Artykuł metodologiczny

Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten

DOI:

10.3791/62527

⸱

8 września 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Clinical Physiology, National Research Council (IFC-CNR), 2Oncogenomics Unit, Core Research Laboratory, ISPRO

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czerniak jest bardzo agresywną chorobą, która szybko rozprzestrzenia się na inne narządy. Protokół ten opisuje zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości, w połączeniu z renderowaniem 3D, do monitorowania objętości pachwinowych węzłów chłonnych w mysim modelu czerniaka z przerzutami Braf/Pten.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Genetycznie modyfikowane myszy Ptenlox/lox (myszy Braf/Pten) są szeroko stosowane jako model in vivo przerzutowego czerniaka. Po wywołaniu guza pierwotnego przez leczenie tamoksyfenem, w ciągu 4-6 tygodni po indukcji obserwuje się wzrost obciążenia przerzutami. W artykule pokazano, w jaki sposób można wykorzystać obrazowanie ultradźwiękami o ultrawysokiej częstotliwości (UHFUS) do monitorowania wzrostu zajęcia przerzutów do pachwinowych węzłów chłonnych poprzez pomiar wzrostu ich objętości.

System UHFUS służy do skanowania znieczulonych myszy za pomocą sondy liniowej UHFUS (22-55 MHz, rozdzielczość osiowa 40 μm). Obrazy w trybie B z pachwinowych węzłów chłonnych (zarówno po lewej, jak i prawej stronie) są rejestrowane w widoku krótkiej osi, umieszczając zwierzęta w pozycji leżącej grzbietowej. Zapisy ultrasonograficzne są pozyskiwane przy użyciu kroku o rozmiarze 44 μm na zmotoryzowanym ramieniu mechanicznym. Następnie dwuwymiarowe (2D) akwizycje w trybie B są importowane do platformy oprogramowania do końcowego przetwarzania obrazów ultrasonograficznych, a pachwinowe węzły chłonne są identyfikowane i segmentowane półautomatycznie w uzyskanych obrazach przekrojowych 2D. Wreszcie, automatycznie uzyskuje się całkowitą rekonstrukcję objętości trójwymiarowej (3D) wraz z renderowaniem objętości węzłów chłonnych, która jest również wyrażona jako pomiar bezwzględny.

Ta nieinwazyjna technika in vivo jest bardzo dobrze tolerowana i pozwala na zaplanowanie wielu sesji obrazowania na tym samym zwierzęciu doświadczalnym przez 2 tygodnie. W związku z tym idealnie nadaje się do oceny wpływu leczenia farmakologicznego na chorobę z przerzutami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czerniak jest agresywną formą raka skóry, która często rozprzestrzenia się na inne miejsca na skórze (przerzuty podskórne), a także na węzły chłonne, płuca, wątrobę, mózg i kości1. W ostatniej dekadzie do praktyki klinicznej wprowadzono nowe leki, które przyczyniły się do poprawy średniej długości życia pacjentów z czerniakiem z przerzutami. Pozostają jednak ograniczenia, w tym zmienny czas i stopień odpowiedzi, poważne skutki uboczne oraz pojawienie się nabytej oporności1. Dlatego tak ważne jest wykrycie rozprzestrzeniania się przerzutów we wczesnych stadiach, czyli gdy dotrą do lokalnych węzłów chłonnych.

Biopsja lokalnych węzłów chłonnych (wartowniczych węzłów chłonnych) jest zwykle wykonywana w celu sprawdzenia obecności komórek czerniaka. Jednak obrazowanie ultrasonograficzne staje się nieinwazyjną metodą wykrywania zajęcia przerzutów, ponieważ przewyższa ocenę kliniczną i może pomóc uniknąć niepotrzebnej biopsji2,3,4. Ponadto obrazowanie ultrasonograficzne wydaje się odpowiednie do monitorowania węzłów chłonnych, zwłaszcza w przypadku zaawansowanego wieku i/lub chorób współistniejących5,6. Cechy, które są wykrywane przez analizę ultrasonograficzną i pozwalają na różnicowanie między prawidłowymi i przerzutowymi węzłami chłonnymi, obejmują zwiększony rozmiar (objętość), zmianę kształtu z owalnego na okrągły, nieregularny margines, zmieniony wzór echogeniczny i zmienione (zwiększone) unaczynienie7.

