Prosta, wewnętrzna, ultra-wydajna produkcja kolumn kapilarnych dzięki podejściu FlashPack

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dla zoptymalizowanej procedury pakowania kolumn kapilarnych FlashPack. Zastosowanie zoptymalizowanego protokołu do powszechnej konfiguracji bomby ciśnieniowej 100 bar pozwala na 10-krotnie szybsze pakowanie i produkcję długich, ultra wysokowydajnych kolumn kapilarnych.

Streszczenie

Kapilarna ultra-wysokosprawna chromatografia cieczowa (UHPLC) jest obecnie metodą wyboru dla etapu separacji próbek w proteomice opartej na LC-MS. Jednak kolumny kapilarne są znacznie mniej wytrzymałe w porównaniu z ich przeciwstawnymi typami o wyższym przepływie. Ze względu na łatwe zanieczyszczenie i blokowanie często wymagają wymiany. To sprawia, że są one znacznie droższą częścią całkowitego kosztu analizy LC-MS. Własne pakowanie kolumn kapilarnych UHPLC pozwala zaoszczędzić dużo pieniędzy i umożliwia dostosowanie do indywidualnych potrzeb. Jednak standardowa procedura pakowania w bombie ciśnieniowej o ciśnieniu 100 barów działa dobrze tylko w przypadku kolumn HPLC, ale jest zbyt wolna w przypadku sorbentów UHPLC. W tym miejscu przedstawiamy opis zoptymalizowanego protokołu FlashPack zastosowanego do tej samej konfiguracji bomby ciśnieniowej o ciśnieniu 100 barów. Metoda opiera się na pakowaniu z zawiesiny o bardzo wysokim stężeniu sorbentu i została opracowana do własnej produkcji kolumn kapilarnych UHPLC o nieograniczonej długości w rozsądnym czasie.

Wprowadzenie

Nowoczesna proteomika opiera się na spektrometrii mas sprzężonej z chromatografią cieczową z ultra-wysokowydajną chromatografią nanoprzepływową (50-150 μm wewnętrzna średnica kolumny (ID)) zapewniającą najlepszą szybkość i czułość analizy¹. Chociaż dostępnych jest wiele komercyjnych kolumn kapilarnych UHPLC, ich cena stanowi znaczną część kosztów materiałów eksploatacyjnych, zwłaszcza gdy w laboratorium prowadzonych jest wiele różnych projektów, a zanieczyszczenie kolumn specyficzne dla projektu jest częstym problemem. Poza tym, pakowanie kolumn we własnym zakresie pozwala na użycie niestandardowych sorbentów specyficznych dla eksperymentu (takich jak np. polyCAT-A sorbent²) oraz charakterystyk kolumn niedostępnych do kupienia jako gotowa kolumna.

Aby sobie z tym poradzić, wiele laboratoriów wyposaża kolumny kapilarne we własnym zakresie. Jednak powszechna procedura pakowania z bombą ciśnieniową o ciśnieniu 100 bar (komórka wtrysku ciśnieniowego) ³ nie nadaje się do wypełnienia kolumny UHPLC ze względu na wysokie ciśnienie wsteczne sorbentów UHPLC poniżej 2 μm, co skutkuje dramatycznym zmniejszeniem szybkości upakowania w porównaniu z sorbentami HPLC o większych rozmiarach. Podczas gdy krótkie kolumny UHPLC mogą być nadal bardzo wolno pakowane, produkcja długich kolumn UHPLC jest fizycznie niemożliwa⁴.

Standardowe napełnianie kolumn kapilarnych odbywa się przy stosunkowo niskich ciśnieniach - do 100 barów i przy bardzo niskim stężeniu zawiesiny sorbentowej. W związku z tym dostępne są dwa możliwe kierunki przyspieszenia tego procesu. Możliwe jest zwiększenie ciśnienia w opakowaniu⁵. Wymaga to jednak specjalnego sprzętu i praktycznie zainstalowania nowej metody w laboratorium. Innym sposobem jest zwiększenie stężenia zawiesiny sorbentowej⁶. Uszczelnienie zawiesiny o wysokim stężeniu sorbentu zostało opisane w połączeniu z bardzo wysokim ciśnieniem upakowania w poprzedniej publikacji⁷. Jednak przy ciśnieniu 100 barów, które jest stosowane w większości istniejących bomb do pakowania, wyższe stężenie sorbentu powoduje albo spowolnienie szybkości upakowania, albo całkowite zaprzestanie pakowania. Niedawno zademonstrowano, że efekt ten jest spowodowany grupowaniem się sorbentu przy wejściu do kolumny, a prosta sztuczka destabilizacji kopuły sorbentu poprzez uderzenie w wejście do kolumny prętem magnetycznym wewnątrz fiolki z sorbentem została zasugerowana⁴. Powstała metoda, nazwana FlashPack, wykorzystuje tę samą konfigurację pakowania bomb ciśnieniowych o ciśnieniu 100 barów. Jednocześnie niewielkie, ale krytyczne zmiany w procedurze pakowania pozwalają na pakowanie z bardzo wysokiego stężenia zawiesiny sorbentowej i produkcję bardzo długich kolumn UHPLC (od 50 do 70 cm i dłuższych) w czasie krótszym niż godzina, podczas gdy krótka kolumna może być wyprodukowana w ciągu kilku minut z jakością separacji równą kolumnom handlowym o tych samych parametrach⁴. Podejście FlashPack zostało już z powodzeniem wykorzystane w wielu projektach proteomicznych do przygotowania zarówno fazy odwróconej (RP)^{8,9,10,11,12,13,14} oraz interakcji hydrofilowej (HILIC)^{2 kolumny kapilarne}.

