Artykuł metodologiczny

Generowanie i charakterystyka mysich kultur organoidów błony śluzowej jamy ustnej

DOI:

10.3791/62529

⸱

31 lipca 2021

 ,  , 
1Mildred Scheel Early Career Centre (MSNZ) for Cancer Research, IZKF/MSNZ, University Hospital Würzburg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy metodę generowania i charakteryzowania kultur organoidów błony śluzowej jamy ustnej pochodzących z nabłonka języka dorosłych myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błona śluzowa pokrywająca wnętrze naszych ust, błona śluzowa jamy ustnej, jest wysoce podzieloną tkanką i może być podzielona na błonę śluzową policzka, dziąsło, wargi, podniebienie i język. Jego najwyższa warstwa, nabłonek jamy ustnej, jest utrzymywany przez dorosłe komórki macierzyste przez całe życie. Proliferacja i różnicowanie dorosłych nabłonkowych komórek macierzystych były intensywnie badane przy użyciu modeli mysich in vivo, a także dwuwymiarowych (2D) modeli in vitro opartych na komórkach zasilających. Uzupełnieniem tych metod jest technologia organoidowa, w której dorosłe komórki macierzyste są umieszczane w hydrożelu bogatym w macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i dostarczane z pożywką hodowlaną zawierającą określony koktajl czynników wzrostu. W tych warunkach dorosłe komórki macierzyste namnażają się i spontanicznie tworzą trójwymiarowe (3D) klastry komórek, tzw. organoidy. Hodowle organoidów początkowo powstały z mysich komórek macierzystych nabłonka jelita cienkiego. Jednak od tego czasu metoda ta została dostosowana do innych typów nabłonkowych komórek macierzystych. W tym miejscu opisujemy protokół generowania i charakterystyki mysich kultur organoidowych błony śluzowej jamy ustnej. Pierwotne komórki nabłonkowe są izolowane z mysiej tkanki języka, zatopione w hydrożelu ECM i hodowane w pożywce zawierającej: naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), R-spondynę i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) 10. W ciągu 7 do 14 dni od początkowego wysiewu powstałe organoidy można pasażować w celu dalszej ekspansji i krioprezerwacji. Dodatkowo przedstawiamy strategie charakterystyki ustalonych kultur organoidów za pomocą obrazowania 3D całego montażu i analizy ekspresji genów. Protokół ten może służyć jako narzędzie do badania zachowania nabłonkowych komórek macierzystych jamy ustnej ex vivo w sposób redukcjonistyczny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Błona śluzowa jamy ustnej to błona śluzowa pokrywająca wnętrze naszych ust. Funkcjonuje jako wejście do przewodu pokarmowego i bierze udział w inicjacji procesu trawienia1,2. Ponadto błona śluzowa jamy ustnej działa jak bariera naszego organizmu przed środowiskiem zewnętrznym, zapewniając ochronę przed fizycznymi, chemicznymi i biologicznymi zniewagami1. Na podstawie funkcji i histologii błonę śluzową jamy ustnej u ssaków można podzielić na trzy typy: błona śluzowa żucia (w tym podniebienie twarde i dziąsło), błona śluzowa wyściółki (działająca jako powierzchnia podniebienia miękkiego, brzuszna powierzchnia języka i powierzchnia policzkowa) oraz wyspecjalizowana błona śluzowa (pokrywająca grzbietową powierzchnię języka)2. Wszystkie tkanki błony śluzowej jamy ustnej składają się z dwóch warstw: powierzchniowego warstwowego nabłonka płaskonabłonkowego i leżącej pod nim blaszki właściwej 1. Keratynocyt nabłonka jamy ustnej jest głównym typem komórek nabłonka, który jest również lokalizacją wewnątrznabłonkowych komórek odpornościowych, takich jak komórki Langerhansa1. Przedział zrębu, blaszka właściwa, składa się z różnych typów komórek, takich jak fibroblasty, komórki śródbłonka, komórki neuronalne i komórki odpornościowe1. Podobnie jak w przypadku wszystkich nabłonków warstwowych, komórki macierzyste i progenitorowe znajdują się w warstwie podstawnej nabłonka jamy ustnej1. Te wyspecjalizowane komórki mają zdolność zastępowania utraconych tkanek poprzez podziały komórkowe, a tym samym odżywiają obrót komórkowy przez całe dorosłe życie3. W przeciwieństwie do innych nabłonków, takich jak nabłonek jelitowy4 lub skin epidermis5, nabłonek jamy ustnej pozostaje słabo poznany. Jednak ostatnie badania ujawniły różne geny, takie jak Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 i Gli1, które oznaczają komórki macierzyste i progenitorowe nabłonka jamy ustnej u myszy1,6,7,8. Ponieważ nabłonek jamy ustnej jest źródłem raka jamy ustnej i kluczowym graczem w zapaleniu, zranieniach i regeneracji błony śluzowej1, lepsze zrozumienie podstawowej biologii komórki ma kluczowe znaczenie dla potencjalnych nowych podejść terapeutycznych i odkryć leków.