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Genetycznie modyfikowane myszy Ptenlox/lox (myszy Braf/Pten) zostały niedawno udostępnione społeczności naukowej jako specyficzny tkankowo i indukowalny model przerzutowego czerniaka8. W tym modelu zwierzęcym guzy pierwotne rozwijają się bardzo szybko: stają się widoczne w ciągu 2-3 tygodni po indukcji zmiany z typu dzikiego (wt) Braf na BrafV600E i utracie Pten, podczas gdy osiągają objętość 50-100 mm3 w ciągu 4 tygodni. W ciągu kolejnych 2 tygodni wzrostowi guza pierwotnego towarzyszy postępujący wzrost obciążenia przerzutami w innych miejscach skóry, węzłach chłonnych i płucach.

myszy Braf/Pten były szeroko wykorzystywane do wielu celów, w tym do analizy szlaków sygnałowych związanych z melanomagenezą9,10, identyfikacja komórek czerniaka pochodzenia11,12,13, oraz testowania nowych opcji terapeutycznych zarówno w zakresie terapii celowanej, jak i immunoterapii8,14,15,16. W szczególności użyliśmy myszy Braf/Pten, aby wykazać, że atenuowana Listeria monocytogenes (Lmat) działa jako szczepionka przeciw czerniakowi. W przypadku stosowania ogólnoustrojowego w warunkach terapeutycznych Lmat nie wiąże się z ogólną toksycznością, ponieważ selektywnie kumuluje się w miejscach guza. Ponadto powoduje niezwykłe zmniejszenie masy pierwotnego czerniaka i zmniejszenie obciążenia przerzutami w węzłach chłonnych i płucach. Na poziomie molekularnym Lmat powoduje apoptotyczne zabijanie komórek czerniaka, co jest spowodowane, przynajmniej częściowo, działaniami nieautonomicznymi komórkami (rekrutacja na miejscu limfocytów T CD4 + i CD8 +)16.

Gdy myszy Braf/Pten są używane do modelowania czerniaka, wzrost pierwotnych guzów i przerzutów podskórnych może być monitorowany za pomocą pomiarów suwmiarką. Jednak zaangażowanie węzłów chłonnych i płuc musi zostać zbadane przy użyciu alternatywnej techniki, być może nieinwazyjnej, która pozwala naukowcom śledzić to samo zwierzę w czasie. W artykule opisano zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego (Rysunek 1), w połączeniu z późniejszą analizą wolumetryczną 3D uzyskanych danych, do podłużnego monitorowania wzrostu wielkości (objętości) pachwinowych węzłów chłonnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (protokoły dla zwierząt #754/2015-PR i #684/2018-PR).

1. Indukcja czerniaka

UWAGA: Sześciotygodniowy Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox myszy [B6. W pracy wykorzystano Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] (patrz Tabela Materiałów).

  1. Potraktuj myszy 4-hydroksytamoksyfenem (4-HT), nakładając 3 μL 5 mM 4-HT na ~1cm2 ogolonej skóry górnej części pleców, jak opisano wcześniej11,16,17, przez 3 dni z rzędu.
    UWAGA: Spowoduje to aktywację enzymu Cre i spowoduje zmianę z wt Braf na BrafV600E i utratę Pten. Te dwa uderzenia wystarczą, aby wywołać powstawanie czerniaka.
  2. Obserwuj, że guzy pierwotne rozwijają się w miejscu malowania skóry w ciągu 2-3 tygodni i osiągają objętość 50-100 mm3 w ciągu 4 tygodni. W tym momencie obserwuj również przerzuty do innych miejsc na skórze, węzłów chłonnych i płuc (t0).
  3. Użyj suwmiarki do pomiaru objętości guza pierwotnego i przerzutów podskórnych, a obrazowanie ultrasonograficzne do pomiaru objętości pachwinowych węzłów chłonnych. Powtórz te pomiary po tygodniu (t1, 5 tygodni po malowaniu skóry) i po dwóch tygodniach (t2, 6 tygodni po malowaniu skóry).
  4. W ostatnim punkcie czasowym poddaj myszy eutanazji poprzez przedawkowanie gazowego seworanu.
  5. Przeanalizuj pierwotny guz i węzły chłonne za pomocą oględzin, a następnie wytnij je do badań histologicznych, jak podano w16.