Tutaj szczegółowo opisujemy modyfikacje potrzebne do dostosowania podejścia FlashPack do standardowej procedury pakowania bomb ciśnieniowych 100 bar.

Protokół

Protokół pakowania składa się z pięciu kroków (Rysunek 1): 1) przygotowanie stacji pakowania, 2) przygotowanie kapilarnej, 3) przygotowanie zawiesiny sorbentowej, 4) upakowanie kapilarne w bombie ciśnieniowej, oraz 5) upakowanie kolumny w systemie HPLC, rozdwojenie do rozmiaru i instalacja połączenia UHPLC. Optymalizacja FlashPack wymaga wprowadzenia korekt w sekcjach 3 i 4 w porównaniu ze wspólnym protokołem.

1. Zespół stanowiska pakowania

1. Przygotować zbiornik gazu wypełniony azotem, helem lub argonem wyposażony w jednostopniowy reduktor gazu o ciśnieniu wylotowym > 50 barów. Maksymalne ciśnienie jest ograniczone przez kompatybilność z bombą ciśnieniową.
2. Podłączyć reduktor do zaworu odpowietrzającego bomby ciśnieniowej.
3. Jeśli bomba ciśnieniowa nie jest wyposażona w zintegrowane mieszadło magnetyczne, umieść bombę na mieszadle magnetycznym.
4. Podłącz wąską rurkę z tworzywa sztucznego o średnicy wewnętrznej (np. 0,13 mm) do wylotu odpowietrzającego bomby ciśnieniowej i włóż ją do naczynia z wodą.

2. Przygotowanie kapilarne

1. Przygotuj kapilarnę ze spiekanym castronomią ze zintegrowanym frytem szklanym utworzonym z Kasilu i formamidu¹⁵ lub kapilarą z wyciąganym emiterem przygotowaną za pomocą ściągacza laserowego¹⁶. Kapilara jest o 10-15 cm dłuższa niż planowana długość kolumny.
   UWAGA: Patrz Tabela 1 w celu omówienia możliwych problemów związanych z różnymi rozmiarami naczyń włosowatych i rodzajami fryty. Tabela 2 zawiera przykład programu ściągacza laserowego P2000 do wykonywania kapilar z emiterem ciągniętym.
2. Zabezpiecz wyciągniętą końcówkę emitera za pomocą przeciętej końcówki pipety z żelem.
   1. Przytnij końcówkę tak, aby ściśle przylegała do kapilary o średnicy zewnętrznej 360 μm (można ją przesuwać wzdłuż kapilary, ale wymaga to pewnego wysiłku).
   2. Wsuń odciętą końcówkę pipety na kapilarnę z kierunku przedniego końca kapilary i przesuń ją w górę do końca emitera.
   3. Przesuń końcówkę ochronną do tyłu, gdy kolumna natryskiwa. Przesuń końcówkę do przodu, aby emiter kończył się wewnątrz końcówki, gdy kolumna nie rozpyla (nawet jeśli kolumna jest pod przepływem, ale nadal nie rozpyla).

3. Przygotowanie gnojowicy sorbentowej

1. Przygotuj podstawową fiolkę z sorbentem: Umieść ~50 mg suchego sorbentu w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. W tym przypadku jako przykład używany jest Reprosil Pur C18.
2. Dodać 1 ml metanolu do probówki sorbentu.
3. Aby całkowicie wymieszać, wiruj rurkę przez 10 sekund za pomocą miksera wirowego.
4. Sonikować w kąpieli sonikacyjnej przez 10 s.
5. Pozwól sorbentowi dokładnie nasiąknąć przez 20-30 minut. Następnie odwiruj i ponownie poddaj sonikacji.
6. Przygotować działającą fiolkę z sorbentem. Użyj fiolki ze stożkowym dnem, która pasuje do bomby.
   UWAGA: Może to być kolejna probówka wirówkowa o pojemności 1,5 ml lub dowolna inna fiolka, w zależności od konkretnej konstrukcji bomby ciśnieniowej. W tym eksperymencie używana jest stożkowa dolna rurka z nakrętką przyciętą do wysokości bomby ciśnieniowej.
7. Zawiesić sorbent w podstawowej fiolce sorbentowej i przenieść 500 μl do roboczej fiolki z sorbentem za pomocą pręta magnetycznego o wymiarach 2 x 3 mm.
8. Dodać metanol do ~1 ml do fiolki roboczej.
9. Pozostaw fiolkę roboczą na stole na 10 minut, aby sorbent osiadł grawitacyjnie.
10. Jeżeli po osiadaniu warstwa sorbentu znajduje się poniżej 4 mm, należy dodać więcej zawiesiny sorbentowej i poczekać, aż sorbent opadnie przez kolejne 10 minut.
    UWAGA: Przygotowana fiolka robocza jest przeznaczona do przygotowania wielu kolumn przez miesiące. Jeżeli działająca fiolka z sorbentem pozostaje bez mieszania przez więcej niż 2 godziny, należy ją wirować przez 10 s, poddawać sonikacji przez 10 s i osadzać grawitacyjnie. Rutynowo sorbent jest ponownie zawieszany rano przed zapakowaniem. Wtedy dobrze nadaje się do pakowania na cały dzień, jeśli nie ma długich przerw między sekwencyjnym pakowaniem kolumn. Jeśli sorbent w fiolce roboczej wyschnie, należy dodać metanol i uruchomić pełną procedurę przygotowania sorbentu, jak w przypadku fiolki z sorbentem podstawowym (kroki 3.2-3.5).