Modele zwierzęce są powszechnie używane do podstawowych badań nad nabłonkiem błony śluzowej jamy ustnej1. Na przykład wyżej wymienione markery komórek macierzystych i progenitorowych nabłonka jamy ustnej zostały w dużej mierze zdefiniowane przy użyciu modeli myszy śledzących linię genetyczną1,6,7,8,9. Jednak podejścia ex vivo wykorzystujące hodowane komórki pochodzenia ludzkiego lub mysiego są również szeroko stosowane10. Konwencjonalnie, takie prace nad hodowlą komórkową przeprowadza się przy użyciu linii komórkowych pochodzących z raka płaskonabłonkowego jamy ustnej (OSCCs) lub linii komórkowych generowanych z (spontanicznie lub genetycznie) unieśmiertelnionych komórek pierwotnych10. Te metody hodowli komórkowych 2D mają ograniczenia o krytycznych implikacjach dla badania homeostazy dorosłych: (1) unieśmiertelnieniu komórek towarzyszy duży stopień niestabilności genetycznej, (2) ograniczona zdolność do różnicowania, (3) zapotrzebowanie na komórki karmicielskie, oraz (4) w dużej mierze niezdefiniowana pożywka wzrostowa zawierająca serum11. Reasumując, te złote standardy metod in vitro nie pozwoliły na długoterminowe hodowle nabłonkowych komórek macierzystych bez ograniczenia ich zdolności do namnażania się i różnicowania, a także przekształcania ich genomu typu dzikiego.

Technologia organoidów pojawiła się jako narzędzie do tworzenia kultur niemal natywnych tkanek nabłonkowych in vitro11. W swoim badaniu z 2009 roku Sato i in. opisali pierwszy system hodowli organoidów nabłonkowych12. Ich metoda opierała się na osadzeniu pojedynczych komórek macierzystych jelita cienkiego oznaczonych genem docelowym Wnt/β-kateniny Lgr513 w bogatym w 3D hydrożelu bogatym w macierz zewnątrzkomórkową (ECM) klasę sup<="xref">12. Dostarczając zdefiniowany koktajl czynników wzrostu ważnych dla macierzystości, dorosłe nabłonkowe komórki macierzyste były w stanie namnażać się do swojej pojemności w culture12. Ostatecznie klastry komórek uformowały się z aktywnie krążących komórek macierzystych zawierających wszystkie główne typy komórek nabłonka jelitowego12, skutecznie przypominając tkankę pochodzenia11. W przeciwieństwie do konwencjonalnych hodowli 2D, technologia organoidów pozwoliła na długotrwałe utrzymanie mysich komórek macierzystych nabłonka jelitowego w warunkach wolnych od karmowania z wolnym od surowicy i w pełni zdefiniowanym podłożem 10,11. Ponadto metoda ta nie zmienia znacząco składu genetycznego ani fenotypu hodowanych komórek macierzystych11. Co więcej, długotrwała hodowla zachowała zdolność komórek macierzystych do namnażania się i różnicowania bez konieczności unieśmiertelniania komórek11. W ciągu nieco ponad dekady ten wczesny system hodowli organoidów nabłonkowych został zmodyfikowany tak, aby hodować dorosłe komórki macierzyste z wielu innych tkanek nabłonkowych, takich jak okrężnica (jelito grube)12,14,15, endometrium16, wątroba17,18, płuca19,20, gruczoły sutkowe21, ovaries22, pancreas23,24, skin epidermis25, and stomach26. Podczas gdy większość protokołów wykorzystywała dorosłe nabłonkowe komórki macierzyste pochodzące od ssaków, takich jak ludzie11,27, myszy11, cats28, dogs29 i pigs30, możliwe było nawet wygenerowanie organoidów nabłonkowych z gruczołów jadu węża31. Technologia organoidów stała się szeroko stosowaną metodą hodowli komórek macierzystych o wysokim stopniu wszechstronności11. Ponieważ organoidy nabłonkowe pozostają w dużej mierze genetyczne32,33 i fenotypowo stabilne, są doskonałymi modelami do edycji genów34,35 do badania funkcji genu36 lub nowotworygeneza27,37,38,39,40. Ponadto hodowle organoidów mogą być przeszczepiane myszom37,41 i są wykorzystywane do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm42 (w tym infekcje chorobotwórcze43,44,45). Ponadto opisano kohodowle oparte na organoidach z komórkami mikrośrodowiska, takimi jak komórki odpornościowe46,47,48 i fibroblasts49,50. W kontekście chorób organoidy były używane w generacjach biobanków żywych tkanek21,22,51, a także testując leki27 pod kątem skuteczności52,53 i toksyczności54.

