Podejścia sztucznej inteligencji do oceny rzęsek pierwotnych

Summary

Wykorzystanie sztucznej inteligencji (Ai) do analizy obrazów jawi się jako potężne, mniej stronnicze i szybkie podejście w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami. Tutaj wyszkoliliśmy Ai, aby rozpoznawała organellę komórkową, pierwotne rzęski i analizowała właściwości, takie jak długość i intensywność barwienia, w rygorystyczny i powtarzalny sposób.

Abstract

Rzęski to komórkowe wyrostki oparte na mikrotubulach, które funkcjonują jako centra sygnalizacyjne dla różnych ścieżek sygnałowych w wielu typach komórek ssaków. Długość rzęsek jest wysoce konserwatywna, ściśle regulowana i różni się w zależności od różnych typów komórek i tkanek oraz jest zaangażowana w bezpośredni wpływ na ich zdolność sygnalizacyjną. Na przykład wykazano, że rzęski zmieniają swoją długość w odpowiedzi na aktywację receptorów rzęskowych sprzężonych z białkiem G. Jednak dokładny i powtarzalny pomiar długości licznych rzęsek jest zabiegiem czasochłonnym i pracochłonnym. Obecne podejścia są również podatne na błędy i stronniczość. Programy sztucznej inteligencji (AI) można wykorzystać do pokonania wielu z tych wyzwań dzięki możliwościom, które umożliwiają asymilację, manipulację i optymalizację obszernych zestawów danych. Tutaj pokazujemy, że moduł sztucznej inteligencji można wytrenować do rozpoznawania rzęsek na obrazach zarówno z próbek in vivo, jak i in vitro. Po wykorzystaniu wyszkolonej sztucznej inteligencji do identyfikacji rzęsek, jesteśmy w stanie zaprojektować i szybko wykorzystać aplikacje, które analizują setki rzęsek w jednej próbce pod kątem długości, intensywności fluorescencji i kolokalizacji. To bezstronne podejście zwiększyło naszą pewność siebie i rygor podczas porównywania próbek z różnych pierwotnych preparatów neuronalnych in vitro, a także w różnych regionach mózgu u zwierzęcia i między zwierzętami. Co więcej, technika ta może być wykorzystana do wiarygodnej analizy dynamiki rzęsek z dowolnego typu komórek i tkanek w sposób wysokoprzepustowy w wielu próbkach i grupach poddanych zabiegowi. Ostatecznie podejścia oparte na sztucznej inteligencji prawdopodobnie staną się standardem, ponieważ większość dziedzin zmierza w kierunku mniej stronniczych i bardziej powtarzalnych podejść do pozyskiwania i analizy obrazów.

Introduction

Pierwotne rzęski to organelle czuciowe wystające z większości typów komórek ssaków^1,2,3,4. Są to na ogół pojedyncze przydatki, które mają kluczowe znaczenie dla koordynacji różnych szlaków sygnalizacji komórkowej poprzez integrację sygnałów zewnątrzkomórkowych^5,6,7. Pierwotne rzęski odgrywają ważną rolę podczas rozwoju embrionalnego i homeostazy tkanek dorosłych, a zakłócenie ich funkcji lub morfologii wiąże się z kilkoma zaburzeniami genetycznymi, które są zbiorczo nazywane ciliopatiami. Ze względu na niemal wszechobecną naturę rzęsek, ciliopatie są związane z szerokim zakresem cech klinicznych, które mogą wpływać na wszystkie układy narządów^8,9,10,11,12. W zwierzęcych modelach ciliopatii utrata struktury rzęskowej lub zdolności sygnalizacyjnej przejawia się w kilku klinicznie istotnych fenotypach, w tym otyłości związanej z hiperfagią^3,13,14,15. W wielu systemach modelowych wykazano, że zmiany długości rzęsek wpływają na ich zdolność sygnalizacyjną i funkcje^16,17,18,19. Istnieje jednak kilka czasochłonnych i technicznych wyzwań związanych z dokładną i powtarzalną oceną długości i składu rzęsek.

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) dorosłego ssaka to jeden z biologicznych kontekstów, który stanowi wyzwanie dla zrozumienia morfologii i funkcji rzęsek. Chociaż wydaje się, że neurony i komórki w całym OUN posiadają rzęski, ze względu na ograniczone narzędzia i możliwości obserwacji i analizy tych rzęsek, zrozumienie ich funkcji pozostaje nieuchwytne²⁰. Na przykład prototypowy marker rzęsek, acetylowana α-tubulina, nie oznacza rzęsek neuronalnych²⁰. Trudność w badaniu tych rzęsek została częściowo rozwiązana dzięki odkryciu kilku receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), maszynerii sygnalizacyjnej i białek związanych z błoną, które są wzbogacone na błonie rzęsek neuronalnych^21,22. Wszystkie te proste podstawowe obserwacje wskazują na znaczenie i różnorodność rzęsek OUN, które do tej pory wydają się nieporównywalne z innymi tkankami. Na przykład różnice w długości rzęsek i lokalizacji GPCR można zaobserwować w całym mózgu, przy czym długości w niektórych jądrach neuronalnych są różne w porównaniu z innymi jądrami^19,23. Podobnie, ich zawartość GPCR i maszyneria sygnalizacyjna uzupełniają różnorodność w oparciu o lokalizację neuroanatomiczną i typ neuronalny^{2,24,25,26,27,28,29}. Te proste obserwacje pokazują, że długość i skład rzęsek ośrodkowego układu nerwowego ssaków są ściśle regulowane, podobnie jak w organizmach modelowych, takich jak Chlamydomonas reinhardtii, ale wpływ tych różnic długości na funkcję, sygnalizację i ostatecznie zachowanie rzęsek pozostaje niejasny^16,30,31,32.

Dokładny pomiar długości i składu rzęsek okazuje się być technicznym wyzwaniem podatnym na błędy użytkownika i nieodtwarzalności. Obecnie rzęski in vivo i in vitro są najczęściej identyfikowane przy użyciu metod immunofluorescencyjnych, które znakują białka rzęskowe lub fluorescencyjne allele reporterowe wzbogacone w rzęski^33,34,35. Długości tych fluorescencyjnie oznakowanych rzęsek są następnie mierzone na podstawie obrazu dwuwymiarowego (2D) za pomocą narzędzi do pomiaru linii w programach do analizy obrazu, takich jak ImageJ³⁶. Proces ten jest nie tylko żmudny i pracochłonny, ale także podatny na stronniczość i błędy. Te same przeszkody pojawiają się podczas pomiaru intensywności rzęsek, które pomagają wskazać zmiany w strukturze rzęsek³⁷. Aby zminimalizować niespójności w tego typu analizach obrazów, programy sztucznej inteligencji (AI) stają się coraz bardziej powszechnymi i przystępnymi cenowo opcjami³⁸.