4. Upakowanie kapilarne w bombie ciśnieniowej

UWAGA: Zawsze noś okulary ochronne podczas pracy z bombą ciśnieniową. Nie noś rękawiczek. Znacznie zmniejszają one zmysł dotyku wymagany do prawidłowego obchodzenia się z naczyniami włosowatymi o małej średnicy i prowadzą do błędów.

1. Umieścić fiolkę z sorbentem w bombie ciśnieniowej i mocno dokręcić wszystkie nakrętki.
2. Rozpocznij obroty przy 60-100 obr./min.
3. Włóż spiekaną lub ciągniętą kapilarę emitera do bomby: wepchnij ją na sam dół fiolki, a następnie podnieś ją o 2-3 mm i zamocuj nakrętkę.
   UWAGA: Zastosuj minimalną wymaganą siłę, aby zamocować kapilarę, aby uniknąć uszkodzenia kapilary i tulejki. Najlepsze jest ręczne dokręcanie. Jeśli używany jest klucz imbusowy, należy użyć minimalnej siły wystarczającej do dokręcenia.
4. Sprawdź, czy kapilara jest prawidłowo zamocowana - nie może być możliwości przesunięcia kapilary poprzez wyciągnięcie jej ręcznie.
5. Bardzo powoli otwórz zawór bomby ciśnieniowej, trzymając otwarty koniec kapilary skierowany z dala od twarzy.
6. Obserwuj początkowe etapy procesu pakowania.
   UWAGA: Natychmiast po zwiększeniu ciśnienia sorbent wypełnia kapilarnę i staje się ona nieprzezroczysta na całej długości. Gdy tylko sorbent zacznie pakować się wewnątrz dystalnego końca, ciśnienie wsteczne wzrasta, przepływ zwalnia, a równomierna zawiesina sorbentowa wewnątrz kapilary przekształca się w kilka pakietów sorbentu oddzielonych szczelinami niezawierającymi sorbentu. Już upakowany sorbent jest widoczny jako gęsto zabarwiony, stale rosnący obszar.
7. Obszary wypełnione sorbentem powinny znajdować się na wysokości co najmniej 70% długości kapilarnej z małymi przerwami wolnymi od sorbentu przez cały czas trwania procesu pakowania.
8. Istnieje kilka typowych problemów, na które należy zwrócić uwagę podczas procesu pakowania, które wymagają dostosowania ustawień w locie, aby utrzymać wydajne dostarczanie sorbentu do kapilary.
   UWAGA: Więcej szczegółów na temat regulacji wydajności dostarczania sorbentu opisano w tabeli 3.
   1. Problem 1: Gdy nowy sorbent przestanie wchodzić do kapilary, podczas gdy sorbent znajdujący się w środku nadal się porusza, wykonaj poniższe czynności.
      UWAGA: Jest to najczęstszy problem. W większości przypadków wejście kapilarne jest blokowane przez samoagregujące się klastry sorbentu. Wykonaj następujące kroki jeden po drugim, aż przepływ sorbentu zostanie przywrócony, a następnie pomiń pozostałe kroki związane z problemem.
      1. Zwiększ prędkość obrotową do 500 obr./min i natychmiast zmniejsz ją z powrotem do 60-100 obr./min. Zwykle przywraca przepływ sorbentu. Sprawdź, czy prędkość obrotowa wynosi co najmniej 60 obr./min przez pozostałą część procesu pakowania.
      2. Jeśli to nie pomoże, na krótko odpowietrz bombę pakującą i natychmiast zwiększ jej ciśnienie.
      3. Jeśli to nie pomoże lub zablokowanie nastąpi ponownie, zmień położenie kapilary wewnątrz warstwy sorbentu. Brak sorbentu może być spowodowany tym, że otwarty koniec kapilary znajduje się zbyt wysoko nad prętem magnetycznym, więc koniec kolumny go nie dotyka, lub kapilara wbija się w dno fiolki. Najpierw należy całkowicie odpowietrzyć bombę, poluzować nakrętkę, docisnąć kapilarnę do dna, a następnie pociągnąć ją 2 mm do tyłu. Zamocuj nakrętkę.
      4. Jeśli zablokowanie nie ustąpi, należy odpowietrzyć system, wyjąć fiolkę z sorbentem, odwirować i ponownie poddać działaniu sonikacji. Sprawdź przedni koniec kapilary pod kątem uszkodzeń pod mikroskopem i w razie potrzeby odetnij ~5 mm przedniego końca.
   2. Problem 2: Gdy sorbent wypełnia tylko niewielką część kapilary długimi pustymi obszarami, wykonaj poniższe czynności.
      1. Sprawdź prędkość obrotową. Jeśli obrót jest zbyt wolny, łamanie kopuły nie jest wystarczająco wydajne. Zwiększ prędkość obrotową do ~150 obr./min.
      2. Jeśli rotacja jest zbyt szybka, sorbent zostaje ponownie zawieszony w większej objętości fiolki, a lokalne stężenie sorbentu wokół wejścia do kolumny jest niskie. Zmniejsz prędkość obrotową do 60-100 obr./min.
      3. Sprawdź poziom sorbentu. Ten sam problem z małą ilością sorbentu w kapilarze obserwuje się, gdy w fiolce nie ma wystarczającej ilości sorbentu. Po zużyciu sorbentu należy napełnić fiolkę nowym sorbentem, aby utrzymać warstwę sorbentu na wysokości nie mniejszej niż 4 mm po osiadaniu wywołanym grawitacją.
9. Kontynuuj pakowanie kolumny, aż zostanie osiągnięta docelowa długość kolumny plus 5-7 cm.
10. Zatrzymaj obrót i bardzo powoli rozhermetyzuj bombę.
    1. Otwórz trochę zawór bomby i poczekaj, aż bańka pęknie w butelce z wodą. Następnie otwórz zawór nieco szerzej i ponownie poczekaj, aż pęcherzyk pęknie.
    2. Zmniejszaj ciśnienie stopniowo, aż gaz nie będzie wydostawał się z zaworu.
       UWAGA: Nie należy od razu otwierać zaworu do końca, ponieważ doprowadzi to do powstania pęcherzyków wewnątrz kapilary i powrotu sorbentu do fiolki. Jeśli tak się stanie, zwiększ ciśnienie w bombie z powrotem i poczekaj, aż kolumna zostanie ponownie zapakowana.
11. Gdy gaz przestanie wypływać z zaworu odpowietrzającego, wyjmij wypełnioną kapilarnę z bomby ciśnieniowej.
    UWAGA: Nie pozwól, aby kolumna wyschła. Jeśli nie zostanie natychmiast podłączony do systemu HPLC w celu dalszego pakowania, umieść wypełnioną kapilarnę w magazynie, zanurzając ją w całości w 10% roztworze EtOH. Do przechowywania kapilarnego można użyć płynnego polipropylenowego pojemnika do przechowywania żywności. Odłączone kolumny HPLC są przechowywane w ten sam sposób.
12. Jeżeli nie jest planowane dalsze pakowanie, wyjąć fiolkę z sorbentem z bomby i szczelnie ją zamknąć. Zachowaj go do dalszego pakowania kolumn.