W tym protokole opisujemy zoptymalizowaną metodologię tworzenia i utrzymywania kultur organoidów błony śluzowej jamy ustnej z nabłonka mysiego języka. Opiera się na wcześniejszych raportach opisujących izolację nabłonka języka za pomocą trawienia enzymatycznego55 oraz wyprowadzanie organoidów nabłonkowych z błony śluzowej jamy ustnej myszy i człowieka52,53. Pożywka wzrostowa dla organoidów błony śluzowej jamy ustnej myszy zawiera krytyczne czynniki utrzymujące stan komórek macierzystych. R-spondyna aktywuje kaskadę sygnalizacyjną Wnt / β-kateniny < klasa sup = "xref">5, podczas gdy naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) 10 to cytokiny i ligandy receptorowych kinaz tyrozynowych, które stymulują kilka szlaków sygnałowych, takich jak szlak MAPK/ERK i szlak PI3K/AKT/mTOR25. Dalej szczegółowo opisujemy, w jaki sposób kultury organoidów można scharakteryzować za pomocą analizy ekspresji genów i białek oraz porównać z tkanką pochodzenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały przeprowadzone zgodnie z prawem Unii Europejskiej i niemieckim dotyczącym eksperymentów na zwierzętach.

UWAGA: Przygotuj miejsce pracy, w tym sterylne narzędzia chirurgiczne (cienkie kleszcze, cienkie nożyczki i skalpele) oraz szalki Petriego wypełnione zimnym PBSO. Rozmrozić BME przez noc i przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie do czasu użycia. Przed rozpoczęciem izolacji komórek należy wstępnie ogrzać płytki do hodowli komórkowych w inkubatorze przez noc. Wszystkie materiały znajdują się w Tabeli Materiałów.

