Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62530

⸱

10 maja 2021

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Georgetown University, 3Ralph H. Johnson Veterans Affairs Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy wyrafinowane procedury chirurgiczne dotyczące skutecznego przeprowadzenia przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrz portalu, klinicznie istotnej, ale technicznie trudnej procedury chirurgicznej u myszy.

Streszczenie

Chociaż wątroba jest obecnie akceptowana jako główne miejsce przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych w warunkach klinicznych, wyspy trzustkowe są przeszczepiane pod torebkę nerkową w większości przedklinicznych badań nad przeszczepem wysp trzustkowych u gryzoni. Model ten jest powszechnie stosowany, ponieważ przeszczep mysich wysp trzustkowych wewnątrz wątroby jest technicznie trudny, a wysoki odsetek myszy może umrzeć z powodu powikłań chirurgicznych, zwłaszcza krwawienia z miejsca wstrzyknięcia po przeszczepie. W tym badaniu przedstawiono dwie procedury, które mogą zminimalizować częstość występowania krwawienia z żyły wrotnej po infuzji. Pierwsza metoda polega na nałożeniu wchłanialnej hemostatycznej gąbki żelatynowej na miejsce wstrzyknięcia, a druga metoda polega na penetracji igły do wstrzykiwania wysp trzustkowych najpierw przez tkankę tłuszczową, a następnie do żyły wrotnej poprzez wykorzystanie tkanki tłuszczowej jako fizycznej bariery zatrzymującej krwawienie. Obie metody mogą skutecznie zapobiegać śmierci myszy wywołanej krwawieniem. Przedstawiono cały wycinek wątroby ukazujący rozmieszczenie wysp trzustkowych oraz objawy zakrzepicy wysp trzustkowych po przeszczepieniu, co jest cechą typową dla przeszczepienia wysp wewnątrzwątrobowych. Te ulepszone protokoły udoskonalają procedury przeszczepiania wysp trzustkowych wewnątrz wątroby i mogą pomóc laboratoriom w przygotowaniu procedury do badania przeżywalności i funkcji wysp trzustkowych w warunkach przedklinicznych.

Wprowadzenie

Przeszczepianie wysp trzustkowych (IIT) przez żyłę wrotną jest najczęściej stosowaną metodą przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych w warunkach klinicznych. Mysi model IIT oferuje doskonałą okazję do zbadania transplantacji wysp trzustkowych i przetestowania obiecujących podejść interwencyjnych, które mogą zwiększyć skuteczność przeszczepu wysp trzustkowych1. IIT został po raz pierwszy opisany w latach siedemdziesiątych XX wieku i używany przez kilka grup1,2,3,4,5. Odzyskał popularność po przełomie w transplantacji ludzkich wysp trzustkowych w roku 20006,7. Jednak w większości badań nad przeszczepem wysp trzustkowych wykorzystywano torebkę nerkową jako preferowane miejsce do eksperymentalnego przeszczepu wysp trzustkowych ze względu na jej łatwy sukces. Wręcz przeciwnie, TIZ jest bardziej wymagająca technicznie i rzadziej stosowana w badaniach nad przeszczepem wysp trzustkowych8,9. Jednak w przeciwieństwie do IIT, wyspy trzustkowe przeszczepione pod torebkę nerkową nie cierpią na natychmiastową reakcję zapalną za pośrednictwem krwi, charakteryzującą się zakrzepicą, stanem zapalnym i niedokrwieniem tkanki wątrobowej, a zatem mają lepszą funkcję niż wyspy trzustkowe przeszczepione do wątroby. Model torebki nerkowej może zatem nie naśladować w pełni naprężeń napotykanych przez wyspy trzustkowe podczas przeszczepiania ludzkich wysp trzustkowych10,11,12.