5. Pakowanie w kolumnie HPLC

1. Podłącz wypełnioną kapilarnę do systemu HPLC za pomocą połączenia HPLC.
2. Rozpocznij przepływ przy 95% rozpuszczalniku B (80 lub 100% acetonitrylu, 0,1% kwasu mrówkowego (FA)) pod ciśnieniem 250-300 barów. W przypadku kapilary z upakowaniem 40 cm należy użyć natężenia przepływu 200-300 nL/min.
   UWAGA: Natężenie przepływu pakowania wynosi 200 nL/min dla kolumny 40-50 cm o średnicy wewnętrznej 100 μm wypełnionej sorbentem 2 μm. Niektóre inne rozmiary kolumn są wymienione w tabeli 4. Natężenia przepływu dla innych długości kolumn i ID są szacowane na podstawie bezpośredniej proporcjonalności między ciśnieniem zwrotnym a długością i przekrojem poprzecznym kolumny. Dokładne natężenie przepływu jest dostosowywane do rzeczywistej długości upakowania, która jest domyślnie dłuższa niż docelowa długość kolumny. Należy również pamiętać, że ciśnienie 300 bar jest ukierunkowane na fizyczną granicę ciśnienia połączenia HPLC. W przypadku przyłączy o wyższym ciśnieniu należy stosować wyższe natężenia przepływu aż do granicy ciśnienia przyłącza w celu szybszego pakowania.
3. Uważaj, czy luźny sorbent wewnątrz kapilary jest pakowany i dodawany do całkowitej długości opakowania.
4. Nie zatrzymując przepływu, zanurzyć korpus kolumny dwukrotnie w kąpieli sonicyjnej.
   UWAGA: Nie zanurzaj końców kolumny i połączeń kapilarnych - tylko część korpusu kolumny. Etap sonikacji pomaga poprawić odtwarzalność kolumn, szczególnie w przypadku bardzo długich kolumn o długości >50 cm (dane niepublikowane); Dodaje to jednak losową szansę na pęknięcie samoorganizującej się fryty sorbentowej wewnątrz końca emitera kapilary ciągniętego emitera i całkowite zablokowanie kolumny. Podczas gdy sonikacja może być uniwersalnie stosowana do dowolnych kolumn ze spiekanym szkłem, sugerujemy sonikację kolumn z ciągniętym emiterem tylko dla długości kolumny > 50 cm.
5. Gdy złoże sorbentu przestanie się kurczyć, zanurz korpus kolumny w kąpieli sonicyjnej dwa razy więcej, nie zatrzymując przepływu.
6. Uruchom kolumnę na dodatkowe 10 minut przy 300 barach.
7. Zatrzymaj przepływ, poczekaj, aż ciśnienie spadnie poniżej trzech barów i odłącz kolumnę.
8. Sprawdź wzrokowo kolumnę pod kątem braku szczelin i przebarwień. Jeśli zostaną znalezione, sonikacja pod przepływem może być powtórzona. W przypadku eksperymentów krytycznych rozważ utworzenie nowej kolumny.
9. Przytnij kolumnę na żądaną długość.
   UWAGA: Prawidłowo wykonane cięcie jest warunkiem wstępnym wydajności kolumny. Wykonaj nacięcie w powłoce poliimidowej za pomocą rysika, częściowo rozbij kapilatę i rozsuń dwa kawałki.
10. Wypoleruj przód kolumny na płytce ceramicznej lub folią docierającą.
11. Podłącz ponownie kolumnę do systemu LC za pomocą połączenia UHPLC.
12. Rozpocznij robocze natężenie przepływu od 2% B w zależności od ID kolumny zgodnie z tabelą 4. Poczekaj, aż ciśnienie się wyrówna i sprawdź ciśnienie wsteczne kolumny.