1 Założenie hodowli organoidów błony śluzowej jamy ustnej

  1. Sekcja mysiego języka
    1. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz odpowiednimi przepisami krajowymi i międzyrządowymi.
      UWAGA: W przypadku tego protokołu myszy zostały poddane eutanazji poprzez ekspozycję na CO2 , ponieważ zwichnięcie szyjki macicy może prowadzić do niestabilności głowy, co skutkuje trudnościami w pobieraniu narządów.
    2. Połóż mysz na grzbiecie i unieruchamiaj ją, przypinając łapy do odpowiedniego podkładu.
    3. Zdezynfekuj mysz, spryskując ją 70% EtOH, aż będzie całkowicie mokra.
    4. Przetnij skórę nożyczkami, najpierw pionowo wzdłuż tchawicy od mostka do wargi, a następnie poziomo od tchawicy w kierunku obojczyka po obu stronach. Każde nacięcie ma około 2 cm długości.
    5. Odsuń futro, aby odsłonić szczękę.
    6. Przetnij mięśnie żuchwy aż do tylnej części jamy ustnej.
    7. Otwórz jamę ustną tak daleko, jak to możliwe, ciągnąc dolną i górną szczękę w przeciwnych kierunkach za pomocą dwóch kleszczy, co powoduje zwichnięcie dolnej szczęki.
    8. Użyj kleszczy, aby chwycić język i usuń jak najwięcej języka, przecinając pionowo z tyłu.
    9. Umieść język w zimnym PBS wolnym od Mg2+ i Ca2+ (PBSO).
    10. Przetnij język poziomo, aby oddzielić błonę śluzową grzbietu i brzusznej języka.
      UWAGA: Błona śluzowa języka grzbietowego to górna strona języka, a język brzuszny to dolna strona języka, która styka się z dnem jamy ustnej. Obie błony śluzowe można rozróżnić ze względu na ich morfologię, ponieważ błona śluzowa grzbietu języka jest widocznie szorstka, podczas gdy błona śluzowa brzusznej strony języka ma gładką powierzchnię. Język brzuszny zajmuje mniejszą powierzchnię niż język grzbietowy (~ 5 x 2 mm język brzuszny; ~ 8 x 3 mm język grzbietowy).
    11. Opcjonalnie: Utrwalić jedną część języka w podłożu utrwalającym (np. 4% paraformaldehydu) lub optymalnym temperaturze cięcia (OCT) w celu kriokonserwacji.
    12. Opcjonalnie: Szybkie zamrażanie fragmentów w celu izolacji RNA lub białka w temperaturze -80 °C.
  2. Trawienie w celu oddzielenia nabłonka i blaszki właściwej
    1. Przed użyciem należy przygotować świeży koktajl enzymatyczny zawierający 1 mg/ml kolagenazy A i 2 mg/ml dypazy II w PBSO i roztworze do temperatury 37 °C.
    2. Wstrzyknąć co najmniej 500 μl koktajlu enzymatycznego w przestrzeń podnabłonkową z tylnego odciętego końca języka za pomocą igły 26 G.
    3. Wbij igłę głęboko w tkankę, perforując blaszkę właściwą i mięsień znajdujący się pod spodem, ostrożnie pozostając równolegle do nabłonka.
    4. Wstrzyknąć koktajl, powoli chowając igłę.
      UWAGA: Rozjaśnienie koloru i widoczne rozszerzenie tkanki języka potwierdza wystarczające wstrzyknięcie enzymów trawiennych. Również indukcja przezroczystej fazy pod nabłonkiem wskazuje na prawidłowe wstrzyknięcie.
    5. Powtórzyć wstrzyknięcie do pięciu razy.
    6. Przenieść tkankę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej ten sam koktajl enzymatyczny.
    7. Inkubować próbkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce (przy 300 obr./min).
    8. Przenieść tkankę na szalkę Petriego zawierającą PBSO.
    9. Chwyć mięsień i czubek języka pęsetą i ostrożnie odciągnij mięsień od nabłonka. Jeśli napotkasz opór, prawdopodobnie na tylnym końcu cięcia, podnieś nabłonek pęsetą.
    10. Umyj oddzielony nabłonek PBSO i przystąp do żądanej aplikacji. W celu ustalenia organoidów należy przejść do etapu 1.3.1, a w przypadku preparatów do całego mocowania tkanek należy przejść do etapu 4.1.1.
  3. Tworzenie mysich organoidów błony śluzowej jamy ustnej z tkanki pierwotnej
    1. Pokrój nabłonek na małe kawałki o wymiarach około 2 x 2 mm.
    2. Trawić tkankę w 1 ml 0,125% trypsyny dodanej do PBSO w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Trawienie nie powinno przekraczać 30 min.
    3. Regularnie sprawdzaj trawienie, wstrząsając co 10 minut.
    4. Gdy mieszanina stanie się mętna (w zależności od ilości tkanki) lub gdy zaobserwuje się mieszaninę grudek komórek, przedłuż rozerwanie, wirując przez 5 s i pipetując w górę iw dół 10-20 razy.
    5. Umyj raz, uzupełniając 10 ml pożywki Advanced DMEM/F12+++.
    6. Bezpośrednio przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka o średnicy 70 μm.
    7. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki Advanced DMEM/F12+++ w celu zliczenia.
    9. Policz komórki za pomocą komory liczącej Neubauera lub równoważnej metody.
    10. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zasysać supernatant.
    11. Ponownie zawiesić osad w BME (utrzymuj BME na lodzie, aby zapobiec zestaleniu). Oblicz ilość BME, w zależności od liczby komórek (około 10 000 komórek/40 μL BME). Jeśli nie można całkowicie zassać pożywki, ostrożnie usuń resztę za pomocą pipety 100 μl.
      UWAGA: Stężenie BME nie powinno być mniejsze niż 70%, ponieważ może to prowadzić do niewystarczającego krzepnięcia.
    12. Umieść komórki na dnie wstępnie podgrzanych płytek do hodowli komórkowych (zawiesiny) w kropelkach o objętości 10 μl za pomocą pipety P100.
    13. Umieść płytkę hodowlaną do góry nogami w inkubatorze na 30 min-1 godzinę, aby BME zastygł.
    14. Przygotuj wymaganą ilość mysiego organoidu błony śluzowej jamy ustnej, świeżo dodając inhibitor ROCK i Primocin (patrz Tabele materiałów i Tabela 1).
    15. Po zestaleniu dodać wstępnie podgrzaną pożywkę do kropelek komórek, ostrożnie pipetując do ścianki studzienek, aby uniknąć oderwania się kropel.
    16. Inkubować płytki w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    17. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni. Inhibitor ROCK i Primocin pozostają w pożywce hodowlanej przez pierwsze dwa pasaże.