Jednym z głównych powikłań IIT u myszy jest krwawienie z miejsca wstrzyknięcia po przeszczepie, co może spowodować 10-30% śmiertelności wśród różnych szczepów myszy12. W tym artykule opracowano dwa udoskonalone podejścia mające na celu szybsze i bezpieczniejsze zatrzymanie krwawienia oraz zmniejszenie śmiertelności myszy po IIT. Wizualna demonstracja tych wyrafinowanych szczegółów pomoże naukowcom zidentyfikować kluczowe etapy tej technicznie wymagającej procedury. Ponadto lokalizacja przeszczepów wysp trzustkowych w wątrobie biorcy została określona na podstawie badania histologicznego tkanki wątroby (cały odcinek) barwionej hematoksyliną i eozyną (H&E) zawierającej przeszczepione wyspy trzustkowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnych Komitetów ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym Południowej Karoliny oraz Centrum Medycznego Ralpha H. Johnsona w Charleston.

1. Indukcja cukrzycy za pomocą streptozotocyny (STZ)

  1. Preparat myszy biorcy:
    1. Zważ wszystkie myszy indywidualnie.
    2. Sprawdź poziom glukozy we krwi z próbki krwi żyły ogonowej za pomocą glukometru.
  2. Oznaczanie dawki STZ dla trzech różnych scenariuszy:
    1. W przypadku myszy ze stłuszczeniem wątroby należy wstrzyknąć jedną dawkę STZ [40 mg/kg/dobę, wstrzyknięcie dootrzewnowe] przez 5 kolejnych dni.
    2. W przypadku myszy NOD-SCID wstrzyknąć 125 mg/kg STZ, pojedyncze wstrzyknięcie, i.p. po całonocnym poście.
    3. W przypadku myszy C57BL/6 wstrzyknąć 225 mg/kg STZ, pojedyncze wstrzyknięcie, i.p.
  3. Obliczenia dla STZ (13,5 mg/ml):
    UWAGA: To obliczenie dotyczy pięciu myszy C57BL/6 o masie ciała 30 g:
    1. Całkowita masa ciała: 5 myszy x 30 g/mysz = 150g
    2. Potrzebne STZ: 150 g x 225 mg / 1000 g STZ = 33,75 mg
  4. Przygotowanie STZ:
    1. Zważyć STZ zgodnie z wcześniej obliczoną dawką.
    2. Przenieść zważony proszek STZ do zlewki o pojemności 10 ml na lodzie.
    3. Dodać 3 ml roztworu cytrynianu sodu do zlewki, aby rozpuścić STZ.
    4. Dobrze wymieszaj, przefiltruj, wysterylizuj przez pory 0,22 μm i użyj roztworu STZ w ciągu 10 minut od przygotowania.
  5. Wtrysk STZ:
    1. Załadować żądaną ilość roztworu STZ (wystarczającą na jedną mysz) do strzykawki o pojemności 1 ml.
    2. Wykonaj wstrzyknięcie dootrzewnowe w prawy dolny kwadrant brzucha myszy.
    3. Obserwuj myszy przez 5 minut po wstrzyknięciu i sprawdź, czy w tym czasie nie ma oznak dyskomfortu przed ponownym umieszczeniem ich w klatkach.
    4. Monitoruj poziom glukozy we krwi z próbki krwi żyły ogonowej za pomocą glukometru codziennie po wstrzyknięciu STZ.
      UWAGA: W tym eksperymencie myszy są uważane za cukrzyki, gdy poziom glukozy we krwi na czczo wynosi > 350 mg / dl przez dwa kolejne dni.

2. Przygotowanie wysepek

UWAGA: Ludzkie wyspy trzustkowe były hodowane w pożywce CMRL-1066 uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) o gęstości 10 000 wysepek (IEQ) na 100 mm naczynia do hodowli komórkowej9. Mysie wysepki hodowano w DMEM z 10% FBS i 1% P/S o tej samej gęstości13. Samce myszy NOD-SCID i C57BL/7 w wieku od 6 do 10 tygodni uzyskano ze źródeł komercyjnych.