    UWAGA: Robocze natężenie przepływu jest regulowane zgodnie z parametrami kolumny. Na przykład kolumna o średnicy wewnętrznej 100 μm o długości 30 cm jest uruchamiana z prędkością 500 nL/min.
13. Upewnij się, że przeciwciśnienie mieści się w granicach 5% oczekiwanej wartości (patrz Tabela 5), co potwierdza, że kolumna jest prawidłowo zapakowana i gotowa do użycia.
    UWAGA: Przeciwciśnienie kolumny to całkowite ciśnienie w kanale gradientowym systemu HPLC z podłączoną kolumną pomniejszone o przeciwciśnienie kapilar przed kolumną. Jednocześnie wartości w tabeli 5 są arbitralne (dają arbitralną skalę tego, czego można się spodziewać). Wewnątrzlaboratoryjne podobieństwo ciśnienia zwrotnego między kolumnami jest ważniejszym wskaźnikiem, że wszystko działa poprawnie. Rzeczywiste bezwzględne ciśnienie wsteczne zależy od wielu parametrów, takich jak wielkość i charakterystyka sorbentu, średnica kapilarna, producent i partia, kształt wciąganego końca emitera lub gęstość i długość fryty szklanej, charakterystyka rozpuszczalnika i temperatura otoczenia w pomieszczeniu itp. Jeśli ciśnienie wsteczne jest zbyt wysokie, zapoznaj się z tabelą 1, aby zapoznać się z możliwymi problemami.

Wyniki

Podejście FlashPack opiera się na standardowej konfiguracji pakowania i podąża za tym samym potokiem pakowania. Pakowanie odbywa się w standardowych kapilarach ze spiekanym lub ciągniętym emiterem. Główna optymalizacja polega na zagęszczeniu gnojowicy sorbentowej: standardowa metoda jest niekompatybilna z wysokostężoną zawiesiną sorbentu stosowaną w FlashPack. Rezultatem jest szybka metoda produkcji długich kolumn UHPLC, na przykład kolumna wypełniona sorbentem 1,9 μm o długości 50 cm w czasie krótszym niż 1 godzina (Rysunek 2).

Aby zademonstrować zastosowanie podejścia FlashPack, przygotowano kolumnę kapilarną o średnicy wewnętrznej 30 cm i średnicy wewnętrznej 100 μm (Tabela 6). Pakowanie sorbentu ReprosilPur C18 1,9 μm odbywało się przy ciśnieniu 60 prętów w kapilarze z ciągniętym emiterem o średnicy 50 cm i średnicy wewnętrznej 100 μm, przygotowanej za pomocą ściągacza laserowego P2000. Kapilara została wypełniona do ~40 cm w ciągu 40 minut, a wewnątrz kapilary pozostało trochę luźniejszego sorbentu. Wypełniona kapilara została podłączona do systemu HPLC i pracowała z prędkością 300 nL/min z rozpuszczalnikiem B (80% acetonitrylu, 0,1% FA). Po dwóch rundach 5-sekundowej sonikacji, ostateczna długość opakowania wynosiła 43 cm. Kolumna została odłączona, przycięta do 30 cm i podłączona do systemu HPLC za pomocą połączenia UHPLC. Rutynowo używamy beztulejowej tulejowej tulejki z nakrętką PEEK 360 μm i złączki ze stali nierdzewnej 360 μm. Ta kombinacja utrzymuje co najmniej do 700 barów przy mocnym dokręceniu. Wyprodukowana kolumna ma przeciwciśnienie 520 barów przy 2% rozpuszczalniku B przy 500 nL/min, co jest zgodne z zakresem wartości oczekiwanych (tabela 5).