2 Pasażowanie, kriokonserwacja i rozmrażanie mysich organoidów błony śluzowej jamy ustnej

  1. Pasażowanie mysich kultur organoidów błony śluzowej jamy ustnej
    1. Mysie organoidy błony śluzowej jamy ustnej można przepasywać po raz pierwszy między 10 a 12 dniem po początkowym posiewie.
    2. W celu rozszczepienia ponownie zawiesić kropelki BME w pożywce za pomocą pipety P1000 i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml lodowatego PBSO.
    3. Uzupełnij objętość 5 ml lodowatego podłoża Advanced DMEM/F12+++.
    4. Odwirować organoidy w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odessać supernatant i strawić organoidy za pomocą 0,125% trypsyny w PBSO.
    6. Zawiesić osad w 1 ml 0,125% roztworu trypsyny i inkubować zawiesinę w temperaturze 37 °C, aż organoidy rozpadną się na kawałki. Sprawdzaj trawienie co 2 minuty.
    7. Zawiesinę komórek należy dokładnie zawiesić, pipetując w górę i w dół 20-30 razy za pomocą pipety P1000 i powtórzyć ostre ponowne zawieszenie za pomocą pipety P200.
    8. Umyj komórki 10 ml pożywki Advanced DMEM/F12+++.
    9. Opcjonalnie: Bezpośrednie filtrowanie zawiesiny komórek za pomocą sitka o długości 70 μm w celu wytworzenia jednorodnej zawiesiny komórek.
    10. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    11. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w BME, a następnie postępować z organoidami zgodnie z opisem w krokach 1.3.8-1.3.17.
  2. Kriokonserwacja i rozmrażanie mysich kultur organoidów błony śluzowej jamy ustnej
    1. W celu krioprezerwacji pozwól mysim organoidom błony śluzowej jamy ustnej rosnąć przez 3-5 dni po pasażowaniu.
    2. Odłączyć organoidy od płytek hodowlanych zgodnie z opisem w krokach 2.1.2–2.1.4.
    3. Po odwirowaniu ponownie zawiesić organoidy w 1 ml pożywki do zamrażania (pożywka Advanced DMEM/F12+++ zawierająca 10% FCS i 10% DMSO) i przenieść zawiesinę komórek do kriowialiów o pojemności 2 ml.
    4. Umieścić komórki w żądanych pojemnikach do zamrażania w temperaturze -80 °C na okres do 24 godzin. W przypadku długotrwałego przechowywania należy przechowywać ogniwa w temperaturze poniżej -120 °C, na przykład w zbiorniku z ciekłym azotem.
    5. Rozmrozić kriokonserwowane komórki w temperaturze 37 °C i szybko przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki zawierającej 9 ml wstępnie podgrzanego podłoża Advanced DMEM/F12+++.
    6. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 350 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    7. Odrzucić supernatant i postępować z organoidami zgodnie z opisem w krokach 1.3.8-1.3.17.

