Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62543

⸱

18 maja 2021

 , 
1Laboratorio de Hígado, Páncreas y Motilidad, Unidad de Medicina Experimental, Facultad de Medicina-UNAM, Hospital General de México “Dr. Eduardo Liceaga”

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół ma być narzędziem do badania stłuszczenia i molekularnych, biochemicznych, komórkowych zmian spowodowanych nadmierną ekspozycją hepatocytów na lipidy in vitro.

Streszczenie

Stłuszczeniowa choroba wątroby związana z dysfunkcją metaboliczną (MAFLD), wcześniej znana jako niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD), jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą wątroby na świecie ze względu na jej związek z otyłością, cukrzycą typu 2 i dyslipidemią. Stłuszczenie wątroby, czyli nagromadzenie kropelek lipidów w miąższu wątroby, jest kluczową cechą choroby poprzedzającej stan zapalny obserwowany w stłuszczeniowym zapaleniu wątroby, zwłóknieniu i schyłkowej niewydolności wątroby. Nagromadzenie lipidów w hepatocytach może zaburzać prawidłowy metabolizm ksenobiotyków i cząsteczek endogennych, a także indukować procesy komórkowe prowadzące do zaawansowania choroby. Chociaż eksperymentalne badanie stłuszczenia można przeprowadzić in vivo, podejścia in vitro do badania stłuszczenia są narzędziami uzupełniającymi o różnych zaletach. Hodowla hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów jest doskonałą, powtarzalną opcją do badania stłuszczenia wątroby, umożliwiając identyfikację procesów komórkowych związanych z akumulacją lipidów, takich jak stresy oksydacyjne i siatkowate, autofagia, proliferacja, śmierć komórki itp., a także inne testy, w tym skuteczność leków i testy toksykologiczne, wśród wielu innych możliwych zastosowań. W tym celu miało to na celu opisanie metodyki hodowli komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów. Komórki HepG2 hodowano w pożywce RMPI 1640 kondycjonowanej palmitynianem sodu i oleinianem sodu. Co ważne, stosunek tych dwóch lipidów ma kluczowe znaczenie dla akumulacji kropelek lipidów, przy jednoczesnym utrzymaniu proliferacji komórek i umiarkowanej śmiertelności, jak ma to miejsce w wątrobie podczas choroby. Przedstawiono metodologię od przygotowania roztworów lipidowych, mieszaniny, dodawania do pożywki i hodowli hepatocytów. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest zidentyfikowanie kropelek lipidów w hepatocytach, które można łatwo zaobserwować za pomocą barwienia czerwienią olejową O, a także krzywych współczynników proliferacji/śmiertelności.

Wprowadzenie

Stłuszczenie wątroby związane z dysfunkcją metaboliczną jest bardzo rozpowszechnione na całym świecie1,2; szacuje się, że dotyczy to do 25% populacji3. Choroba ta, znana wcześniej jako niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD), zaktualizowała swoją nomenklaturę do stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną (MAFLD), aby dokładnie odzwierciedlić patogenezę związaną z otyłością, insulinoopornością, cukrzycą typu 2 i dyslipidemią, a także możliwe sposoby postępowania w chorobie3,4.

Bez względu na nazwę, choroba obejmuje szerokie spektrum zmian histopatologicznych charakteryzujących się nienormalnie wysokim nagromadzeniem lipidów w wątrobie (>5% tłuszczu w hepatocytach5) i może postępować poprzez akumulację lipidów typowo występującą w prostym stłuszczeniu do stłuszczeniowego zapalenia wątroby, co z kolei może prowadzić do rozwoju zwłóknienia, marskości wątroby, Rak wątrobowokomórkowy i niewydolność wątroby5,6,7,8. Ze względu na rosnące rozpowszechnienie, oczekuje się, że MAFLD stanie się pierwszym wskazaniem przeszczepu wątroby i główną przyczyną raka wątrobowokomórkowego9.