Jako demonstrację efektywności kolumny, użyliśmy wyprodukowanej kolumny o średnicy 30 cm, aby oddzielić 50 fmol tryptycznego trawienia białka cytochromu C w 15-minutowym gradieniu od 2% do 50% B. Chromatogramy jonowe ekstrahowane wykazały, że piki są wysoce symetryczne z minimalnym ogonem. Średni FWHM wynosił około 3 s (Rysunek 3).

Tabela 1: Rozwiązywanie problemów z wysokim roboczym ciśnieniem wstecznym kolumny. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Program ściągacza laserowego P2000/F. Program ściągacza laserowego P2000/F do przygotowania kapilar z ciągniętym emiterem z kapilar pokrytych poliimidem o średnicy zewnętrznej 360 μm 100 μm ID bez powłoki wewnętrznej w temperaturze pokojowej 23-25 °C. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Problemy z pakowaniem specyficzne dla FlashPacków i punkty kontrolne do kontroli podczas procesu pakowania. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Przykładowe natężenia przepływu i pakowania dla różnych identyfikatorów kolumn i długości. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Oczekiwane przeciwciśnienie dla kolumny wypełnionejsferycznymi sorbentami o długości 2 μ m i działającej z roboczym natężeniem przepływu (zgodnie z ID kolumny) w systemie rozpuszczalnikowym RP przy RT. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 6: Przykładowe opakowanie kolumny UHPLC o średnicy 30 cm. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek 1: Schemat upakowania kolumny kapilarnej. Etapy od 1 do 3 są przygotowawcze, po których następuje pakowanie bombą ciśnieniową, a kończą pakowanie HPLC. Etapy 3 i 4 są modyfikowane pod kątem ultrawydajnego protokołu FlashPack. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Szybkość pakowania dla kapilary spiekanej 100 μm ID z ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm przy 100 barach w metanolu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ekstrahowane chromatogramy jonowe peptydów tryptycznych cytochromu C. Wyekstrahowane chromatogramy jonowe peptydów tryptycznych cytochromu C po rozdzieleniu 50 fmol w kolumnie kapilarnej z ciągniętym emiterem o długości 30 cm i średnicy 100 mm ID, wypełnionej ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm w gradiacji buforu B (80% acetonitrylu, 0,1% FA) i w buforze A (2% acetonitrylu, 0,1% FA) od 2% do 40% B w ciągu 15 minut przy 500 nL/min w temperaturze suchej. Detekcję przeprowadzono za pomocą spektrometru masowego. Bezwzględne intensywności i wyekstrahowane zakresy m/z dla każdego peptydu są pokazane po prawej stronie widm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Własne pakowanie kolumn kapilarnych jest bardzo popularne w dużych laboratoriach pracujących nad wieloma niezależnymi projektami. Jednak powszechna metoda pakowania z zawiesiny sorbentu o niskim stężeniu ma poważne ograniczenia prędkości i nie jest w stanie wytworzyć długich kolumn UHPLC.

FlashPack jest modyfikacją standardowej procedury pakowania, która umożliwia pakowanie z bardzo wysokiego stężenia sorbentu. Podstawą teoretyczną metody jest ciągła destabilizacja żeliwiaka sorbentu na wejściu do kolumny przez cały okres upakowania. To ostatnie osiąga się technicznie poprzez ciągłe uderzanie w wejście kolumny prętem magnetycznym. Metoda destabilizacji żeliwiaka została celowo opracowana tak, aby konfiguracja pakowania była całkowicie podobna do zwykłego procesu pakowania, ale sztuczka FlashPack polega na szczegółach przygotowania zawiesiny sorbentowej, pozycjonowaniu kapilarnym i użyciu pręta magnetycznego podczas procesu pakowania.

Jęczynę sorbentową przygotowuje się jako warstwę sorbentu osadowego w dużej objętości rozpuszczalnika. Interesujące jest to, że uszczelnienie oparte na bombie ciśnieniowej nie wymaga takich samych warunków pakowania dla każdej kolumny. W FlashPack nigdy nie znamy dokładnego stężenia gnojowicy sorbentowej wokół wejścia do kolumny. Nie można go dokładnie zmierzyć i kontrolować, ponieważ zmienia się również podczas procesu pakowania. Jednak końcowe kolumny są nadal bardzo powtarzalne⁴ niezależnie od tego, w jaki sposób uzyskano uszczelnienie.

Podstawą szybkiego pakowania jest skuteczna destabilizacja żeliwiaka z sorbentu. Z tego powodu ważne jest kontrolowanie przedostawania się sorbentu do kapilary i utrzymanie optymalnych warunków destabilizacji żeliwiaka przez cały okres pakowania. Istnieje kilka możliwych problemów, które mogą uniemożliwić skuteczne dostarczanie sorbentu. Niektóre przykłady to ponowne zawieszenie warstwy sorbentu przez szybki obrót pręta magnetycznego, nieefektywna destabilizacja żeliwiaka spowodowana niewłaściwym względnym położeniem pręta magnetycznego lub zbyt wolnym obrotem pręta magnetycznego. Same kwestie i sposób ich rozwiązania zostały szczegółowo omówione w części poświęconej protokołowi.