3 Analiza ekspresji genów mysiej tkanki błony śluzowej jamy ustnej i organoidów

  1. Ekstrakcja RNA z mysich organoidów błony śluzowej jamy ustnej i tkanki natywnej
    1. Zbierz mysie organoidy błony śluzowej jamy ustnej zgodnie z opisem w krokach 2.1.2-2.1.4.
    2. Odrzucić supernatant i umyć organoidy w zimnym PBSO.
    3. Odwirować organoidy w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    4. Aby wyizolować RNA z tkanki natywnej, użyj oddzielonego nabłonka (patrz krok 1.2.10).
    5. Pokrój tkankę na małe kawałki o wymiarach 2 mm x 2 mm.
    6. Do izolacji RNA należy użyć ustalonej metody lub zestawu: Ponownie zawiesić organoidy lub fragmenty tkanek w, odpowiednio, 350 lub 700 μl buforze do lizy
      7. .
    7. Organoidy poddawane ostrej lizie wirowej przez co najmniej 10 s i lizie tkanki przez co najmniej 30 s.
    8. Umieścić roztwór w temperaturze -80 °C na co najmniej 2 godziny.
    9. Rozmrozić lizat komórkowy na lodzie i przystąpić do izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Synteza cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji
    1. Zmierz stężenie RNA i oblicz objętość dla całkowitego wejścia RNA 0,1-1 μg.
    2. Do syntezy cDNA należy użyć zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta. W tym doświadczeniu zastosowano następujący preparat: 4 μL 5x mieszaniny reakcyjnej, 1 μL odwrotnej transkryptazy, x μL 0,1-1 μg całkowitego RNA i x μL wody wolnej od nukleaz do 20 μL końcowej objętości.
    3. Wykonaj odwrotną transkrypcję w trzyetapowym programie cyklera z następującym programem: 25 °C przez 5 min, 42 °C przez 30 min i 85 °C przez 5 min.
    4. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C.
  3. Analiza ekspresji genów metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym
    1. W przypadku ilościowego PCR w czasie rzeczywistym wykonaj wszystkie reakcje w duplikatach technicznych.
    2. Przygotuj mieszaninę 5 μl qPCR Supermix, 1 μl startera odwrotnego (400 nM), 1 μl startera forward (400 nM), 1 μl cDNA (10-20 ng/basenik) i 2 μl wody wolnej od nukleaz.
    3. Do amplifikacji należy użyć standardowych ustawień w następujący sposób: aktywacja polimerazy i denaturacja DNA w temperaturze 95 °C przez 30 s, denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5-10 s, wyżarzanie/rozciąganie i odczyt płytki w temperaturze 60 °C przez 60 s przez 40 cykli. Wykonaj analizę krzywej topnienia w temperaturze 65-95 °C z przyrostem co 0,5 °C co 2-5 s/krok (lub użyj domyślnych ustawień urządzenia).
    4. Analizuj dane za pomocą żądanych metod, takich jak metody ΔCt lub ΔΔCt56 lub za pomocą oprogramowania analitycznego dostarczonego przez producenta termocyklera, postępując zgodnie z podanymi instrukcjami.

4 Analiza ekspresji białek w mysiej tkance błony śluzowej jamy ustnej i organoidach

UWAGA: Barwienie całego nabłonka języka zostało przeprowadzone na 24-dołkowej płytce, przenosząc tkankę za pomocą kleszczy z dołka do dołka na każdym etapie.

  1. Utrwalanie mysich tkanek błony śluzowej jamy ustnej i kultur organoidowych
    1. W przypadku barwienia tkanek metodą całego mocowania należy postępować od kroku 1.2.10 i kontynuować od kroku 4.1.5.
    2. W przypadku barwienia organoidów należy pobrać organoidy zgodnie z opisem w kroku 2.1.2 i kontynuować czynności w kroku 4.1.3.
    3. Uzupełnić zawiesinę komórkową 10 ml PBSO.
    4. Odwirować zawiesinę komórek o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    5. Utrwalić nabłonek lub organoidy w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut w temperaturze pokojowej (21 °C).
    6. Umyć próbki raz w PBSO. Odwirować organoidy przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  2. Barwienie całościowe mysich tkanek błony śluzowej jamy ustnej i kultur organoidowych
    1. Zdemaskuj epitopy, inkubując próbki w 0,2% roztworze Triton X-100 przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przenieść próbki do roztworu blokującego (5% surowicy osła w PBSO) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    3. Rozcieńczyć przeciwciała w roztworze blokującym i inkubować próbki w roztworze przeciwciał przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Przemyć komórki lub tkankę trzykrotnie (po 5 minut każda) buforem płuczącym zawierającym 0,1% Tween-20 i 1% PBSO w ddH2O.
    5. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:400 w PBSO.
    6. Próbki inkubować w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
    7. Powtórzyć etap prania 4.2.4. W przypadku próbek tkanek należy postępować zgodnie z krokiem 4.2.8. W przypadku próbek organoidów należy postępować zgodnie z krokiem 4.2.9.
    8. Umieść nabłonek na szkiełku stroną podstawową (stroną, która była przymocowana do blaszki właściwej) skierowaną do góry. Zamontuj nabłonek w wodnym roztworze mocującym z DAPI i szkiełkiem nakrywkowym. Przejdź do kroku 4.2.11.
    9. W przypadku próbek organoidów należy ponownie zawiesić wybarwione organoidy w dowolnej odpowiedniej matrycy żelowej, która krzepnie w temperaturze pokojowej.
    10. Szybko pipetować kropelki do 96-dołkowej szklanej płytki dolnej (5 μl/dołek). Umieść płytkę na lodzie i pozwól matrycy żelowej zastygnąć przez 15 minut. Umieścić organoidy w wodnym roztworze mocującym z DAPI, dodając 100 μl na studzienkę.
    11. Barwione próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu analizy obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje oddzielenie nabłonka języka od leżącej pod nim blaszki właściwej i mięśni za pomocą koktajlu enzymatycznego (Rysunek 1). Oddzielony nabłonek może być dalej wykorzystywany do generowania organoidów, a także zbierany do różnych rodzajów analiz genów i białek. Podobnie, strawiona warstwa blaszki właściwej i mięśni może być wykorzystana do zabiegów z wyboru.