Ai to zaawansowanie systemów komputerowych, które wykorzystują przewagę algorytmów komputerowych i programowania do wykonywania zadań, które zwykle wymagałyby ludzkiej inteligencji³⁹. Urządzenia AI są uczone dostrzegania powtarzających się wzorców, parametrów i cech oraz podejmowania działań w celu maksymalizacji szans na osiągnięcie pomyślnych wyników. Sztuczna inteligencja jest wszechstronna i można ją wytrenować do rozpoznawania określonych obiektów lub struktur będących przedmiotem zainteresowania, takich jak rzęski, a następnie zaprogramować ją do przeprowadzania różnych analiz na zidentyfikowanych obiektach. W związku z tym złożone dane obrazowe mogą być szybko i powtarzalnie generowane przez klasę Ai38. Automatyzacja i analiza AI przechwyconych obrazów zwiększy skuteczność i wydajność, jednocześnie ograniczając potencjalne błędy ludzkie i stronniczość³⁹. Ustanowienie opartej na sztucznej inteligencji metodologii identyfikacji rzęsek tworzy spójny sposób dla wszystkich grup badawczych do analizy i interpretacji danych dotyczących rzęsek.

Tutaj używamy modułu Ai do identyfikacji rzęsek zarówno in vivo, jak i in vitro na obrazach 2D. Korzystając z zestawu przykładowych obrazów, sztuczna inteligencja jest szkolona w rozpoznawaniu rzęsek. Po zakończeniu trenowania wyznaczona sztuczna inteligencja jest używana do nakładania maski binarnej na rzęski zidentyfikowane przez sztuczną inteligencję na obrazie. Pliki binarne stosowane przez sztuczną inteligencję można modyfikować, jeśli to konieczne, aby zapewnić, że wszystkie rzęski na obrazach są prawidłowo zidentyfikowane, a identyfikacja niespecyficzna jest eliminowana. Po wykorzystaniu sztucznej inteligencji do identyfikacji rzęsek, niestandardowe programy do analizy ogólnej (GA) są używane do wykonywania różnych analiz, takich jak pomiar długości rzęsek i intensywności fluorescencji. Zebrane dane są eksportowane do tabeli, którą można łatwo odczytać, zinterpretować i wykorzystać do analiz statystycznych (Rysunek 1). Wykorzystanie zautomatyzowanej technologii i sztucznej inteligencji do identyfikacji rzęsek i uzyskania konkretnych pomiarów między grupami eksperymentalnymi pomoże w przyszłych badaniach mających na celu zrozumienie wpływu funkcji i morfologii rzęsek OUN na komunikację i zachowanie komórka-komórka.

Protocol

1. Pobieranie surowych obrazów

1. W razie potrzeby napraw i oznacz immunologicznie próbki²⁰.
   1. Obraz rzęsek za pomocą mikroskopu konfokalnego przy maksymalnej głębi bitowej przy użyciu tego samego rozmiaru piksela z rozdzielczością Nyquista.
   2. Eksportuj obrazy jako monochromatyczne pliki w formacie obrazu oznaczonego tagiem (.tif).
      UWAGA: Ten protokół określa sposób korzystania z modułu Ai w szczególności w oprogramowaniu NIS Elements. Jeśli obrazy zostały pozyskane jako pliki .nd2, eksportowanie obrazów jako plików .tif nie jest konieczne i użytkownik może przejść bezpośrednio do kroku 2.3. Jeśli obrazy zostały pozyskane w innym systemie, licencję NIS Elements można zakupić osobno, a .tif pliki można przekonwertować zgodnie z opisem w następnych krokach.

2. Naucz sztuczną inteligencję do rozpoznawania rzęsek

1. Otwórz zestaw danych treningowych.
   1. Wybierz około 50 przykładowych obrazów z co najmniej jedną rzęską na klatkę, aby przeszkolić oprogramowanie i skopiować je do jednego folderu. Ten folder służy do kierowania oprogramowaniem podczas otwierania obrazów. Otwórz te 50 ramek w jednym dokumencie ND2 z co najmniej jedną rzęską na klatkę. Wybierz opcję File (Plik) > Import/Export (Importuj/Eksportuj) > Create ND File (Utwórz plik ND z sekwencji plików).
   2. Wybierz folder zawierający zestaw danych treningowych. Spowoduje to otwarcie listy plików na środku okna dialogowego. Zdefiniuj ręcznie organizację plików, korzystając z co najmniej jednej opcji w menu rozwijanym powyżej. Dostępne opcje to wielopunktowy (dla wielu plików maksymalnej projekcji), seria Z (dla obrazu ze stosu z), czas (dla obrazu poklatkowego) i długość fali (dla plików z wielu kanałów).
   3. Wprowadź odpowiednie wartości liczbowe pod każdą wybraną opcją. Wybierz opcję Brak wszędzie tam, gdzie opcje nie są zaznaczone. Kliknij przycisk Konwertuj, aby otworzyć dokument ND.
2. Kalibrowanie obrazów.
   1. Wprowadź rozmiar w pikselach w lewym dolnym rogu obrazu: Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Nieskalibrowany > Kalibruj dokument > rozmiaru w pikselach.
3. Zidentyfikuj rzęski.
   1. Ręcznie zidentyfikuj rzęski, precyzyjnie śledząc poszczególne struktury rzęskowe we wszystkich otwartych ramkach za pomocą funkcji AutoDetect lub Draw Object na pasku narzędzi binarnych. Spowoduje to narysowanie masek binarnych na obiektach zainteresowania. Te pliki binarne posłużą jako przykładowe obiekty do szkolenia oprogramowania w zakresie identyfikacji rzęsek na podstawie cech opartych na pikselach w przyszłej eksperymentalnej analizie obrazu. Wybierz opcję Widok > Formanty analizy > binarnym pasku narzędzi > Rysuj obiekt.
      UWAGA: Usuń każdą ramkę, która nie ma żadnych plików binarnych, ponieważ oprogramowanie nie rozpocznie trenowania, jeśli nie będzie w stanie wykryć plików binarnych we wszystkich otwartych ramkach.
4. Trenuj sztuczną inteligencję.
   1. Rozpocznij szkolenie oprogramowania. Spowoduje to otwarcie pociągu Segment.ai skrzynki. Wybierz NIS.ai > Train Segment.ai.
   2. W polu Train Segment.ai (Trenowanie ) wybierz kanał źródłowy, który ma być używany do trenowania. Jeśli otwarte są pliki z wielu kanałów, wybierz tylko jeden kanał jako kanał źródłowy. Następnie wybierz odpowiednie pliki binarne prawdy podstawowej, na których chcesz trenować sztuczną inteligencję. Na koniec wybierz liczbę iteracji potrzebnych do wytrenowania sztucznej inteligencji w zależności od rozmiaru i dystrybucji plików binarnych.
      UWAGA: Jeśli pliki binarne są łatwo wykrywalne z otoczenia i dobrze rozmieszczone na obrazie, oprogramowanie może potrzebować mniej niż 1000 iteracji, aby nauczyć się identyfikować obrazy. Jeśli obrazy mają niski stosunek sygnału do szumu, idealnie jest uruchomić co najmniej 1000 iteracji podczas treningu, aby umożliwić sztucznej inteligencji identyfikację rzęsek w próbkach testowych z dużą pewnością.
   3. Wybierz folder docelowy, aby zapisać wytrenowany plik sztucznej inteligencji (.sai), a następnie kliknij przycisk Trenuj, aby wytrenować oprogramowanie. Oprogramowanie będzie teraz trenować się w rozpoznawaniu rzęsek na podstawie śledzonych plików binarnych. Ten proces trwa kilka godzin.
      UWAGA: Podczas treningu oprogramowanie wyświetli wykres przedstawiający straty treningowe. Wykres początkowo pokaże skok, a następnie zwęzi się do idealnie około 1% straty, gdzie utrzymuje się do końca treningu. Zapisz wykres do wykorzystania w przyszłości, zaznaczając pole wyboru Zapisz zrzut ekranu wykresu w polu Train Segment.ai (Rysunek uzupełniający 1).
   4. Jeśli wymagane jest dalsze uściślenie trenowania, kontynuuj trenowanie na tym samym zestawie danych. Alternatywnie możesz trenować na nowym zestawie danych z dokładnie tymi samymi parametrami. Nie zaleca się trenowania już wytrenowanej sztucznej inteligencji na nowym zbiorze danych o różnych parametrach lub różnych obiektach zainteresowania. Wybierz pozycję Trenuj segment.ai > kontynuuj trenowanie > wybierz pozycję Plik wytrenowanej sztucznej inteligencji.

