i około 180 000 po ponownym wprowadzeniu wapnia. Zapis prądu sodowego ( Rysunek 9A, B) i gęstości prądu ( Rysunek 9C) w izolowanych AM i VM potwierdzają, że jakość ogniwa spełniła wymagania eksperymentów elektrofizjologicznych. Anatomia aorty (Ryc. 10) pokazuje, że ujście naczynia przedsionkowego znajduje się w pobliżu korzenia aorty i przylega do ujścia tętnicy wieńcowej (CA). Tabela 3 przedstawia odległość od końcówki kaniuli do ujścia CA serc kaniulowanych i podwiązanych odpowiednio na aorcie wstępującym i korzeniu aorty.

figure-results-1
Rysunek 1. Schemat ideowy zmontowanego zmodyfikowanego systemu Langendorffa. System ten jest ekonomiczny i przenośny dla użytkowników. Składa się z dwóch części rurki z tworzywa sztucznego - jednej do wody (średnica wewnętrzna, 8 mm) i jednej do perfuzatu (średnica wewnętrzna, 1,5 mm) - z których dystalny koniec jest podłączony do medycznego trzydrogowego kranu PE z zamkiem Luer. Szklana butelka zawierająca wodę i z gumowym korkiem służy jako wymiennik ciepła. Perfuzat jest pompowany do plastikowej rurki w wymienniku ciepła przez pompę perystaltyczną i wychodzi z trójdrogowego kranu podłączonego do kaniuli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Aorta i tkanki wokół. Struktura naczynia krwionośnego w kształcie litery "Y" to aorta i jej odgałęzienia: tętnica ramienno-głowowa (strzałka 1) i lewa tętnica szyjna wspólna (strzałka 2). Przeciąć aortę między lewą tętnicą szyjną wspólną (zielona linia) i jednocześnie przeciąć tętnicę ramienno-głowową u niektórych myszy; transekt na aorcie wstępującej (linia) u innych myszy (stereomikroskop 10 × powiększenie 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Widok z przodu kaniulowanego serca. zakrzywiona linia reprezentuje krawędź sieczną aorty, która została przecięta między lewą tętnicą szyjną wspólną. Czerwona zakrzywiona linia reprezentuje krawędź sieczną aorty przeciętą na aorcie wstępującej. Linia prosta reprezentuje miejsce, w którym aorta została podwiązana: na aorcie wstępującej i czerwona u nasady aorty (mikroskop stereoskopowy w powiększeniu 10 × 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Stan perfuzji kaniulowanych serc. Przedsionki są wystarczająco ukrwione, a oba przydatki przedsionkowe są napompowane w sercu (A) kaniulowane i podwiązane na aorcie wstępującej. Jednak oba przydatki przedsionkowe są wydrążone w sercu (B), kaniulowane i podwiązane w korzeniu aorty, co wskazuje na słabą perfuzję przedsionków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Morfologia komórek i ocena żywotności po reintrodukcji wapnia. AM (A) i VM (B) wyizolowane z serca kaniulowane i podwiązane w aorcie wstępującej są reprezentowane odpowiednio jako AMAA i VMAA. AM (C) i VM (D) wyizolowane z serca kaniulowane i podwiązane w korzeniu aorty są reprezentowane odpowiednio jako AMAR i VMAR. Wysokiej jakości CM są spokojne i mają nienaruszone błony, wyraźne kontury, wyraźne prążkowane sarkomery i gładką powierzchnię komórek. AM mają kształt wrzeciona, podczas gdy maszyny wirtualne mają kształt pręta lub cegły z prostokątnymi końcami. CM, które spontanicznie kurczą się lub zawierają pęcherzyki w błonie, są złej jakości, a te, które kurczą się do kulistego kształtu, są martwymi komórkami. Losowe pole widzenia (mikroskop fluorescencyjny, powiększenie 10 × 10; podziałka liniowa, 100 μm). AM = miocyt przedsionkowy, VM = miocyt komorowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Morfologia komórek pod mikroskopem konfokalnym przed i po reintrodukcji wapnia. Przed ponownym wprowadzeniem wapnia, AMAA (A) i AMAR (C) mają kształt wrzeciona z wyraźnymi konturami, prążkowanymi sarkomerami i gładkimi powierzchniami błony. Po reintrodukcji wapnia, AMAA (B) i AMAR (D) mają również kształt wrzecionowaty z wyraźnymi konturami, prążkowanymi sarkomerami i gładkimi powierzchniami błony. Przed ponownym wprowadzeniem wapnia VMAA (E) i VMAR (G) mają kształt pręta lub cegły z wyraźnymi konturami, prążkowanymi sarkomerami i gładkimi powierzchniami błony z prostokątnymi końcami. Po reintrodukcji wapnia, VMAA (F) i VMAR (H) mają również kształt pręta lub cegły z wyraźnymi konturami, prążkowanymi sarkomerami i gładkimi powierzchniami błony z prostokątnymi końcami (olej z mikroskopu konfokalnego, powiększenie 63 × 10; podziałka liniowa, 50 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. Ocena żywotności komórek. Uszkodzone komórki, które tracą aktywność, są barwione błękitem trypanowym. W przeciwieństwie do tego, żywe komórki nie mogą być barwione błękitem trypanowym (mikroskop fluorescencyjny, powiększenie 4 × 10; podziałka liniowa, 100 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8. Wykres słupkowy przedstawiający wskaźniki przeżycia AMAA, AMAR, VMAA i VMAR przed i po reintrodukcji wapnia. CR = reintrodukcja wapnia. Każda wartość reprezentuje średnią ± SD z 10 myszy. p < 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