2. Procedura obrazowania

  1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia gazowego i dostarczaj 3% izofluranu w czystym tlenie, aż zwierzę zostanie w pełni znieczulone. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie łapy.
  2. Przenieś zwierzę na podgrzewaną deskę - stanowiącą część stacji obrazowania UHFUS - trzymając zwierzę w pozycji leżącej. Użyj sondy doodbytniczej nasmarowanej wazeliną, aby zmierzyć temperaturę ciała. Dostosuj temperaturę deski, aby utrzymać temperaturę ciała myszy w fizjologicznym zakresie (36 ± 1°C).
  3. Zwilż oczy myszy maścią weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Dostarczyć gaz narkotyczny (1,5% izofluranu w czystym tlenie) przez maskę na nos myszy. Dostosuj zawartość procentową izofluranu, aby utrzymać prawidłową głębokość znieczulenia.
  4. Pokryj przednią i tylną łapę pastą przewodzącą i przyklej je do elektrod płytki EKG osadzonych w tablicy. Sprawdź, czy parametry fizjologiczne (tętno, sygnał oddechowy i temperatura ciała) są prawidłowo rejestrowane i wyświetlane.
  5. Usuń włosy z obu obszarów pachwinowych, nakładając środek do depilacji i pokryj je akustycznym środkiem sprzęgającym.
  6. Zamocuj sondę liniową UHFUS (częstotliwość środkowa 40 MHz) w specjalistycznym silniku 3D osadzonym w stacji obrazowania UHFUS, umożliwiając zautomatyzowany i stopniowy ruch sondy.
  7. Prawidłowo zorientuj i wyreguluj położenie sondy ultrasonograficznej, aby uzyskać obrazy pachwinowego węzła chłonnego w krótkiej osi (lewy/prawy) i umieść obszar zainteresowania w strefie ogniskowej.
  8. Zeskanuj całą objętość pachwinowego węzła chłonnego jako sekwencję obrazów 2D w trybie B, zgodnie z wcześniejszym opisem18. Uzyskuj obrazy na wielu poziomach węzła chłonnego poprzez liniowy ruch głowicy z rozmiarami kroków w skali mikrometrycznej, aby generować dane 3D w postaci automatycznie bramkowanych pętli filmowych z oddychaniem i sercem.
  9. Ustaw zapis obrazu z następującymi parametrami: odległość skanowania w zakresie od 2 do 5 mm (w zależności od wielkości węzłów chłonnych); wielkość kroku 44 μm, z wynikiem 46-114 kroków skanowania/wycinki węzłów chłonnych i czasem akwizycji 1-3 min na zwierzę. Cyfrowe przechowywanie uzyskanych obrazów w formacie RAW (DICOM) w celu dalszych analiz offline.
  10. Pod koniec sesji obrazowania przerwij znieczulenie gazowe i pozwól zwierzęciu dojść do siebie na płycie grzewczej w pozycji leżącej mostka. Opiekuj się zwierzęciem, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję na brzuchu.