3. Zidentyfikuj rzęski za pomocą wyszkolonej sztucznej inteligencji

1. Otwórz eksperymentalny zestaw danych.
   1. Otwórz eksperymentalne obrazy konfokalne rzęsek w oprogramowaniu, konwertując pliki próbki .tif na pliki .nd2, podobnie jak w kroku 2.1. Wybierz opcję Plik > Importuj/Eksportuj > Utwórz plik ND z sekwencji plików.
      UWAGA: Obrazy powinny mieć ten sam rozmiar piksela, co te używane do trenowania sztucznej inteligencji. Jeśli obrazy są już w formacie ND2, przejdź do kroku 3.3.
2. Kalibrowanie obrazów.
   1. Wprowadź rozmiar w pikselach w lewym dolnym rogu obrazu. Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Nieskalibrowany > Kalibruj dokument > rozmiaru w pikselach.
3. Uruchom wytrenowaną sztuczną inteligencję na otwartych plikach.
   1. Rozpocznij identyfikację rzęsek za pomocą Ai. Oprogramowanie będzie teraz rysować pliki binarne na rzęskach na podstawie treningu, który otrzymał w poprzednim kroku. Ten proces zajmie kilka sekund. Wybierz NIS.ai > Segment.ai.
      UWAGA: Oprogramowanie poprosi o wybranie kanału, jeśli otwartych jest wiele kanałów. Kanały są tutaj wymienione według ich nazw. Jeśli nie, pole oznaczone "Mono" zostanie automatycznie zaznaczone.
4. Sprawdź obrazy pod kątem błędnie zidentyfikowanych plików binarnych.
   1. Gdy sztuczna inteligencja zidentyfikuje rzęski i narysuje pliki binarne, sprawdź obrazy pod kątem błędnie zidentyfikowanych obiektów. W razie potrzeby ręcznie usuń wszystkie błędnie zidentyfikowane pliki binarne. Wybierz opcję Widok > formantów analizy > binarny pasek narzędzi > Usuń obiekt.

4. Pomiar długości i intensywności rzęsek

1. Utwórz nową recepturę Analizy ogólnej 3 (GA3).
   1. Teraz, gdy rzęski zostały zidentyfikowane i podzielone na segmenty, przystąp do analizy różnych parametrów rzęsek, takich jak długość i intensywność, za pomocą narzędzia GA3. Spowoduje to otwarcie nowego okna z pustym miejscem pośrodku, w którym zostanie zdefiniowana analiza. Wybierz Obraz > Nowy przepis GA3.
2. Wybierz pliki binarne do analizy.
   1. Ponieważ rzęski są już podzielone na segmenty za pomocą Segment.ai, GA3 automatycznie wykryje pliki binarne odpowiednio oznaczone zgodnie ze sztuczną inteligencją i uwzględni węzeł. Wybierz opcję "Pliki binarne > automatyczne Detect_AI" lub "Pliki binarne > rysuj Object_AI".
3. Wybierz kanały wymagane do analizy. GA3 automatycznie wykryje również kanały na obrazach i wyświetli ich zakładki w sekcji Kanały.
4. Usuń obiekty stykające się z krawędzią ramki.
   1. Ponieważ Ai podzieli na segmenty wszystkie obiekty podobne do rzęsek w ramce, wykryje również niekompletne rzęski wzdłuż krawędzi ramki. Obiekty te można usunąć ręcznie w kroku 3.4 lub automatycznie w wersji ogólnie dostępnej 3. Wybierz Przetwarzanie binarne > Usuń obiekty > Stykające się granice.
5. Wybierz parametry do pomiaru rzęsek.
   1. Przeciągnij i upuść parametry do pomiaru, takie jak długość rzęsek (długość) i intensywność (suma intensywności obiektu). Połącz węzły z odpowiednim węzłem binarnym (połączenie A) i węzłami kanału (połączenie B). Umieść kursor na połączeniu węzła, aby wyświetlić etykietkę narzędzia, aby pokazać, do którego połączenia należy węzeł. Wybierz Pomiar > Rozmiar > długość obiektu oraz Pomiar > intensywności obiektu > Sumuj intensywność obiektu.
      UWAGA: >Długość węzła łączy się tylko z węzłem binarnym, podczas gdy Suma intensywności obj łączy się zarówno z węzłem binarnym, jak i węzłem kanału.
6. Dołącz pomiary do jednej tabeli.
   1. Połącz wszystkie pomiary w jednej tabeli wyjściowej, przeciągając i upuszczając węzeł Dołącz kolumnę do schematu blokowego analizy i łącząc go z węzłami pomiaru, długością i intensywnością sumy. Wybierz pozycję Zarządzanie danymi > Podstawowe > Dołącz kolumnę.
7. Zmierz rzęski.
   1. Zmierz rzęski, klikając Uruchom. Ten proces zajmuje kilka chwil, aby zmierzyć wszystkie rzęski na obrazach eksperymentalnych. Długości i intensywności pojawią się w nowym oknie Wyniki analizy.
      UWAGA: Tabela może czasami zawierać dane z masek, które sztuczna inteligencja rozpoznała jako rzęski, ale były zbyt małe, aby mogły zostać wykryte przez ludzkie oko i wyeliminowane w kroku 3.4. Obiekty te można usunąć ze zbioru danych za pomocą filtru przed analizą statystyczną. W tym przypadku do pomiarów długości rzęsek in vitro użyto filtra o wielkości 1 μm w Rysunek 2 i 2 μm dla rzęsek in vivo. Można to zrobić przed wyeksportowaniem danych za pomocą poniższej ścieżki. Wybierz okno Wyniki analizy > Zdefiniuj filtr > Wprowadź wartość > Użyj filtru.
8. Eksport danych do analizy statystycznej.