  1. Odłącz wyhodowane wyspy trzustkowe od naczynia do hodowli komórkowych poprzez delikatne drapanie.
  2. Ręcznie wybierz żądaną liczbę wysepek (np. 300-350 wysepek) za pomocą strzykawki o pojemności 1 cm3 i umieść je w sterylnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na lodzie.
  3. Obracaj probówkę przez 10 sekund za pomocą mikrowirówki.
  4. Usuń supernatant, pozostawiając trochę płynu, aby uniknąć utraty osadu.
  5. Zawiesić osad w 200 μl HBSS z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
  6. Odessać zawieszone wyspy trzustkowe do strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml.
  7. Umieścić strzykawkę w pozycji pionowej. Pozwól wysepkom opaść na 1 minutę.
  8. Popchnąć strzykawkę, aby usunąć wszystkie pęcherzyki, pozostawiając około 100-150 μl płynu zawierającego wysepki.
  9. Umieścić głowicę strzykawki w dół i delikatnie postukać w bok strzykawki, aby wysepki równomiernie rozprowadziły się w płynie. Wyspy trzustkowe są teraz gotowe do wstrzyknięcia.

3. Przeszczep wysp trzustkowych

  1. Indukuj i utrzymuj mysz w znieczuleniu ogólnym za pomocą 2% izofluranu. Sprawdź, czy nie ma odruchów pedałowania, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie zwierzęcia.
  2. Ogol i usuń sierść w okolicy brzucha myszy.
  3. Należy podać pojedynczą przedoperacyjną dawkę buprenorfiny (0,1 mg/kg i.p.).
  4. Zdezynfekuj obszar operacyjny trzema naprzemiennymi chusteczkami zawierającymi 2% jodu i 75% alkoholu.
  5. Wykonaj laparotomię mikronożyczkami, aby wygenerować nacięcie o długości 1-1,5 cm.
  6. Otwórz jamę otrzewnej za pomocą retraktora. Postępuj zgodnie z metodą A lub metodą B, jak opisano poniżej.

4. Metoda A: (zatamować krwawienie pianką żelową, Rysunek 1A)14,15,16

  1. Przygotowanie myszy
    1. Umieść sterylną gazę wokół nacięcia.
    2. Delikatnie wyciągnij jelito za pomocą kleszczy i trzymaj je na gazie.
    3. Zidentyfikuj żyłę wrotną na podstawie jej lokalizacji i dobrze ją wyeksponuj.
    4. Przykryj jelito ciepłą gazą mokrą od soli fizjologicznej podczas całego zabiegu.
  2. Włóż wstępnie załadowaną igłę strzykawki insulinowej z wysepką przez żyłę wrotną w pobliżu dwunastnicy (Ryc. 1B). W tym celu należy przytrzymać igłę otworem (skosem) skierowanym w dół i ustawić kąt powierzchni otworu równolegle do ściany żyły wrotnej przed przebiciem przez ścianę.
    1. Pociągnąć za tłok, aby pobrać trochę krwi (20-50 μl) do strzykawki, aby najpierw wymieszać wyspy trzasnkowe.
    2. Powoli wprowadzaj wysepki do żyły wrotnej, wielokrotnie ciągnąc i popychając zanurzenie.
    3. Umieścić kawałek pianki żelowej (o wymiarach około 0,5 cm x 0,5 cm) tak, aby pokryć miejsce wstrzyknięcia.
    4. Dociśnij piankę żelową bawełnianą końcówką, jednocześnie wyciągając igłę z żyły wrotnej.
    5. Kontynuuj naciskanie żelu przez około 2 minuty, aby upewnić się, że nie ma aktywnego krwawienia.
    6. Przewróć bawełnianą końcówkę na wierzch i odsuń ją od pianki żelowej, aby upewnić się, że pianka żelowa dobrze zakrywa żyłę wrotną.

5. Metoda B: (zatamować krwawienie z poduszeczki tłuszczowej, Rysunek 1C)17

  1. Dokładnie odsłoń żyłę wrotną.
    1. Użyj dwóch bawełnianych końcówek, aby przytrzymać odsłoniętą żyłę wrotną zarówno z lewej, jak i prawej strony.
    2. Zidentyfikuj poduszeczkę tkanki tłuszczowej między dwunastnicą a żyłą wrotną.
    3. Przeniknąć przez poduszeczkę tłuszczową przed wkłuciem igły do żyły wrotnej (Ryc. 1D).
    4. Wprowadzić wysepki, postępując zgodnie z podobną procedurą opisaną powyżej w części 4.2.1 i 4.2.2 metody A.
    5. Wyciągnij igłę, dociskając tłuszcz bawełnianą końcówką.
    6. Kontynuuj naciskanie na poduszeczkę tłuszczową przez 1 minutę po wyjęciu igły.
  2. Po upewnieniu się, że nie ma krwawienia z żyły wrotnej, delikatnie przywróć jelito do jamy otrzewnej w pierwotnym położeniu.
  3. Pozostawić 0,5 ml ciepłej soli fizjologicznej (36-37 °C) w jamie brzusznej przed zamknięciem.
    UWAGA: Ciepła sól fizjologiczna ułatwia pooperacyjne przemieszczanie jelit i rekonwalescencję oraz zapobiega martwicy jelit.
  4. Zamknij warstwę mięśniową szwem 5-0.
  5. Zamknij warstwę skóry szwem 4-0.
  6. Umieść mysz w czystej klatce na poduszce grzewczej, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.
  7. Kontynuuj podawanie leku przeciwbólowego (np. buprenorfiny 0,1 mg/kg i.p.) co 12 godzin i dodatkowego ogrzewania przez 48 godzin po zabiegu.
    UWAGA: Procedura przeszczepu wysp trzustkowych trwa około 15-20 minut.

6. Barwienie H&E i zdjęcie całego odcinka wątroby

  1. Perfuzja wątroby
    1. Umieść mysz w znieczuleniu, jak opisano powyżej w części 3.1.
    2. Ostrożnie odsłoń żyłę wrotną i przetnij żyłę główną dolną.
    3. Ręcznie perfundować wątrobę za pomocą 20 ml 10% paraformaldehydu przez żyłę wrotną przez około 5 minut, używając strzykawki o pojemności 20 ml z igłą 25G18.
      UWAGA: Perfuzja wątroby może usunąć krew z tkanki wątroby i poprawić unieruchomienie wątroby bez naruszania przeszczepów wysp trzustkowych.
    4. Wypreparuj perfundowaną całą wątrobę z innych narządów.
    5. Utrwalić perfundowaną tkankę wątroby w 10% paraformaldehydzie przez 24 godziny.
    6. Zanurz tkankę w parafinie.
    7. Wyciąć skrawki tkanki o grubości 5 μm każdy i umieścić je na szkiełku w celu barwienia.
    8. Wykonaj barwienie H&E, insuliny, fibryny i wielojądrzastych neutrofili (PMN) przy użyciu standardowych metod15,16.
    9. Zeskanuj cały wycinek wątroby pod mikroskopem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadziliśmy syngeneiczne i ksenogeneiczne przeszczepy wysepek przez żyłę wrotną. Funkcję przeszczepionych wysepek obserwowano w sposób zależny od dawki w obu modelach transplantacji. W modelu syngeneicznego przeszczepu wysepek z wykorzystaniem myszy C57BL/6, transplantacja 250 wysepek doprowadziła do przejściowej normoglikemii, przed powrotem myszy do stanu hiperglikemii. Myszy, które otrzymały 500 wysepek, osiągnęły i utrzymały normoglikemię powyżej 30 dni po transplantacji (Rycina 2A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu wykazano dwie ulepszone procedury, które mogą zapobiegać krwawieniu i mogą zmniejszać śmiertelność myszy podczas IIT u myszy. Badanie to umożliwia naukowcom wizualizację modelu przeszczepu wysp trzustkowych, który jest unikalny w badaniu natychmiastowej reakcji zapalnej za pośrednictwem krwi po przeszczepie. Model IIT jest charakterystycznym modelem do badania przeżywalności komórek wysp trzustkowych i uszkodzeń niedokrwiennych wątroby w odpowiedzi na przeszczep wysp trzustkowych19. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Departament ds. Weteranów (VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536), a Narodowy Instytut Zdrowia przyznaje HW # 1R01DK105183, DK120394, DK118529. Chcielibyśmy podziękować Panu Michaelowi Lee i Pani Lindsay Swaby za redakcję językową