Chociaż stłuszczenie wątroby zostało uznane za łagodną lub łagodną formę stłuszczenia wątroby, w rzeczywistości jest kluczem metabolicznym w MAFLD10. Akumulacja lipidów w wątrobie wpływa na różne szlaki metaboliczne, w tym między innymi na syntezę, eksport i metabolizm lipidów10. Insulinooporność, stres oksydacyjny, stres siatkowaty i dysfunkcja komórkowa są silnie związane z lipotoksycznością wątroby11,12. Z drugiej strony, hepatocyty tłuszczowe są celem reaktywnych form tlenu, powodując metabolity jako nadtlenki lipidów, karbonylki białkowe i addukty kwasów nukleinowych13. Na poziomie komórkowym hepatocyty tłuszczowe mogą ulegać uszkodzeniu mitochondriów14, cellular senescence15, apoptosis16, pyroptosis12 i autophagia17, między innymi.

Hepatocyty są wysoce odpowiedzialne za metabolizm, detoksykację i syntezę szerokiej gamy molekuł. Wiele z tych funkcji może być zagrożonych przez akumulację lipidów obserwowaną w stłuszczeniu. Dlatego tak ważne jest, aby dysponować powtarzalnymi narzędziami, które pozwalają na dokładną ocenę stłuszczenia. W tym sensie modele in vitro są łatwe do zastosowania i wysoce powtarzalne. Stłuszczenie in vitro było stosowane w różnych celach16,18,19. Komórki HepG2 są szeroko stosowane jako linia komórkowa hepatocytów. Ma zalety, takie jak łatwość uprawy i dobrze scharakteryzowana. Być może jedyną wadą komórek HepG2 jest fakt, że jest to rakotwórcza linia komórkowa, więc należy to wziąć pod uwagę podczas analizy wyników. Przedstawiono zastosowanie mieszaniny kwasów tłuszczowych szeroko stosowanych w hodowli komórkowych: kwasu palmitynowego (PA) i kwasu oleinowego (OA). Zarówno PA, jak i OA oferują różne wyniki w culture20. PA (C 16:0) jest najczęściej spotykanym nasyconym kwasem tłuszczowym otrzymywanym z diety16. PA jest uważany za biomarker lipogenezy de novo, kluczowy krok w rozwoju NAFLD21. Wykazano, że PA jest wysoce toksyczny22; W związku z tym może nie być zalecane wywoływanie stłuszczenia in vitro. OA (C 18:1) jest jednonienasyconym kwasem tłuszczowym. W przeciwieństwie do PA, sugeruje się, że choroba zwyrodnieniowa stawów ma właściwości przeciwzapalne i przeciwutleniające, będąc w stanie przeciwdziałać PA12. Zarówno PA, jak i OA są głównymi kwasami tłuszczowymi obecnymi w trójglicerydach, niezależnie od stanu zdrowia lub choroby16. Tabela 1 zawiera przykłady hodowli hepatocytów z PA, OA i ich mieszaniną, a także przedstawione wyniki12,23,24,25,26,27. Inne kwasy tłuszczowe były również używane w hodowli hepatocytów, w tym kwas stearynowy (C 18:0)28,29,30, kwas linolowy (C 18:1)28,30,31 i jego koniugaty (CLA)28,32, kwas palmitynowy (C 16:1)29. Jednak ich stosowanie jest najrzadziej opisywane w literaturze, być może dlatego, że ich liczebność w wątrobie jest niższa niż PA i OA16.

W połączeniu, oba kwasy tłuszczowe przypominają stłuszczenie in vitro, dostarczając proliferujących komórek, o zwiększonej śmierci komórek i niższej żywotności w porównaniu z warunkami kontrolnymi. Warto wspomnieć, że odpowiednie sole tych kwasów tłuszczowych są dostępne i mogą być również stosowane. Jednym z głównych problemów przy ocenie przeciążenia lipidami w hodowli komórek hepatocytów jest rozróżnienie między modelami toksykologicznymi a modelem, który najlepiej reprezentuje stłuszczenie. W pierwszym przypadku można uwzględnić wiele modeli. W rzeczywistości użycie samego PA może być brane pod uwagę wśród nich, a wysoka śmiertelność jest najbardziej widocznym wynikiem12,16,23,24,25,26,27. Stosowanie wysokich dawek nawet w przypadku choroby zwyrodnieniowej stawów można również uznać za model toksykologiczny. Przedstawiony tutaj protokół jest bardziej zgodny z rozwojem stłuszczenia, ponieważ wykazuje niską śmiertelność w porównaniu z obserwowaną w innych modelach i pozwala na jego przestrzeganie przez kilka dni z postępującą akumulacją lipidów, tak jak ma to miejsce w NAFLD. Za kolejną zaletę uważa się możliwość oceny łagodnego i ciężkiego stłuszczenia w warunkach eksperymentalnych.