5. Badania kolokalizacyjne

UWAGA: Analiza kolokalizacji może być zawarta w tym samym przepisie GA3, który jest używany do pomiarów długości rzęsek i analizy intensywności. W przypadku korzystania z tej samej receptury otwórz pliki zgodnie z poniższym opisem i zmierz długość i intensywność obu kanałów wraz ze współczynnikami kolokalizacji w tym samym potoku analizy.

1. Otwórz eksperymentalny zestaw danych.
   1. Otwórz eksperymentalne obrazy konfokalne rzęsek w oprogramowaniu, konwertując pliki próbki .tif na pliki .nd2. Wybierz opcję File (Plik) > Import/Export (Importuj/Eksportuj) > Create ND File (Utwórz plik ND z sekwencji plików).
   2. W wyskakującym okienku wybierz pliki monochromatyczne o 16-bitowej głębi ze wszystkich interesujących Cię kanałów z eksploratora okien znajdującego się w pierwszej kolumnie wyskakującego okienka. Z pierwszego menu rozwijanego wybierz opcję Wielopunktowe lub Seria Z i wprowadź wartość odpowiadającą odpowiednio całkowitej liczbie obrazów lub stosów.
   3. W drugim polu rozwijanym wybierz opcję Długość fali i zmień wartość na całkowitą liczbę kanałów w folderze. Oprogramowanie automatycznie odblokuje okno wyboru długości fali znajdujące się w prawym dolnym rogu wyskakującego okienka. Użyj menu rozwijanego Kolor, aby wybrać kolor każdego kanału. Podaj każdemu kanałowi inną nazwę w kolumnie Nazwa. Po zaktualizowaniu wszystkich informacji kliknij przycisk Konwertuj. Oprogramowanie automatycznie wygeneruje plik obrazu Wszystkie nałożony na wszystkie pojedyncze obrazy ze wszystkich wybranych kanałów.
2. Kalibrowanie obrazów.
   1. Wprowadź rozmiar w pikselach w lewym dolnym rogu obrazu. Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Nieskalibrowany > Kalibruj dokument > rozmiaru w pikselach.
3. Uruchom wytrenowaną sztuczną inteligencję na pierwszym kanale.
   1. Rozpocznij identyfikację rzęsek na jednym z otwartych kanałów (np. ACIII; Rysunek 5A) za pomocą sztucznej inteligencji. Oprogramowanie będzie teraz rysować pliki binarne na rzęskach oznaczonych ACIII na podstawie treningu, który otrzymał dla tego kanału. Ten proces zajmie kilka sekund. Wybierz NIS.ai > Segment.ai > Kanały źródłowe > ACIII.
4. Uruchom wytrenowaną sztuczną inteligencję na drugim kanale.
   1. Rozpocznij identyfikację rzęsek na drugim otwartym kanale (np. MCHR1; Rysunek 5B) za pomocą sztucznej inteligencji. Oprogramowanie będzie teraz rysować pliki binarne na rzęskach oznaczonych MCHR1 na podstawie treningu, który otrzymał dla tego kanału. Ten proces zajmie kilka chwil. Wybierz NIS.ai > Segment.ai > Kanały źródłowe > MCHR1.
5. Sprawdź obrazy pod kątem błędnie zidentyfikowanych plików binarnych.
   1. Gdy sztuczna inteligencja zidentyfikuje rzęski i narysuje pliki binarne, sprawdź obrazy pod kątem błędnie zidentyfikowanych obiektów. W razie potrzeby ręcznie usuń wszystkie błędnie zidentyfikowane pliki binarne. Wybierz opcję Widok > formantów analizy > binarny pasek narzędzi > Usuń obiekt.
6. Utwórz nowy przepis GA3.
   1. Teraz, gdy rzęski zostały zidentyfikowane i podzielone na segmenty, przejdź do analizy kolokalizacji za pomocą narzędzia GA3. Spowoduje to otwarcie nowego okna z pustym miejscem pośrodku, w którym zostanie zdefiniowana analiza. Zostanie wygenerowane okno ze wszystkimi zidentyfikowanymi plikami binarnymi i kanałami. Sprawdź, czy wszystkie żądane kanały i pliki binarne wymagane do analizy są obecne i wybrane. Wybierz Obraz > Nowy przepis GA3.
7. Usuń obiekty stykające się z krawędzią ramki.
   1. Ponieważ sztuczna inteligencja podzieli na segmenty wszystkie obiekty podobne do rzęsek w ramce, wykryje również niekompletne rzęski wzdłuż krawędzi ramki. Obiekty te można usunąć ręcznie w kroku 5.5 lub automatycznie w wersji ogólnie dostępnej 3. Wybierz opcję Przetwarzanie binarne > Usuń obiekty > Stykające się krawędzie.
8. Skonfiguruj ścieżkę kolokalizacji w GA3.
   1. Aby zmierzyć nakładanie się dwóch kanałów w rzęskach, użyj korelacji współczynnika Mandera. Przeciągnij i upuść węzeł Współczynnik Mandersa w puste miejsce przepisu GA3 i połącz go z odpowiednim plikiem binarnym i kanałami. W tym przypadku "połączenie A" łączy się z plikiem binarnym ACIII, "połączenie B" z kanałem MCHR1, a "połączenie C" z kanałem ACIII, aby określić nakładanie się MCHR1 w obrębie pliku binarnego ACIII. Wybierz Pomiar > Współczynnik proporcji obiektu > Manders.
      UWAGA: Oprogramowanie umożliwia pomiar kolokalizacji za pomocą korelacji współczynnika Pearsona przy użyciu tych samych kroków, które opisano w tym protokole⁴⁰.
9. Dołącz pomiary do jednej tabeli.
   1. Połącz wszystkie pomiary w jednej tabeli wyjściowej. Wybierz pozycję Zarządzanie danymi > Podstawowe > Dołącz kolumnę.
10. Mierz kolokalizację.
    1. Zmierz rzęski, klikając Uruchom. Ten proces zajmuje kilka chwil, aby zmierzyć wszystkie rzęski na obrazach eksperymentalnych. Dane pojawią się w nowym oknie Wyniki analizy.
11. Eksport danych do analizy statystycznej.