W przypadku kultur organoidowych, nabłonek języka jest dalej trawiony na małe kępy komórek (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trawienie tkankowe
Trawienie kolagenazy pomaga w oddzieleniu nabłonka od leżącej pod nim blaszki właściwej i tkanki mięśniowej. Ten etap pozwala na lepsze porównanie tkanki pierwotnej z następnie wygenerowanymi organoidami błony śluzowej jamy ustnej. Ponieważ nadmierne trawienie enzymami wpływa na zdolność organoidów dorosłych nabłonkowych komórek macierzystych, zalecamy inkubację kolagenazy nie dłużej niż 1 godzinę, a trawienie trypsyny nie dłużej niż 30 minut. Po trawieniu kolagenazy nabłonek jest...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.K. jest wymieniony jako wynalazca w zgłoszonym patrycie, który jest związany z technologią organoidów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Sabine Kranz za pomoc. Chcielibyśmy podziękować Jednostce Głównej ds. Mikroskopii Konfokalnej i Sortowania Komórek w oparciu o Cytometrię Przepływową IZKF Würzburg za wsparcie tego badania. Praca ta została sfinansowana z grantu Niemieckiej Pomocy Onkologicznej (za pośrednictwem IZKF/MSNZ Würzburg dla K.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Media & Komponenty nośników
Advanced Dulbecco" s Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM)/F12Thermo Fisher Scientific 12634-028 B27
Suplement Thermo Fisher Scientific17504-044
GlutaMAX-I (100x)Thermo Fisher Scientific35050-038
HEPESThermo Fisher Scientific15630-056
N-acetylo-L-cysteinaSigma AldrichA9165
NikotynamidSigma AldrichN0636
Penicylina/Streptomycyna Thermo Fisher Scientific15140-122
PrimocinInvivogenant-pm1
RSPO3-Fc pożywka kondycjonowana białkiem fuzyjnymU-Protein Express BVR001
Rekombinowany ludzki EGFPreprotechAF-100-15
Rekombinowany ludzki inhibitor FGF-10Preprotech100-26
ROCK (kinaza Rho) Y-27632 dichlorowodorekHö lzel BiotechM1817
Przeciwciała 
Keratin-14 Przeciwciało poliklonalne 100&mikro; lBiozolBLD-905301
Przeciwciało E-KadherynyBio-TechneAF748
Oczyszczony mysz Anti-Ki-67  Klon B56   (0,1 mg)BD Bioscience556003
ALEXA FLUOR 594 Donkey Anti MouseThermo Fisher ScientificA21203
ALEXA FLUOR 647 Donkey Anti RabbitThermo Fisher ScientificA31573
ALEXA FLUOR 488 Donkey Anti GoatThermo Fisher ScientificA110555
Odczynniki / Chemikalia
BME Type 2, RGF Cultrex PathclearBio-Techne3533-005-02
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma Aldrich34943-1L-M
Kolagenaza A Roche10103578001
Serum osłaSigma AldrichS30-100ML
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific100-100-15
EDTASigma Aldrich221465-25G
Etanol, denaturowany (96 %)Carl RothT171.3
Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
TritonX-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween-20 Sigma AldrichP1379-500ML
TrypLE Express Enzyme (1&razy), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific12605-010
XyleneSigma Aldrich534056-500ML
strong>Equipment i inne
Cell culture 12-dołkowe płytki wielodołkoweGreiner BioOne392-0047
Filtr siatkowy komórek: 100 i mikro; mVWR732-2759
Szkiełka nakrywkoweVWR631-1569P
Mikropłytki ze szklanym dnem VE=10 4580Corning13539050
Szkiełka obiektywowe: Superfrost PlusVWR631-0108P
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
  2. Gartner, L. P. Oral anatomy and tissue types. Seminars in Dermatology. 13 (2), 68-73 (1994).
  3. Post, Y., Clevers, H. Defining adult stem cell function at its simplest: The ability to replace lost cells through mitosis. Cell Stem Cell. 25 (2), 174-183 (2019).
  4. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatolology. 16 (1), 19-34 (2019).
  5. Kretzschmar, K., Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in adult mammalian epithelial stem cells. Developmental Biology. 428 (2), 273-282 (2017).
  6. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
  7. Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
  8. Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
  9. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
  10. Bierbaumer, L., Schwarze, U. Y., Gruber, R., Neuhaus, W. Cell culture models of oral mucosal barriers: A review with a focus on applications, culture conditions and barrier properties. Tissue Barriers. 6 (3), 1479568(2018).