Po upakowaniu kolumny głównym parametrem kolumny, który należy sprawdzić, jest ciśnienie zwrotne kolumny. Wartości ciśnienia podane w tabeli 5 stanowią punkt odniesienia do tego, co jest oczekiwane dla jednego z popularnych sorbentów o rozmiarze kulki poniżej 2 μm - ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). W tym samym czasie dodatkowe przeciwciśnienie może być dodane przez frytę lub zbyt wąsko naciągnięty emiter i należy to stale monitorować. Jeśli pakowanie odbywa się w ciągniętym emiterze, nadal sugerujemy zmierzenie oczekiwanego ciśnienia wstecznego kolumny dla konkretnego używanego sorbentu poprzez upakowanie najpierw spiekanych kapilarn, a następnie sprawdzenie, czy fryta samoorganizująca się nie dodaje zbyt dużo. W przypadku problemów z wysokim ciśnieniem należy skorzystać ze wskazówek podanych w Tabeli 1 , aby określić problem.

Z naszego doświadczenia wynika, że wypełniona kolumna bez przebarwień, szczelin i przy odpowiednim przeciwciśnieniu działa w 100% przypadków i daje jakość separacji zbliżoną do tej, jakiej można oczekiwać po długości kolumny i charakterystyce sorbentu. Kolumna z przebarwieniami nie gwarantuje prawidłowego działania, ale mimo to może dać zadowalające efekty.

W większości przypadków, jeśli występują jakiekolwiek problemy z jakością separacji, nie pochodzą one z samej kolumny, ale raczej z innych części systemu separacji, a mianowicie pomp, rozpuszczalników lub połączeń. Szczególnie potencjalnie szkodliwe są wszelkie połączenia po kolumnie. Złe połączenie z objętością martwą między emiterem a spiekaną kolumną prowadzi do znacznego poszerzenia piku i ogonowania z powodu bardzo niskich natężeń przepływu w chromatografii kapilarnej.

Jeszcze jedną ważną kwestią charakterystyczną dla podejścia FlashPack jest to, że wykorzystuje ono wiele drogich sorbentów w działającej fiolce z zawiesiną sorbentową. Należy pamiętać, że zawiesina sorbentowa zawarta w pakiecie FlashPack jest przeznaczona do wielokrotnego użytku. Zadbaj o sorbent. Unikaj niepotrzebnego mieszania pręta magnetycznego, aby zmniejszyć mielenie sorbentu - pamiętaj, aby zatrzymać obrót, gdy tylko uszczelnienie zostanie zakończone. I nie pozostawiać otwartej fiolki z sorbentem w bombie ciśnieniowej, aby uniknąć wysuszenia sorbentu. Chociaż sorbent może być nadal używany po tym czasie, potrzeba czasu, aby ponownie przygotować zawiesinę sorbentu.

Metoda sprawdza się równie dobrze zarówno w przypadku naczyń włosowatych spiekanych, jak i naczyń włosowatych z emiterem wciągniętym. Zasada FlashPack zwiększa szybkość upakowania dla średnic kapilarnych z 20 do 250 μm (mniejsze i większe nie były testowane). Ma to również zastosowanie do wszystkich sorbentów, zarówno pełnych, jak i powierzchownie porowatych, które mogliśmy przetestować (odzwierciedlając, że tworzenie się żeliwiaka sorbentu w wysokim stężeniu zawiesiny sorbentowej nie ogranicza się konkretnie do sorbentów RP). Poza tym parametry rozpuszczalnika wyraźnie wpływają na uszczelnienie zgodnie z ich właściwościami fizycznymi i chemicznymi. Na przykład aceton o mniejszej lepkości zapewnia jeszcze wyższą szybkość upakowania niż metanol przy tym samym ciśnieniu upakowania. Jest jednak również mniej polarny niż metanol i zmniejsza sklejanie się cząsteczek sorbentu. Efekt sam w sobie zapobiega tworzeniu się żeliwiaka sorbentowego na początku upakowania, gdy natężenie przepływu jest jeszcze wysokie. Jednak zmniejszenie interakcji cząstek sorbentu prowadzi również do mniej niezawodnego tworzenia się fryty samoorganizującej się i częstszego blokowania ciągniętych końcówek podczas pakowania. Tak więc, podczas gdy aceton jest lepszy do wypełniania spiekanych kapilarn, jest mniej odpowiedni dla kapilar z ciągnącą emiterem, przy czym metanol jako rozpuszczalnik zawiesinowy jest wolniejszy, ale nadaje się do obu rodzajów zakończeń. Pakowanie z heksanu lub dichlorometanu (DCM) to skrajne przypadki przejścia z metanolu na aceton: są one jeszcze mniej polarne, więc całkowicie zapobiegają tworzeniu się żeliwiaka sorbentowego, jednak w ogóle nie nadają się do pakowania z emiterem ciągniętym. Poza tym zauważono, że wyjątkowo niska polaryzacja DCM prowadzi do przywierania cząstek sorbentu do wewnętrznej ścianki kapilary i tworzenia na niej grubej warstwy. Grubość warstwy stopniowo rośnie i tworzą się losowe bloki lokalne, w wyniku czego kolumna jest upakowana w kilka części oddzielonych obszarami bez sorbentu. Taki efekt zaobserwowano dla sorbentu C18 Peptide Aeris.