Results

Trening AI w rozpoznawaniu rzęsek
Pomiar i ocena długości strukturalnej i składu rzęsek może być żmudnym, czasochłonnym i podatnym na błędy procesem. Tutaj używamy Ai do dokładnej segmentacji rzęsek z dużej puli obrazów i analizujemy ich długość i intensywność za pomocą narzędzia analitycznego (Rysunek 1). Wszystkie podejścia do sztucznej inteligencji wymagają etapów szkoleniowych w celu ich wdrożenia. Ustaliliśmy proces treningowy rozpoznawania rzęsek, który został przeprowadzony poprzez ręczne nakładanie masek binarnych na struktury rzęskowe. Informacje te są następnie wykorzystywane do trenowania sztucznej inteligencji na podstawie charakterystyki pikseli w zastosowanych plikach binarnych. Ogólnie rzecz biorąc, szkolenie obejmuje oprogramowanie przechodzące przez kilka iteracji, około 1000, i jest uważane za optymalne, jeśli strata lub wskaźnik błędów uczenia jest mniejszy niż 1%. Jednak liczba iteracji i błędów w procesie trenowania może się różnić w zależności od przykładowych obrazów używanych do trenowania. Na przykład, po naszych sesjach treningowych z wykorzystaniem obrazów rzęsek neuronalnych in vitro, poziom błędu wynosił 1,378% w porównaniu z 3,36% w przypadku obrazów przekrojów mózgu in vivo (rysunek uzupełniający 1). Po zakończeniu trenowania sztuczna inteligencja może być następnie wykorzystana do segmentacji rzęsek z obrazów eksperymentalnych w ciągu kilku sekund, a powstałe w ten sposób maski binarne są wykorzystywane do pomiaru parametrów strukturalnych. Eliminuje to konieczność segmentacji obiektów przy użyciu tradycyjnej metody progowania intensywności, co może być trudne w przypadku obrazów o wysokim poziomie szumów tła lub gdy obiekty znajdują się w bliskiej odległości od siebie. Sztuczna inteligencja zmniejsza również ryzyko błędów i stronniczości, stosując ten sam algorytm do wszystkich obrazów, niezależnie od użytkownika.

Pomiar długości rzęsek za pomocą GA3
Długość rzęsek jest ściśle regulowana i wiąże się z funkcjonalnym wpływem na sygnalizację rzęskową^16,19. W tym przypadku zmierzyliśmy długości rzęsek za pomocą potoku analizy w oprogramowaniu NIS Elements o nazwie General Analysis 3 lub GA3. GA3 pomaga w łączeniu wielu narzędzi w jednym przepływie pracy w celu tworzenia niestandardowych procedur dla każdego eksperymentu. Zaczęliśmy od zmierzenia długości rzęsek w linii komórkowej. Rzęski na komórkach wewnętrznego kanału zbiorczego rdzenia myszy (IMCD-3) znakowano immunologicznie acetylowaną tubuliną i obrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Zmierzyliśmy długości rzęsek za pomocą GA3 po segmentacji za pomocą segment.ai (rysunek uzupełniający 3A). Podczas gdy acetylowana α-tubulina znajduje się preferencyjnie w rzęsce pierwotnej, znajduje się również w innych regionach bogatych w mikrotubule, takich jak cytoszkielet, a także mostek cytokinekinetyczny. Wytrenowana sztuczna inteligencja prawidłowo zidentyfikowała rzęski na obrazie, ale nie inne nierzęskowe, acetylowane struktury dodatnie tubuliny. Rzęski na komórkach IMCD wahały się od 0,5 μm do 4,5 μm o średniej długości 1,8 ± 0,04 μm (Ryc. 2A). Następnie przetestowaliśmy zdolność sztucznej inteligencji do pomiaru długości rzęsek w pierwotnych kulturach neuronalnych. Hodowaliśmy neurony z podwzgórza i hipokampa nowonarodzonych myszy przez 10 dni i znakowaliśmy je immunologicznie markerem rzęsek cyklazy adenylanowej III (ACIII)^21,41. Analizując hodowle neuronów, stwierdziliśmy, że przydatne jest zastosowanie filtra przed analizą statystyczną długości. Ze względu na niższy stosunek sygnału do szumu zidentyfikowano kilka obiektów mniejszych niż 1 μm, które nie były rzęskami. Dlatego przefiltrowaliśmy dane, aby wyeliminować wszelkie obiekty o długości mniejszej niż 1 μm, aby upewnić się, że analizowane są tylko rzęski. W hodowanych neuronach podwzgórza długość rzęsek wahała się od 2 μm do 7 μm przy średniej długości 3,8 ± 0,19 μm (Ryc. 2B). Co ciekawe, hodowane rzęski neuronalne hipokampa były dłuższe i miały średnią długość 6,73 ±0,15 μm (Rysunek 2C). Doniesiono, że różne jądra neuronalne w podwzgórzu wykazują różne długości rzęsek i że te rzęski zmieniają swoją długość w odpowiedzi na zmiany fizjologiczne w sposób specyficzny dla jądra^19,23. Dlatego oznaczyliśmy również skrawki mózgu podwzgórza od dorosłych samców myszy C57BL / 6J z ACIII i zobrazowaliśmy jądro łukowate (ARC) i jądro przykomorowe (PVN). Używając GA3 do pomiaru długości rzęsek, zaobserwowaliśmy, że rzęski podwzgórza in vivo wydawały się dłuższe niż rzęski in vitro. W szczególności rzęski podwzgórza in vivo wahają się od 1 μm do około 15 μm (Ryc. 3). Nie stwierdzono istotnych różnic między długościami rzęsek w PVN (5,54 ± 0,0,42 μm) a tymi w ARC (6,16 ± 0,27 μm) (Rysunek 3C)²³. Podobnie, rzęski w obszarze rogu-amonisa (CA1) hipokampa mają węższy zakres długości od 1 μm do 10 μm ze średnią długością 5,28 ± 0,33 μm (Rysunek 3). Zgodnie z wcześniej opublikowanymi badaniami, nasza analiza z wykorzystaniem narzędzi Ai i GA3 wykazała, że rzęski z różnych regionów mózgu wykazują różnorodność długości^19,23. Co więcej, korzystając z tego podejścia AI, jesteśmy w stanie szybko ocenić dużą liczbę rzęsek.