3. Przetwarzanie końcowe obrazów ultrasonograficznych

  1. Otwórz zestaw danych obrazów 3D DICOM lewego/prawego pachwinowego węzła chłonnego na platformie oprogramowania do przetwarzania końcowego obrazów ultrasonograficznych.
  2. segmentacja:
    1. Wybierz opcję Metoda wieloplasterkowa, aby wyświetlić zarówno bieżące klatki, jak i miniatury wszystkich klatek odpowiadających każdemu obrazowi zarejestrowanemu podczas akwizycji 3D.
    2. Wybierz miniaturę pierwszej klatki, aby wczytać ją do widoku konturowania. W widoku konturowania kliknij lewym przyciskiem myszy, aby upuścić punkty wzdłuż granicy węzła chłonnego. Po ustawieniu żądanej liczby punktów (zakres 10-15) kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć kontur.
    3. Po zakończeniu pierwszego konturu użyj widoku miniatur, aby wybrać następny obraz do konturowania. W razie potrzeby pomiń kilka obrazów (średnio 3 klatki) między konturami, aby zmniejszyć liczbę ręcznych ścieżek potrzebnych dla każdej objętości 3D.
      UWAGA: Platforma oprogramowania do przetwarzania końcowego obrazów ultrasonograficznych automatycznie generuje kontury między ręcznymi ścieżkami, skracając w ten sposób czas analizy.
    4. Powtarzaj ten proces, aż cała wolumin zostanie obrysowany. Po zakończeniu kliknij Zakończ.
  3. Generowanie makiety 3D i pomiar objętości:
    1. W obszarze roboczym okna Tryb 3D kliknij ikonę Pomiar objętości pod obszarem wyświetlania obrazu, aby aktywować widok powierzchni.
      UWAGA: Widok powierzchni tworzy widok kompilacji, który odwzorowuje wolumin wygenerowany przez użytkownika na uzyskany obraz. Widok powierzchni można obrócić do dowolnej pozycji.
    2. Zwróć uwagę na pomiar głośności wymieniony w lewym dolnym rogu widoku sześcianu.
      UWAGA: Segmentację i generowanie objętości 3D można również uzyskać za pomocą niestandardowego oprogramowania i/lub ogólnodostępnego/komercyjnego oprogramowania do ogólnego przetwarzania obrazu. Zaczynając od ręcznej segmentacji, oprogramowanie powinno zapewnić matematyczny i/lub pikselowy opis konturów węzłów chłonnych. Kontury te zostałyby połączone w przestrzeni 3D, aby odwzorować zewnętrzną powierzchnię węzłów chłonnych. Wszystkie kroki opisane w procedurze obrazowania i przetwarzania końcowego obrazów ultrasonograficznych są podsumowane w Rysunek 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po pomalowaniu skóry myszy Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox z 4-HT, indukowana jest aktywność Cre, dzięki czemu następuje zmiana na poziomie genomu z wt Braf na BrafV600E, podczas gdy Pten jest tracony (Rysunek 3A). W ciągu 2-3 tygodni u myszy rozwijają się pierwotne guzy o 100% penetracji. Po czterech tygodniach od leczenia 4-HT (t0) guzy pierwotne osiągają objętość 50-100 mm3, a ich wzrost można mierzyć suwmiarką przez dodatkowe 2 tygodni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dane uzyskane w tym badaniu potwierdzają zdolność obrazowania ultrasonograficznego do monitorowania przerzutowego zajęcia pachwinowych węzłów chłonnych mysiego modelu czerniaka Braf/Pten. Jak wykazanowcześniej16, technika ta jest szczególnie przydatna do oceny skuteczności leczenia farmakologicznego. Dzieje się tak, ponieważ umożliwia monitorowanie zmian objętości węzłów chłonnych u tego samego zwierzęcia w czasie, poprzez porównanie pomiarów pobranych przy t1 i t2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować S. Burchielli (FTGM, Piza) za pomoc w procedurach na zwierzętach. Praca ta była wspierana przez ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica, instytucjonalne fundusze dla LP; MFAG #17095 przyznany przez AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro do LP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-hydroksytamoksyfenMerckH6278lek stosowany do indukcji nowotworu
B6. Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) myszyThe Jackson Laboratory013590
Blu gelSooft Ialiaroztwór okulistyczny
BRAFV600E przeciwciałoSpring Bioscience CorporationE19290
IsoFlo (isoflorane)Zoetispłyn do znieczulenia gazowego
Przeciwciało MLANAThermo Fisher ScientificM2-7C10
Sigma gelParkerElectrode
Gel Transonic clearTelic SAUżel ultrasonograficzny
VeetReckitt Benckiser ITKrem do depilacji
Kompaktowy podwójny system anestezjologicznyFujifilm, Visualsonics Inc.System anestezjologiczny na bazie izofluranu wyposażony w stożek nosowy i komorę indukcyjną
MX550SFujifilm, Visualsonics Inc.Sonda liniowa UHFUS
Vevo 3100Fujifilm, Visualsonics Inc.System UHFUS
Stacja obrazowania Vevo Fujifilm, Visualsonics Inc.Stacja obrazowania UHFUS i Advancing Physiological Monitoring Unit wyposażone w podgrzewaną płytę
Vevo LabFujifilm, Visualsonics Inc.platforma programowa do obróbki końcowej obrazów ultrasonograficznych
żel

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).
  2. Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
  3. Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
  4. Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
  5. Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
  6. Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
  7. Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
  8. Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
  9. Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
  10. Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
  11. Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
  12. Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
  13. Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
  14. Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
  15. Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
  16. Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
  17. Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
  18. Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mysz Braf Ptenmodel czerniakaw ze ch onny pachwinowytr jwymiarowe obrazowanie USGprzerzutowy czerniakpomiar obj to ci guzabarwienie immunohistochemiczneprzerzuty podsk rne

Powiązane artykuły