Kwasy tłuszczoweWarunkiWynikiodniesienie
PAStężenie: 200 μMAkumulacja lipidówYan i inni, 201925.
Czas ekspozycji: 24 hUszkodzenie hepatocytów
Zwiększenie aktywności aminotransferaz
PAStężenie: 50, 100 i 200 μMNagromadzenie lipidówXing i inni, 201924.
Czas ekspozycji: 24 h
PAStężenie: 250 μM , 500 μM , 750 μM i 1,000 μMAkumulacja lipidówWang i inni, 202026.
Czas ekspozycji: 24 hPostępujące zmniejszanie żywotności komórek
Mieszanka OA/PAStężenie: 1 mMAkumulacja lipidówXiao i inni, 202027.
Czas ekspozycji: 24 hNie zgłasza lipotoksyczności
Oceń: 2OA:1PA
Mieszanka OA/PAPierwsza stymulacja 200 μM i 400 μM PA, a następnie druga stymulacja 200 μM OANagromadzenie lipidów. Zeng i inni, 202012.
Stężenie:400 μM PA: 200 μM OADowody na lipotoksyczność wywołaną przez PA zostały zmniejszone przez stymulację choroby zwyrodnieniowej stawów.
Oceń: 2PA:1OA
Czas ekspozycji: 24 h
Mieszanka OA/PAStężenie: 400 μM PA: 200 μM OAAkumulacja lipidówChen i inni, 201823.
Oceń: 2PA:1OA
Czas ekspozycji: 24 h
Mieszanka OA/PAStężenie :50 i 500 μMPowstawanie dwóch rodzajów stłuszczenia: łagodne stłuszczenie i
ciężkie stłuszczenie.		Campos i Guzmán 2021
Oceń: 2PA:1OASymuluje przewlekłe narażenie na przeciążenie lipidami
Czas ekspozycji: 24 godziny, 2 dni, 3 dni i 4 dni.

Tabela 1. Hodowla hepatocytów w warunkach stłuszczeniowych. W tabeli przedstawiono rodzaj użytego kwasu tłuszczowego, utrzymywane warunki oraz obserwowane wyniki w hodowli hepatocytów. PA: Kwas palmitynowy. OA: Kwas oleinowy.

Na koniec, ten model ma zastosowanie nie tylko do badania stłuszczenia i stłuszczenia wątroby, ale także do szlaków metabolicznych, syntetycznych i detoksykacyjnych w wątrobie w kontekście stłuszczenia. Również stłuszczenie indukowane in vitro może dostarczyć dowodów na identyfikację potencjalnych markerów choroby, a także celów terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki standardowej i warunkowanej