Pomiar składu rzęsek za pomocą GA3
Rzęska pierwotna jest węzłem sygnalizacyjnym dla wielu szlaków, które wykorzystują różne rodzaje białek do wykonywania unikalnych funkcji, takich jak białka motoryczne, białka transportu wewnątrzwiciowego i GPCR, aby wymienić tylko kilka^3,24,42,43. Utrzymanie odpowiedniego poziomu tych białek w rzęsce jest ważne dla prawidłowego funkcjonowania i często wydaje się zależne od kontekstu komórkowego. Znakowanie fluorescencyjne tych białek nie tylko umożliwiło nam ich wizualizację, ale także ilościowe określenie ich intensywności jako miary ilości znakowanego białka w stosunkowo małym przedziale²⁰. Dlatego staraliśmy się określić intensywność rzęskowego GPCR, receptora hormonu koncentracji melaniny 1 (MCHR1), in vivo zarówno w ARC, jak i PVN podwzgórza dorosłych samców myszy^24,44. Korzystając z Ai i GA3, zmierzyliśmy długości rzęsek dodatnich MCHR1 wraz z intensywnością, aby upewnić się, że liczone obiekty były rzęskami (rysunek uzupełniający 3A). Wyeliminowaliśmy obiekty po analizie, które miały długość mniejszą niż 2 μm i przeanalizowaliśmy intensywności pozostałych masek binarnych. Co ciekawe, odkryliśmy, że intensywność rzęskowego MCHR1 w PVN jest znacznie wyższa niż w ARC, co wskazuje na silniejszą obecność rzęskowego MCHR1 w PVN (Figura 4). Konieczne są dalsze badania w celu określenia znaczenia rzęskowego MCHR1 w tych obwodach neuronalnych. Zmierzyliśmy również intensywność rzęskowego MCHR1 w pierwotnych hodowanych neuronach podwzgórza i hipokampa. Rzęski z obu kultur wykazują szeroki rozkład intensywności MCHR1, co sugeruje obecność heterogenicznych populacji neuronów (ryc. uzupełniająca 2). Tak więc stosowanie zaawansowanych narzędzi analitycznych, takich jak Ai i GA3, pozwala na ocenę niejednorodności rzęsek w tej samej tkance lub między wieloma tkankami. Interesujące będzie sprawdzenie, czy inne neuronalne GPCR wykazują podobne różnice w swojej lokalizacji w neuronach tej samej tkanki i czy zmienia się to w odpowiedzi na zmiany fizjologiczne.

Kolokalizacja
Podczas gdy pomiar intensywności fluorescencji w całym polu obrazu może dać wrażenie białka, nie dostarcza informacji, takich jak rozmieszczenie przestrzenne lub bliskość innych pobliskich białek i struktur komórkowych. Tutaj zmierzyliśmy nakładanie się MCHR1 z ACIII jako markerem rzęsek, wykreślając intensywność MCHR1 w stosunku do intensywności ACIII dla każdej maski binarnej (Rysunek 5). Wykres pokazuje, że większość rzęsek jest dodatnia zarówno dla ACIII, jak i MCHR1, chociaż niektóre rzęski wykazują silniejszą ekspresję jednego kanału w stosunku do drugiego. Ponadto istnieją rzęski, które wykazują obecność ACIII lub MCHR1, co jest oczywiste w punktach, które leżą bezpośrednio odpowiednio na osi x i y. Aby określić ilościowo to nakładanie się, zmierzyliśmy współczynnik nakładania się Mandera i porównaliśmy zakres ekspresji MCHR1 w rzęskach neuronalnych ARC i PVN⁴⁰. Co ciekawe, nasza analiza wykazała, że nastąpił znaczny wzrost współczynników PVN (0,6382 ± 0,0151) niż tych w ARC (0,5430 ± 0,0181) (Rysunek 5C). Jest to zgodne z naszymi poprzednimi danymi, w których zaobserwowaliśmy wyższą intensywność MCHR1 w PVN w porównaniu z ARC (Rysunek 4). Dane te sugerują, że podobnie jak długość rzęsek, wzorzec ekspresji MCHR1 w przedziale rzęskowym różni się w różnych obszarach mózgu. Korzystając z tego samego toku analizy, możliwe będzie określenie, czy inne rzęskowe GPCR, takie jak receptor neuropeptydu Y typu 2 (NPY2R) i receptor somatostatyny typu 3 (SSTR3) wykazują podobną różnorodność.

Pomiar profilu intensywności wzdłuż rzęski
Po zidentyfikowaniu rzęsek za pomocą segment.ai, receptura GA3 może zostać zmodyfikowana, aby połączyć analizę rzęsek z identyfikacją innych struktur interesujących na obrazie. Na przykład znakowanie za pomocą podstawowych markerów ciała jest przydatne do identyfikacji polaryzacji rzęsek. Aby przeprowadzić tę analizę, zobrazowaliśmy podwzgórzowe skrawki mózgu myszy P0, które wyrażają ARL13B-mCherry i Centrin2-GFP oraz zobrazowaliśmy ARC i PVN³⁴. W tym przypadku rzęski zostały zidentyfikowane za pomocą Ai, tak jak wcześniej, ale teraz zmodyfikowana receptura GA3 obejmuje identyfikację Centrin2-GFP, białka dośrodkowego znajdującego się u podstawy rzęsek (rysunek uzupełniający 3B). Znakując Centrin2-GFP, podstawę rzęsek można odróżnić od końcówek rzęsek dodatnich ARL13B-mCherry (Rysunek 6A). Następnie, zamiast mierzyć intensywność w obrębie całych rzęsek, jesteśmy w stanie zmierzyć zmiany intensywności ARL13B na całej długości rzęsek (Rysunek 6B). Możemy również porównać różnice w intensywności ARL13B między końcami bliższymi a dalszymi końcami rzęsek. Aby to zrobić, podzieliliśmy długość rzęski na pojemniki o wielkości 1 mikrona, zaczynając od podstawy i wyznaczyliśmy pierwszy pojemnik mikronowy jako koniec proksymalny i ostatni pojemnik mikronowy jako koniec dystalny. Nasza analiza wykazała, że zarówno w ARC, jak i PVN, zarówno w ARC, jak i PVN, jest znacznie więcej ARL13B bliżej podstawy niż na czubku rzęski, co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi badaniami na ludzkich chondrocytach⁴⁵ (Figura 6C). W tego typu analizie, zamiast stosować filtr długości w celu wykluczenia z analizy małych obiektów nierzęskowych, analizowane są tylko rzęski związane z znakowaniem Centrin2-GFP. Może to być korzystne w sytuacjach, gdy mutacje genetyczne powodują, że rzęski są bardzo krótkie lub jeśli zaangażowane są zmiany w subdomenach rzęsek, takich jak strefa przejściowa lub wierzchołek. Identyfikacja rzęsek za pomocą analizy Ai i GA3 jest wysoce elastyczna i może być dostosowana do różnych złożonych pytań badawczych.

