Ten protokół ma być narzędziem do badania stłuszczenia i molekularnych, biochemicznych, komórkowych zmian spowodowanych nadmierną ekspozycją hepatocytów na lipidy in vitro.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stłuszczeniowa choroba wątroby związana z dysfunkcją metaboliczną (MAFLD), wcześniej znana jako niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD), jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą wątroby na świecie ze względu na jej związek z otyłością, cukrzycą typu 2 i dyslipidemią. Stłuszczenie wątroby, czyli nagromadzenie kropelek lipidów w miąższu wątroby, jest kluczową cechą choroby poprzedzającej stan zapalny obserwowany w stłuszczeniowym zapaleniu wątroby, zwłóknieniu i schyłkowej niewydolności wątroby. Nagromadzenie lipidów w hepatocytach może zaburzać prawidłowy metabolizm ksenobiotyków i cząsteczek endogennych, a także indukować procesy komórkowe prowadzące do zaawansowania choroby. Chociaż eksperymentalne badanie stłuszczenia można przeprowadzić in vivo, podejścia in vitro do badania stłuszczenia są narzędziami uzupełniającymi o różnych zaletach. Hodowla hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów jest doskonałą, powtarzalną opcją do badania stłuszczenia wątroby, umożliwiając identyfikację procesów komórkowych związanych z akumulacją lipidów, takich jak stresy oksydacyjne i siatkowate, autofagia, proliferacja, śmierć komórki itp., a także inne testy, w tym skuteczność leków i testy toksykologiczne, wśród wielu innych możliwych zastosowań. W tym celu miało to na celu opisanie metodyki hodowli komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów. Komórki HepG2 hodowano w pożywce RMPI 1640 kondycjonowanej palmitynianem sodu i oleinianem sodu. Co ważne, stosunek tych dwóch lipidów ma kluczowe znaczenie dla akumulacji kropelek lipidów, przy jednoczesnym utrzymaniu proliferacji komórek i umiarkowanej śmiertelności, jak ma to miejsce w wątrobie podczas choroby. Przedstawiono metodologię od przygotowania roztworów lipidowych, mieszaniny, dodawania do pożywki i hodowli hepatocytów. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest zidentyfikowanie kropelek lipidów w hepatocytach, które można łatwo zaobserwować za pomocą barwienia czerwienią olejową O, a także krzywych współczynników proliferacji/śmiertelności.
Wprowadzenie
Stłuszczenie wątroby związane z dysfunkcją metaboliczną jest bardzo rozpowszechnione na całym świecie1,2; szacuje się, że dotyczy to do 25% populacji3. Choroba ta, znana wcześniej jako niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD), zaktualizowała swoją nomenklaturę do stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną (MAFLD), aby dokładnie odzwierciedlić patogenezę związaną z otyłością, insulinoopornością, cukrzycą typu 2 i dyslipidemią, a także możliwe sposoby postępowania w chorobie3,4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie pożywki standardowej i warunkowanej
- Aby przygotować standardowe medium RPMI 1640, uzupełnić pożywkę RPMI 1640 o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS, uprzednio inaktywowanej ciepłem) oraz 1% (v/v) roztworu penicyliny i streptomycyny. Pożywkę przechowywać w temperaturze 4 °C. Sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm.
- Aby przygotować roztwór zapasowy palmitynu, przygotować 50 mM roztwór palmitynu w standardowym medium RPMI 1640, uprzednio uzupełnionym o 1% albuminy surowicy bydlęcej (wolnej od lipidów). Wystarczająca będzie objętość 5-10 mL tego roztworu. Roztwór zapasowy sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Przechowywać w te....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Hepatocyty hodowane w medium steatogennym wykazują wzrost na całej powierzchni dołka; jednakże hepatocyty stłuszczone wykazują niższy tempo wzrostu w porównaniu z komórkami hodowanymi w medium kontrolnym. Zaproponowany stosunek i stężenie OA i PA gwarantują przeżywalność komórek podczas hodowli. Wysianie 1 x 105 komórek na dołek w płytkach 24-dołkowych zapewnia optymalną konfluencję, co przedstawiono na Rysunku 1.
Żywotność hodowanych komórek była niższ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten ma na celu zapewnienie strategii badania stłuszczenia in vitro. Hodowla komórkowa jest potężnym narzędziem do badania komórkowych, molekularnych, biochemicznych i toksykologicznych aspektów komórek narażonych na różne warunki. Dzięki takiemu podejściu stłuszczenie można uwidocznić nie tylko jako etap złożonej choroby, jaką jest MAFLD, ale także jako nadmierną ekspozycję hepatocytów na lipidy i możliwe wyniki wynikające z takiej ekspozycji. Dlatego jego zastosowanie nie ogranicza się do fizjopatologi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos jest doktorantką w Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, a jej wsparcie otrzymał Conacyt (CVU: 1002502).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Klasa II Wpisz A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznego |
| Filtr górny do butelki | Corning, USA | 430513 | Nie pirogenny, polistyrenowy, sterylny. 1 filtr/worek. 0,22 &m; m, 500 ml. |
| Surowica bydlęca albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Bez kwasów tłuszczowych do hodowli komórkowych |
| Pożywki hodowlane RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022-Płodowa | |
| surowica bydlęca (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | ||
| A4766801-Hemocytometr | Marienfeld, DE | 640010-HepG2 | |
| linia komórkowa | ATCC, US | HB-8065 | Rak wątrobowokomórkowy komórki ludzkie. |
| Nawilżany inkubator | Thermo Electronic Corporation, model amerykański | : 3110 | Temperatura (37 & stopnie; C ± 1 &stopnie; C), wilgotność (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Mikroskop odwrócony Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S-Isopropanol | |
| Sigma-Aldrich, US | I9030-4L-Oil | ||
| Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Zestaw do histologicznej wizualizacji obojętnego tłuszczu. |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G-penicylina | |
| /streptomycyna | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antybiotyki 10 000 U/ml Penicylina, 10 000 μ pH-metr g / ml Streptomycyny |
| Beckman, model amerykański | : 360 miernik PH / Temp / MV | - | |
| buforowana solą fizjologiczną z fosforanami | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023-Pipety | |
| serologiczne | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Niepirogenne, sterylne, 5 ml |
| pipety serologiczne | Sarstedt, AUS& | nbsp; 86.1254.001 | Niepirogenny, sterylny, 10 ml |
| wodorowęglanu sodu | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Przygotowanie pożywek |
| hodowlanych Oleinian sodu | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A-Palmitynian | |
| sodu | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881-Filtr | |
| strzykawkowy | Corning, USA | 431219 | Niepirogenny, sterylny, 28 mm, 0,2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G-Trypsyna | |
| 0,05% / EDTA 0,53 mM | Corning, US | 25-052-Cl-24 | |
| studzienkowy klaster hodowli komórkowych | Corning, US | 3524 | Płaskie dno z pokrywką. Hodowla tkankowa poddana obróbce. Niepirogenne, polistyrenowe, sterylne. 1/opakowanie. |
| 96-dołkowy klaster hodowli komórkowych | Corning, US | 3599 | Płaskie dno z pokrywką. Hodowla tkankowa poddana obróbce. Niepirogenne, polistyrenowe, sterylne. 1/opakowanie. |
Bibliografia
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatiti....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