  1. Aby przygotować standardowe medium RPMI 1640, uzupełnić pożywkę RPMI 1640 o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS, uprzednio inaktywowanej ciepłem) oraz 1% (v/v) roztworu penicyliny i streptomycyny. Pożywkę przechowywać w temperaturze 4 °C. Sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm.
  2. Aby przygotować roztwór zapasowy palmitynu, przygotować 50 mM roztwór palmitynu w standardowym medium RPMI 1640, uprzednio uzupełnionym o 1% albuminy surowicy bydlęcej (wolnej od lipidów). Wystarczająca będzie objętość 5-10 mL tego roztworu. Roztwór zapasowy sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, do 1 miesiąca.
  3. Aby przygotować roztwór zapasowy oleinianu, przygotować 50 mM roztwór oleinianu w standardowym medium RPMI 1640, uprzednio uzupełnionym o 1% albuminy surowicy bydlęcej (wolnej od lipidów). Wystarczająca będzie objętość 10 mL. Roztwór zapasowy sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem, do 1 miesiąca.
  4. Aby przygotować medium steatogenne z uprzednio przygotowanych roztworów zapasowych, przygotować medium steatogenne w proporcji 1 część palmitynu : 2 części oleinianu dla dwóch możliwych poziomów: stłuszczenia łagodnego i ciężkiego.
    1. Stłuszczenie łagodne: Przygotować 100 mL mieszaniny 1 część palmitynu : 2 części oleinianu (50 µM) w standardowym medium RPMI 1640. Sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
    2. Stłuszczenie ciężkie: Przygotować 100 mL mieszaniny 1 część palmitynu : 2 części oleinianu (500 µM) w standardowym medium RPMI 1640. Sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
    3. Alternatywna metoda przygotowania roztworów zapasowych.
      1. Przygotować oba roztwory zapasowe z odpowiednich kwasów tłuszczowych, wykorzystując albuminę wolną od lipidów, zgodnie z powyższymi instrukcjami.
      2. W przypadku braku albuminy wolnej od lipidów, należy użyć soli palmitynianu i oleinianu.
        1. Rozpuścić palmitynian lub oleinian w 2 mL bezwodnego etanolu, a następnie wymieszać do uzyskania końcowej objętości standardowego medium RPMI 1640 (5-10 mL). Oleinian rozpuszczać bezpośrednio poprzez mieszanie w standardowej pożywce RPMI 1640.
        2. Pozwolić na odparowanie etanolu, inkubując w kąpieli wodnej w temperaturze 70 °C; dokładnie wymieszać.
      3. W każdym przypadku oba roztwory zapasowe należy sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Roztwór zapasowy palmitynu przechowywać w temperaturze 4 °C, a roztwór zapasowy oleinianu w temperaturze -20 °C. Oba roztwory chronić przed światłem. Roztwory te są stabilne przez 1 miesiąc.

2. Przedhodowla

  1. Wysiać 100 000 komórek HepG2 na dołek w płytce 24-dołkowej. Dodać 1 mL standardowej pożywki RPMI 1640.
  2. Preinkubować w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 24 h, aby umożliwić adhezję komórek.

3. Hodowla steatogenna

  1. Po wstępnej hodowli usunąć standardową pożywkę RPMI 1640 i dodać odpowiednią pożywkę steatogenną.
  2. Co 24 h usuwać supernatant i dodawać świeżą pożywkę steatogenną.

4. Ocena żywotności i śmiertelności

  1. Wysiać 100 000 komórek HepG2 na dołek w płytce 24-dołkowej. Dodać 1 mL standardowego medium RPMI 1640.
  2. Preinkubować przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  3. Wymienić standardowe medium RPMI 1640 na medium steatogenne.
  4. Inkubować przez 24 h, 2 dni, 3 dni i 4 dni, odświeżając medium steatogenne co 24 h.
  5. Po odpowiednim czasie odpiąć nadosad.
  6. Odłączyć komórki z dołka, dodając 500 µL 0,05% Trypsyny-EDTA. Inkubować przez 5 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  7. Zebrać resuspendowane komórki do mikroprobówki.
  8. Wirować przy 300 x g i odpiąć nadosad.
  9. Dodać 200 µL standardowego RPMI 1640 i resuspendować komórki.
  10. Do nowej mikroprobówki dodać 15 µL 0,4% roztworu błękitu trypanu. Wymieszać z 15 µL poprzedniej zawiesiny komórek.
  11. Policzyć komórki zabarwione i niezabarwione za pomocą komory licznikowej (hemocytometru).
  12. Obliczyć odpowiednio wskaźniki żywotności i śmiertelności.
    Żywotność =
    Wzór na żywotność komórek; (Komórki żywe/Wszystkie komórki)x100; stosowany w eksperymentach biologicznych; równanie.
    Śmiertelność =
    Wzór na obliczanie żywotności komórek; równanie procentu śmierci komórek; analiza danych naukowych.