rozwiązanieZawartość (stężenie końcowe w mmol/l, jeśli nie określono inaczej)Zauważyć
Roztwór perfuzyjny (roztwór 1)113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Tauryna, 5 Glukoza, 10 2,3-butanodion monoksym(BDM)Który może być przechowywany przez 3 dni w temperaturze 4 °C. Glukoza, tauryna i BDM są dodawane w dniu eksperymentu. Przygotuj 200 ml roztworu perfuzyjnego dla każdego serca.
Rozwiązanie Tyrode'a (rozwiązanie 2)140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 GlukozaKtóry może być przechowywany przez 3 dni w temperaturze 4 °C. CaCl2 i glukozę dodaje się w dniu eksperymentu, dostosuj pH do 7,3-7,4 z nasyconym NaOH w temperaturze pokojowej (28-30°C) za pomocą miernika pH.

Tabela 1. Rozwiązania do izolacji CM dorosłych myszy.

rozwiązanietreść Zauważyć
Roztwór wytrawiający (roztwór 3)25 ml roztworu 1, 6 μL 100 mM/L CaCl2, 25 mg kolagenazy II, 50 μl (2,5 % 10×) trypsynyza każde serce
Zatrzymaj rozwiązanie 1 (rozwiązanie 4)9 ml roztworu 1, 1 ml FBS (płodowa surowica bydlęca), 4 μl 100 mM/L CaCl2za każde serce
Zatrzymaj rozwiązanie 2 (rozwiązanie 5)9,5 ml roztwór 1, 0,5 ml FBS (płodowa surowica bydlęca), 4 μl 100 mM/L CaCl2za każde serce
Roztwór do ponownego zawieszania komórek (roztwór 6)13 ml roztwór 1,7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) w dawce, która może tworzyć cienką warstwę pokrywającą powierzchnię cieczyza każde serce

Tabela 2. Rozwiązania do izolacji i przechowywania CM dorosłych myszy.

figure-results-9
Rysunek 9. Krzywe prądowo-napięciowe kanałów sodowych.Techniki klamry krosowej całych komórek zastosowano do rejestrowania prądów sodowych izolowanych kardiomiocytów w trybie zacisku napięciowego. Protokół cęgów napięcia jest pokazany we wstawce. Pokazane są prądy sodowe zarejestrowane z AM (A) i VM (B). Gęstości prądu przy potencjałach odpowiednio −45mV, −40mV i −35 mV są znacznie wyższe w AM (−32,71 ± 1,597 pA/pF, −31,49 ± 1,820 pA/pF i −29,34 ± 1,939 pA/pF; n = 10) niż w VM (−17,66 pA/pF ± 1,976 pA/pF, −21,09 ± 1,560 pA/pF, i odpowiednio −21,86 ± 1,381 pA/pF; n = 8; P < 0,05). (C) Krzywe I-V pokazują gęstości prądu sodu, które zostały znormalizowane do pojemności komórki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10. Pochodzenie i dystrybucja naczynia przedsionkowego. Naczynie przedsionkowe (strzałka 1) i CA (strzałka 2) w panelu A. Panel B to bliższe spojrzenie na naczynie przedsionkowe (strzałka 3). (C) Istnieją dwie ujścia różnej wielkości; jedna (strzałka 4) odpowiada naczyniu przedsionkowemu, które nawadniało przydatki przedsionków, a druga (strzałka 5) odpowiada CA (mikroskop stereoskopowy o powiększeniu 10 × 5). CA = tętnica wieńcowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
Numer seryjny myszy1cyfra arabska345678910
Głębokość kaniulacji aorty znajduje się na wysokości aorty wstępującej0,50,60,30,40,80,30,80,70,50,7
Głębokość kaniulacji aorty znajduje się w korzeniu aorty0,2-0,10,10-0,10,1-0,20-0,10

Tabela 3. Odległość od końcówki kaniuli do ujścia tętnicy wieńcowej. Serca myszy C57BL/6 (n = 20) użyto do kanniulacji i podwiązania aorty na głębokości odpowiednio aorty wstępującej i korzenia aorty. Aorta jest anatomizowana i mierzono odległość od końcówki kaniuli do ujścia CA. Odległość jest mierzona w milimetrach, a znaki dodatnie lub ujemne reprezentują końcówkę kaniuli odpowiednio powyżej i poniżej ujścia CA.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojedynczy CM jest cennym i niezbędnym narzędziem w badaniach funkcji i chorób serca na poziomie komórkowym20. W związku z tym izolacja żywotnych CM od serc jest początkowym i najważniejszym krokiem. Jakość komórek jest jednym z istotnych wyznaczników przeprowadzania udanych eksperymentów, zwłaszcza w eksperymentach optycznych i elektrofizjologicznych. W porównaniu z CM innych zwierząt, CM gryzoni są bardziej podatne na niedokrwienie i niedotlenienie ze względu na wyższe stężenie wewnątrzkomórkowych jonów sodu, co sprzyja napływowi wapnia przez wymiennik Na+/Ca2+ 21. Co więcej, liczba AM jest znacznie mniejsza niż w przypadku maszyn wirtualnych; W związku z tym skuteczna izolacja jest niezwykle trudna do osiągnięcia. Metoda Langendorffa doskonale nadaje się do izolowania maszyn wirtualnych myszy22, ale wskaźnik sukcesu w izolowaniu AM jest niski i dostępnych jest niewiele raportów. Właściwa głębokość kaniulacji aorty jest również istotnym czynnikiem w uzyskaniu idealnych VM, oprócz temperatury, aktywności enzymów, PH i jakości wody używanej do przygotowania buforu. Zasada działania metody Langendorffa opiera się na wstecznej perfuzji serca. Po perfuzji zastawka aortalna jest zamknięta; W ten sposób perfuzat jest wtłaczany do tętnic wieńcowych, dostarczając roztwór enzymu przez gałęzie naczyń, a tkanka mięśnia sercowego jest równomiernie trawiona. Aby osiągnąć tego rodzaju wzorzec krążenia, aorta musi zachować wystarczającą długość do kaniulacji i podwiązania, a końcówka kaniuli nie może przenikać przez zastawki aortalne ani blokować ujścia CA. Dlatego uzasadnione jest spekulowanie, że głębokość kaniulacji aorty jest również związana z perfuzją przedsionków, co w podobny sposób wpływa na skuteczność trawienia przedsionków i wydajność AM. Przedstawiony tutaj protokół potwierdził hipotezę, a kluczowe kroki w celu optymalizacji wydajności komórek wraz z sugestiami opisano poniżej.

W kroku 1.9, aby lepiej zabezpieczyć aortę, zalecana jest kaniula 20 G z wcięciem (lub rowkiem obwodowym) od miejsca, w którym odległość wynosi 1 mm do końcówki. Na podstawie naszych doświadczeń stwierdzono, że rozmiar kaniuli, który jest nieco większy niż średnica aorty, zapobiega przebijaniu zastawek aortalnych przez końcówkę kaniuli podczas kaniulacji, ponieważ aorta, opierając się na swojej wewnętrznej elastyczności, może ściśle dopasować się do kaniuli i wytwarzać tarcie, które działa jako czynnik ochronny podczas poruszania się do przodu lub do tyłu podczas regulacji głębokości kaniulacji. Jeśli chodzi o położenie wycięcia, serce łatwo zsunie się podczas kaniulacji z powodu grawitacji, jeśli znajdzie się zbyt blisko końcówki kaniuli. I odwrotnie, przestrzeń do regulacji głębokości kaniulacji i pozycji podwiązania będzie bardzo ograniczona, jeśli będzie zbyt duża. Biorąc pod uwagę te okoliczności, przecięcie aorty między lewą tętnicą szyjną wspólną (jak zielona linia na rysunku 2) w celu upewnienia się, że aorta jest wystarczająco długa i może być kaniulowana i podwiązana na aorcie wstępującej, jest lepsze w kroku 3.3. Podczas transekcji w aorcie wstępującej, długość zarezerwowana przynajmniej dla kaniulacji może zabezpieczyć końcówkę kaniuli blisko korzenia aorty i nie przeniknie do zastawek aortalnych po podwiązaniu. Anatomia aorty i pomiar odległości od końcówki kaniuli do ujścia CA wskazują, że przecięcie aorty między lewą tętnicą szyjną wspólną jest idealną pozycją do uzyskania odpowiedniej głębokości kaniulacji aorty.

Stwierdzono, że głębokość kaniulacji jest związana z perfuzją przedsionków, która z kolei działa jako wskaźnik głębokości. Rycina 4 pokazuje, że perfuzja przedsionków jest dobra, gdy głębokość znajduje się w aorcie wstępującej, a oba przydatki przedsionków są napompowane. Jednak perfuzja przedsionków jest niewystarczająca, gdy głębokość jest na poziomie (lub zbliża się) do korzenia aorty, a oba przydatki przedsionków są pochylone. Całkowita i żywotna liczba AM uzyskana z nadmuchanych przydatków przedsionków była wyższa (ryc. 8). Wyniki te wskazują, że głębokość kaniulacji aorty może w pewien sposób wpływać na perfuzję i trawienie przedsionków i przydatków przedsionków, a ostatecznie wpływać na wydajność i jakość AM. Stwierdzono, że wydajność i jakość AM są związane z rozmieszczeniem naczyń zaopatrujących przedsionki. Badanie Fernándeza i wsp.23 wykazało różne anomalie w pochodzeniu i przebiegu mysiego CA. Okazało się, że ujścia CA były bardzo zmienne i nie wszystkie były zlokalizowane w zatoce aortalnej. Niektóre CA mogą pochodzić nieprawidłowo znad zatok aortalnych, zwanych ujściem wysokiego startu. Niektóre CA mogą pochodzić z tej samej zatoki aortalnej, a ujście naczynia przedsionka znajduje się tuż obok. Anatomia aorty w niniejszym badaniu (ryc. 10) jest również zgodna z odkryciem Fernándeza. Może to być przyczyną, dla której próby wyizolowania AM metodą Langendorffa były w dużej mierze nieskuteczne, jeśli głębokość kaniulacji nie jest odpowiednia. W ten sposób końcówka kaniuli będzie miała większą szansę na zablokowanie ujścia naczynia przedsionka, które przylega do ujścia CA, jeśli nie ma wystarczającej ilości miejsca między końcówką kaniuli a ujściem CA. W przeciwieństwie do tego, perfuzja i wydajność komórek komory były prawie nienaruszone, o ile zastawki aortalne nie były penetrowane przez końcówkę kaniuli. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że CA, które dostarczają krew do komory, mają większe ujścia i więcej pochodzenia. Jeśli jedno ujście zostało zamknięte przez kaniulę, perfuzja komory może być skompensowana przez inne CA lub krążenie poboczne, podczas gdy naczynie krwionośne zaopatrujące przedsionek jest raczej małe i nie ma substytutu. Dlatego ważny jest wpływ głębokości kaniulacji aorty.

Inne godne uwagi czynniki i rozwiązania problemów w procesie trawienia i przechowywania komórek są wymienione poniżej. Po pierwsze, rozważ perfuzję natlenionego roztworu Tyrode'a w kroku 4.1, aby spowodować skurcz mięśnia i wypompować resztki krwi, jeśli krew w przedsionkach nie została szybko usunięta po podwiązaniu aorty. Może to pomóc uniknąć niekorzystnego wpływu ca2+ i innych materiałów uwalnianych z uszkodzonych erytrocytów. Po drugie, perfuzja roztworu wolnego od ca2 + z wyprzedzeniem w celu dysocjacji połączenia i rozszerzenia przestrzeni między komórkami może poprawić skuteczność trawienia enzymów, ponieważ interkalowane dyski między CM są połączeniami międzykomórkowymi zależnymi od wapnia. Jednak czas powinien być ograniczony do 3-5 minut, aby uniknąć zjawiska paradoksu wapniowego 24. Zalecany jest mieszany roztwór enzymatyczny. Kolagenaza typu II zaburza sieć macierzy zewnątrzkomórkowej, a trypsyna pomaga usunąć ziarnisty materiał, który pozostaje na powierzchni komórki, jeśli trawienie kolagenazy II jest niekompletne. Zapewnia to gładką powierzchnię ogniwa, co ma kluczowe znaczenie dla utworzenia uszczelnienia GΩ w nagraniu zacisku krosowego. Niemniej jednak stężenie trypsyny powinno być kontrolowane w odpowiednim zakresie, aby uniknąć nadmiernego trawienia i uszkodzenia komórek, ponieważ może to degradować białko błonowe. Stosowanie samej kolagenazy typu II w celu poprawy wydajności komórek może często prowadzić do nadmiernego trawienia tkanek, a izolowane CM będą nietolerancyjne wapnia po długotrwałej ekspozycji na kolagenazę25. Stosowanie monoksymu 2,3-butanodionu (BDM), substancji, która zapobiega spontanicznemu skurczowi poprzez hamowanie ATPazy miozyny i zapobieganie tworzeniu się mostków krzyżowych, jest nadal kontrowersyjne 26,27,28,29. Zgodnie z wcześniejszymi doświadczeniami, dodanie BDM jest konieczne dla tego protokołu. Roztwór enzymatyczny przygotowuje się z roztworem 1, chociaż roztwór 1 nie zawiera wapnia, a wapń dodaje się w celu aktywacji enzymu. Korzyści z dodania BDM do roztworu perfuzyjnego obejmują (1) hamowanie skurczu miocytów i zmniejszanie zużycia tlenu podczas perfuzji roztworu enzymatycznego oraz (2) zapobieganie niedotlenieniu miocytów i poprawę jakości izolowanych miocytów. Niektóre badania wykazały, że BDM może mieć potencjalnie niekorzystny wpływ na właściwości elektryczne komórek. Jednak wyniki rejestracji prądu sodowego w całym kominie nie wykazały niepożądanego efektu. Na etapie przechowywania komórek (krok 6) w licznych badaniach wybrano bufor KB, roztwór bez wapnia o wysokim stężeniu potasu, w którym komórki mogą utrzymać lepszy stan, ponieważ znajdują się w spolaryzowanych i niskich warunkach metabolicznych. Jednak glikokaliks błony komórkowej oddzieli się od dwuwarstwy lipidowej przy braku egzogennego wapnia przez pewien czas, a przepuszczalność błony wzrośnie, wpływając na późniejszą analizę funkcjonalną 30,31,32.