Rysunek 1. Przepływ pracy do pomiaru długości i intensywności rzęsek za pomocą Ai.(A) Aby wytrenować Ai, pliki binarne są rysowane wokół obiektów zainteresowania (rzęsek) na surowych obrazach treningowych. Korzystając z narysowanych plików binarnych, Segment Ai jest szkolony w rozpoznawaniu kształtu i intensywności pikseli rzęsek. (B) Następnie wytrenowany Segment Ai jest stosowany do surowych obrazów eksperymentalnych. Rysuje pliki binarne na obiektach, które rozpoznaje jako rzęski. Te pliki binarne można udoskonalić, aby upewnić się, że analizowane są wszystkie i tylko rzęski. (C) Program GA3 jest skonstruowany do analizy intensywności i długości obiektów rozpoznawanych przez sztuczną inteligencję. (D) Rekordy są importowane do tabeli w oprogramowaniu. Tabelę tę można następnie wyeksportować do dalszej analizy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Pomiary długości rzęsek in vitro. Reprezentatywne obrazy rzęsek w (A) komórkach IMCD (zielony, acetylowana tubulina) (B) pierwotnych kulturach podwzgórza (zielony, ACIII) i (C) kulturach hipokampa (zielony, ACIII). Do rozpoznania rzęsek użyto wytrenowanej sztucznej inteligencji, jak pokazano na masce binarnej (magenta), a następnie GA3 użyto do pomiaru długości rzęsek. Rozkład długości rzęsek jest przedstawiony na wykresie jako procent rzęsek w pojemnikach 0,5 lub 1,0 mikrona. * wskazuje na mostek cytokinetyczny prawidłowo nierozpoznany przez Ai. n=225 rzęsek w komórkach IMCD z 3 powtórzeń, 54 rzęski w podwzgórzu i 139 rzęsek w hodowlach hipokampa od 3 zwierząt. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Pomiary długości rzęsek in vivo. (A) Reprezentatywne obrazy rzęsek (zielony, ACIII) w ARC, PVN i CA1 sekcji mózgu dorosłej myszy. (B) Do rozpoznania rzęsek użyto wytrenowanej sztucznej inteligencji w elementach NIS, jak pokazano na masce binarnej (magenta), a następnie użyto GA3 do pomiaru długości rzęsek. (C) Rozkład długości rzęsek jest przedstawiony na wykresie jako procent rzęsek w pojemnikach jednomikronowych. n = 68 rzęsek w ARC, 36 w PVN i 29 w CA1 od 3 zwierząt. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Pomiary intensywności barwienia rzęsek rzęsek neuronalnych w podwzgórzu wspomagane sztuczną. (A) Reprezentatywne obrazy rzęsek (MCHR1, czerwony) w ARC i PVN sekcji mózgu dorosłej myszy. Do rozpoznania rzęsek wykorzystano wytrenowaną sztuczną inteligencję w elementach NIS, jak pokazano w masce binarnej (cyjan), a następnie GA3 użyto do pomiaru intensywności barwienia MCHR1 w rzęskach. (B) Intensywności MCHR1 są przedstawione na wykresie jako średnia ± S.E.M. Każda kropka reprezentuje rzęskę. * p < 0,05, test t-studenta. (C) Rozkład intensywności MCHR1 jest przedstawiony na wykresie jako procent rzęsek w przedziałach 0,2 x 10⁷ dowolnych jednostek (A). n = 53 rzęski w ARC, 78 w PVN od 3 zwierząt. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Analiza kolokalizacji rzęsek wspomagana sztuczną inteligencją. (A, B) Reprezentatywne obrazy rzęsek odpowiednio w ARC i PVN. Rzęski są oznaczone ACIII (na zielono) i MCHR1 (na czerwono). Do rozpoznania rzęsek wykorzystano wytrenowaną sztuczną inteligencję w elementach NIS, jak pokazano na masce binarnej (magenta dla rzęsek znakowanych ACIII, cyjan dla rzęsek oznaczonych MCHR1). GA3 był używany do rozpoznawania rzęsek, które zawierały zarówno ACIII, jak i MCHR1. (C) Wartości współczynnika nakładania się Manders (MOC) są przedstawione na wykresie jako średnia ± S.E.M. Każda kropka reprezentuje rzęskę. * p < 0,05, test t-studenta. (D) Wykres punktowy intensywności MCHR1 w funkcji intensywności ACIII w ARC i PVN. Każda kropka reprezentuje rzęskę. n = 72 rzęski w ARC, 47 w PVN od 3 zwierząt. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Analiza rzęsek i ciała podstawnego. (A) Reprezentatywne obrazy rzęsek (czerwony, ARL13B-mCherry) i markera podstawy ciała (zielony, Centrin2-GFP) w ARC i PVN myszy P0. Wytrenowana sztuczna inteligencja została użyta do rozpoznania rzęsek, jak pokazano w masce binarnej (cyjan). Maska binarna dla ciała podstawowego (magenta) została narysowana przez progowanie w przepisie GA3. (B) Reprezentatywna intensywność skanowania linii rzęski. (C) Natężenie ARL13B na bliższych i dalszych końcach Ai zidentyfikowało rzęski przedstawione na wykresie jako średnia ± S.E.M. Końce proksymalne i dystalne definiuje się jako obszar o długości 1 μm i długości ostatniej 1 μm odpowiednio od podstawy rzęski. Każda kropka reprezentuje rzęskę. * p < 0,05. n = 6 rzęsek w ARC od 2 zwierząt i 21 rzęsek w PVN od 3 zwierząt. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1. Wykresy strat związanych z trenowaniem AI. (A, B) Wykresy przedstawiające utratę segment.ai treningowej na rzęskach neuronalnych odpowiednio in vitro i in vivo. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2. Pomiary intensywności barwienia rzęsek neuronalnych in vitro wspomagane sztuczną intesencją. (A, B) Reprezentatywne obrazy rzęsek (MCHR1, czerwony) odpowiednio w pierwotnych kulturach podwzgórza i hipokampa. Do rozpoznania rzęsek wykorzystano wytrenowaną sztuczną inteligencję w elementach NIS, jak pokazano w masce binarnej (cyjan), a następnie GA3 użyto do pomiaru intensywności barwienia MCHR1 w rzęskach. Rozkład intensywności MCHR1 jest przedstawiony na wykresie jako procent rzęsek w 1000 przedziałach AU dla posiewów podwzgórza i 2000 AU dla kultur hipokampa. n = 30 rzęsek w podwzgórzu i 106 rzęsek w kulturach hipokampa od 3 zwierząt. Podziałka 10 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3. Analiza ogólna 3 przepisy na analizę rzęsek. (A) Prosta Analiza Ogólna (GA3) receptura do pomiaru długości rzęsek, intensywności i współczynnika Mandera. (B) Złożona receptura GA3 do pomiaru intensywności wzdłuż długości rzęski przy użyciu markera dla ciała podstawnego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Pomiary długości i intensywności są powszechnymi sposobami analizy rzęsek pierwotnych, jednak nie ma ustandaryzowanej konwencjonalnej metody stosowanej w tej dziedzinie. Identyfikacja i kwantyfikacja rzęsek pierwotnych za pomocą oprogramowania takiego jak ImageJ jest czasochłonna i podatna na stronniczość i błędy użytkownika. Utrudnia to dokładną analizę dużych zbiorów danych. Tutaj pokazujemy, że użycie programu AI może przezwyciężyć wiele z tych wyzwań, dzięki czemu możliwa jest wysokoprzepustowa analiza rzęsek pierwotnych. W tym miejscu opisujemy procedurę trenowania aplikacji opartej na sztucznej inteligencji w celu rozpoznawania rzęsek pierwotnych i nakreślamy kroki wymagane do analizy długości i intensywności.