5. Barwienie lipidów metodą Oil-Red O

  1. Umieść szkiełko przykrywowe do hodowli komórkowych w każdym dołku płytki 24-dołkowej.
  2. Zasiać 100 000 komórek HepG2 na dołek. Dodać 1 mL standardowego medium RPMI 1640.
  3. Preinkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h.
  4. Wymienić standardowe medium RPMI 1640 na medium steatogenne.
  5. Inkubować przez 24 h, 2 dni, 3 dni i 4 dni, odświeżając medium steatogenne co 24 h.
  6. Po odpowiednim czasie usunąć nadsącz.
  7. Przemyć 1 mL solą fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Usunąć nadsącz.
  8. Utrwalić 1 mL 4% paraformaldehydu w PBS.
  9. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  10. Usunąć nadmiar paraformaldehydu.
  11. Przepłukać komórki 1 mL wody destylowanej.
  12. Dodać 1 mL 70% izopropanolu i inkubować przez 5 min.
  13. Usunąć nadmiar izopropanolu. Na tym etapie płukanie w PBS nie jest wymagane.
  14. Dodać 1 mL roztworu Oil-red O i inkubować przez 30 min.
  15. Usunąć nadmiar roztworu Oil-red O.
  16. Przepłukać 1 mL wody destylowanej.
  17. Dodać 500 µL roztworu hematoksyliny. Inkubować przez 3 min.
  18. Usunąć nadmiar roztworu hematoksyliny.
  19. Przepłukać 1 mL wody destylowanej.
  20. Obserwować pod mikroskopem przy powiększeniu 400x (obiektyw 40x, okular 10x).

6. Ocena morfometryczna zawartości lipidów

  1. Losowo wybierz i wykonaj zdjęcia 10 pól widzenia z całego obszaru studzienki. Powtórz tę procedurę dla każdej studzienki.
  2. Oceń procent powierzchni zabarwionej na czerwono, korzystając z narzędzia Color Threshold w oprogramowaniu ImageJ zgodnie z opisem Ferreira i Rasband33.
  3. Porównaj obszar zabarwiony z całkowitą powierzchnią pola widzenia, korzystając z narzędzia Analyze Particles w oprogramowaniu ImageJ zgodnie z opisem Ferreira i Rasband33.
  4. Oblicz średni procent dla każdej studzienki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hepatocyty hodowane w medium steatogennym wykazują wzrost na całej powierzchni dołka; jednakże hepatocyty stłuszczone wykazują niższy tempo wzrostu w porównaniu z komórkami hodowanymi w medium kontrolnym. Zaproponowany stosunek i stężenie OA i PA gwarantują przeżywalność komórek podczas hodowli. Wysianie 1 x 105 komórek na dołek w płytkach 24-dołkowych zapewnia optymalną konfluencję, co przedstawiono na Rysunku 1.