  11. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  12. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  13. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nature Medicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  17. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  19. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  20. Lamers, M. M., et al. An organoid-derived bronchioalveolar model for SARS-CoV-2 infection of human alveolar type II-like cells. EMBO Journal. 40 (5), 105912(2020).
  21. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  22. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  23. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  24. Seino, T., et al. Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
  25. Boonekamp, K. E., et al. Long-term expansion and differentiation of adult murine epidermal stem cells in 3D organoid cultures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (29), 14630-14638 (2019).
  26. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  27. Kretzschmar, K. Cancer research using organoid technology. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), Berlin. 501-515 (2020).
  28. Kruitwagen, H. S., et al. Long-term adult feline liver organoid cultures for disease modeling of hepatic steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
  29. Wiener, D. J., et al. Establishment and characterization of a canine keratinocyte organoid culture system. Veterinary Dermatology. 29 (5), 375(2018).
  30. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  31. Post, Y., et al. Snake venom gland organoids. Cell. 180 (2), 233-247 (2020).
  32. Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538 (7624), 260-264 (2016).
  33. Kuijk, E., et al. The mutational impact of culturing human pluripotent and adult stem cells. Nature Communications. 11 (1), 2493(2020).
  34. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas tools and their application in genetic engineering of human stem cells and organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  35. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nature Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
  36. Gehart, H., et al. Identification of enteroendocrine regulators by real-time single-cell differentiation mapping. Cell. 176 (5), 1158-1173 (2019).
  37. Artegiani, B., et al. Probing the tumor suppressor function of BAP1 in CRISPR-engineered human liver organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 927-943 (2019).
  38. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  39. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  40. Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
  41. Fumagalli, A., et al. A surgical orthotopic organoid transplantation approach in mice to visualize and study colorectal cancer progression. Nature Protocols. 13 (2), 235-247 (2018).
  42. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  43. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  44. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  45. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  46. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews Immunology. 20 (5), 279-293 (2020).
  47. Dijkstra, K. K., et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  48. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO Journal. 38 (12), (2019).
  49. Nanki, K., et al. Divergent routes toward Wnt and R-spondin niche independency during human gastric carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
  50. Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
  51. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  52. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  53. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  54. Driehuis, E., et al. Patient-derived oral mucosa organoids as an in vitro model for methotrexate induced toxicity in pediatric acute lymphoblastic leukemia. PLOS One. 15 (5), 0231588(2020).
  55. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825(2020).
  56. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy b ony luzowej jamy ustnejhodowla organoid wb ona luzowa jamy ustnej myszykom rki macierzyste nab onkahydro el ECMizolacja tkanki j zykaczynniki wzrostutr jwymiarowe skupiska kom rekobrazowanie ca ych preparat wanaliza ekspresji gen w
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły