Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Podejścia inżynierii tkankowej były szeroko badane w ostatnich latach, aby towarzyszyć wynikom klinicznym in vivo w medycynie regeneracyjnej i modelowaniu chorób^1,2. Szczególny nacisk położono na modelowanie tkanek serca in vitro ze względu na nieodłączne trudności w pozyskiwaniu ludzkiej pierwotnej tkanki serca i wytwarzaniu fizjologicznie istotnych substytutów in vitro, co ogranicza podstawowe zrozumienie złożonych mechanizmów chorób sercowo-naczyniowych (CVD)1^,3. Tradycyjne modele często obejmowały testy hodowli jednowarstwowych 2D. Jednak znaczenie hodowli komórek serca w środowisku 3D w celu naśladowania zarówno natywnego krajobrazu mięśnia sercowego, jak i złożonych interakcji komórkowych zostało szeroko scharakteryzowane^4,5. Ponadto większość wyprodukowanych do tej pory modeli zawierała monokulturę CM różnicowanych z komórek macierzystych. Jednak serce składa się z wielu typów komórek⁶ w złożonej architekturze 3D⁷, co uzasadnia krytyczną potrzebę poprawy złożoności składu tkankowego w modelach 3D in vitro, aby lepiej naśladować składniki komórkowe natywnego mięśnia sercowego.

Do tej pory badano wiele różnych podejść do tworzenia biomimetycznych modeli 3D mięśnia sercowego⁸. Podejścia te obejmują zarówno konfiguracje eksperymentalne, które pozwalają na obliczanie generowanej siły w czasie rzeczywistym, od monokulturowych CM wysiewanych na cienkich warstwach (zwanych cienkimi warstwami mięśni (MTF))⁹, po kohodowlę komórek serca w matrycach hydrożelowych 3D zawieszonych wśród wolnostojących wsporników (uważanych za zmodyfikowane tkanki serca (EHT))¹⁰. Inne podejścia koncentrowały się na wdrażaniu technik mikroformowania w celu naśladowania anizotropii mięśnia sercowego, od monokulturowych CM w hydrożelu 3D zawieszonych wśród wystających mikropostów w plastrze tkanki¹¹, do monokulturowych CM wysiewanych wśród wciętych mikrorowków^12,13. Każda z tych metod ma nieodłączne zalety i wady, dlatego ważne jest, aby wykorzystać technikę, która jest zgodna z zamierzonym zastosowaniem i odpowiadającym mu pytaniem biologicznym.

Zdolność do przyspieszenia dojrzewania CM pochodzących z komórek macierzystych jest niezbędna do udanej inżynierii in vitro tkanki mięśnia sercowego podobnej do dorosłej i przełożenia późniejszych wyników na interpretacje kliniczne. W tym celu szeroko zbadano metody dojrzewania CM, zarówno w 2D, jak i 3D^14,15,16. Na przykład stymulacja elektryczna włączona do EHT, wymuszone wyrównanie CM z topografią powierzchni, sygnały sygnalizacyjne, czynniki wzrostu z kohodowli i / lub warunki hydrożelu 3D itp., Wszystko to prowadzi do zmiany na korzyść dojrzewania CM w co najmniej jednym z następujących elementów: morfologia komórki, obchodzenie się z wapniem, struktura sarkomeryczna, ekspresja genów lub siła skurczu.

Spośród tych modeli, podejścia wykorzystujące platformy mikroprzepływowe zachowują pewne zalety natury, takie jak kontrola gradientów, ograniczony dopływ komórek i minimalna ilość niezbędnych odczynników. Co więcej, wiele replik biologicznych może być generowanych jednocześnie za pomocą platform mikroprzepływowych, co służy do lepszego zbadania interesującego mechanizmu biologicznego i zwiększenia wielkości próby eksperymentalnej na korzyść mocy statystycznej^17,18,19. Dodatkowo, wykorzystanie fotolitografii w procesie wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych umożliwia tworzenie precyzyjnych cech (np. topografii) na poziomie mikro- i nano, które służą jako mezoskopowe wskazówki do poprawy otaczającej struktury komórkowej i architektury tkanek na poziomie makro^18,20,21,22 do różnych zastosowań w regeneracji tkanek i chorobach Modelowania.

Wcześniej zademonstrowaliśmy rozwój nowego modelu 3D tkanki serca na chipie, który wykorzystuje topografię powierzchni, w postaci wrodzonych eliptycznych mikropostów, aby wyrównać otoczone hydrożelem współhodowane komórki serca w połączoną, anizotropową tkankę²⁰. Po 14 dniach hodowli tkanki utworzone w urządzeniu mikroprzepływowym są bardziej dojrzałe pod względem fenotypu, profilu ekspresji genów, charakterystyki obchodzenia się z wapniem i odpowiedzi farmaceutycznej w porównaniu z jednowarstwowymi i izotropowymi kontrolami 3D²³. Opisany w niniejszym dokumencie protokół przedstawia metodę tworzenia tej 3D, współhodowanej, wyrównanej (tj. anizotropowej) ludzkiej tkanki serca w urządzeniu mikroprzepływowym przy użyciu CM pochodzących z hiPSC. W szczególności wyjaśniamy metody różnicowania i oczyszczania hiPSC w kierunku CM, suplementacji hCF CM w celu wytworzenia ustalonej populacji kohodowli, wprowadzania populacji komórek zamkniętych w hydrożelu kolagenowym do urządzeń mikroprzepływowych, a następnie analiza tkanek skonstruowanych w 3D za pomocą testów kurczliwych i immunofluorescencyjnych. Powstałe w ten sposób mikrotkanki zaprojektowane w 3D nadają się do różnych zastosowań, w tym do podstawowych badań biologicznych, modelowania CVD i testów farmaceutycznych.

Wykonaj wszystkie czynności związane z komórkami i przygotowanie odczynników w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Upewnij się, że wszystkie powierzchnie, materiały i sprzęt, które mają kontakt z komórkami, są sterylne (tj. spryskaj 70% etanolem). Komórki należy hodować w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%_{CO2 .} Cała hodowla i różnicowanie hiPSC odbywa się na płytkach 6-dołkowych.

1. Tworzenie urządzenia mikroprzepływowego (przybliżony czas trwania: 1 tydzień)

1. Fotolitografia
   UWAGA: Maska, zaprojektowana przy użyciu pliku CAD (dostarczonego jako plik uzupełniający 1), zawiera projekt kanału mikroprzepływowego. Wydrukuj projekt na przezroczystej masce. Następnie wykonaj standardową fotolitografię za pomocą ujemnego fotorezystu SU8 2075 na 4-calowej płytce krzemowej w pomieszczeniu czystym.
   1. Oczyść płytkę krzemową alkoholem izopropylowym (IPA) i osusz azotem. Piec w temperaturze 200 °C przez 5 minut w celu odwodnienia.
      UWAGA: Manipuluj waflem za pomocą pęsety do wafli.
   2. Umieść wafel w wirówce. Umieść 3-4 ml SU8 w środku płytki, a następnie wiruj, aby utworzyć warstwę 200 μm (tj. Zwiększ prędkość od 15 s do 500 obr./min, wiruj przez 10 s, zwiększ o 5 s do 1,200 obr./min i wiruj przez 30 s, a następnie wiruj w dół przez 15 s, aż się zatrzyma).
   3. Wyjmij wafel i piecz na miękko przez 7 minut w temperaturze 65 °C, a następnie 45 minut w temperaturze 95 °C.
   4. Przenieś wafel do wyrównywacza maski i umieść przezroczystą maskę w uchwycie maski z filtrem UV. Wystaw płytkę na 2 cykle po 230 mJ/cm² z opóźnieniem 30 s, co daje całkowitą ekspozycję 460 mJ/cm².
   5. Wykonaj pieczenie poekspozycyjne na odsłoniętej płytce w piekarniku o temperaturze 50 °C przez noc.
   6. Wyłącz piekarnik następnego ranka, a gdy wafel ostygnie do temperatury pokojowej, zanurz go w wywoływaczu SU8. Wyjmuj wafel z wywoływacza co 5 minut i myj IPA, a następnie umieść go z powrotem w wywoływaczu.
   7. Po około 20 minutach lub gdy IPA jest klarowne, osusz wafel azotem powietrznym i upiecz na twardo w piekarniku nastawionym na 150 °C; gdy tylko piekarnik osiągnie 150 °C, wyłącz go, ale nie otwieraj. Pozostaw wafel w piekarniku, aż osiągnie temperaturę pokojową, a następnie wyjmij wafelek.
   8. Potwierdź wysokość SU8 za pomocą profilometru, a cechy optyczne za pomocą mikroskopu świetlnego. Po potwierdzeniu przyklej wafel do plastikowej szalki Petriego o średnicy 150 mm.
2. Litografia miękka
   UWAGA: Wafel, przyklejony taśmą do szalki Petriego, musi być silanizowany, aby zapobiec przyleganiu PDMS do cech SU8.
   1. Odwróć wafel (przyłożony do plastikowej szalki Petriego) na szklanej szalce Petriego tej samej wielkości, zawierającej 0,4 ml metylotrichlorosilanu (MTCS) i wystawij wafel na działanie oparów przez 4 minuty. Obróć wafel do góry nogami i umieść pokrywkę na szalce Petriego.
   2. Wymieszaj 30 g bazy z elastomeru silikonowego z utwardzaczem w proporcji 10:1. Zdjąć pokrywkę z szalki Petriego i wlać polidimetylosiloksan (PDMS) na płytkę, a następnie odgazować w eksykatorze.
   3. Gdy wszystkie pęcherzyki znikną, umieść wafel w temperaturze 80 °C na 1,5 godziny, aby utwardzić PDMS.
   4. Ostrożnie odklej PDMS i przebij wloty i wyloty portów tkanek i kanałów pożywki odpowiednio 1 mm i 1,5 mm przebijakiem do biopsji.
   5. Wyczyść kanały PDMS taśmą, aby usunąć kurz. Następnie namocz szkiełka nakrywkowe (18 x 18 mm, nr 1) w 70% etanolu przez co najmniej 15 minut. Następnie osusz je chusteczkami higienicznymi.
   6. Poddaj zarówno szkiełka nakrywkowe, jak i kanały PDMS (strona odsłonięta) plazmie (ustawienie na wysokim poziomie) przez 1 minutę, a następnie szybko połącz ze sobą i umieść na noc w piekarniku o temperaturze 80 °C, aby zabezpieczyć połączenie.
      UWAGA: Podczas klejenia konieczne jest wywieranie łagodnego nacisku na krawędzie kanałów PDMS, aby zapewnić dobre uszczelnienie między PDMS a szkłem, jednocześnie unikając samego kanału, aby zapobiec zapadnięciu się kanału.
3. Przygotowanie urządzenia
   1. Zanurz połączone urządzenia PDMS w wodzie dejonizowanej (DI H₂O) i autoklaw w cyklu cieczy. Następnie odessać ciecz z urządzeń i ponownie autoklawować w cyklu grawitacyjnym. Następnie odwadniaj wysterylizowane urządzenia przez noc w temperaturze 80 °C.

2. Hodowla komórek macierzystych (przybliżony czas trwania: 1-2 miesiące)

1. Hodowla i utrzymanie hiPSC
   UWAGA: Wirusy hiPSC muszą być hodowane przez trzy kolejne pasaże po rozmrożeniu in vitro przed kriokonserwacją lub różnicowaniem. hiPSC są hodowane w pożywce E8 lub mTeSR1, w zależności od linii komórkowej, na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej²⁴.
   1. Aby pokryć płytki matrycą membrany podstawnej o jakości hESC, należy rozmrozić jedną podwielokrotność podłoża matrycowego (objętość zależna od partii, zwykle 200-300 μL; przechowywana w temperaturze -80 °C), dodając ją do 25 ml DMEM/F-12K na lodzie. Dozować 1 ml tej zawiesiny do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Pozostawić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę.
   2. Po rozmrożeniu zmodyfikuj pożywkę E8 pod kątem hodowli hiPSC, dodając 5 μM klasy Y-2763225 (E8+RI). Używaj tego nośnika przez 24 godziny, a następnie zmień nośnik na nowy E8.
      UWAGA: W przypadku rutynowych zmian pożywki do hodowli hiPSC używa się niezmodyfikowanej pożywki E8. W przypadku regularnej konserwacji media E8 należy wymieniać codziennie, około 24 godziny po poprzedniej wymianie nośnika.
   3. Komórki pasażujące w dniu 3 lub 4 odessać pożywkę, a następnie przemyć każdą studzienkę 1 ml roztworu buforowanego fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco.
      UWAGA: Upewnij się, że komórki są w około 70% zlewające się. Nie pozwól im urosnąć powyżej 70% zbieżności.
   4. Odessać DPBS, a następnie dodać 1 ml 0,5 mM EDTA do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 6-7 minut.
   5. Ostrożnie odessać EDTA, dodać 1 ml E8 + RI do każdej studzienki i wydmuchać powierzchnię pipetą o pojemności 1 ml (~ 5-10 razy, aby zebrać wszystkie komórki). Zawiesinę komórkową zebrać do probówki mikrowirówkowej o pojemności 15 ml.
   6. Policz zawiesinę i pasaż komórek przy żądanej gęstości komórek (tj. ~ 200 K na studzienkę) w E8 + RI.
   7. Zmień nośnik na E8 (bez RI) 24 godziny po. Nie pozostawiaj komórek z RI na dłużej niż 24 godziny < br /> UWAGA: E8 nie powinien być podgrzewany do 37 °C. Zawsze pozostawiaj go w temperaturze pokojowej do ogrzania przed hodowlą komórkową.
2. Różnicowanie ukierunkowane na kardiomiocyty (CM
   UWAGA: Ważne jest, aby zwrócić uwagę na istnienie niejednorodności między różnymi liniami hiPSCs^26,27, więc poniższe kroki mogą wymagać optymalizacji dla każdej linii komórkowej. Wykonaj poniższe czynności, aby zróżnicować CM.
   1. Przygotuj RPMI + B27 - insulinę, dodając 10 ml witaminy B27 bez insuliny i 5 ml penicyliny/streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec) do 500 ml RPMI 1640.
   2. Przygotuj insulinę RPMI + B27 +, dodając 10 ml witaminy B27 i 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca do 500 ml roztworu RPMI 1640.
   3. Przygotuj RPMI minus glukoza + B27 + insulina, dodając 10 ml witaminy B27, 5 ml wstrzykiwacza/paciorkowca i 4 mM mleczanu sodu do 500 ml RPMI 1640 bez glukozy.
   4. Gdy hiPSC osiągną 85% konfluencji, rozpocznij różnicowanie (Dzień 0), zastępując starą pożywkę 4 ml RPMI + B27 - pożywki insulinowej zawierającej 10 μM CHIR99021 do każdej studzienki 6-dołkowej płytki (tj. dodaj 25 μL 10 mM CHIR99021 do 25 ml RPMI + B27 - insuliny, a następnie natychmiast dodaj 4 ml na studzienkę).
      UWAGA: CHIR99021 jest inhibitorem GSK i prowadzi do aktywacji Wnt. Optymalne stężenie CHIR99021 i początkowa konfluencja różnią się dla każdej linii komórkowej²⁸. Zawsze sprawdzaj gradient stężenia 6-12 μM CHIR99021 i serię gęstości wysiewu przed właściwym eksperymentem, aby określić optymalne warunki do rozpoczęcia różnicowania.
   5. Dokładnie 24 godziny później (Dzień 1) odessać pożywkę i zastąpić 5 ml podgrzanej RPMI + B27 - insuliny do każdego dołka.
   6. Dokładnie 72 godziny po CHIR99021 dodaniu (Dzień 3) zebrać 2,5 ml zużytego podłoża z każdej studzienki płytki 6-dołkowej, co daje w sumie 15 ml zużytego podłoża w probówce.
   7. Do tego dodaj 15 ml świeżego RPMI + B27 - pożywki insulinowej. Dodać IWP2 do stężenia 5 μM do probówki z pożywką (tj. 1 μl IWP2 w stężeniu 5 mM na 1 ml połączonego podłoża lub 30 μl IWP2 do 30 ml pożywki ogółem).
   8. Usuń ~1,5 ml pozostałej pożywki na dołek płytki, tak aby pozostał 1 ml pożywki. Energicznie obracaj płytką, aby zapewnić odpowiednie usunięcie resztek komórek. Następnie odessać resztę starej pożywki i dodać 5 ml połączonej pożywki zawierającej IWP2 na dołek płytki.
      UWAGA: Dodanie IWP2 do komórek prowadzi do zahamowania Wnt.
   9. W dniu 5 odessać pożywkę z każdej studzienki i zastąpić ją 5 ml podgrzanej RPMI + B27 - insuliny.
   10. Dojrzewanie CM: W dniu 7, dniu 9 i dniu 11 odessać pożywkę z każdej studzienki i zastąpić ją 5 ml podgrzanej RPMI + B27 + insuliny. W tych dniach należy zaobserwować spontaniczne bicie.
   11. Oczyszczanie CM: W dniu 13 i dniu 16 rozpocznij głód glukozy, odsysając pożywkę z każdej studzienki, myjąc każdą studzienkę 1 ml 1x DPBS, a następnie dodając 5 ml podgrzanego RPMI minus glukoza + B27 + insulina, uzupełnionego 4 mM mleczanu sodu.
   12. W dniu 19 odessać zużytą pożywkę i zastąpić ją 5 ml wstępnie podgrzanej insuliny RPMI + B27 + do każdej studzienki, aby umożliwić regenerację komórek po oczyszczeniu.
   13. W dniu 21 należy ponownie umieścić komórki na płytkach, postępując zgodnie z opisanym poniżej protokołem dysocjacji CM (krok 3.3). Staraj się płytkować 1,5-2 x 10⁶ komórek na dołek w płytce 6-dołkowej. Na przykład, jeśli jest to wysoce wydajne różnicowanie, generalnie rozszerzenie 6 dołków do 9 dołków jest dobre.
   14. Od 21 dnia odsysaj pożywkę z każdej studzienki i zastępuj ją 4 ml RPMI + B27 + insuliny co 2-3 dni.
       UWAGA: hiPSC-CM są gotowe do użytku eksperymentalnego po 23 dniu.

3. Tworzenie 3D tkanki serca w urządzeniu mikroprzepływowym: (Przybliżony czas trwania: 2-3 godziny)

1. Posiew wirusa hCF
   1. Hodowla ludzkich komorowych fibroblastów serca (hCF; uzyskanych komercyjnie z Lonza) w kolbach T75 (przy 250 tys. komórek na kolbę) w pożywce Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Zmieniaj pożywkę co drugi dzień i przechodź, gdy jest w 70% zlewanym. Użyj hCF przed pasażem 10, ponieważ mogą zacząć różnicować się do miofibroblastów przy wysokich pasażach²⁹.
2. Dysocjacja hCF
   1. Aby oddzielić hCF, należy najpierw wyjąć kolbę z inkubatora. Umieścić kolbę w komorze bezpieczeństwa biologicznego i rozpocząć zasysanie zużytej pożywki z kolby. Następnie umyć kolbę T75 3 ml 1x DPBS. Zamknąć nakrętkę i zakręcić kolbą.
   2. Zassać DPBS. Weź 3 ml podgrzanego 1x Trypsin-EDTA (0,05%) i dodaj go do kolby. Przechylić kolbę i zakręcić, aby pokryć dno. Pozostawić w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 4-6 minut, sprawdzając kolbę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki się odłączają, o czym świadczy okrągły kształt komórek i pływające komórki. Jeśli nie, umieść kolbę z powrotem w inkubatorze na kolejną minutę.
   3. Zneutralizować działanie trypsyny, dodając 3 ml podgrzanego FGM3 do kolby. Następnie należy pipetować roztwór w górę i w dół do dna kolby, aby usunąć CFs.
   4. Zawiesinę komórkową zebrać do probówki mikrowirówkowej o pojemności 15 ml. Weź 10 μl zawiesiny komórek i dozuj ją do hemocytometru, aby policzyć komórki pod mikroskopem.
   5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 4 minuty. Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
   6. Ponownie zawiesić osad w świeżym FGM3, aby uzyskać pożądane 75 x 10⁶ komórek/ml. Albo pasuj porcję (250 tys. komórek na kolbę T75), albo postępuj zgodnie z poniższym protokołem, aby wygenerować tkankę serca 3D.
3. Dysocjacja CM
   UWAGA: Po różnicowaniu i oczyszczeniu należy przygotować CM do użycia w iniekcji do urządzeń mikroprzepływowych.
   1. Wyjmij płytkę CM z inkubatora i odessaj pożywkę. Następnie umyj studzienki 1 ml 1x DPBS na dołek 6-dołkowej płytki. Weź 6 ml DPBS i odpipetuj 1 ml na studzienkę.
   2. Zassać DPBS, uważając, aby nie naruszyć komórek przymocowanych do płytki. Pobrać pipetą 6 ml roztworu do oddzielania ciepłych komórek (np. TrypLE express) i dodać 1 ml do dołka. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 10 minut.
   3. Zneutralizować enzym równą objętością insuliny RPMI + B27+ (tj. 1 ml na studzienkę) i mechanicznie dysocjować komórki, pipetując w górę iw dół do naczynia hodowlanego za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
   4. Zbierz CM w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 3 min.
   5. Odessać supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml RPMI + B27 + insuliny. Pipetować roztwór w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i dozować ją do hemocytometru, aby określić całkowitą liczbę komórek.
   6. Ponownie odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty (aby zapewnić całkowite usunięcie TrypLE) i odessać supernatant. Następnie dodaj odpowiednią objętość RPMI + B27 + insuliny, aby uzyskać 75 x 10⁶ komórek/mL.
      UWAGA: Jeśli różnicowanie/selekcja serca nie powoduje wysokiego CM% (tj. >80%), czego dowodzi barwienie immunologiczne lub cytometria przepływowa dla białek specyficznych dla CM, takich jak cTnT, nie należy traktować komórek jako odpowiednich do tworzenia tkanki. Proces różnicowania powinien być zoptymalizowany, gdy odbywa się to poprzez dostosowanie stężeń CHIR99021 i początkowej gęstości początkowej. Jeśli oczyszczanie CM wymaga poprawy, można zastosować inne metody, takie jak sortowanie CM za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) lub sortowania komórek aktywowanego magnetycznie (MACS)^30,31,32.
4. Preparat kolagenowy
   UWAGA: Przygotuj kolagen z wysokiego stężenia zapasu kolagenu (w zakresie 8-11 mg/ml). Kolagen użyty do stworzenia mieszaniny komórka: hydrożel ma moc 6 mg/ml, a końcowe stężenie wynosi 2 mg/ml. W zależności od liczby urządzeń do wstrzyknięcia, objętość roztworu kolagenu, który ma zostać wykonany, musi zostać ponownie obliczona.
   1. Przechowywać wszystkie wymagane odczynniki na lodzie w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Kolagen jest hydrożelem termoresponsywnym. Dlatego temperatura musi pozostać niska, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.
   2. Weź 75 μl kolagenu wyjściowego (8 mg/ml) i dozuj go do probówki mikrowirówkowej na lodzie. Roztwór kolagenu jest bardzo lepki, dlatego powoli odsysaj go pipetą.
   3. Weź 13,85 μl pożywki (tj. RPMI + B27 + insulina) i dozuj ją do tej samej probówki.
   4. Następnie weź 10 μl czerwieni fenolowej i dodaj do mieszaniny i ponownie zawieś.
   5. Na koniec weź 1,15 μl 1N NaOH i dodaj do zawiesiny.
   6. Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl zawiesić zawiesinę.
      UWAGA: Kolagen wyjściowy ma kwaśne pH, co wymaga dodania NaOH w celu zneutralizowania przed użyciem go do kapsułkowania komórek serca. Czerwień fenolowa działa jako wskaźnik pH; dlatego dodaj to przed dodaniem NaOH. W tym momencie roztwór kolagenu będzie żółty, co oznacza jego kwasowość. Po dodaniu NaOH roztwór powinien zmienić kolor na pomarańczowy do jasnoróżowego, wskazując na jego neutralizację.
5. Mieszanina hydrożelowa i przygotowanie komórek
   UWAGA: Na tym etapie odbywa się enkapsulacja komórek w hydrożelu na bazie kolagenu. Komórki, jak również wszystkie prekursory hydrożelu, należy umieścić na lodzie podczas kolejnych kroków.
   1. W tym momencie, jeśli CF nie zostały jeszcze wytrypsynizowane, należy przechowywać zawiesinę CM w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, z odkręconą pokrywą, aby umożliwić przepływ gazu, w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Równolegle zdysocjuj CF i zbierz w gęstości 75 x 10⁶ komórek/ml w celu załadowania urządzenia.
   2. Wymieszaj zawieszone CM z CF w stosunku 4:1. Pobrać porcję 8 μl CM i dodać do świeżej probówki wirówkowej na lodzie. Następnie weź 2 μl CF i dodaj do zawiesiny komórek w probówce wirówkowej.
   3. Zawiesić zawiesinę komórkową, pobrać 5,6 μl zawiesiny komórek i umieścić ją w świeżej probówce do mikrowirówki.
   4. Weź 4 μl kolagenu przygotowanego w powyższych krokach i dodaj do mieszanki 4:1 CM:CF. Dodać 2,4 μl matrycy błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu (GFR), uzyskując końcową gęstość komórek jako 35 x 10⁶ komórek/ml do wstrzykiwania urządzenia. Pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby upewnić się, że zawiesina komórek jest jednorodna.
6. Wkładanie urządzenia
   UWAGA: Po przygotowaniu mieszaniny komórka-hydrożel należy ją włożyć do urządzeń.
   1. Wyjąć autoklawizowane urządzenia mikroprzepływowe z pieca o temperaturze 80 °C i umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego na co najmniej 1 godzinę przed włożeniem zawiesiny komórek, aby umożliwić ostygnięcie urządzeń do temperatury pokojowej przy zachowaniu sterylności.
   2. Umieść urządzenia na szalkach Petriego o wymiarach 60 x 15 mm, po 3-4 urządzenia na szalkę. Wypełnij szalkę Petriego o wymiarach 150 x 15 mm cienką warstwą DI_{H 2}O, aby pomieścić 3 szalki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm. Ten krok tworzy nawilżone środowisko otaczające urządzenia mikroprzepływowe.
   3. Użyj nowej końcówki i dokładnie zawieś mieszaninę komórka-hydrożel, pipetując zawiesinę, podczas gdy probówka pozostaje na lodzie.
   4. Włóż końcówkę do portu iniekcyjnego urządzenia i powoli i równomiernie wstrzyknij 3 μl zawiesiny komórka:hydrożel do wlotu tkanki urządzenia mikroprzepływowego za pomocą końcówki do pipety o pojemności 20 μl. Po napełnieniu portu należy przerwać wstrzykiwanie i zdjąć końcówkę. Powtórzyć te czynności dla wszystkich urządzeń lub całej przygotowanej zawiesiny hydrożelowej.
      UWAGA: Mała objętość zawiesiny komórka:hydrożel bardzo szybko się nagrzewa/ochładza, dlatego ważne jest, aby zawiesina była utrzymywana na lodzie tak długo, jak to możliwe. Podczas wkładania należy odpipetować roztwór z lodu i włożyć do urządzeń tak szybko, jak to możliwe, ponieważ hydrożel może zacząć polimeryzować w końcówce pipety. Ważne jest, aby jednorazowo tworzyć małe objętości zawiesiny komórka:hydrożel, więc jeśli ma być wstrzykiwanych wiele urządzeń, zawiesina komórka:hydrożel będzie musiała być świeża dla każdego zestawu 4 urządzeń.
   5. Odwróć urządzenia na szalkach Petriego za pomocą pęsety i umieść je w dużej szalce Petriego z wodą. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 9 minut w celu polimeryzacji hydrożelowej.
   6. Wyjąć urządzenia z inkubatora, obrócić je do pozycji pionowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 9 minut, aby zakończyć polimeryzację hydrożelową.
   7. Wstrzyknąć RPMI + B27 + insulinę do bocznych kanałów pożywki (~20 μL na urządzenie). Umieścić urządzenia z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Codziennie zmieniaj pożywkę w kanałach pożywki ze świeżym RPMI + B27 + insuliną. Wykazano, że urządzenia są hodowane od 14 do 21 dni²⁰.
      UWAGA: Ze względu na małą objętość mediów na chip, aby zapobiec parowaniu mediów, ważne jest, aby utrzymywać urządzenia w dużej szalce Petriego wypełnionej DI_{H 2}O, która służy jako nawilżona komora. Dodatkowo, małe kropelki nadmiaru insuliny RPMI + B27 + mogą być pipetowane na górze wlotów/wylotów kanałów podczas rutynowej wymiany pożywki.

4. Analiza tkanek

1. Obrazowanie na żywo
   UWAGA: Wszystkie obrazowania na żywo powinny być wykonywane w inkubatorze stopniowym, aby utrzymać 37 °C i 5% CO_{2 .}
   1. Umieść urządzenia w inkubatorze ze stopniami kontrolowanymi przez środowisko. Nagrywaj filmy 30 s z wielu miejsc w każdym urządzeniu z maksymalną liczbą klatek na sekundę.
   2. Aby ocenić kurczliwość tkanek po wyodrębnieniu sygnałów dudnień, użyj dodatkowego, niestandardowego kodu MATLAB do wyodrębnienia pików (plik uzupełniający 2) w celu obliczenia zmienności interwałów między uderzeniami.
   3. Zmień pożywkę w urządzeniach w kapturze do hodowli komórkowych, a następnie umieść z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.
2. Barwienie immunofluorescencyjne
   1. Przygotuj PBS-glicynę: Rozpuść 100 mM glicyny w PBS i dodaj 0,02% NaN₃ do długotrwałego przechowywania. Dostosuj pH do 7,4.
   2. Przygotuj PBS-Tween-20: Dodaj 0,05% Tween-20 do PBS i dodaj 0,02% NaN₃ do długotrwałego przechowywania. Dostosuj pH do 7,4.
   3. Przygotuj bufor IF: Dodaj 0,2% Triton X-100, 0,1% BSA i 0,05% Tween-20 do PBS i dodaj 0,02% NaN₃ do długotrwałego przechowywania. Dostosuj pH do 7,4.
   4. Przygotuj 10% surowicę kozią: Ponownie zawiesić liofilizowaną surowicę kozią w 2 ml PBS, aby uzyskać 100% surowicę kozią. Następnie rozcieńczyć 2 ml 18 ml PBS, aby uzyskać 10% koziej surowicy.
   5. Utrwalić próbki, dodając 4% paraformaldehydu (PFA) do kanałów tkankowych i inkubując w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
   6. Umyj komórki, dodając PBS-glicynę do kanałów tkankowych 2x przez 10 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.
   7. Umyj komórki, dodając PBS -Tween-20 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Przepuszczalność komórek poprzez dodanie buforu IF do kanałów tkankowych przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   9. Zablokuj komórki, dodając 10% roztwór surowicy koziej do kanałów tkankowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   10. Rozcieńczyć niesprzężone przeciwciała pierwszorzędowe w 10% surowicy koziej w pożądanych stężeniach (patrz Plik Uzupełniający 3), dodać do kanałów tkankowych i inkubować próbki w temperaturze 4 °C przez noc.
   11. Następnego dnia umyj próbki, dodając PBS-Tween-20 do kanałów tkankowych 3x po 20 minut w temperaturze pokojowej.
       UWAGA: Począwszy od kroku 4.2.12, wszystkie zadania należy wykonywać w ciemności, aby próbki były chronione przed światłem.
   12. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w PBS-Tween-20 w pożądanych stężeniach, odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut, aby zebrać osady, a następnie dodać do kanałów tkankowych.
   13. Po 30 minutach-1 godzinach przemyć próbki PBS-Tween-20 3x przez 10 minut każda w temperaturze pokojowej.
   14. Dodaj środek zapobiegający blaknięciu lub pożądany środek montażowy do kanałów tkankowych. Następnie próbki można obrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub mikroskopu konfokalnego, jeśli pożądane jest większe powiększenie. Aby zobrazować całą tkankę 3D, obrazy w różnych płaszczyznach Z można układać w stosy i rekonstruować w celu utworzenia reprezentatywnych obrazów 3D.

Aby uzyskać wysoce oczyszczoną populację CM z hiPSC, używana jest zmodyfikowana wersja obejmująca kombinację protokołu różnicowania Lian33 i etapy oczyszczania Tohyama34 (patrz Rysunek 1A dla osi czasu eksperymentu). HiPSC muszą być podobne do kolonii, ~ 85% zlewające się i równomiernie rozmieszczone w kulturze dobrze 3-4 dni po pasażu, na początku różnicowania CM (Rysunek 1B). W szczególności w dniu 0 kolonie hiPSC powinny mieć wysoką ekspresję czynników transkrypcyjnych pluripotencji, w tym SOX2 i Nanog (Figura 1C). W oparciu o ten protokół, dowody na udany proces różnicowania i oczyszczania komórek macierzystych są pokazane w Rysunek 1D, z gęstymi koloniami CM eksprymujących sarkomeryczne α-aktyninę, z minimalną ilością otaczających nie-CM. Dodatkowo, hCF muszą utrzymywać morfologię fibroblastów z wysoką ekspresją wimentyny (Rysunek 1E), więc należy je stosować przed P10, ponieważ mogą zacząć różnicować się do miofibroblastów w wyższych pasażach29.

Aby utrzymać solidny charakter tego protokołu, istotne jest wdrożenie ponownego powlekania hiPSC-CMs po oczyszczeniu metabolicznym. Ze względu na obecność martwych komórek i zanieczyszczeń, które powstają w wyniku głodu glukozy, CM potrzebują dalszego etapu oczyszczania, aby zmaksymalizować czystość i zdrowie CM przed użyciem w eksperymencie; dlatego stosuje się ponowne powlekanie, ponieważ pomaga poluzować zanieczyszczenia / martwe ciała inne niż CM (rysunki 2A-B, filmy 1-2). Film 1 przedstawia przykładową populację CM przed ponownym posiewem, prezentującą wysoką czystość CM w wielu warstwach, jednak z dużą ilością zanieczyszczeń obecnych na komórkach i unoszących się w pożywce dzięki wdrożonemu oczyszczaniu. W związku z tym, film 2 pokazuje tę samą populację CM bezpośrednio po ponownym posianiu, prezentując CM w monowarstwie ze znacznie mniejszą ilością zanieczyszczeń, demonstrując efekty trawienia tkanek i dysocjacji pojedynczych komórek, które zachodzą podczas ponownego posiewu.

Po włożeniu hydrożelu osadzonego w komórce do urządzenia mikroprzepływowego (tj. chipa; wstawka obrazu w Rysunek 3), komórki są gęste i równomiernie rozmieszczone w słupkach. Komórki zaczynają się rozprzestrzeniać w dniu 1 (Rysunek 3A), a następnie w dniu 7 wznawiają bicie i stają się bardziej synchroniczne w swoich wzorcach skurczu (Rysunek 3B). Dodatkowo tkanki 3D kondensują się wokół słupków, tworząc powtarzające się eliptyczne pory, a komórki wydłużają się. Do 14 dnia dojrzałe tkanki wykazują wysoki stopień anizotropii (tj. organizacji kierunkowej), składającej się z komórek o wydłużonym kształcie (ryc. 3C, 4A), prążkowanych, wyrównanych sarkomerów i zlokalizowanych połączeń szczelinowych ( Figura 4B). Co więcej, spontaniczne wzorce kurczliwości tych tkanek są wysoce synchroniczne (Rysunek 4C, Wideo 3) ze względu na wzajemnie połączoną, wyrównaną naturę komórek serca.

Rysunek 1: Schemat eksperymentalny i reprezentatywne obrazy morfologii komórkowej podczas przygotowań do wstrzyknięcia urządzenia: Schemat protokołu, opisujący kroki po wytworzeniu urządzenia mikroprzepływowego, od hodowli hiPSC do mikroprzepływowej tkanki serca (A). hiPSC powinny utrzymywać morfologię podobną do kolonii (B) i wysoką ekspresję markerów pluripotencji (SOX2, zielony; Nanog, czerwony) (C) na początku różnicowania. Po różnicowaniu hiPSC-CM powinny pojawić się obfite, gęste plamy CM, zabarwione sarkomeryczną alfa-aktyniną (SAA, kolor zielony), z minimalną ilością otaczających nie-CM, o czym świadczy barwienie wimentyną (vim, czerwony) (D). HCcuzkwiska powinny charakteryzować się wysokim poziomem ekspresji wimentyny i utrzymywać morfologię fibroblastów (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Populacje hiPSC-CM w późniejszych etapach różnicowania: Proces oczyszczania powoduje śmierć nie-CM, wytwarzając resztki w kulturze komórkowej, obecne przed ponownym posiewem CM (A). Po ponownym posadzeniu (B) szczątki i substancje niebędące CM są usuwane, co służy dalszemu oczyszczaniu populacji CM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Tworzenie tkanki 3D ludzkiego serca w urządzeniu mikroprzepływowym: Dzień po wstrzyknięciu do urządzenia (pokazane w lewym górnym wstawce, obok dziesięciocentówki US dla skali), komórki zaczną się rozprzestrzeniać i będą gęste i jednorodnie rozmieszczone w całym urządzeniu (A). Po tygodniu hodowli komórki wznowią spontaniczne bicie i utworzą skondensowane, wyrównane tkanki (B). Po dwóch tygodniach hodowli komórki tworzą skondensowane, wyrównane tkanki wokół eliptycznych słupków (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne cechy ludzkiej tkanki serca po hodowli przez 14 dni w urządzeniu mikroprzepływowym: Komórki utworzyły wydłużone, wysoce wyrównane tkanki, co zostało oznaczone przez barwienie aktyną (A). Sarkomery są równoległe i prążkowane, a także występuje lokalizacja połączeń szczelinowych, o czym świadczy barwienie odpowiednio sarkomerycznej α-aktyniny (SAA) i koneksyny 43 (CX43) (B). Skurcz spontaniczny jest synchroniczny (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Spontaniczne skurczenie się hiPSC-CMs w dniu 21 po oczyszczeniu mleczanu i przed ponownym posiewem Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Spontaniczne skurczenie się hiPSC-CM w dniu 23 po ponownym posiewie Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 3: Synchroniczny, spontaniczny skurcz ludzkiej tkanki serca w urządzeniu przez 14 dni Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Plik AutoCAD dla urządzenia z sercem na chipie Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Program MATLAB do wyodrębniania pików w celu określenia zmienności interwałów między uderzeniami na podstawie sygnałów dudnień Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Tabela pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.