Innym zaobserwowanym problemem było to, że sorbent YMC Triart C18 nie był prawidłowo zawieszony w metanolu, ale tworzył pewnego rodzaju płatki. Nie przeszkadza to jednak w pakowaniu go z pakietem FlashPack i zapewnianiu bardzo przyzwoitej wydajności separacji (dane niepublikowane). Tak więc, choć w niektórych przypadkach nie był optymalny, metanol był najbardziej uniwersalnym rozpuszczalnikiem do pracy dla wszystkich badanych sorbentów i kolumn. Należy wspomnieć, że nie analizowaliśmy jeszcze, w jaki sposób różne rozpuszczalniki zawiesinowe wpływają na skuteczność separacji kolumn. Jednocześnie wydajność kolumn wypełnionych metanolem jest już całkowicie równa kolumnom komercyjnym dla tych samych sorbentów⁴.

FlashPack nie jest jedynym istniejącym podejściem mającym na celu poprawę szybkości upakowania kolumn UHPLC. Szybkie pakowanie z wysokiego stężenia zawiesiny sorbentowej jest również możliwe dzięki zastosowaniu uszczelnienia ultra-wysokociśnieniowego⁷. Zaletą FlashPack jest to, że jest znacznie prostszy, ponieważ nie wymaga specjalnych pomp ultrawysokociśnieniowych i bomb ciśnieniowych do dostarczania sorbentu i połączeń kapilarnych. Jednocześnie wykazano, że kolumny upakowane pod ekstremalnymi ciśnieniami mogą mieć wyższą skuteczność separacji niż kolumny wypełnione niższym ciśnieniem¹⁷. I o ile FlashPack produkuje kolumny identyczne z komercyjnymi użytymi w porównaniu⁴, dla których nie znamy metody pakowania, o tyle nie przetestowano jeszcze, jak kolumny FlashPack wypadają w porównaniu z kolumnami upakowanymi pod ultra wysokim ciśnieniem.

Podsumowując, opisaną metodę FlashPack można łatwo dostosować do istniejącego protokołu pakowania w laboratorium z pewnymi poprawkami do protokołu, podczas gdy konfiguracja pozostaje całkowicie taka sama. Przyspiesza to napełnianie kolumn kapilarnych HPLC do kilku minut i umożliwia produkcję długich kolumn kapilarnych UHP, co jest oczywiście niemożliwe przy standardowej procedurze pakowania. Ogólna oszczędność czasu i pieniędzy dla laboratorium dzięki zastosowaniu podejścia FlashPack może być liczona w dziesiątkach tysięcy euro rocznie. Dodatkowo, możliwość lokalnej produkcji kolumn kapilarnych UHP otwiera możliwości personalizacji eksperymentów, które są niemożliwe do uzyskania przy użyciu dostępnych produktów komercyjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetonitryl z 0,1% (v/v) kwasem mrówkowym	Merck	1.59002
probówka wirówkowa 1,5 ml	Eppendorf
Ceramiczny wafel nacinający	Restek	20116	każdy wafel ceramiczny nadaje się do polerowania kapilarnego
Rysik z wiórkami diamentowymi	NewObjective	Rysik z tarczą diamentową	zalecany do cięcia
kapilarnegokapilara z topionej krzemionki 100 mm ID 375 mm OD	CM Scientific	TSP100375
Końcówki GELoader	Eppendorf	30001222
Ściągacz	ThermoScientific	Ultimate3000 RSLCnano
	Listwa magnetyczna Sutter	P2000/F
2x5 mm	Merck	Z283819
MeOH	Merck	1.06018
mikroszpatułka	Merck	Z193216
Tulejka PEEK 360 mm	VICI	JR-C360NFPK	służy do podłączenia kolumny do końcówki pipety UPLC złączka
, 1000 uL	Merck	Z740095
, 1000 uL	Gilson	Pipetman L P1000L
ciśnieniowa	NextAdvance	PC-77 regulator MAG
	GCE	Jetcontrol 600 200/103
Reprosil Pur C18 AQ 120 1,9 mm	Dr. Maisch	r13.aq.0001
Rurki z nakrętką bez nakrętek, stożkowe dno, wolnostojące, 0,5 mL	Merck	AXYST050SS
Rurki z nakrętką bez nakrętek, stożkowe dno, wolnostojące, 1,5 ml	Merck	AXYST150SS
Nakrętki z O-ringami	Merck	AXYSCOC
sonikacyjna	Elma	Elmasonic S30 H
union HPLC	VICI	JR-C360RU1PK6	HPLC przyłącze od 1/16 OD kapilary HPLC do 360 um złącze kolumny kapilarnej
UPLC	VICI	JR-C360RU1FS6	Przyłącze UPLC od 1/16 OD kapilary HPLC do 360 um wir kolumny kapilarnej
	BioSan	V-1plus
Woda z 0,1% (v/v) kwasem mrówkowym	Merck	Numer katalogowy: 1.59013