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% neutralna buforowana formalina v/vFisher Scientific 23426796
1 ml Strzykawka z igłąAHSAH01T
20 mL StrzykawkaBD301031
25G x 5/8" igły podskórneBD305122
Wkładki nasączone alkoholem, sterylneFisher Scientific22-363-750
Znieczulenie zwierząt systemVetEquip, Inc.
Chlorowodorek buprenorfiny, do wstrzykiwańPar Sterile Products, LLCNDC 42023-179-05
Probówki wirówkowe, 15 mlFisher Scientific0553859A
CMRL-1066Corning15110CV
DMEMCorning10013CV
Etanol, absolutny (200 dowodów), klasa biologii molekularnejFisher Scientific
Bardzo cienkie nożyczki do mikro preparowania 4 "proste, ostrenarzędzie chirurgiczne Roboz Co.RS-5882
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Corning35011CV
FreeStyle  GlukometrPaskiLite
FreeStyle Gelfoam (wchłanialna gąbka żelatynowa, USP)Pharmacia & Upjohn Company34201
Kleszcze Graefe 4-calowa bardzo delikatna końcówkaRoboz Surgical Instrument Co.RS-5136
Podgrzewana podkładkaAmazonB07HMKMBKM
Uchwyt igły Hegar-Baumgartner 5,25 "Narzędzie chirurgiczne Roboz Co.RS-7850
Strzykawka insulinowa z igłą o rozmiarze 27 BD879588
Podkładki do przygotowania joduFisher Scientific19-027048
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-25
Penicylina/streptomycyna (P/S)HyCloneSV30010
Szew polipropylenowy 4-0Med-Vet InternationalMV-8683
Szew polipropylenowy 5-0Med-Vet InternationalMV-8661
Chlorek sodu, 0,9% roztwór dożylnyVWR2B1322Q
Streptozocin (STZ)SigmaS0130
Obłożenie chirurgiczne, sterylneMed-Vet InternationalDR1826
Kaseta na tkankiFisher Scientific22-272416
901806BP2818500 testowe do pomiaru stężenia glukozy we krwi Abbott

Bibliografia

  1. Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes. Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).
  2. Ballinger, W. F., Lacy, P. E. Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).
  3. Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival. American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).
  4. Toyofuku, A., et al. Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice. Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).
  5. Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model. Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).
  6. Hara, M., et al. A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation. Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).
  7. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  8. Wang, J., et al. Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction. Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).
  9. Gou, W., et al. Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation. American Journal of Transplantation. , (2020).
  10. Contreras, J. L., et al. Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death. Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).
  11. Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
  12. Melzi, R., et al. Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization. Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).
  13. Wang, H., et al. Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance. Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).
  14. Desai, C. S., et al. Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation. Islets. 9 (6), 140-149 (2017).
  15. Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation. Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).
  16. Cui, W., et al. Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).
  17. Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis. Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).
  18. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).
  19. Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).
  20. Wang, H., et al. Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy. Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

myszy z przeszczepionymi wysepkamihemostatyczna g bka elatynowatechnika podsk rnego przeszczepu w tkank t uszczowwstrzykiwanie do y y wrotnejprze ywalno wysepekpowik ania chirurgicznedystrybucja wysepektransplantacja w troby myszy
Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.