Wszystkie techniki izolacji miocytów można obecnie zasadniczo podzielić na trawienie kawałków (małego fragmentu tkanki) w roztworze enzymatycznym lub perfuzję CA z roztworem enzymatycznym (perfuzja Langendorffa)22. W porównaniu z metodą Langendorffa, metoda trawienia kawałków jest łatwiejsza do wykonania i jest również rutynowo stosowana do izolowania CM w wielu laboratoriach. Jednak metoda ta zwykle prowadzi do niskiej wydajności CM niskiej jakości z tkanek dorosłych22. Co więcej, komórki wyizolowane tą metodą mogą nie nadawać się do przeprowadzania eksperymentów porównawczych. Na przykład, podczas badania specyficznego dla typu komórki działania leku między AM i VM, nie można pominąć ani wykluczyć wpływu różnych warunków izolacji. Dzieje się tak, ponieważ mięsień sercowy i gęstość tkanki komory są znacznie grubsze i gęstsze niż w przedsionku, co skutkuje różnymi czasami trawienia i stężeniami enzymów. Co więcej, nadmierne poruszenie i pipetowanie tkanki podczas trawienia uszkodzi komórki i znacząco wpłynie na badania funkcjonalne. Co więcej, wiele wcześniejszych badań wykazało, że AM są bardziej podatne na wapń. Jednak AM wyizolowane przez obecny protokół mogą być tolerancyjne na gradientowe ponowne wprowadzenie wapnia, prawdopodobnie dlatego, że tkanka jest łatwa do pęknięcia pod koniec procesu trawienia. W związku z tym uszkodzenia mechaniczne są mniejsze, podczas gdy ogniwa doznałyby więcej uszkodzeń mechanicznych, ponieważ etapy metody fragmentów wymagają wielokrotnego pękania i odśrodkowania. Niedawno Ackers i wsp.33 opisali uproszczoną, wolną od Langendorffa metodę izolacji żywotnych miocytów serca i niemiocytów. Maszyny wirtualne i fibroblasty można skutecznie wyizolować, ale nie wspomniano o ilości AM. Protokół ten ma jednak kilka ograniczeń. Po pierwsze, rozmieszczenie naczyń krwionośnych serca może różnić się w zależności od różnic indywidualnych i szczepu myszy, a zalecana głębokość kaniulacji nie może zagwarantować udanej izolacji AMs za każdym razem. Po drugie, dla tych, którzy są nowicjuszami w tej procedurze, może zająć trochę czasu, aby ćwiczyć przecięcie aorty i kaniulację aorty wstecznej. Wreszcie, metoda ta nie została przetestowana w innych modelach chorób serca, z wyjątkiem zdrowych i starszych myszy. W związku z tym będzie wymagało dostosowania stężeń enzymów i czasu trawienia ze względu na rozległość zwłóknienia serca. Wadą różnych warunków trawienia występujących w metodzie chunkowej nie będzie problem w metodzie Langendorffa, w której roztwór enzymu jest równomiernie rozprowadzany w tkance przez łożyska naczyń.

Podsumowując, opisane tutaj protokoły jednoczesnej izolacji pojedynczych AM i VM wykazały, że odpowiednia głębokość kaniulacji aorty może skutecznie poprawić perfuzję przedsionka i wydajność AM. CM wyizolowane tą metodą są wysokiej jakości, mają dobrą tolerancję na wapń i zostały z powodzeniem zastosowane do rejestracji patch clamp i obsługi wapnia (uwalnianie Ca2+ i pomiar fal Ca2+ przez system IonOptix) w zespole34. Przewiduje się, że protokół izolacji może być wykorzystany do przygotowania komórek w serii badań komórkowych i subkomórkowych, co pomoże pogłębić zrozumienie fizjologii i patologii serca. Co ważne, umożliwi to odkrycie bardziej istotnych klinicznie mechanizmów chorób serca i metod interwencji.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) oraz Pekińskiej Fundacji Nauk Przyrodniczych (nr 7192051). Wkład autora: Bai i Liu zaprojektowali i wymyślili projekt. Wen i Ruan udzielili cennych rad dotyczących eksperymentów. Wu i Linling Li przeprowadzili prace eksperymentalne i odegrali kluczową rolę w pozyskiwaniu, analizie i interpretacji danych. Li brał udział w montażu aparatury Langendorffa. Peng, Zhang, Wang i Yang uczestniczyli w przygotowaniu odczynników i roztworów przed eksperymentem. Wu napisał ten artykuł.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Monoksym 2,3-butanodionu (BDM)Sigma-Aldrich31550
Albumina surowicy byka (BSA)Sigma-AldrichA2153
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Kolagenaza typu IIWorthington43D14160
Akwizycja i analiza danychExcel
Płód Surowica bydlęca (FBS)Zhejiang Tianhang Biotechnology150207
GlukozaSigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH3375
KClSigma-AldrichP9333
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
KHCO3Sigma-Aldrich237205
MgCl2Sigma-AldrichM8266
MgSO4Sigma-AldrichM7506
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS7653
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
Pochodzenie 8.5OriginLab, Northampton, MA, USAAkwizycja i analiza danych
Pompa perystaltycznaLongerpumpBT100-2J
Pentobarbital soduFabryka odczynników w Szanghaju810923
TaurynaSigma-AldrichT0625
Trypan niebieskiSolarbioC0040
TrypsynaInvitrogen15090046
Kąpiel wodnaJULABOED (v.2)
HEPES Sigma-Aldrich H3375

