Dostarczono szczegółowy protokół metod analizy różnicowej ekspresji dla sekwencjonowania RNA: limma, EdgeR, DESeq2.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trzy metody analizy różnicowej ekspresji do sekwencjonowania RNA: limma, EdgeR, DESeq2
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) jest jedną z najczęściej stosowanych technologii w transkryptomice, ponieważ może ujawnić związek między zmianami genetycznymi a złożonymi procesami biologicznymi i ma wielką wartość w diagnostyce, prognostyce i terapii nowotworów. Analiza różnicowa danych sekwencyjnych RNA ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji nieprawidłowych transkrypcji, a limma, EdgeR i DESeq2 są skutecznymi narzędziami do analizy różnicowej. Jednak analiza różnicowa RNA-seq wymaga pewnych umiejętności posługiwania się językiem R i umiejętności wyboru odpowiedniej metody, której brakuje w programie edukacji medycznej.
Niniejszym udostępniamy szczegółowy protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG) między rakiem dróg żółciowych (CHOL) a normalnymi tkankami odpowiednio za pomocą limma, DESeq2 i EdgeR, a wyniki są pokazane na wykresach wulkanów i diagramach Venna. Trzy protokoły limma, DESeq2 i EdgeR są podobne, ale mają różne etapy w procesach analizy. Na przykład model liniowy jest używany do statystyk w limma, podczas gdy ujemny rozkład dwumianowy jest używany w edgeR i DESeq2. Dodatkowo, znormalizowane dane dotyczące liczby sekwencji RNA są niezbędne dla EdgeR i limma, ale nie są konieczne dla DESeq2.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół dla trzech metod analizy różnicowej: limma, EdgeR i DESeq2. Wyniki tych trzech metod częściowo się pokrywają. Wszystkie trzy metody mają swoje zalety, a wybór metody zależy tylko od danych.
Wprowadzenie
Sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) jest jedną z najczęściej stosowanych technologii w transkryptomice, z wieloma zaletami (np. wysoką odtwarzalnością danych) i znacznie zwiększyła nasze zrozumienie funkcji i dynamiki złożonych procesów biologicznych1,2. Identyfikacja aberracyjnych transkryptów w różnych kontekstach biologicznych, które są również znane jako geny o zróżnicowanej ekspresji (DEC), jest kluczowym krokiem w analizie sekwencyjnej RNA. RNA-seq umożliwia dogłębne zrozumienie mechanizmów molekularnych i funkcji biologicznych związanych z patogenezą. Dlatego analiza różnicowa została uznana za ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Otwórz program R-studio i załaduj plik R "DEGs.R", plik można pobrać z Dodatkowych plików/Skryptów.
1. Pobieranie i wstępne przetwarzanie danych
- Pobierz dane dotyczące sekwencjonowania wysokoprzepustowego (HTSeq) raka dróg żółciowych (CHOL) z Atlasu genomu raka raka (TCGA). Ten krok można łatwo wykonać za pomocą następującego kodu języka R.
- Kliknij pozycję Uruchom, aby zainstalować pakiety języka R.
- Kliknij pozycję Uruchom, aby załadować pakiety języka R.
if(!requireNamespace("BiocManager", cicho=PRAWDA))
+ install.packages("BiocManager")
Bio....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Istnieje wiele podejść do wizualizacji wyników analizy różnicowej ekspresji, wśród których szczególnie często stosuje się wykres wulkaniczny (volcano plot) oraz diagram Venna. Przy zastosowaniu progów |logFC|≥2 oraz adj.P.Val <0.05, narzędzie limma zidentyfikowało 3323 DEG pomiędzy tkankami CHOL a tkankami prawidłowymi, z czego 1880 wykazano jako wyciszone w tkankach CHOL, a 1443 jako nadekspresyjne (Rysunek 1a). Tymczasem edgeR zidentyfikował 1578 wyciszonych DEG i 3121 nadekspresyjnych .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obfite aberracyjne transkrypty w nowotworach można łatwo zidentyfikować za pomocą analizy różnicowej RNA-seq5. Jednak zastosowanie analizy różnicowej ekspresji RNA-seq jest często ograniczone, ponieważ wymaga pewnych umiejętności w zakresie języka R i zdolności do wyboru odpowiednich metod. Aby rozwiązać ten problem, przedstawiamy szczegółowe wprowadzenie do trzech najbardziej znanych metod (limma, EdgeR i DESeq2) oraz samouczki dotyczące stosowania analizy różnicowej wyrażeń RNA-seq. Ułatwi to zr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Manuskrypt nie był wcześniej publikowany i nie jest brany pod uwagę do publikacji w innych miejscach. Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania tego manuskryptu ze względu na ważne treści intelektualne oraz przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję rękopisu. Oświadczamy, że nie ma konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 81860276) oraz Kluczowe Projekty Funduszu Specjalnego Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego (Grant nr 2018YFC1003200).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| R | wersja 3.6.2 | darmowe oprogramowanie | |
| Darmowe oprogramowanie | Rstudio |
Bibliografia
- Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach. Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomic....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