Żywotność hodowanych komórek była niższ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten ma na celu zapewnienie strategii badania stłuszczenia in vitro. Hodowla komórkowa jest potężnym narzędziem do badania komórkowych, molekularnych, biochemicznych i toksykologicznych aspektów komórek narażonych na różne warunki. Dzięki takiemu podejściu stłuszczenie można uwidocznić nie tylko jako etap złożonej choroby, jaką jest MAFLD, ale także jako nadmierną ekspozycję hepatocytów na lipidy i możliwe wyniki wynikające z takiej ekspozycji. Dlatego jego zastosowanie nie ogranicza się do fizjopatologi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos jest doktorantką w Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, a jej wsparcie otrzymał Conacyt (CVU: 1002502).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoESCO AirstreamAC2-452+C2:C26Klasa II  Wpisz A2  Szafa bezpieczeństwa biologicznego
Filtr górny do butelkiCorning, USA430513  Nie pirogenny, polistyrenowy, sterylny. 1 filtr/worek. 0,22 &m; m, 500 ml.
Surowica bydlęca albimun (BSA)Gold Biotechnology, USA-421-10BSA Bez kwasów tłuszczowych do hodowli komórkowych
Pożywki hodowlane RPMI 1640ThermoFisher-Gibco, US31800-022-Płodowa
surowica bydlęca (FBS)ThermoFisher-Gibco, US
A4766801-HemocytometrMarienfeld, DE640010-HepG2
linia komórkowaATCC, USHB-8065Rak wątrobowokomórkowy komórki ludzkie.
Nawilżany inkubatorThermo Electronic Corporation, model amerykański: 3110Temperatura (37 & stopnie; C ± 1 &stopnie; C), wilgotność (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Mikroskop odwrócony EclipseNIKON, JPNModel: TE2000-S-Isopropanol
Sigma-Aldrich, USI9030-4L-Oil
Red O KitAbcam, USab150678Zestaw do histologicznej wizualizacji obojętnego tłuszczu.
ParaformaldehydSigma-Aldrich, USP6148-500G-penicylina
/streptomycynaThermoFisher-Gibco, US15140-122Antybiotyki 10 000 U/ml Penicylina, 10 000 μ pH-metr g / ml Streptomycyny
Beckman, model amerykański: 360 miernik PH / Temp / MV-
buforowana solą fizjologiczną z fosforanamiThermoFisher-Gibco, US10010-023-Pipety
serologiczneSarstedt, AUS86.1253.001  Niepirogenne, sterylne, 5 ml
pipety serologiczneSarstedt, AUS  86.1254.001  Niepirogenny, sterylny, 10 ml
wodorowęglanu soduSigma-Aldrich, USS5761-1KGPrzygotowanie pożywek
hodowlanych Oleinian soduSanta Cruz Biotechnology, USsc-215879A-Palmitynian
soduSanta Cruz Biotechnology, USsc-215881-Filtr
strzykawkowyCorning, USA431219  Niepirogenny, sterylny, 28 mm, 0,2 μm.
Trypan BlueSigma-Aldrich, UST6146-25G-Trypsyna
0,05% / EDTA 0,53 mMCorning, US25-052-Cl-24
studzienkowy klaster hodowli komórkowychCorning, US3524Płaskie dno z pokrywką. Hodowla tkankowa poddana obróbce. Niepirogenne, polistyrenowe, sterylne. 1/opakowanie.
96-dołkowy klaster hodowli komórkowychCorning, US3599Płaskie dno z pokrywką. Hodowla tkankowa poddana obróbce. Niepirogenne, polistyrenowe, sterylne. 1/opakowanie.

Bibliografia

  1. Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
  2. Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).
  3. Eslam, M., et al. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement. Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).
  4. Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease. Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).
  5. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  6. Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. The natural course of non-alcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774(2016).
  7. Reccia, I., et al. Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease. Metabolism. 72, 94-108 (2017).
  8. Tomita, K., et al. Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).
  9. Byrne, C. D., Targher, G. Nafld: A multisystem disease. Journal of Hepatology. 62, 1 Suppl 47-64 (2015).
  10. Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).
  11. Diehl, A. M., Day, C. Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
  12. Zeng, X., et al. Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis. Nutrition and Metabolism. 17, London. 11(2020).
  13. Ore, A., Akinloye, O. A. Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease. Medicina (Kaunas). 55 (2), 26(2019).
  14. Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).
  15. Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).
  16. Gomez, M. J., et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis. Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).
  17. Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).
  18. Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. In vitro cell culture models of hepatic steatosis. Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).
  19. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  20. Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
  21. Lee, Y., et al. Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119(2020).
  22. Alnahdi, A., John, A., Raza, H. Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid. Nutrients. 11 (9), 1979(2019).
  23. Chen, X., et al. Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis. Life Sciences. 203, 291-304 (2018).
  24. Xing, J. H., et al. NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction. Life Sciences. 239, 116882(2019).
  25. Yan, H., et al. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).
  26. Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells. Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).
  27. Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease. Life Sciences. 256, 117997(2020).
  28. Avila, G., et al. In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes. Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).
  29. Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).
  30. Oh, J. M., et al. Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells. Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).
  31. Stellavato, A., et al. In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model. Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24(2018).
  32. Pachikian, B. D., et al. Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis. PLoS One. 13 (2), 0192447(2018).
  33. Ferreira, T., Rasband, W. Analyze. ImageJ User Guide. , Ch. 30 132-135 (2012).
  34. Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology. , 404(2020).
  35. Geng, Y., et al. Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621(2020).
  36. Sarnyai, F., et al. Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626(2020).
  37. Chen, J. W., et al. Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).
  38. Burhans, M. S., et al. Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation. Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).
  39. Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease. Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).
  40. Nagarajan, S. R., et al. Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).
  41. Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Stłuszczenie wątrobybarwienie Oil Red Okomórki HepG2pożywka steatogennamieszanina palmitanu i oleinianutest żywotności komórekwewnątrzkomórkowe kropelki lipidoweanaliza w programie ImageJ
Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.