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mahmood, S. S., Levy, D., Vasan, R. S., Wang, T. J. The framingham heart study and the epidemiology of cardiovascular diseases: a historical perspective. Lancet. 383 (9921), London, England. 999-1008 (2014).
  2. Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. Isolated heart models: cardiovascular system studies and technological advances. Medical & Biological Engineering & Computing. 53 (7), 669-678 (2015).
  3. Guinamard, R., Hof, T., Sallé, L. Current recordings at the single channel level in adult mammalian isolated cardiomyocyte. Methods in Molecular Biology. 1183, 291-307 (2014).
  4. Santana, L. F., Kranias, E. G., Lederer, W. J. Calcium sparks and excitation-contraction coupling in phospholamban-deficient mouse ventricular myocyte. The Journal of Physiology. 503, Pt 1 21-29 (1997).
  5. Chou, C. C., et al. Intracellular calcium dynamics and anisotropic reentry in isolated canine pulmonary veins and left atrium. Circulation. 111 (22), 2889-2897 (2005).
  6. Brittsan, A. G., et al. Chronic SR Ca2+-ATPase inhibition causes adaptive changes in cellular Ca2+ transport. Circulation Research. 92 (7), 769-776 (2003).
  7. Mohler, P. J., et al. Ankyrin-B mutation causes type 4 long-QT cardiac arrhythmia and sudden cardiac death. Nature. 421 (6923), 634-639 (2003).
  8. Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nature medicine. 1 (3), 215-220 (1995).
  9. Ni, L., et al. Atrial-specific gene delivery using an adeno-associated viral vector. Circulation Research. 124 (2), 256-262 (2019).
  10. Dobrev, D., Wehrens, X. H. T. Mouse models of cardiac arrhythmias. Circulation Research. 123 (3), 332-334 (2018).
  11. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605(2016).
  12. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51357(2014).
  13. Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments JoVE. (79), e50289(2013).
  14. Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51109(2014).
  15. Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
  16. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50145(2013).
  17. Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51823(2014).
  18. Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
  19. Andrade, J., Khairy, P., Dobrev, D., Nattel, S. The clinical profile and pathophysiology of atrial fibrillation: relationships among clinical features, epidemiology, and mechanisms. Circulation Research. 114 (9), 1453-1468 (2014).
  20. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  21. Bers, D. M. Cardiac Na/Ca exchange function in rabbit, mouse and man: what's the difference. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34 (4), 369-373 (2002).
  22. Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: a new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
  23. Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
  24. Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
  25. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Methods in Molecular Biology. 290, 305-314 (2005).
  26. Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
  27. Hall, A. R., Hausenloy, D. J. Mitochondrial respiratory inhibition by 2,3-butanedione monoxime (BDM): implications for culturing isolated mouse ventricular cardiomyocytes. Physiological Reports. 4 (1), 12606(2016).
  28. Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. 2,3-butanedione monoxime unmasks Ca (2+)-induced NADH formation and inhibits electron transport in rat hearts. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (4), 1839-1848 (2000).
  29. Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na (+)/Ca (2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. British Journal of Pharmacology. 132 (6), 1317-1325 (2001).
  30. Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. Sodium current in single myocardial mouse cells. European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).
  31. Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle. The Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).
  32. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". European Journal of Physiology. 395 (1), 6-18 (1982).
  33. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  34. Jiang, L., et al. Ibrutinib promotes atrial fibrillation by inducing structural remodeling and calcium dysregulation in the atrium. Heart Rhythm. 16 (9), 1374-1382 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Langendorff MethodCardiomyocyte IsolationAtrial MyocytesVentricular MyocytesRetrograde PerfusionPatch ClampAorta CannulationHeart DigestionCalcium ReintroductionMouse Heart

Related Articles