Podczas gdy wstępne szkolenie sztucznej inteligencji w rozpoznawaniu rzęsek wymaga od użytkownika znacznego czasu, po zakończeniu można je wykorzystać na dowolnym zestawie danych uzyskanych o tych samych parametrach. Maska binarna generowana przez sztuczną inteligencję jest modyfikowalna w taki sposób, że wszelkie błędy można poprawić. Jednak błędy w identyfikacji rzęsek powinny sygnalizować użytkownikowi, że sztuczna inteligencja musi być dalej trenowana za pomocą dodatkowych obrazów. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że sztuczną inteligencję można wytrenować do rozpoznawania rzęsek w różnych typach próbek zarówno w 2D, jak i 3D. Poprzednie metody analizy generowane w laboratoriach miały różne ograniczenia, w tym wymaganie ręcznego progowania w celu identyfikacji i problemy z identyfikacją rzęsek obrazowanych na podstawie odcinków tkanki, w których gęstość komórek jest wysoka 36,46,47. Metody te są również wyspecjalizowane w analizie rzęsek, podczas gdy analiza za pomocą oprogramowania NIS Elements może oceniać kilka aspektów obrazów jednocześnie. Ponieważ opisana tutaj sztuczna inteligencja jest częścią pakietu oprogramowania NIS Elements, obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu firmy Nikon można łatwo kontynuować aż do analizy. Jednak obrazowanie za pomocą firmy Nikon nie jest wymagane do korzystania z tej metody. Niezależnie od przechwyconego formatu pliku danych surowych, pliki ".tif" mogą być otwierane przez NIS Elements w celu użycia w sztucznej inteligencji.

Ta aplikacja AI w ramach NIS Elements jest szeroko dostępna i prawdopodobnie jest już częścią oprogramowania do analizy obrazu używanego przez laboratoria badające pierwotne rzęski. Wraz z rozwojem technologii sztucznej inteligencji inne programy do obrazowania mogą rozszerzyć swoje opcje analizy o podobny moduł sztucznej inteligencji. Zastosowanie analizy Ai do identyfikacji rzęsek może być wykorzystane do kilku różnych aspektów analizy rzęsek. Chociaż przedstawiliśmy metody dla kilku prostych analiz, takich jak długość (Rysunek 2 i 3), intensywność (Rysunek 4) i kolokalizacja (Rysunek 5), bardziej wyrafinowaną analizę można dodać do przepływu pracy analizy GA3, jak na Rysunku 6. Na przykład, zamiast mierzyć intensywność całej rzęski, różnice w intensywności w podregionie rzęski mogą być interesujące dla oceny lokalizacji podrzęskowej. Różnice w intensywności w podregionie rzęski mogą wskazywać, że białko gromadzi się na czubku lub podstawie rzęski, na przykład w jaki sposób białka Gli są wzbogacane na końcu rzęski⁴⁸. Ponadto ta aplikacja AI może być używana do łatwej identyfikacji różnic między genotypami lub grupami leczonymi. Chociaż nasze laboratorium wykorzystuje tę metodę głównie do analizy rzęsek zobrazowanych z wycinków mózgu lub kultur neuronalnych, można ją zastosować do obrazów uzyskanych z różnych linii komórkowych lub innych typów tkanek. Elastyczność typu próbki, do której można wykorzystać tę aplikację, sprawia, że ta metoda analizy jest cenna dla wielu różnych grup badających rzęski pierwotne lub dowolne dyskretne organelle, które są oceniane, takie jak mitochondria, jądro lub ER.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intel Xeon, 3,6 GHz, 32 GB pamięci RAM	Intel Corporation	W-2123	używany do uruchamiania NIS Elements.
Oprogramowanie Nikon Elements	Nikon Instruments Inc.	-	Oprogramowanie Ai i GA3
Karta graficzna Quadro RTX 4000 NVIDIA	Corporation	Quadro RTX 4000
Windows 10 Professional 64-bit	Microsoft Inc.	-	System operacyjny używany do uruchamiania NIS
Elements Workstation	HP Development Company, L.P.	HP  Stacja robocza Z4G4	używana do uruchamiania elementów NIS